˘ ˇˆtesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/1751/1/2468... · IKCa Canales de potasio de conductancia intermedia, activados por calcio IP3 Inositol (1,4, 5) trifosfato K+ ATP Canales

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

“MECANISMO DE ACCIÓN RELAJANTE DE BERBERINA

AISLADA DE Argemone ochroleuca Sweet EN ANILLOS

DE TRÁQUEA AISLADA DE COBAYO”

T E S I SQUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIASEN I NVESTIGACIÓN EN MEDICINA

P R E S E N T A : M en C MARÍA ELENA SÁNCHEZ MENDOZA

ASESORES: Dr. ANDRÉS NAVARRETE CASTRO

Dr. CARLOS CASTILLO HENKEL

Diciembre, 2007

Este trabajo se realizó en la Facultad de Química Departamento de Farmacia

en el Laboratorio 126 del Conjunto E de la Universidad Nacional Autónoma de

México y en el Laboratorio de Farmacología Cardiovascular de la Escuela

Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología (CONACyT) con el número de proyecto C01-018 y por la Dirección

General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) Proyecto: IN201506

Al Instituto Politécnico Nacional por la beca Institucional otorgada.

INDICE

RESUMEN........................................................................................................ ................I ABSTRACT.....................................................................................................................IILISTA DE ABREVIACIONES....................................................................................IIILISTA DE CUADROS........................................................................................ ...........VLISTA DE ESQUEMAS Y FIGURAS......................................................................... .V LISTA DE GRAFICAS.................................................................................................VI

I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1

II. FUNDAMENTO TEORICO ............................................................................. 2

2.1. APARATO RESPIRATORIO ............................................................................. 2

2.2. EL MÚSCULO LISO DE LAS VÍAS AÉREAS ......................................................... 2

2.2.1. Inervación colinérgica ........................................................................ 3

2.2.2. Inervación adrenérgica ...................................................................... 3

2.2.3. Inervación no adrenérgica no colinérgica (NANC)............................. 4

2.3. BRONCOCONSTRICCIÓN............................................................................... 4

2.3.1. Broncoconstricción a través de los receptores acoplados a proteína

Gq................................................................................................................ 5

2.3.2. Broncoconstricción a través de los receptores acoplados a proteína

Gi ................................................................................................................. 8

2.4. BRONCORRELAJACIÓN................................................................................. 9

2.4.1. Broncorrelajación a través de los receptores acoplados a proteína Gs

....................................................................................................................10

2.4.2. Broncorrelajación a través de la Guanilil ciclasa...............................11

2.4.2.1. Guanilil ciclasa soluble...................................................................12

2.4.2.2. Guanilil ciclasa particulada ............................................................13

2.4.3. Inhibición de la degradación de los nucléotidos cíclicos..................13

2.4.4. Broncorrelajación relacionada con influencia sobre canales iónicos 14

2.4.4.1. Canales de calcio...........................................................................14

2.4.4.2. Canales de potasio ........................................................................14

2.4.4.2.1. Canales de K+ activados por calcio.............................................14

2.4.4.2.2. Canales de K+ rectificador tardío ................................................15

2.4.4.2.3. Canales de K+ sensibles a ATP ..................................................15

2.5. FÁRMACOS BRONCODILATADORES...............................................................15

2.5.1. Fármacos que bloquean el efecto de mediadores contráctiles .........15

2.5.1.1. Anticolinérgicos..............................................................................15

2.5.1.2. Antihistamínicos.............................................................................16

2.5.1.3. Fármacos anti-leucotrienos............................................................17

2.5.1.4. Glucocorticoides ............................................................................17

2.5.2. Fármacos relajantes .........................................................................17

2.5.2.1. ββββ2 - Adrenérgicos ...........................................................................17

2.5.2.2. Inhibidores de fosfodiesterasas .....................................................18

2.5.2.3. Canales de K+ ................................................................................18

2.5.2.4. Canales de K+ sensibles a ATP .....................................................19

2.6. PLANTAS MEDICINALES UTILIZADAS EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

RESPIRATORIAS ................................................................................................19

2.7. PLANTAS MEDICINALES UTILIZADAS EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES

RESPIRATORIAS EN MÉXICO ...............................................................................23

2.8. EL GÉNERO ARGEMONE.............................................................................24

2.8.1. Información etnomédica de Argemone ochroleuca...........................25

2.8.2. Estudios químicos del género Argemone y de Argemone ochroleuca

....................................................................................................................26

2.8.3. Estudios de actividad biológica del género Argemone .....................26

III. JUSTIFICACIÓN ..........................................................................................27

IV. HIPÓTESIS ..................................................................................................28

V. OBJETIVO GENERAL..................................................................................29

VI. OBJETIVOS ESPECIFICOS........................................................................29

VII. MATERIALES Y METODO .........................................................................30

7.1. MATERIAL VEGETAL ....................................................................................30

7.2. PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS ..............................................................30

7.2.1. Fraccionamiento y aislamiento de berberina ....................................30

7.3. ANIMALES..................................................................................................33

7.4. FÁRMACOS................................................................................................33

7.5. ENSAYOS BIOLÓGICOS................................................................................34

7.5.1. Disección de la tráquea y montaje de la preparación .......................34

7.5.2. Evaluación del efecto relajante de los extractos, fracciones de

Argemone ochroleuca y/o berberina..........................................................35

7.5.3. Evaluación del efecto del extracto de diclorometano o berberina en

tejidos pre-contraídos con diferentes agonistas..........................................35

7.5.4. Evaluación de la participación de receptores β-adrenérgicos, canales

de K+ATP, adenilil ciclasa y guanilil ciclasa soluble en el efecto relajante de

berberina.....................................................................................................35

7.5.5. Evaluación del efecto de berberina en la respuesta relajante de

isoproterenol, forskolina y nitroprusiato. .....................................................36

7.5.6. Evaluación del efecto de berberina o bromuro de ipratropio en la

respuesta contráctil de carbacol. ................................................................36

VIII. ESTADÍSTICA............................................................................................37

IX. RESULTADOS.............................................................................................38

X. DISCUSIÓN...................................................................................................61

XI. CONCLUSIONES.........................................................................................68

XII. PERSPECTIVAS.........................................................................................69

XIII. BIBLIOGRAFIA..........................................................................................70

XIV. ANEXOS....................................................................................................81

Mecanismo de acción relajante de berberina aislada de Argemone ochroleuca Sweet en anillos de tráquea aislada de cobayo

I

Resumen

En el presente trabajo se investigó el efecto relajante de la especie Argemone

ochroleuca, en el modelo de anillos aislados de tráquea de cobayo. Esta

especie es utilizada en la medicina tradicional mexicana para el tratamiento de

diversas enfermedades respiratorias como son: tos, bronquitis, y asma. Los

cambios de contracción y relajación de los anillos de la tráquea fueron

registrados en un polígrafo. El extracto de diclorometano de A. ochroleuca fue el

extracto más activo (EC50 = 78.03 ± 2.15 µg/mL con 95.12 ± 3.56 % de máxima

relajación). El alcaloide berberina fue identificado como uno de los principios

activos relajantes de esta planta medicinal (EC50 = 118.50 ± 3.91 µM). La

berberina relajó de manera dependiente de la concentración las

precontracciones inducidas con carbacol, pero no las inducidas con histamina o

cloruro de potasio. El efecto relajante de berberina no fue afectado por la

presencia de propranolol (3 µM), glibenclamida (10 µM) u ODQ (10 µM). Sin

embargo, 2’,5’-dideoxiadenosina (10 µM), bloqueó las curvas concentración

respuesta relajante de berberina. Por otro lado, la berberina produjo un

desplazamiento hacia la izquierda de las curvas concentración-respuesta de

isoproterenol (10-10 - 3.16 x 10-6 M), forskolina (10-8 - 10-6 M) y nitroprusiato (10-

10 - 10-5 M). Adicionalmente, la berberina produjo un desplazamiento paralelo

hacia la derecha de las curvas concentración respuesta de carbacol,

comportándose como un antagonista de tipo competitivo presentando un valor

de pA2 = 3.87 ± 0.045. Este resultado sugiere que el efecto relajante de

berberina en los anillos aislados de tráquea de cobayo, es debido a un efecto

antagonista muscarínico de los receptores de acetilcolina, probablemente

similar al mecanismo de otros antagonistas muscarínicos utilizados en clínica

para el tratamiento del asma y de las enfermedades pulmonares obstructivas

crónicas.


II

Abstract

We investigated the relaxant effect of Argemone ochroleuca, which is used in

the Mexican traditional medicine for the treatment of various respiratory

diseases such as cough, bronchitis and asthma. The tension changes of guinea-

pig trachea segments were isometrically recorded on a polygraph.

Dichloromethane extract of A. ochroleuca was the most active relaxant extract

(EC50 = 78.03 ± 2.15 µg/mL with 95.12 ± 3.56 % of relaxation). The alkaloid

berberine was identified as the active relaxant principle in this medicinal plant

(EC50 = 118.50 ± 3.91 µM). Berberine concentration-dependently relaxed the

carbachol-induced precontractions but not histamine- or KCl-induced

precontraction. The relaxant effect of berberine was unaffected by the presence

of propranolol (3 µM), glibenclamide (10 µM) or ODQ (10 µM). However, 2’,5’-

dideoxyadenosine (10 µM), blocked the log concentration-response curves of

berberine. On the other hand, berberine produced a leftward shift of the log

concentration-response curves of isoproterenol (10-10 to 3.16 x 10-6 M), forskolin

(10-8 to 10-6 M) and nitroprusside (10-10 to 10-5 M). Additionally, berberine

produced a parallel rightward shift of the concentration response curve of

carbachol in a competitive manner with a pA2 = 3.87 ± 0.045. The above results

suggest that relaxant effect of berberine on the tracheal muscle is due to its

antagonistic effect on muscarinic acetylcholine receptors, probably by a similar

mechanism to other muscarinic antagonists with clinical uses in the treatment of

asthma or chronic obstructive pulmonary disease.


III

LISTA DE ABREVIACIONES AA Ácido araquidónico

AC Adenilil ciclasa AcOEt Acetato de etilo

AMPc 3’,5’- monofosfato cíclico de adenosina

BKCa++ Canales de alta conductancia a K+ activados por calcio

COX Ciclooxigenasa

CREB Factor de transcripción

CH2Cl2 Diclorometano DAG Diacilglicerol

DMSO Dimetilsulfóxido EEM Error estándar de la media

EPOC Enfermedades pulmonares obstructivas crónicas

Gαi Subunidad α de la proteína Gi

Gβγ Subunidad βγ de la proteína G

GC Guanilil ciclasa GMPc 3’,5’-monofosfato cíclico de guanosina Gsα Subunidad α de la proteína Gs IKCa Canales de potasio de conductancia intermedia, activados por calcio

IP3 Inositol (1,4, 5) trifosfato

K+ATP Canales de potasio dependientes de ATP

MAPK Protein cinasa activada por mitógeno MeOH Metanol

MLA Músculo liso de las vías aéreas

MLCK Cinasa de las cadenas ligeras de miosina

MLC Cadenas ligeras de miosina

NANC Inervación no adrenérgica no colinérgica

NO Oxido nítrico

ODQ 1H-[1,2,4]-oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona


IV

PDE Fosfodiesterasas

PLC Fosfolipasa C PIP2 Fosfoinositol,4,5-bifosfato

PKA Protein cinasa A

PKC Protein cinasa C PLA2 Fosfolipasa A2

PLCβ Fosfolipasa C beta

PNA Péptido natriurético auricular ROC Canales de calcio activados por receptor

sGC Enzima guanilil ciclasa soluble

SKCa Canales de potasio de baja conductancia, activados por

calcio

SR Retículo sarcoplásmico VIP Péptido intestinal vasoactivo

VOC Canales de calcio voltaje dependientes


V

LISTA DE CUADROS

Cuadro 1. Principales agentes contráctiles del músculo liso de las vías aéreas….....6

Cuadro 2. Principales relajantes del músculo liso de las vías aéreas……………….10 Cuadro 3. Plantas utilizadas en la medicina tradicional de China……………….......20

Cuadro 4. Plantas utilizadas en la medicina tradicional de la India………………….21

Cuadro 5. Plantas utilizadas en la medicina tradicional de diferentes países……...22

Cuadro 6. Plantas utilizadas en la medicina tradicional mexicana en el

tratamiento de enfermedades respiratorias………………………………………… .24

Cuadro 7. Señales características de berberina en técnicas de: IR, FAB+MS,

RMN- 1H (300 MHz, DMSO-d6) y RMN- 13C (75 MHz, DMSO-d6).................................33

Cuadro 8. Valores de CE50 (µM; log M) de berberina y forskolina en ausencia y

presencia de 2’,5’-dideoxyadenosina……………………………………………… .…51

Cuadro 9. Valores de CE50 (µM; log M) de isoproterenol, forskolina y

nitroprusiato en ausencia y presencia de berberina……………………………….…..55

Cuadro 10. Valores de CE50 (µM; log M) de carbacol en ausencia y en presencia

de berberina…………………………………………………………………………… ...56

Cuadro 11. Valores de CE50 (µM; log M) de carbacol en ausencia y en presencia

de Ipratropio……………………………………………………………………………….59

LISTA DE ESQUEMAS Y FIGURAS Esquema 1. Señalización a través de los receptores acoplados a proteína Gq en

músculo liso de vías aéreas…………………………………………………………… ...7

Esquema 2. Señalización a través de los receptores acoplados a proteína Gi en

músculo liso de vías aéreas…………………………………………………………...... .9

Esquema 3. Señalización a través de los receptores acoplados a proteína Gs en

músculo liso de vías aéreas……………………………………………………………..11

Esquema 4. Señalización a través de los receptores de guanilato ciclasa soluble y

particulada en músculo liso de vías aéreas……………………………….………… 12

Esquema 5. Estudio biodirigido de Argemone ochroleuca Sweet...…………….…31

Figura 1. Estructura de la berberina………………………….……………………… .32


VI

LISTA DE GRÁFICAS

Gráfica 1. Efecto relajante de los extractos obtenidos con hexano, diclorometano

y metanol de A. ochroleuca………………………………………………………… …….39

Gráfica 2. Efecto relajante del extracto obtenido con diclorometano de A.

ochroleuca sobre las precontracciones inducidas con carbacol (A), histamina (B)

y KCl (C) ……………………………..……………………………………………………...40

Gráfica 3. Efecto relajante de isoproterenol sobre las precontracciones inducidas

con carbacol (A), histamina (B) y KCl (C)……………………………………. ……….41

Gráfica 4. Efecto relajante de las fracciones obtenidas de la percolación del

extracto de diclorometano de A. ochroleuca………………………………………….....43

Gráfica 5. Efecto relajante de berberina sobre las precontracciones inducidas con

carbacol (A), histamina (B) y KCl (C)…………………………………………………… .44

Gráfica 6. Efecto relajante de berberina (A) e isoproterenol (B) en ausencia y en

presencia de propranolol………………………………………………………………......46

Gráfica 7. Efecto relajante de berberina en ausencia y en presencia de

glibenclamida……………………………………………………………………………… .47

Gráfica 8. Efecto relajante de berberina (A) y nitroprusiato (B) en ausencia o en

presencia de ODQ…………………………………………………………………….…... 49

Gráfica 9. Efecto relajante de berberina (A) y forskolina (B) en ausencia y en

presencia de 2’,5’-Dideoxyadenosina…………………………………………………… 50

Gráfica 10. Efecto relajante de isoproterenol, en ausencia y presencia de

berberina……………………………………………………………………………....... ....52

Gráfica 11. Efecto relajante de forskolina, en ausencia y en presencia de

berberina…………………………………………………………………………………... .53

Gráfica 12. Efecto relajante de nitroprusiato, en ausencia y en presencia de

berberina………………………………………………………………………………… ....54

Gráfica 13. Efecto inhibitorio de berberina sobre la respuesta contráctil de

carbacol (A), gráfico de Shild (B)…………………………………………………… ……57

Gráfica 14. Efecto inhibitorio de ipratropio sobre la respuesta contráctil de

carbacol (A), gráfico de Shild (B)……………………………………………………….. .58

Gráfica 15. Efecto relajante de ipratropio y berberina…………………………..… ....60


1

I. INTRODUCCIÓN En la medicina tradicional Mexicana a varias especies de Argemone se les

conoce como “Chicalote” y son utilizadas en el tratamiento de enfermedades

respiratorias y afecciones oculares (Argueta y Cano, 1994). En el Valle de

México pueden encontrarse dos especies: Argemone platyceras Link & Otto y

Argemone ochroleuca Sweet (Calderón, 1991).

Para la especie Argemone platyceras Link & Otto, se reporta que el flavonoide

isoquercitrina, inhibe las contracciones inducidas por carbacol y por el

leucotrieno D4 en vías aéreas de cobayo (Fernandez et al., 2005). Sin embargo,

no hay reportes adicionales concernientes a la evaluación farmacológica de

otras especies de Argemone en vías aéreas, por lo que considerando el empleo

tradicional que se le da a plantas de este género y con la finalidad de

proporcionar bases científicas que sustenten el uso de la especie Argemone

ochroleuca Sweet, el presente trabajo estuvo encaminado a la evaluación de la

actividad relajante utilizando el modelo de anillos aislados de tráquea de

cobayo.

La especie Argemone ochroleuca Sweet, cuenta con estudios químicos que han

determinado la presencia de diversos alcaloides (Haisova y Slavik, 1973;

Israilov et al., 1986; Chelombit´ko y Nazarova, 1988; Takken et al., 1993) y

ácidos grasos (Fletcher et al., 1993) como algunos de sus principales

constituyentes. En el presente trabajo, se describe como a través de un estudio

biodirigido se logró la identificación del alcaloide berberina, como uno de los

constituyentes responsables de la actividad relajante de esta especie,

adicionalmente se aporta información acerca de su mecanismo de acción.


2

II. FUNDAMENTO TEORICO 2.1. Aparato respiratorio El aparato respiratorio comprende las vías respiratorias (fosas nasales, la

parte superior de la faringe, la laringe, la tráquea y los bronquios) y a los

pulmones. Las primeras conducen el aire a los segundos, en los cuales se

producen los intercambios gaseosos (Rouviere y Delmas, 1999).

Las estructuras anatómicas más importantes de la vía aérea, desde el punto de

vista farmacológico, son el músculo liso, el epitelio ciliado y las glándulas

bronquiales. El músculo liso involuntario frecuentemente sufre de modo

inapropiado constricción grave en respuesta a diversos tipos de irritación; con el

consiguiente broncoespasmo, el cual es un problema de primera importancia

en la mayor parte de las enfermedades respiratorias obstructivas crónicas del

pulmón (Latarjet y Ruiz, 1995).

La submucosa es la capa de tejido conectivo vascular que se encuentra debajo

del epitelio, contiene glándulas bronquiales especializadas, compuestas por

dos tipos de células secretoras: serosas y mucosas. La función principal de las

glándulas traqueobronqueales es la producción de mucina que ayuda a formar

una barrera protectora entre el epitelio de las vías aéreas y el medio ambiente

(Finkbeiner, 1999).

2.2. El músculo liso de las vías aéreas El músculo liso de las vías aéreas (MLA), es un importante tejido involucrado en

la regulación del tono broncomotor que existe desde la traquea hasta los

bronquiolos (Amrani y Panettieri, 2003). La inervación del músculo liso de las

vías aéreas es compleja, además de participar nervios simpáticos

(adrenérgicos) y parasimpáticos (colinérgicos), existe una inervación no

adrenérgica no colinérgica (NANC). Sin embargo, el calibre de las vías aéreas

no solamente esta determinado por el tono del músculo liso, sino también

depende de la profundidad de la submucosa así como de las secreciones

luminales (Finkbeiner, 1999).


3

2.2.1. Inervación colinérgica Las vías aéreas del ser humano, reciben una importante inervación colinérgica.

La liberación de acetilcolina regula el tono de las vías aéreas, ocasionando

contracción del músculo liso y secreción de moco, a través de la interacción con

receptores muscarínicos de acetilcolina localizados en músculo liso bronquial,

glándulas y vasculatura pulmonar (Belmonte, 2005). El MLA contiene dos tipos

de receptores muscarínicos el M2 y el M3. La proporción de receptores M2 y M3

es aproximadamente 4:1, variando ligeramente la proporción de acuerdo a la

especie (Belmonte, 2005; Gosens et al., 2006). Se ha establecido que la

estimulación de los receptores muscarínicos M3 media la contracción del

músculo liso, sin embargo la función de los del tipo M2, no es totalmente clara.

Algunos estudios plantean que la estimulación de los receptores M2 en músculo

liso de vías aéreas, lleva a una inhibición de la activación de la adenilil ciclasa,

lo que resulta en una disminución de los niveles de AMPC (Fryer y Jacoby,

1998), otros estudios proporcionan evidencia del papel contráctil de los

receptores M2 cuando los receptores M3 están bloqueados (Ehlert, 2003;

Walker et al., 2004) y otros reportes han sugerido que desempeñan dos

papeles: a corto plazo efectúan una inhibición de la enzima adenilil ciclasa y a

largo plazo, regulan a la alta la expresión de esta enzima contrarrestando con

ello, la acción de los agonistas de los receptores M3 acoplados a la fosfolipasa

C (Hall, 2000; Michal et al., 2001; Mistry et al., 2005). En tanto que en los

nervios parasimpáticos los receptores M2 actúan como autoreceptores,

inhibiendo la liberación de acetilcolina (Barnes, 1998; Thirstrup, 2000).

2.2.2. Inervación adrenérgica

Las fibras adrenérgicas han sido detectadas desde los bronquios hasta la

terminal de los bronquiolos. La inervación adrenérgica de las vías aéreas de los

seres humanos tiene una importancia funcional limitada con respecto a la

broncodilatación, sin embargo las fibras adrenérgicas pueden modular la

neurotransmisión colinérgica, además la adrenalina liberada por la médula


4

suprarrenal puede ejercer notable efecto broncodilatador en ciertas

circunstancias (Thirstrup, 2000; McGraw et al., 2007).

2.2.3. Inervación no adrenérgica no colinérgica (NANC) En las vías aéreas del cobayo se ha identificado que el péptido intestinal

vasoactivo (VIP) y el óxido nítrico (NO) son los trasmisores que median la

relajación NANC, en tanto que los probables candidatos del componente

excitatorio del NANC son la capsaicina, taquicininas, sustancia P y neurocinina

A. Con respecto al humano, ya se ha establecido que el NO forma parte de los

componentes inhibitorios; sin embargo, todavía no se define el papel del VIP

(Thirstrup, 2000; Fischer et al., 2002).

2.3. Broncoconstricción La contracción del músculo liso puede ser iniciada por una despolarización

(acoplamiento electro-mecánico) o por una estimulación con agonistas

contráctiles (acoplamiento fármaco-mecánico) que está íntimamente

relacionado con un incremento en las concentraciones de calcio intracelular. El

incremento en las concentraciones de calcio intracelular origina la formación de

un complejo calcio-calmodulina que activa a la enzima cinasa de las cadenas

ligeras de miosina (MLCK), la cuál es responsable de la fosforilación de las

cadenas ligeras de miosina en la serina 19, esta fosforilación activa a la miosina

ATPasa, la cuál genera la subsecuente formación de puentes cruzados entre

actina y miosina desencadenando el proceso contráctil (Barnes, 1998; Thirstrup,

2000).

El MLA puede ser contraído por agentes que estimulen directamente a

receptores acoplados a proteínas G, o a través de vías indirectas, que

involucran la liberación y/o síntesis de otros mediadores que actúan

directamente (Barnes, 1998; Thirstrup, 2000; McGraw et al., 2007). Los

principales mediadores contráctiles del músculo liso de las vías aéreas, se

presentan en el Cuadro 1.


5

2.3.1. Broncoconstricción a través de los receptores acoplados a proteína Gq En el MLA existen receptores acoplados a proteínas Gq capaces de inducir

contracción, entre los que se encuentran los receptores de acetilcolina (M3),

histamina (H1), leucotrienos (CysLT1), endotelina (ET-A) y bradicinina (B2).

Adicionalmente existen otros receptores tales como los de adenosina (A3), y

neurocinina 1 y 2 (NK-1, NK-2 respectivamente) (Barnes, 1998; Aharony, 1998;

Nicosia et al., 2001; Billington y Penn, 2003). Sin embargo, la importancia de

estos últimos en la mediación de la contracción bajo condiciones fisiológicas o

patológicas aún permanece incierta (Billington y Penn, 2003).

La señalización de estos receptores involucra la activación secuencial del

receptor y del efector, como se puede apreciar en el Esquema 1. Al unirse el

agonista al receptor, este experimenta un cambio conformacional, con la

subsiguiente activación de la subunidad α, y la disociación de las

subunidades βγ, la subunidad Gα, activa a la fosfolipasa C (PLC), que

promueve la hidrólisis de fosfoinositol 4,5-difosfato (PIP2) dando lugar a los

segundos mensajeros intracelulares 1,2-diacilglicerol (DAG) y 1,4,5-trifosfato

de inositol (IP3).


6

Mediador contráctil Mecanismo contráctil Directo Indirecto

Acetilcolina M3

Adenosina Liberación de histamina, acetilcolina,

y prostaglandinas, neuropéptidos y

leucotrienos

Bradicinina BK Liberación de neuropéptidos y

acetilcolina

Endotelina

( ET-1,-2, -3 )

ETB Liberación de prostaglandinas (a

partir de células infamatorias),

acetilcolina y neuropéptidos

Histamina H1

Leucotrienos

LTB4

LTC4

LTD4

LTE4

CysLT1

CysLT1

CysLT1

Síntesis de tromboxano A2

Neuropéptidos

Sustancia P

Neurocinina A

NK1

NK2

Factor de activación

plaquetaria

PAF Leucotrienos, eosinófilos,

tromboxano A2, acetilcolina

Prostaglandinas

PGD2

PGF2α

DP

FP

Serotonina 5-HT2

Tromboxano TP Acetilcolina

Cuadro 1. Principales agentes contráctiles del músculo liso de las vías aéreas (Barnes,

1998; Thirstrup, 2000).


7

PLA2P

P

PLCαq

βγ

αq

αq βγ

P

P P

p42/p44P

MLCK

IP3

+

+

+

+

+

+

Crecimiento

GTP

GTP

Ca2+

eicosanoides

COX

CaM

DAGGTP

AAContracción

GDP

GTP

H2N

H2N

COOH

COOH

PKC

HistaminaAcetilcolina

BradicininaLeucotrienos

Endotelina Adenosina

Neurocinina

βγ

βγαq

αqGDP

Esquema 1. Señalización a través de los receptores acoplados a proteína Gq en

músculo liso de vías aéreas. PLC = fosfolipasa C, PKC = protein cinasa C, PLA2 =

fosfolipasa A2, AA = ácido araquidónico, COX = ciclooxigenasa, MLCK = cinasa de las

cadenas ligeras de miosina, IP3 = inositol (1,4,5) trifosfato. Modificada de Billington,

2003.

El DAG activa a la protein cinasa C (PKC), que es capaz de fosforilar a

numerosos sustratos, algunos de ellos intermediarios de la vía de señalización

de la MAPK (protein cinasa activada por mitógeno) lo cual activa varios factores

de transcripción involucrados en promover el crecimiento de las vías aéreas.

Los receptores acoplados a Gq también son capaces de activar al receptor de

tirosin cinasa induciendo el crecimiento del músculo liso de las vías aéreas. Por

otro lado, tanto la PKC como intermediarios de la MAPK p42/p44 fosforilan y

estimulan la actividad catalítica de la fosfolipasa A2 (PLA2), que libera ácido

araquidónico (AA). El otro producto de la hidrólisis de PIP2, el IP3 se une a un

receptor del retículo sarcoplásmico, lo que resulta en la apertura de canales de


8

calcio y el flujo del ion hacia el citosol. El incremento de calcio libre intracelular,

promueve la unión de calcio a calmodulina formando un complejo que activa a

las cinasas de las cadenas ligeras de miosina (MLCK), la fosforilación de las

cadenas de miosina, permite la unión con actina y la activación de miosina

ATPasa requerida para la contracción (Barnes, 1998; Hall, 2000; Thirstrup,

2000; Billington y Penn, 2003).

2.3.2. Broncoconstricción a través de los receptores acoplados a proteína Gi El MLA de los humanos expresa receptores muscarínicos (M2), de serotonina

(5-HT2c) y de adenosina (A1) los cuales están acoplados a proteínas G

inhibitorias Gi (Barnes, 1998; Fryer y Jacoby, 1998; Hall, 2000; Jacoby y Fryer,

2001; Billington y Penn, 2003). Estos receptores tienen la capacidad de iniciar o

modular la señalización a través de acciones derivadas de las subunidades α y

βγ, como se representa en el Esquema 2. Al disociarse Gαi del complejo

heterotrimérico se une a la adenilil ciclasa (AC) V y VI actuando como un

modulador negativo de la señalización inducida por Gαs. Las subunidades Gβγ

modulan la actividad de AC, inhibiendo la AC tipo I, pero incrementa la

activación inducida de AC II, IV y VII. Las subunidades Gβγ también pueden

activar la fosfolipasa Cβ (PLCβ) resultando la generación de fosfoinósitidos,

activación de PKC vía DAG y movilización de calcio. La activación del receptor

acoplado a Gi también puede promover el crecimiento del músculo liso de las

vías aéreas (Hall, 2000; Billington y Penn, 2003).


9

βγ

Crecimiento

ACH2N

HOOC αs βγ

GDP

DAG

IP3

+βγ

+

H2N

P P

γβ

Ca2+

?

HOOCαiγ

GTPGDP

β

αsGTP

+ αiαs

GTP

+

PKC

Serotonina

Adenosina

PLCAC

GDP

GTPGTPGTP

GDP GTP GTP

AC

βγ

+++

Contracción /Sensibilización contráctil

Esquema 2. Señalización a través de los receptores acoplados a proteína Gi en

músculo liso de vías aéreas. AC = adenilil ciclasa, PLC = fosfolipasa C, PKC = protein

cinasa C, IP3 = inositol (1,4,5) trifosfato, DAG = diacilglicerol. Modificada de Billington,

2003.

2.4. Broncorrelajación Varias sustancias endógenas son relajantes del MLA y actúan ya sea activando

receptores o liberando broncodilatadores endógenos (Barnes, 1998). En el

Cuadro 2 se presentan los principales mediadores relajantes del músculo liso

de las vías aéreas. El proceso de relajación a través de las diferentes vías de

señalización finalmente tiende a reducir las concentraciones de calcio libre

intracelular y/o afectan la sensibilidad al calcio de las proteínas contráctiles.

Para ello existen cuatro mecanismos celulares principales mediante los cuales

actúan los relajantes del músculo liso de las vías aéreas; estos son a través del:

a) incremento del 3’,5’-monofosfato cíclico de adenosina AMPc; b) aumento del

3’,5’-monofosfato cíclico de guanosina GMPc; c) inhibición del rompimiento de


10

los nucléotidos cíclicos; d) modulando la actividad de los canales iónicos de la

membrana celular (Thirstrup, 2000).

Broncodilatador Receptor

Epinefrina β2- adrenérgico

Péptido intestinal vasoactivo PVR1

Prostaglandina E2 EP

Prostaciclina IP

Péptido natriurético auricular Guanilil ciclasa (particulada)

Oxido nítrico Guanilil ciclasa (soluble)

Cuadro 2. Principales relajantes del músculo liso de las vías aéreas (Barnes, 1998).

2.4.1. Broncorrelajación a través de los receptores acoplados a proteína Gs Los receptores acoplados a Gs en el MLA son activados por agentes endógenos

como las catecolaminas (β2-adrenérgicos), prostaglandinas (PGE2), adenosina

(A2b) y el péptido intestinal vasoactivo (VIP) (Barnes, 1998; Hall, 2000; Billington

y Penn, 2003). La activación de Gsα activa a la adenilil ciclasa (AC) (Billington y

Penn, 2003). La activación de la AC cataliza la formación de AMPc a partir del

ATP citoplasmático, la función principal del AMPc es activar a la protein cinasa

A (PKA), como se muestra en el Esquema 3. La PKA puede fosforilar varias

proteínas intracelulares en residuos específicos de serina y treonina (Barnes,

1998), lo que lleva a la inactivación de las MLCK. Asimismo, PKA fosforila

ciertos canales de K+ los cuales se abren permitiendo un flujo de potasio con la

consiguiente hiperpolarización (Barnes, 1998). También fosforila el factor de

transcripción CREB, activa la señalización vía tirosin cinasas y regula la

transcripción de numerosos genes (Billington y Penn, 2003).


11

βγ

ADP

αsGTP

K+

P

GDPGTPαs β

γ αs βγ

GDP

αsGTP

βγ

αsGTP

ATPAMPc

cAMPC

C

C

CC

C

Regulaciónde genes

Regulaciónde canal

Crecimiento (-)

CREBP

P

RR

cAMP

RR

RR

Blanco P

ATP

AMPc

AMPc

AMPc

AMPc

AMPc

AMPc

AMPc

AMPc

αsGTP

+H2N

HOOC

AC

β2− ΑdrenérgicosProstaglandina E2

Adenosina

VIP

Relajación

AC

GTP

GDP

GDPGTP

GTP

P

P P

P

P

GTP

AMPc

AMPcGTP

Esquema 3. Señalización a través de los receptores acoplados a proteína Gs en

músculo liso de vías aéreas. AC = adenilil ciclasa, VIP = péptido intestinal vasoactivo.

Modificada de Billington, 2003.

2.4.2. Broncorrelajación a través de la Guanilil ciclasa Existen dos formas de la enzima guanilil ciclasa, (soluble y particulada) que al

activarse catalizan la conversión de GTP a GMPc, con la subsecuente

activación de la protein cinasa G, la cual fosforila diversos sustratos

produciendo la relajación, (Hamad et al., 2003) como se presenta en el

Esquema 4.


12

P

αsGTP

GTP GMPc

K+ATP

BKCa

VOC

K+K+

Ca2+

PDE V

PKG

SR

Ca2+ +

Relajación

Hiperpolarización

NO

GC

GTP

Péptido natriuréticoauricular

GC

GTP

Esquema 4. Señalización a través de los receptores de guanilil ciclasa soluble y

particulada en músculo liso de vías aéreas. GC = guanilil ciclasa, BKCa++ = canales de

alta conductancia a K+ activados por calcio, VOC = canales de calcio voltaje

dependientes, SR = retículo sarcoplásmico, PDE V = fosfodiesterasa V. Modificada de

Thirstrup, 2000. Activación/estimulación. Inhibición.

2.4.2.1. Guanilil ciclasa soluble La guanilil ciclasa es una enzima heterodimérica que contiene una subunidad

larga α y una pequeña β. Es activada por el oxído nítrico (NO) endógeno y por

los nitrovasodilatadores. El NO ejerce su efecto relajante por el incremento de

GMPc y, además se ha sugerido que en el músculo liso de las vías aéreas

activa directamente canales BKCa++ (alta conductancia a potasio), oxida

proteínas contráctiles intracelulares (tales como las cabezas de miosina o

proteínas reguladoras involucradas en la contracción) y disminuye la

sensibilidad al calcio intracelular (Hamad et al., 2003). Dependiendo del sitio de

generación y de la cantidad, el NO presenta muchos efectos sobre las


13

funciones de las vías aéreas en condiciones fisiológicas o patológicas (Fischer

et al., 2002; Hamad et al., 2003) entre las que se encuentran el ejercer un

efecto vasodilatador bronquial, presentar un efecto inmunoprotector, estimular

la secreción de moco y formación de radicales libres. Asimismo, el NO

desempeña un papel importante como vía parácrina, mediando los efectos

relajantes de bradicinina y endotelina (Fischer et al., 2002).

2.4.2.2. Guanilil ciclasa particulada Esta enzima esta compuesta por un solo dominio transmembrana, con una

región variable extracelular y una región intracelular más conservada con un

dominio catalítico (Hamad et al., 2003). Es activada por el péptido natriurético

auricular (PNA) y péptidos relacionados (Barnes, 1998; Hamad et al., 2003). El

PNA es producido principalmente en el corazón, pero es liberado en otros

tejidos incluyendo a los pulmones. En las vías aéreas sus sitios de unión se han

detectado tanto en músculo liso como en el epitelio. El PNA actúa a través de

tres tipos de receptores PNAA, PNAB y PNAC, los primeros dos incorporan una

parte de la enzima catalítica de la guanilil ciclasa particulada y el último esta

acoplado a la inhibición de adenilil ciclasa (Devillier et al., 2001).

2.4.3. Inhibición de la degradación de los nucléotidos cíclicos Las fosfodiesterasas (PDEs) comprenden una gran superfamilia de proteínas

cuyos miembros son responsables de la hidrólisis de AMPc y GMPc a sus

correspondientes nucleósidos inactivos 5’-monofosfatos AMP y GMP,

respectivamente. Consecuentemente, la inhibición las fosfodiesterasas resulta

en una broncodilatación. En el MLA de animales y del humano por lo menos

existen 5 subtipos (I, II, III, IV y V) (Santing et al., 2001), siendo los más

importantes las fosfodiesterasas III, IV y V. Ya que los inhibidores de ellas, son

potentes broncodilatadores del MLA. Las fosfodiesterasas III y IV, degradan

AMPc, en tanto que la fosfodiesterasa V degrada GMPc (Thirstrup, 1997).

Actualmente, la principal atención recae sobre los inhibidores de la

fosfodiesterasa IV, debido a que tienen una importancia especial como agentes


14

antiasmáticos, ya que regulan la función de casi todas las células pro-

inflamatorias e inmunes (Billah et al., 2002). Además, se tiene la evidencia de

que actúan como antiinflamatorios y broncodilatadores en diferentes especies

de animales (Burnouf y Pruniaux, 2002).

2.4.4. Broncorrelajación relacionada con influencia sobre canales iónicos 2.4.4.1. Canales de calcio En el MLA existen canales de calcio operados por voltaje (VOC) y canales de

calcio operados por receptor (ROC), cuya apertura permite el incremento

intracelular de calcio que es necesario para la contracción. En la actualidad, los

fármacos que bloquean dichos canales, no forman parte de la terapia para tratar

el asma, sin embargo, no se descarta su utilidad ya que en estudios clínicos, se

ha demostrado que los bloqueadores de los canales de calcio ofrecen una

pequeña pero significativa protección contra estímulos broncoconstrictores

inducidos por histamina, metacolina, ejercicio y aire frío (Thirstrup, 2000).

2.4.4.2. Canales de potasio Los canales de K+ desempeñan un papel importante en el control del potencial

de membrana del MLA, su apertura induce una hiperpolarización y

broncodilatación. Se han identificado diferentes canales y por lo menos, tres de

ellos desempeñan un papel fisiológico y farmacológico en la modulación de la

respuesta contráctil en MLA siendo estos: 1) los activados por calcio; 2)

rectificador retardado y 3) los sensibles a ATP (Hall, 2000; Pelaia et al., 2002).

2.4.4.2.1. Canales de K+ activados por calcio Se han identificado varios canales de K+ activados por calcio los cuáles se

clasifican de acuerdo a la conductancia del canal. De este modo se tienen

canales de alta conductancia (maxi-KCa), de conductancia intermedia (IKCa) y

de baja conductancia (SKCa), pero los más importantes son los maxi-K, que son

abiertos tanto por una despolarización de la membrana como por el incremento

de las concentraciones de calcio del citosol (Pelaia et al., 2002).


15

2.4.4.2.2. Canales de K+ rectificador tardío Los canales de K+ rectificador tardío, son dependientes de voltaje e

independientes de calcio, por lo cuál responden a una despolarización de la

membrana y contribuyen significativamente al potencial de reposo de la misma

(Pelaia et al., 2002).

2.4.4.2.3. Canales de K+ sensibles a ATP La apertura de los canales de K+ sensibles a ATP es inhibida por un incremento

en los niveles citosólicos de trifosfato de adenosina (ATP). El canal es un

complejo octamérico cuyo poro incluye 4 subunidades proteicas, cada una

asociada con un receptor para sulfonilurea, la activación de este receptor

induce un cambio conformacional que incrementa la probabilidad de apertura

del poro del canal (Pelaia et al., 2002).

2.5. Fármacos broncodilatadores Los fármacos broncodilatadores pueden dividirse en dos grupos dependiendo

del mecanismo farmacológico responsable de la actividad relajante. El primer

grupo comprende a los fármacos que bloquean el efecto de agonistas

contráctiles (tales como anti-colinérgicos, anti-leucotrienos e inhibidores de 5-

lipooxigenasas) y el segundo grupo comprende fármacos que actúan

directamente como relajantes del músculo liso de las vías aéreas a través de la

liberación de AMPc, GMPc, inhibición de la degradación de los nucleótidos

cíclicos y/o modulando la actividad de los canales iónicos de la membrana

celular (Thirstrup, 2000).

2.5.1. Fármacos que bloquean el efecto de mediadores contráctiles 2.5.1.1. Anticolinérgicos En las últimas dos décadas, los medicamentos anticolinérgicos han llegado a

ser muy utilizados en el tratamiento de rutina de enfermedades pulmonares

obstructivas crónicas (EPOC) y también para el asma en ciertas circunstancias

(Gross, 2006).


16

Actualmente existen antagonistas no selectivos como: ipratropio, oxitropio y

tiquizium, que se unen con igual afinidad a los subtipos M2 y M3, sin embargo,

pueden incrementar la broncoconstricción al inhibir a los autoreceptores M2,

cuyo bloqueo ocasiona incremento en la liberación de acetilcolina. También

existen antagonistas selectivos, como el tiotropio (cuya selectividad es cinética,

puesto que se une con igual afinidad a los subtipos M1, M2 y M3, pero con una

rápida disociación del M2 (3.6 h) comparándola con la unión a los tipos M1 (14.6

h) y M3 (34.7 h)), flutropio (con selectividad M3 además de acción anti-

histaminica), revatropato (selectivo para M1 y M3), zamifenacin y darifenacin

(selectivos para M3). Sin embargo de todos los anteriores el que mayor éxito

sigue teniendo en clínica es el tiotropio (Lee et al., 2001).

Los anticolinérgicos inhalados tienen un amplio margen de seguridad

terapéutico y son bien tolerados, en el uso clínico el efecto adverso más

frecuente es sequedad de boca y tos ocasional (Gross, 2006).

2.5.1.2. Antihistamínicos La histamina liberada de las células mastocito y de los basófilos, puede

provocar broncoconstricción, secreción de moco y aumento en la

broncoconstricción colinérgica a través de la interacción con receptores H1, los

cuáles están acoplados a proteínas G(q/11), además han mostrado activación de

fosfolipasa D, A2 y NF-kB, cuyas consecuencias funcionales se desconocen.

Los receptores H2 y H3, también han sido identificados en vías aéreas, pero de

igual forma se desconoce su importancia (Belvisi et al., 2004). Recientemente,

se han desarrollado antihistamínicos nuevos con elevada selectividad y poca

capacidad de cruzar barrera hematoencefálica, disminuyendo de tal forma sus

efectos depresores del sistema nervioso central. Algunos de estos

antihistamínicos nuevos, son aplicados al tratamiento del asma bronquial y

entre ellos se incluyen la loratadina, la fexofenadina, la ebastina y la cetirízina

(Barnes, 2001; Inagaki, 2001; Gelfand, 2002).


17

2.5.1.3. Fármacos anti-leucotrienos Cuando el ácido araquidónico es metabolizado vía 5-lipoxigenasa se forman los

leucotrienos que son potentes broncoconstrictores. Se ha desarrollado un

fármaco inhibidor de su síntesis, ziuleton que inhibe la enzima 5-lipoxigenasa,

así como también fármacos antagonistas competitivos selectivos de los cysteinil

leucotrienos LTC4, LTD4, y LTE4 tales como pranlukast, montelukast y

zafirlukast, que han mostrado utilidad en el tratamiento del asma pero poco

beneficio en pacientes con EPOC (Belvisi et al., 2004; Donohue, 2004).

2.5.1.4. Glucocorticoides Los glucocorticoides producen potentes acciones antiinflamatorias, antialérgicas

e inmunosupresoras y son los medicamentos más eficaces en el tratamiento de

enfermedades alérgicas, aunque pueden causar severos efectos adversos que

incluyen supresión adrenal y desarrollo de osteoporosis, cuando son utilizados

a elevadas dosis por un periodo prolongado (Inagaki, 2001). Son efectivos en

la terapia del asma y la mayoría se administran por vía oral, sin embargo, son

mucho más seguros por vía inhalatoria (Barnes, 1995). Ejemplo de ellos son la

beclometasona, la budesonida y la fluticasona (Inagaki, 2001), y recientemente

furoato de mometasona, etabonato y ciclesonida que reducen el perfil de

efectos adversos (Belvisi et al., 2004).

2.5.2. Fármacos relajantes

2.5.2.1. β2 - Adrenérgicos

En el tratamiento para el asma y otros trastornos respiratorios se utilizan

fármacos de acceso directo a la pared bronquial; como son los

broncodilatadores que comprenden a los estimulantes de los β2-

adrenoreceptores. Los cuales se pueden dividir en aquellos que presentan una

duración intermedia de (3-6 h) y los que presentan una larga duración (>12 h).

Dentro de los primeros se encuentran el bitolterol, terbutalina y metoproterenol,

y dentro de los de larga duración el salmeterol y el formoterol (Harold, 1995).


18

Sus efectos colaterales principales son el temblor, el incremento de la

frecuencia cardiaca y las palpitaciones, las cuales son menos comunes cuando

se utilizan agonistas selectivos de los receptores β2 como el albuterol, el

salmeterol y el formoterol, en comparación con agonistas no selectivos tales

como el isoproterenol (Harold, 1995).

2.5.2.2. Inhibidores de fosfodiesterasas El interés en estos compuestos nace del hecho de que durante muchos años se

ha utilizado la teofilina en cuadros broncoconstrictivos, no obstante, en los

países industrializados ocupa el tercer lugar como agente terapéutico ya que

presenta alta frecuencia de efectos adversos en comparación con su baja

eficacia. Su mecanismo de acción broncodilatador es parcialmente explicado

por la inhibición de las fosfodiesterasas (PDE), lo que resulta en un incremento

de los niveles de AMPc (al inhibir a las PDE III y PDE IV), y GMPc (al inhibir a la

PDE V). La teofilina además actúa antagonizando a los receptores de

adenosina (Donohue, 2004).

Actualmente se tiene gran interés por inhibidores de las PDE IV como posible

blanco terapéutico para el tratamiento del asma y otras enfermedades

pulmonares obstructivas crónicas, ya que presentan propiedades

broncodilatadoras y anti-inflamatorias. Entre los inhibidores de las PDE IV de

segunda generación se encuentra: roflumilast que ha mostrado utilidad en el

asma y en EPOC (Belvisi et al., 2004; Donohue, 2004).

2.5.2.3. Canales de K+

El análisis de los canales de K+ representa el punto de partida para el desarrollo

de nuevas alternativas farmacéuticas en el tratamiento del asma y de las

enfermedades pulmonares obstructivas crónicas. Sería muy importante el

desarrollo de fármacos de uso inhalatorio, más selectivos para actuar en las

vías aéreas que en el músculo liso vascular, sin embargo, son limitados los

estudios clínicos con fármacos que abran canales de K+. De los estudios

clínicos realizados, cabe mencionar los efectuados con cromakalim con el que


19

se observó que protegía contra la broncoconstricción inducida con histamina

pero inducía dolor de cabeza. En tanto que bimakalim, no producía efectos

cardiovasculares significativos, pero era incapaz de facilitar una

broncodilatación en pacientes asmáticos (Pelaia et al., 2002).

2.5.2.4. Canales de K+ sensibles a ATP

La actividad de los canales de K+ sensibles a ATP, es bloqueada

selectivamente por derivados de la sulfonilurea, tales como la glibenclamida y

son abiertos por fármacos como levcromakalim y HOE234, los cuales son

efectivos relajantes de las vías aéreas humanas in vitro. Sin embargo, tales

fármacos se han desaprobado en estudios clínicos, ya que son más potentes

como vasodilatadores que como broncodilatadores pudiendo inducir efectos

cardiovasculares (Barnes, 1998).

2.6. Plantas medicinales utilizadas en el tratamiento de enfermedades respiratorias El uso de la medicina complementaria y alternativa es frecuente en el

tratamiento de enfermedades respiratorias (Ziment, 2000), sobre todo en las de

tipo crónico como lo es el asma, en cuyo tratamiento destaca el empleo de

preparaciones herbales (Huntley y Ernst, 2000) que son utilizadas ampliamente

por diferentes culturas. Algunas de las plantas se han evaluado en clínica,

obteniendose resultados favorables para algunas y poco convincentes para

otras. En los Cuadros 3 y 4 se muestran algunos ejemplos de las plantas

utilizadas en el tratamiento del asma por la medicina tradicional de China e

India. En el Cuadro 5 se presentan algunos ejemplos de plantas utilizadas en

otros países. La medicina herbal para el tratamiento del asma ha tenido una

importancia histórica innegable, ya que cuatro clases de fármacos

frecuentemente utilizados para su tratamiento como son: los agonistas β2

adrenérgicos, anticolinérgicos, metilxantinas y cromonas han tenido sus

orígenes en tratamientos herbales (Huntley, 2000; Chu y Drazen, 2005), razón

por la que en la actualidad se siguen las prácticas medicas tradicionales como


20

fuente para el descubrimiento de nuevos compuestos bioactivos (Fabricant y

Farnsworth, 2001).

Planta Compuestos activos

Mecanismos de acción

Estudios clínicos /

Resultados

Referencia

Ginkgo

biloba

Ginkgolidos. Relajan el

músculo liso,

además de

actuar como

antagonistas

del factor de

activación

plaquetario.

Sí /

Mejoramiento

en la función

pulmonar

comparado con

placebo y grupo

control.

Li et al.,

1997.

Glycyrrhiza

uvale

Glicirrizina,

ácido

glicerritínico,

ácidos tánnicos,

licorice, etc.

Inhibición del

factor de

activación

plaquetario,

bloquea la

conversión

de cortisol a

cortisona.

No / ----- Bielory y

Lupoli, 1999.

Ligusticum

wallichii

No reportados. No

reportado.

Sí / Mejora de

síntomas

subjetivos.

Shao et al.,

1994.

Ephedra

sinica

Efedrina,

pseudoefedrina

y alcaloides.

Activadores

de

receptores

adrenérgicos.

Sí / Mecanismo

broncodilatador.

Graham y

Blaiss, 2000.

Cuadro 3. Plantas utilizadas en la medicina tradicional de China.


21

Planta Compuestos activos

Mecanismos de acción

Estudios clínicos /

Resultados

Referencia

Picrorrhiza

kurroa

No

reportados.

No

reportados.

Sí / No se

presentaron

cambios en los

parámetros de

función

pulmonar.

Doshi et al.,

1983.

Solanum

xanthocarpum

/ trilobatum

No

reportados.

No

reportados.

Sí / Mejora en

síntomas

subjetivos,

broncodilatación,

reducción de

edema bronquial

y de

secreciones.

Govindan et

al., 1999.

Tylophora

indica

Tylophorina. Se ha

reportado

inhibición de

anafilaxis.

Sí / Existen 5

reportes clínicos,

pero su eficacia

es inconclusa.

Huntley,

2000.

Coleus

forskohlii

Forskolina. Estimula la

enzima

adenilil

ciclasa.

Sí / Efecto

broncodilatador.

Huntley,

2000.

Cuadro 4. Plantas utilizadas en la medicina tradicional de la India.


22

Planta País Compuestos activos

Mecanismos de acción (estudios

in vitro)

Referencia

Petasites

formosanus

Taiwan s-petasina y el

s-isopetasina.

Efecto

antiespasmódico

no específico y un

efecto

antimuscarínico.

Ko et al.,

2001.

Rhamnus

nakaharai

Taiwan 3-O-

metilquercetina.

Inhibición de

fosfodiesterasas y

reducción de los

niveles de calcio.

Ko et al.,

2002.

Carum

copticum

India, Iran

y Egipto

No reportados. Anticolinérgico, y

antagonista

competitivo sobre

receptores H1.

Boskabady y

Shaikhi,

2000.

Entada

africana

Africa No reportados. Antihistamínico. Occhiuto et

al., 1999.

Clerodendrum

petasites

Tailandia Hispidulina. No descrito. Hazekamp et

al., 2001.

Hydrastis

canadensis

Estados

Unidos

de

América

Berberina, β-

hidrastina,

canadina y

canadalina.

Activación de

receptores

adrenérgicos y

adenosínicos e

inhibición de

fosfodiesterasas.

Abdel-Haq et

al., 2000.

Cuadro 5. Plantas utilizadas en la medicina tradicional de diferentes países.


23

2.7. Plantas medicinales utilizadas en el tratamiento de enfermedades respiratorias en México

En nuestro país, la medicina tradicional tiene un amplio uso para el tratamiento

de los padecimientos respiratorios ya que es una práctica común preparar

infusiones o decocciones herbales, entre las cuáles destaca el uso de Allium

sativum (ajo), Argemone (chicalote), Bouganvillea glabra (bugambilia),

Crescentia alata (cirian), Cunila lythrifolia (poleo de campo), Eucalyptus

globulus (eucalipto), Gnaphalium sp. (gordolobo), Gossypium hirsutum

(algodón), Mentha pulegium (poleo), Origanum vulgare (orégano), Rosmarinus

officinalis (romero), Sambucus nigra (sauco) y Thymus vulgaris (tomillo) entre

otras (Lozoya et al, 1987; Argueta y Cano, 1994).

Sin embargo, a pesar de la gran variedad de plantas utilizadas para tratar estos

padecimientos, las investigaciones científicas encaminadas a demostrar el valor

terapéutico de ellas es limitado (Rojas et al., 2001). Cabe mencionar algunos de

los estudios efectuados a plantas utilizadas en la medicina tradicional mexicana

para el tratamiento de enfermedades respiratorias los cuáles se muestran en el

Cuadro 6.


24

Planta Extracto o compuestos

activos identificados

Actividad reportada/Mecanismo propuesto

Referencia

Argemone

platyceras

Isoquercitrina

Actividad relajante en tráquea de

cobayo. Inhibe las contracciones

provocadas por carbacol y

leucotrieno D4.

Fernandez et

al., 2005.

Eucalyptus

globulus

Aceite esencial Actividad anti-inflamatoria en

ratas. Inhibe la hipersecreción de

mucinas en vías aéreas.

Lu Xiao-Qin

et al., 2004.

Galphimia

glauca

Fracciones de

acetato de etilo


cobayo. Inhibe la

broncoconstricción inducida por

leucotrieno D4.

Campos et

al., 2001.

Gnaphalium

conoideum

Extracto

metanólico


cobayo. Bloqueador parcial de

canales de Ca++.

Campos-

Bedolla et al.,

2005.

Gnaphalium

liebmannii

Extracto

hexánico


cobayo. Probable inhibición de

fosfodiesterasas.

Sánchez-

Mendoza et

al., 2007.

Thymus

vulgaris

Extracto

acuoso


cobayo. Inhibe la expresión del

mRNA de la iNOS.

Boskabady

M. H. et al.,

2006.

Cuadro 6. Plantas utilizadas en la medicina tradicional mexicana en el tratamiento de

enfermedades respiratorias.

2.8. El género Argemone

El género Argemone pertenece a la familia Papaveraceae y esta constituido por

28 especies con numerosas subespecies y variedades identificadas (Stermitz et

al., 1969). De acuerdo con Calderón (1991) son plantas herbáceas, anuales o


25

perennes con látex acuoso blanquecino o amarillento hasta anaranjado o rojizo,

erectas o ascendentes, por lo común espinosas, tallos con frecuencia muy

ramificados, hojas a menudo dispuestas tanto en roseta basal como alternas

sobre el tallo.

Hay poco más de 20 especies distribuidas en regiones templadas y tropicales

casi exclusivamente de América, aunque una de ellas, Argemone mexicana L.

ha sido introducida a muchas otras partes del mundo. En México, con

frecuencia se les denomina “chicalote”. Las especies del Valle de México con

frecuencia han sido confundidas con Argemone mexicana L. que habitan en

lugares más cálidos. Por lo que en esta misma región pueden encontrarse dos

especies: Argemone ochroleuca Sweet y Argemone platyceras Link & Otto

(Calderón, 1991).

2.8.1. Información etnomédica de Argemone ochroleuca

La especie Argemone ochroleuca es conocida con diversos nombres comunes,

entre los que se encuentran: amapola amarilla, cardo, chacalote, chicalote

amarillo, chiacalote y espinosilla. Cuenta con una gran trayectoria de uso

medicinal en México, la referencia más antigua encontrada, corresponde al

Códice Florentino del siglo XVI, que menciona que era utilizada para aliviar el

dolor de ojos al aplicar unas gotas del látex de la planta en ellos. En el siglo XX,

el Instituto Médico Nacional señaló su utilidad como: antiescabiático,

cicatrizante, contra algunas enfermedades de los ojos y contra dermatosis.

Posteriormente, Maximino Martínez citó su usos como: anticonvulsivo,

antidiarreico, antiespasmódico, antitusígeno, enfermedades articulares,

hipnótico, narcótico y analgésico.

En la actualidad, Argemone ochroleuca continúa siendo recomendada para

curar diversos padecimientos: en Puebla y Morelos se utiliza para tratar “el mal

de ojo”, que se manifiesta por tener los ojos irritados o infectados y en

Michoacán, el jugo de la planta se usa para eliminar la carnosidad de los ojos.

En problemas dermatológicos, se aplica el látex en la piel irritada, se pone un

emplasto hecho con las semillas machacadas, agregando un poco de leche


26

sobre la tiña o sarna. Para combatir el insomnio se sugiere tomar la infusión de

la planta antes de acostarse. En caso de diabetes, se prepara una decocción de

las hojas, que se toma en ayunas. Cuando hay dolor de cabeza, se recomienda

poner las hojas machacadas en las sienes. Para combatir la tos y otras

afecciones respiratorias, se recomienda tomar la infusión de la planta con

pétalos. Asimismo se menciona su uso medicinal para el tratamiento de

gingivitis, reumas, “mal de orín” y “aire malo”, sin embargo, las fuentes no

mencionan que partes de la planta son utilizadas (Argueta y Cano, 1994).

2.8.2. Estudios químicos del género Argemone y de Argemone ochroleuca

En estudios químicos del género Argemone han sido identificados diversos

alcaloides, flavonoides, compuestos fenólicos, aminoácidos, carbohidratos y

ácidos grasos (Stermitz et al., 1969; Bhardwaj et al., 1982; Saleh et al., 1987;

Fletcher et al., 1993; Chang et al., 2003). En el caso particular de la especie A.

ochroleuca se han identificado ácidos grasos (Fletcher et al., 1993) y diversos

alcaloides, tales como: sanguinarina, queleritrina, protopina, berberina,

dihidrosanguinarina, dihidroquelerithrina, α-allocriptopina, heleritrina,

queilantifolina, scouletrina, reticulina y coptisina (Haisova y Slavik, 1973; Israilov

et al., 1986; Chelombit´ko y Nazarova, 1988; Takken et al., 1993).

2.8.3. Estudios de actividad biológica del género Argemone

Han sido reportadas diversas actividades farmacológicas del género Argemone

entre las que se encuentran: anti-inflamatoria (Sukumar et al., 1984),

antimicrobiana (Zavala et al., 1997), espasmolítica en ileon de cobayo (Piacente

et al., 1997) y antiprotozoaria contra Plasmodium falciparum (Bourdy et al.,

2004). Adicionalmente, Fernandez y colaboradores publicaron que el flavonoide

isoquercitrina aislado de Argemone platyceras inhibe las contracciones

inducidas por carbacol y leucotrieno D4 en vías aéreas de cobayo (Fernandez

et al., 2005).


27

III. JUSTIFICACIÓN En la actualidad aunque existen diversos fármacos para el tratamiento de las

enfermedades obstructivas de las vías respiratorias, los tratamientos existentes

no son curativos ni son eficaces en todos los pacientes, por lo que existe

necesidad de descubrir nuevos fármacos que enriquezcan las alternativas

terapéuticas actuales y suplan, en la medida de lo posible, las limitaciones de

los medicamentos actuales. En este sentido y considerando que algunos de los

compuestos que han sido útiles en la terapia de las enfermedades respiratorias

se han obtenido de plantas medicinales, es importante considerar a esta fuente

como un sitio de búsqueda de los fármacos antes mencionados. Tal es el caso

de la planta Argemone ochroleuca Sweet cuyo estudio es motivo del presente

trabajo.


28

IV. HIPÓTESIS

La Argemone ochroleuca Sweet es una de las especies que es utilizada

ampliamente en la medicina tradicional Mexicana para el tratamiento de

padecimientos respiratorios entre los que se encuentra el asma, sin embargo no

ha sido sometida al escrutinio farmacológico para verificar sus propiedades

relajantes en el músculo liso de las vías aéreas, por lo que en primer lugar se

espera demostrar que los extractos de esta planta poseen actividad relajante en

el músculo liso de la tráquea aislada de cobayo y mediante un estudio

biodirigido se espera poder identificar al menos a un principio activo con dicha

actividad. Dado que en el género Argemone se han identificado varios

alcaloides como componentes principales, se puede esperar que la actividad

relajante sea debida a uno de esos alcaloides, para el cual, después de ser

identificado será posible proporcionar una explicación de la forma en la cual

ejerce su efecto relajante.


29

V. OBJETIVO GENERAL

Identificar al menos un principio activo relajante del músculo liso traqueal de

cobayo de la parte aérea de Argemone ochroleuca Sweet y analizar su posible

mecanismo de acción.

VI. OBJETIVOS ESPECIFICOS 1) Identificar a través del estudio biodirigido, al menos un principio activo

relajante de A. ochroleuca Sweet.

2) Determinar la participación de los canales de K+ sensibles a ATP, de los

receptores β-adrenérgicos y colinérgicos, de las enzimas guanilil ciclasa soluble

y adenilil ciclasa en el mecanismo de acción del principio activo aislado de A.

ochroleuca, en el modelo de anillos de tráquea aislada de cobayo.


30

VII. MATERIALES Y METODO 7.1. Material vegetal Las partes aéreas de Argemone ochroleuca Sweet se colectaron en

Tequesquinahuac perteneciente al municipio de Texcoco, en el Estado de

México. Una muestra de referencia se depositó en el Herbario-Hortorio Biólogo

Jorge Espinosa Salas de la Universidad Autónoma Chapingo, con el número de

registro 17559. La especie fue identificada por la M en C. Ernestina Cedillo

Portugal. Las partes aéreas de Argemone ochroleuca se secaron a la sombra a

temperatura ambiente (aproximadamente 22° C), posteriormente se

fraccionaron en un molino manual.

7.2. Preparación de los extractos

Los extractos se prepararon a partir de 5 Kg de planta seca y molida de

Argemone ochroleuca, mediante maceración a temperatura ambiente en forma

sucesiva con 30 L de hexano, 30 L de diclorometano y 30 L de metanol, por un

período de tres días con cada disolvente. Este procedimiento se repitió 2 veces

más. Después de la evaporación de los disolventes se obtuvieron 85 g de

extracto hexánico, 33 g de extracto de diclorometano y 95 g de extracto

metanólico. Como se muestra en el Esquema 5. Los extractos crudos fueron

evaluados a diferentes concentraciones (17.7-316 µg/mL), suspendidos en

agua destilada con trazas de tween 80, en el modelo de anillos aislados de

tráquea de cobayo (ver más adelante).

7.2.1. Fraccionamiento y aislamiento de berberina.

El extracto de diclorometano resultó con mayor actividad relajante en el modelo de

anillos aislados de tráquea de cobayo (ver más adelante), por lo que 32 g de

este extracto se sometieron a una separación por cromatografía en columna

empacada con silica gel (0.063-0.200 mm, 200 g) utilizando un gradiente de

hexano (1.5 L, F1), hexano/CH2Cl2 (1:1, 1.5 L; F2), CH2Cl2 (1.5 L; F3), AcOEt (1.5

L, F4) y MeOH (1.5 L, F5) (Esquema 5).


31

Esquema 5. Estudio biodirigido de Argemone ochroleuca Sweet.

Precipitó

Cristalización

Cromatografía en columna

Extracto de CH2Cl2 (32 g)

F1 1.2 g

F2 4.6 g

F3 6.2 g

F4 7.0 g

F5 13 g

F1’ F2’ F3’ F4’ F5’

Sólido amarillo

Berberina (700 mg, 0.014 %)

Extracto hexánico (85 g)

Residuo

Residuo

Extracto de MeOH (95 g)

Residuo

Planta (5 kg)


32

Las fracciones fueron evaluadas a diferentes concentraciones (17.7 - 316 µg/mL).

La fracción F5 fue la más activa, por lo cuál 10 gramos de esta fracción se

sometieron nuevamente a separación por cromatografía en columna utilizando

como eluyentes diclorometano (F1’), AcOEt (F2’), AcOEt/MeOH (95:5, F3’),

AcOEt /MeOH (4:1, F4’) y finalmente MeOH (F5’) (Esquema 5). La fracción F4’

(4.7 g) resultó con mayor actividad y dio un polvo amarillo el cuál fué purificado

con una mezcla de MeOH/CH2Cl2, obteniendo un sólido amarillo (700 mg, 0.014

%) con punto de fusión de 142 ºC (con descomposición). El sólido amarillo fue

identificado como berberina (Figura 1A) por IR, RMN y espectrometría de masas

por comparación con los datos reportados en la literatura (Blaskó et al., 1988).

Las señales características se presentan en el Cuadro 7. Adicionalmente se

obtuvieron cristales adecuados para un análisis de difracción por rayos-x, que

confirmaron inequívocamente que se trata de berberina teniendo como contraión

al ion bicarbonato (Figura 1B).

N

O

O

OCH3

OCH3

1

2

3

45

6

8

9

1011

12

13

4a

12a

8a

13a7

13b

Figura 1. Estructura de la berberina.

A B


33

Técnica Señales características

IR (KBr) νmax = 3434, 1572, 1505, 1386 cm-1.

FAB+MS m/z = 336 (100).

RMN-1H (DMSO-d6) δ = 9.80 (1H, s, H-8), 8.84 (1H, s, H-13), 8.14 (1H, d, J =

9.3 Hz, H-11), 7.98 (1H, d, J = 9.3 Hz, H-12), 7.74 (s, H-

1), 7.05 (s, H-4), 6.12 (2H, s, OCH2O ), 4.87 (2H, t, J =

5.5 Hz, H-6), 4.05 (3H, s, CH3O), 4.03 (3H, s, CH3O),

3.18 (2H, t, J = 5.5 Hz, H-5).

RMN-13C (DMSO-d6) δ = 150.7 (C-10), 150.1 (C-3), 148.0 (C-2), 145.7 (C-8),

143.9 (C-9), 137.8 (C-13a), 133.3 (C-12a), 131.0 (C-4a),

127.0 (C-11), 123.9 (C-12), 121.7 (C-8a), 120.7 (C-13b),

120.4 (C-13), 108.7 (C-4), 105.7 (C-1), 102.2 (OCH2O),

62.2 (C10-OCH3), 57.3 (C9-OCH3) 55.6 (C-6), 26.6 (C-5).

Cuadro 7. Señales características de berberina en técnicas de: IR, FAB+MS,RMN-1H

(300 MHz, DMSO-d6) y RMN-13C (75 MHz, DMSO-d6).

Los espectros de IR, RMN, espectrometría de masas y rayos-x, se muestran en el

anexo 1.

7.3. Animales Para los experimentos se utilizaron cobayos machos con un peso corporal

entre 300 y 400 g, mantenidos a temperatura ambiente con libre acceso de

alimento y agua. Los procedimientos involucrados en el cuidado y manejo de

los animales se realizaron de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana para el

Cuidado y Mantenimiento de los Animales (NOM-062-ZOO-1999)

Especificaciones Técnicas para la Producción, Cuidado y Uso de Animales de

Laboratorio.

7.4. Fármacos La acetilcolina, histamina, carbacol, KCl, propranolol, isoproterenol, forskolina,

nitroprusiato, glibenclamida, ODQ (1H-[1,2,4]-oxadiazol[4,3-a]quinoxalin-1-ona)


34

y 2’,5’-Dideoxiadenosina fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. La glibenclamida,

ODQ, 2’,5’-Dideoxiadenosina y forskolina se disolvieron primero en

dimetilsulfóxido (DMSO) y posteriormente se diluyeron en agua destilada. La

concentración final de DMSO fue menor a 0.1% y no tuvo efecto significativo en

la respuesta de la tráquea. Los fármacos restantes, fueron disueltos en agua

destilada. Los extractos y fracciones de Argemone ochroleuca Sweet, y la

berberina fueron suspendidos en agua destilada con Tween 80 al 0.5%.

7.5. Ensayos biológicos 7.5.1. Disección de la tráquea y montaje de la preparación Los animales se sacrificaron por una inyección intraperitoneal de pentobarbital

sódico (95 mg/kg). Inmediatamente se realizó la disección de la tráquea

limpiándola del tejido circundante. El órgano se mantuvo en una solución Krebs

cuya composición fue (mM): NaCl 118, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4 ⋅ 7 H2O,

NaHCO3 25.0, CaCl2 ⋅ 2H2O 2.2 y glucosa 11.0, a 37 ºC, con un pH de 7.4 y

con aeración constante con una mezcla de 95% O2 y 5% CO2. Posteriormente

se obtuvieron 8 anillos de aproximadamente 2 mm de espesor, cada uno se

colocó en una cámara para órgano aislado con 10 mL de solución Krebs. La

preparación se suspendió entre dos ganchos de alambre de acero inoxidable,

uno de los extremos se fijó a la cámara y el otro al transductor de fuerza (Grass

FT 03E) conectado a un polígrafo Biopack System. El procesamiento de datos

se realizó mediante el programa Acknowledge MP100 versión 3.5.3.

El órgano se sometió a una tensión inicial de 1.5 g y se dejó estabilizar por una

hora, realizando lavados con solución Krebs cada 15 minutos en este periodo.

A continuación, el órgano se estimuló con clorhidrato de acetilcolina 30 µM dos

veces a intervalos de treinta minutos. Después de cada estimulación los

órganos se lavaron tres veces con solución Krebs. Posteriormente se permitió

que la preparación se equilibrara media hora antes de la realización de los

experimentos.


35

7.5.2. Evaluación del efecto relajante de los extractos, fracciones de Argemone ochroleuca y/o berberina Para evaluar el efecto relajante, el tejido se precontrajo con carbacol 3 µM

dejando en contacto al fármaco con el tejido hasta alcanzar una meseta de

contracción (aproximadamente 6 minutos). Una vez en la meseta se aplicaron

los extractos (17.7, 31.6, 56.2, 100, 177 y 316 µg/mL) o fracciones (17.7, 31.6,

56.2, 100, 177 y 316 µg/mL) de Argemone ochroleuca y/o berberina [26 (10

µg/mL), 47 (17.7 µg/mL), 84 (31.6 µg/mL), 151(56.2 µg/mL), 268 (100 µg/mL) y

476 (177 µg/mL) µM] en forma acumulativa (en experimentos independientes).

El control, consistió en la aplicación de Tween 80 al 0.5% disuelto en agua

destilada. El efecto relajante de los extractos crudos, fracciones y berberina

fueron expresados como CE50.

7.5.3. Evaluación del efecto del extracto de diclorometano, isoproterenol o berberina en tejidos pre-contraídos con diferentes agonistas Para determinar si el extracto de diclorometano y berberina relajaban los tejidos

precontraidos con diferentes agonistas, se aplicó carbacol (3 µM), histamina (30

µM) o KCl (30 mM) en experimentos independientes. Una vez alcanzada la

meseta se construyeron las curvas acumulativas concentración-respuesta. El

extracto de diclorometano se evaluó a las concentraciones de 17.7, 31.6, 56.2,

100, 177, 316 y 562 µg/mL, y la berberina a las concentraciones de 26, 47, 84,

151, 268 y 476 µM. Como fármaco de referencia se utilizó el isoproterenol (10-

10- 1 x 10-6 M). Los controles consistieron en aplicación de Tween 80 al 0.5%

en agua destilada.

7.5.4. Evaluación de la participación de receptores β-adrenérgicos, canales de K+

ATP, adenilil ciclasa y guanilil ciclasa soluble en el efecto relajante de berberina Las preparaciones fueron precontraidas con carbacol (3 µM), una vez

alcanzada la meseta se incubaron con propranolol (3 µM), glibenclamida (10

µM), 2’,5’-dideoxiadenosina (10 µM), ODQ (10 µM) o vehículo (en experimentos


36

independientes) durante 5 minutos, posteriormente se aplicó berberina en

forma acumulativa a las mismas concentraciones empleadas en la evaluación

del efecto relajante.

En la determinación de la participación de los receptores β-adrenérgicos, los

vehículos consistieron en la aplicación de agua destilada y para los demás

experimentos se aplicó como vehículo: DMSO disuelto en agua destilada a los

mismos volúmenes que se utilizaron para la preparación de las concentraciones

de los fármacos (glibenclamida, 2’,5’-dideoxiadenosina y ODQ). Adicionalmente

se obtuvieron datos de la actividad de controles, a los cuáles se les adicionó

una mezcla de Tween 80 al 0.5% en agua destilada, similar a la utilizada en la

preparación de las concentraciones de berberina.

7.5.5. Evaluación del efecto de berberina en la respuesta relajante de isoproterenol, forskolina y nitroprusiato Las preparaciones se precontrajeron con carbacol (3 µM), una vez alcanzada la

meseta se incubaron por 5 minutos con berberina (151, 268 y 476 µM) o

vehículo, posteriormente se construyeron las curvas concentración-respuesta

relajante de isoproterenol (10-10–3.16 x 10-6 M), forskolina (10-8-10-6 M) y

nitroprusiato de sodio (10-10-10-5 M) en experimentos independientes. El

vehículo consistió en la aplicación de Tween 80 al 0.5% en agua destilada. 7.5.6. Evaluación del efecto de berberina o bromuro de ipratropio en la respuesta contráctil de carbacol Primero se obtuvieron curvas acumulativas concentración-respuesta de

carbacol (10-10 - 10-2 M), para obtener el efecto contráctil máximo. En un

segundo experimento, se incubó el tejido (durante 15 minutos) con berberina

(151, 268 y 476 µM), bromuro de ipratropio (1.77x10-9, 3.16x10-9, 5.62x10-9,

1x10-8 M) o el vehículo, y posteriormente se obtuvieron nuevamente curvas

acumulativas contráctiles de carbacol. Las diferentes concentraciones se

aplicaron en experimentos independientes. Los vehículos consistieron en la

aplicación de Tween 80 al 0.5% de agua destilada para los experimentos con


37

berberina y aplicación de agua destilada en los experimentos con bromuro de

ipratropio. El efecto antagonista de berberina e ipratropio fue expresado como

valores de pA2.

VIII. ESTADÍSTICA Los valores de CE50 fueron calculados por el método de regresión lineal

(Tallarida, 2000). Los datos se presentan como la media ± el error estándar de

la media. Las diferencias entre dos determinaciones se analizaron con una

prueba t de Student no pareada. Las diferencias entre varias determinaciones

se realizaron utilizando un análisis de varianza de una vía (ANADEVA), seguida

de la prueba de Dunnett. Se consideraron diferencias estadísticamente

significativas para un valor de p < 0.05. El valor de pA2 fue calculado de

acuerdo con la ecuación de Schild: log (A’/A-1) = log B-logKB, donde A es la

CE50 de carbacol en ausencia del antagonista, A’ es la CE50 de carbacol en

presencia del antagonista; KB es la constante de afinidad para el antagonista y

B es la concentración (M) del antagonista. El valor de pA2 es la abscisa al

origen cuando A’/A = 2 (Tallarida, 2000).


38

IX. RESULTADOS En la Gráfica 1, se muestran los resultados obtenidos al aplicar concentraciones

crecientes de los extractos de hexano, diclorometano y metanol de las partes

aéreas de Argemone ochroleuca, en anillos de tráquea aislada de cobayo

previamente contraídos con carbacol (3 µM). Se aprecia que los tres extractos

produjeron una relajación dependiente de la concentración. Sus valores de

máxima relajación fueron: 59.13 ± 4.86, 95.12 ± 3.56 y 31.87 ± 3.76%

respectivamente, considerando como 100% la contracción máxima obtenida

con carbacol. El extracto de diclorometano fue el más potente, presentando

una CE50= 78.029 ± 2.15 µg/mL; 1.892 ± 0.33 log [µg/mL].

Dado que el extracto de diclorometano fue el más activo, posteriormente se

evaluó su capacidad de relajar las precontracciones inducidas con carbacol,

histamina y KCl, en dichos experimentos se encontró una mayor potencia

relajante sobre las precontracciones inducidas con carbacol ( 3 µM, CE50=

78.029 ± 2.15 µg/mL; 1.892 ± 0.33 log [µg/mL] ) en comparación a las inducidas

con histamina ( 30 µM, CE50= 262.14 ± 56.47 µg/mL; 2.418 ± 1.75 log [µg/mL] )

y fue incapaz de relajar las precontracciones inducidas con KCl (30 mM), como

se aprecia en las Gráficas 2A, B y C, respectivamente. Como fármaco de

referencia se utilizó isoproterenol, el cuál, relajó la precontracción inducida por

los tres agentes contráctiles: carbacol, histamina y KCl. Los resultados de las

evaluaciones se presentan en las Gráficas 3A, B y C, respectivamente.


39

Extractos Log [µg/mL]

1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6

Con

trac

ción

(%)

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 1. Efecto relajante de los extractos obtenidos con ▲ hexano, diclorometano

y metanol de A. ochroleuca (17.7-316 µg/mL) o vehículo en anillos aislados de

tráquea de cobayo precontraídos con carbacol (3 µM). Cada punto representa el

promedio ± EEM de seis observaciones.


40

Extracto de diclorometano Log [µg/mL]

1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120


1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120


1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 2. Efecto relajante del extracto obtenido con diclorometano de A. ochroleuca

( ,17.7-562 µg/mL) o vehículos ( ,▲, ) en anillos de tráquea aislada de cobayo

precontraídos con carbacol (A, 3 µM), histamina (B, 30 µM) y KCl (C, 30 mM). Cada

punto representa el promedio ± EEM de seis observaciones.

BA

C


41

Isoproterenol Log [M]

-9 -8 -7 -6

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120


-9 -8 -7 -6C

ontr

acci

ón (%

)

-20

0

20

40

60

80

100

120


-9 -8 -7 -6

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 3. Efecto relajante de isoproterenol ( ,10-10 a 10-6 M) o vehículos ( ,▲ , )

en anillos de tráquea aislada de cobayo precontraídos con carbacol (A, 3 µM),

histamina (B, 30 µM) o KCl (C, 30 mM). Cada punto representa el promedio ± EEM de

seis observaciones.

A

B

C

B


42

A continuación, se prosiguió con el estudio biodirigido del extracto de

diclorometano, de A. ochroleuca. Mediante un fraccionamiento por

cromatografía en columna, se encontraron dos fracciones activas: la fracción de

AcOEt (F4. Esquema 5; CE50= 143.9 ± 7.3 µg/mL; 2.158 ± 0.86 log [µg/mL] ) y

la fracción de MeOH (F5, Esquema 5; CE50= 110.2 ± 5.8 µg/mL; 2.042 ± 0.76

log [µg/mL] ) que presentaron un efecto relajante máximo similar, pero de

diferente potencia. Debido a que la fracción de metanol fue más potente, se

continuó con ella el estudio biodirigido (Gráfica 4).

En el segundo fraccionamiento por cromatografía en columna, la fracción eluida

con una mezcla de AcOEt/ MeOH (4:1), mostró mayor actividad relajante ( F4’,

Esquema 5; CE50= 56.00 ± 4.15 µg/mL; 1.748 ± 0.62 log [µg/mL]). El principal

componente de esta fracción, precipitó a partir de una mezcla de MeOH/CH2Cl2

(1:1), obteniéndose 700 mg de un sólido amarillo. El compuesto presentó un

punto de fusión de 142 °C con descomposición, y fue identificado como

berberina (Figura 1) por comparación con los datos reportados en la literatura

(Blaskó, et al., 1988). Adicionalmente se obtuvieron cristales adecuados que

permitieron un análisis por rayos x, en los que se identificó al contraión como

bicarbonato. Los espectros correspondientes se presentan en el Anexo 1.

Una vez identificada la berberina como uno de los compuestos responsables de la

actividad relajante de Argemone ochroleuca, se procedió a determinar su efecto

relajante en tejidos precontraídos con diferentes agonistas. Y solamente se

encontró relajación de los tejidos precontraídos con carbacol (Gráfica 5A) no así

en los estimulados con histamina (Gráfica 5B) o KCl (Gráfica 5C).


43

Extractos Log [µg/mL]

1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6

Con

trac

ción

(%)

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 4. Efecto relajante de las fracciones obtenidas de la percolación del extracto de

diclorometano de A. ochroleuca (17.7-316 µg/mL): Fracción-hexano, Fracción

hexano/CH2Cl2, Fracción CH2Cl2, Fracción AcOEt, Fracción-metanol o

vehículo en anillos de tráquea aislada de cobayo precontraidos con carbacol (3 µM).

Cada punto representa el promedio ± EEM de seis observaciones.


44

Berberina Log [M]

-4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -3.6 -3.4

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Berberina Log [M]

-4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -3.6 -3.4C

ontr

acci

ón (%

)-20

0

20

40

60

80

100

120

Berberina Log [M]

-4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -3.6 -3.4

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 5. Efecto relajante de berberina ( 26-476 µM) o vehículos ( ,▲, ) en

anillos de tráquea aislada de cobayo precontraídos con carbacol (A,3 µM), histamina

(B,30 µM) y KCl (C,30 mM). Cada punto representa el promedio ± EEM de seis

observaciones.

A B

C


45

Con la finalidad de aportar información acerca del mecanismo de acción relajante

de berberina, y determinar si su efecto relajante se debe a que actúa a través

de la activación de receptores β-adrenérgicos, se aplicaron concentraciones

crecientes de berberina (26, 47, 84, 151, 268 y 476 µM) o isoproterenol (3.16 x

10-10 – 10-6M) antes y después de exponer las preparaciones al bloqueador β-

adrenérgico: propranolol (3 µM). Se puede observar que tanto la berberina

(Gráfica 6A), como el isoproterenol (Gráfica 6B) produjeron relajación traqueal

dependiente de la concentración y que el efecto relajante de isoproterenol pero no

el de berberina se inhibió por la presencia de propranol.

Por otro lado, para determinar la participación de los canales de K+ sensibles a

ATP, se realizaron curvas de relajación concentración-respuesta de berberina,

en ausencia y en presencia de un bloqueador de dichos canales: glibenclamida

(10 µM). En la Gráfica 7, se muestran comparativamente los resultados, en ellos

se puede apreciar que la glibenclamida no modificó el efecto relajante de

berberina.


46

Berberina Log [M]

-4.8 -4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -3.6 -3.4

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120


-9 -8 -7 -6

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 6. Efecto relajante de berberina A ( 26-476µM) e isoproterenol B ( 3.16 x

10-10 – 10-6 M) en anillos aislados de tráquea de cobayo, en ausencia y en presencia de

propranolol ( 3 x 10-6 M). El efecto del vehículo se incluye en cada gráfica. Cada


A

B


47

Berberina Log [M]

-4.8 -4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -3.6 -3.4

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 7. Efecto relajante de berberina en anillos aislados de tráquea de cobayo, en

ausencia ( 26-476µM) y en presencia de glibenclamida ( 10 µM). También se

representa el efecto del vehículo . Cada punto representa el promedio ± EEM de

seis observaciones.


48

Para determinar la participación de la enzima guanilil ciclasa soluble en su

mecanismo de acción, se aplicaron concentraciones crecientes de berberina (26,

47, 84, 151, 268 y 476 µM) o nitroprusiato (10-10-10-5 M) antes y después de

exponer las preparaciones con un inhibidor: el ODQ (10 mM). No se encontró

diferencia en las curvas concentración-respuesta de berberina, como se puede

apreciar en la Gráfica 8A, en cambio, el efecto relajante del fármaco de referencia

utilizado: nitroprusiato si se inhibió tal como se esperaba (Gráfica 8B).

Con respecto al involucramiento de la enzima adenilil ciclasa, se utilizó un

inhibidor: la 2’,5’-dideoxiadenosina (10 µM), que inhibió de manera parcial las

curvas concentración-respuesta de berberina (26, 47, 84, 151, 268 y 476 µM) y

las del fármaco de referencia: forskolina (10-8-1.77 x 10-6 M), como se puede

apreciar en las Gráficas 9A y 9B respectivamente. Los valores de CE50

resultaron estadisticamente significativos respecto a su control y se muestran

en el Cuadro 8.


49

Berberina Log [M]

-4.8 -4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -3.6 -3.4

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Nitroprusiato Log [M]

-10 -9 -8 -7 -6 -5

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 8. Efecto relajante de berberina A ( 26-476 µM) y Nitroprusiato B ( 10-10-10-

5 M) en anillos aislados de tráquea de cobayo, en ausencia o en presencia de ODQ (

10 µM). El efecto del vehículo se incluye en cada gráfica. Cada punto representa el

promedio ± EEM de seis observaciones.

A

B


50

Berberina Log [M]

-4.8 -4.6 -4.4 -4.2 -4.0 -3.8 -3.6 -3.4 -3.2

Con

trac

ción

(%)

0

20

40

60

80

100

120

Forskolina Log [M]

-8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5

Con

trac

ción

(%)

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 9. Efecto relajante de berberina A ( 26-476 µM) y forskolina B ( 10-8-1.77 x

10-6 M) en anillos aislados de tráquea de cobayo, en ausencia y en presencia de 2’,5’-

Dideoxyadenosina ( 10 µM). El efecto del vehículo se incluye en cada gráfica.


A

B


51

Cuadro 8. Valores de CE50 presentados como la media ± EEM (µM; Log M) de

berberina y forskolina en ausencia y presencia de 2’,5’-Dideoxiadenosina. La diferencia

significativa fue obtenida por una prueba de t *p = 0.011, **p ≤ 0.001.

2’,5’-Dideoxiade-

nosina (µM)

Berberina CE50

(µM; Log M)

Forskolina CE50

(µM; Log M)

0 118.50 ± 3.91 ; -3.92 ± -5.40 0.262 ± 0.045 ; -6.58 ± -7.33

10 194.88 ± 76.05* ; -3.71 ± -4.12 0.947 ± 0.121** ; -6.02 ± -6.92

En las evaluaciones enfocadas a determinar el efecto de berberina a las

concentraciones de 151, 268 y 476 µM, sobre la acción relajante de

isoproterenol (10-10 - 3.16 x 10-6 M), forskolina (10-8 - 10-6 M) y nitroprusiato de

sodio (10-10 - 10-5 M), se encontró que produce un desplazamiento hacia la

izquierda de las curvas acumulativas concentración-respuesta de los agonistas

en forma dependiente de la concentración (Gráficas 10,11 y 12,

respectivamente) reduciendo significativamente los valores de CE50 respecto al

control, como se puede apreciar en el Cuadro 9.


52


-10 -9 -8 -7 -6 -5

Con

trac

ción

(%)

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 10. Efecto relajante de isoproterenol en anillos aislados de tráquea de

cobayo, en ausencia y presencia de berberina (▲151 µM, 268 µM y 476 µM).



53

Forskolina Log [M]

-8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5

Con

trac

ción

(%)

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 11. Efecto relajante de forskolina en anillos aislados de tráquea de cobayo,

en ausencia y en presencia de berberina (▲151 µM, 268 µM, y 476 µM). Cada



54

Nitroprusiato Log [M]

-10 -9 -8 -7 -6 -5

Con

trac

ción

(%)

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 12. Efecto relajante de nitroprusiato en anillos aislados de tráquea de

cobayo, en ausencia y en presencia de berberina (▲151 µM, 268 µM, y 476 µM).



55

Cuadro 9. Valores de CE50 presentados como la media ± EEM (µM; Log M), de

isoproterenol, forskolina y nitroprusiato en ausencia y presencia de berberina. La

diferencia significativa fue obtenida por una ANADEVA seguida de la prueba de

Dunnett *p<0.05 respecto al control.

Berberina(µM)

Isoproterenol CE50

(µM; Log M)

Forskolina CE50

(µM; Log M)

Nitroprusiato CE50

(µM; Log M)

0

0.064 ± 0.0069 ;

-7.2 ± -8.2

0.219 ± 0.018 ;

-6.6 ± -7.7

0.816 ± 0.149 ;

-6 ± -6.8

151

0.0081 ± 0.0036* ;

-8.1 ± -8.4

0.038 ± 0.0038* ;

-7.4 ± -8.4

0.014 ± 0.0043* ;

-7.8 ± -8.4

268

0.0027 ± 0.0003* ;

-8.6 ± -9.5

0.017 ± 0.0082* ;

-7.8 ± -8.0

0.0086 ± 0.0022* ;

-8.1 ± -8.6

476

0.0009 ± 0.0002* ;

-9.0 ± -9.7

0.0117 ± 0.0028* ;

-7.9 ± -8.5

0.0019 ± 0.0007* ;

-8.7 ± -9.1

En los experimentos encaminados a demostrar si berberina (151, 268 y 476

µM) antagoniza la respuesta contráctil de carbacol, se observó que produce un

desplazamiento paralelo hacia la derecha de las curvas concentración–

respuesta de carbacol, comportándose como un antagonista de tipo competitivo

(Gráfica 13A). Presentando un valor de pA2 de 3.87 ± 0.045 (Gráfica 13B). Los

valores de CE50, se muestran en el Cuadro 10.

En tanto que el bromuro de ipratropio (1.77x10-9, 3.16x10-9, 5.62x10-9 y 1x10-8

M) utilizado como fármaco de referencia, produjo de igual forma un

desplazamiento hacia la derecha en las curvas concentración-respuesta de

carbacol a medida que se incrementaba su concentración (Gráfica 14A). Los

valores de CE50, se muestran en el Cuadro 11. No obstante el efecto

antagonista del ipratropio, es más potente que el producido por berberina como


56

lo indica el valor de su pA2 de 9.05 ± 0.057 (Gráfica 14B). Igualmente el efecto

relajante fue más potente que el provocado por berberina (Gráfica 15).


carbacol en ausencia y presencia de berberina. La diferencia significativa fue obtenida

por una ANADEVA seguida de la prueba de Dunnett *p<0.05 respecto al control.

Berberina(µM)

Carbacol CE50

(µM; Log M)

0

0.10 ± 0.01 ; -7 ± -7.8

151

0.34 ± 0.099 ; -6.5 ± -7.0

268

2.18 ± 0.388 ; -5.7 ± -6.4

476

55.9 ± 13.6* ; -4.2 ± -4.9


57

Carbacol Log [M]

-10 -8 -6 -4 -2 0

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

Berberina -Log[M]

3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9

Log

((A

'/A) -

1)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

a = 18.410b = -4.745r ² = 0.985pA2 = 3.879 +/- 0.045

Gráfica 13. Efecto inhibitorio de berberina A (▲151 µM, 268 µM, 476 µM) sobre

la respuesta contráctil de carbacol O, en anillos aislados de tráquea de cobayo. Cada

punto representa el promedio ± EEM de seis observaciones. Gráfico de Schild (B)

para la obtención del pA2.

A

B


58

Carbacol Log [M]

-10 -8 -6 -4 -2

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Ipratropio -Log[M]

7.8 8.0 8.2 8.4 8.6 8.8

Log

((A

'/A) -

1)

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

a = 17.291b = -1.91r ² = 0.988pA2 = 9.054 +/- 0.057

Gráfica 14. Efecto inhibitorio de ipratropio A (▲1.77x10-9 M, 3.16x10-9 M, 5.62x10-

9 M, 1x10-8 M) sobre la respuesta contráctil de carbacol O en anillos aislados de

tráquea de cobayo. Cada punto representa el promedio ± EEM de seis observaciones.

Gráfico de Schild (B) para la obtención del pA2.

A

B


59


carbacol en ausencia y presencia de ipratropio. La diferencia significativa fue obtenida

por una ANADEVA seguida de la prueba de Dunnett *p<0.05 respecto al control.

Ipratropio (M)

Carbacol CE50

(µM; Log M)

0

0.16 ± 0.018 ; -6.77± -7.72

1.77 x 10-9

0.87 ± 0.19 ; -6.0 ± -6.71

3.16 x 10-9

1.68 ± 0.33 ; -5.77 ± -6.47

5.62 x 10-9

6.4 ± 1.24 * ; -5.19 ± -5.91

1 x 10-8

17 ± 5.39 * ; -4.75 ± -5.27


60

Log [M]

-8 -6 -4 -2

Con

trac

ción

(%)

-20

0

20

40

60

80

100

120

Gráfica 15. Efecto relajante de ipratropio ( 1x10-9 – 1.77x10-8 M) y berberina ( 26-

476 µM) en anillos aislados de tráquea de cobayo. Cada punto representa el promedio

± EEM de seis observaciones.


61

X. DISCUSIÓN Los resultados de este estudio muestran que Argemone ochroleuca Sweet

produce un efecto relajante en el músculo liso de tráquea aislada de cobayo, lo

que sustenta farmacológicamente su amplio uso en la medicina tradicional

Mexicana en el tratamiento de padecimientos respiratorios. Ya que como se

puede apreciar en la Gráfica 1, los tres extractos preparados con las partes

aéreas de la planta relajaron las preparaciones traqueales. El extracto obtenido

con diclorometano presentó mayor actividad respecto a los obtenidos con

metanol y hexano. Por lo tanto, se seleccionó a el extracto de diclorometano

para ser sometido a un fraccionamiento con la finalidad de aislar un compuesto

activo, que permitió identificar dos fracciones activas, una obtenida con AcOEt

y otra con MeOH, ambas presentaron un efecto de relajación máxima similar,

pero la fracción de metanol fue más potente (CE50= 143.9 ± 7.3 µg/mL vs CE50=

110.2 ± 5.8 µg/mL) lo cuál sugiere que el efecto relajante del extracto de

diclorometano se debe a la participación de más de un compuesto, no obstante,

dado que la fracción de metanol fue la más potente (Gráfica 4), se continuó con

ella el segundo fraccionamiento, el cuál permitió la identificación del alcaloide

berberina, como uno de los principios activos relajantes de esta planta.

La presencia de berberina como constituyente de Argemone ochroleuca y de

otras especies de Argemone, ha sido reportada con anterioridad (Haisova et al.,

1973; Israilov et al., 1986; Chelombit’ko y Nazarova, 1988; Takken et al., 1993).

Pero por primera vez, se reconoce su papel en el efecto relajante de Argemone

ochroleuca, ya que en la especie Argemone platycera la actividad fue atribuida

a el flavonoide isoquercitrina (Fernandez et al., 2005).

La berberina es el constituyente principal de diversas plantas, como son:

Hydrastis canadensis (goldenseal), Coptis chinensis (huanglian) Cortex

phellodendri (Huangbai), Rhizoma coptidis (Huanglian) y diversas especies

Berberidaceae. Estas plantas medicinales son utilizadas en la India y en China

en el tratamiento de diarrea, desordenes gastrointestinales, infecciones

respiratorias, constipación y arritmias cardiacas, también se incluyen en

preparaciones herbales como remedio antipirético, contra el paludismo y para


62

tratar la giardiasis (Jahnke et al., 2006; Zhu y Qian, 2006). En Bulgaria las

especies de Berberidaceae, se emplean para tratar padecimientos reumáticos

y desordenes inflamatorios crónicos (Zhu y Qian, 2006). En los Estados Unidos

de América, Hydrastis canadensis es una de las plantas más populares para

tratar la gripe (Abdel-Haq et al., 2000). Además de poder encontrar a la

berberina en diversas plantas medicinales, también puede ser producida

sintéticamente y en la actualidad se encuentra presente en diversos tes y en

suplementos dietéticos comerciales (Jahnke et al., 2006).

Se han descrito diversos efectos farmacológicos para la berberina, entre los que

se encuentran: Actividad analgésica (Yesilada y Küpeli, 2002), antitumoral

(Iizuka et al., 2003), ansiolítica (Peng et al., 2004), hipocolesterolemiante (Kong

et al., 2004; Abidi et al., 2005; Brusq et al., 2006), anti-inflamatoria (Huang et al.,

2002), antioxidante (Shirwaikar et al., 2006), hipoglucemiante (Leng et al., 2004;

Ko et al., 2005; Ko et al., 2005), inhibición de la enzima acetilcolinesterasa (Kim

et al., 2004; Cho et al., 2006; Ingkaninan et al., 2006), utilidad para prevenir la

arterosclerosis (Cho et al., 2005; Liang et al., 2006), relajante en: aorta aislada

de cobayo (Bova et al., 1992), en tejido de corpus cavernoso de conejo (Chiou

et al., 1998) y en arterias aorta y mesentérica de rata (Ko, et al., 2000).

Adicionalmente Abdel-Haq y col.(2000), han reportado que la berberina ejerce

un efecto relajante en músculo liso de tráquea de cobayo, encontrando que su

efecto no se modifica por timolol (β-bloqueador), o por un congénere de

xantin-amina (antagonista de adenosina). En el presente trabajo, las curvas

concentración respuesta de berberina no se modificaron por la presencia de

propranolol (3 µM), un β-bloqueador, (Gráfica 6A) lo cuál sugiere que su

mecanismo de acción relajante no es a través de la activación de los β-

adrenoreceptores, resultado similar a lo reportado por Abdel-Haq y col.(2000).

Aunque berberina desplazó a la izquierda las curvas concentración-respuesta

de isoproterenol (Gráfica 10) reduciendo los valores de CE50 (Cuadro 9), se

descarta considerar la activación de los β- receptores, ya que como se

mencionó anteriormente el efecto de berberina no se antagonizó por dos

antagonistas de los receptores β: timolol (Abdel-Haq et al., 2000) y propranolol


63

en este estudio. Este incremento en la relajación de isoproterenol, plantea la

posibilidad de otro mecanismo relajante diferente a la activación de receptores

β-adrenérgicos.

Considerando lo anterior, se procedió a explorar otras posibilidades. Se sabe

que en el músculo liso de vías aéreas, el mecanismo de relajación involucra la

apertura de canales de K+ATP (Thirstrup et al., 1997). Se ha descrito que

berberina produce un efecto hipoglucemiante y un efecto benéfico sobre

arritmias isquémicas, atribuido por algunos autores a la acción inhibidora sobre

los canales de K+ATP, en células β (Hua y Wang, 1994; Ko et al., 2005) y en

miocitos cardiacos (Wang et al., 1996) respectivamente. Pero también se ha

reportado una acción vasorrelajante en arteria mesentérica de rata, en la cuál

los canales de K+ATP no participan (Ko et al., 2000). Para determinar su

involucramiento en el músculo liso traqueal se realizaron curvas concentración-

respuesta relajante de berberina en ausencia y en presencia (Gráfica 7) de

glibenclamida (10 µM), en las cuales no se observó modificación alguna, lo que

sugiere un mecanismo relajante diferente a la apertura de dichos canales.

El Oxido nítrico, presenta muchos efectos sobre las funciones de las vías

aéreas en condiciones fisiológicas o patológicas entre las que se encuentran el

ejercer un efecto vasodilatador bronquial, presentar un efecto inmunoprotector,

estimular la secreción de moco y la formación de radicales libres. (Fischer et al.,

2002; Hamad et al., 2003). Varios compuestos liberadores de óxido nítrico,

como el nitroprusiato de sodio, o el óxido nítrico endógeno, activan a la enzima

guanilil ciclasa soluble (sGC) incrementando a su vez la concentración de

GMPc, con la subsecuente relajación de las vías aéreas del músculo liso (Hall,

2000). Dentro de las actividades farmacológicas atribuidas a berberina, se

encuentra la acción vasorrelajante y respecto a su mecanismo de acción,

algunos autores mencionan el involucramiento de la liberación de óxido nítrico

(Chiou et al., 1998; Ko et al., 2000). En el presente trabajo berberina produjo un

desplazamiento hacia la izquierda de las curvas concentración-respuesta de

nitroprusiato (Gráfica 12) y redujo significativamente los valores de CE50

(Cuadro 9). No obstante, el efecto relajante de berberina no fue inhibido por el


64

pretratamiento con ODQ, un inhibidor de la sGC (Gráfica 8A). Estos resultados

sugieren, que la relajación inducida con berberina no es a través de la

activación de la vía sGC/GMPc.

En la exploración de via de la adenilil ciclasa/AMPc en el mecanismo de acción

relajante de berberina, se encontró un desplazamiento hacia la izquierda de las

curvas concentración-respuesta de forskolina, un activador de adenilil ciclasa

(Seamon et al., 1983), con reducción significativa de los valores de CE50

(Gráfica 11, Cuadro 9). Además en presencia de un inhibidor de adenilil ciclasa:

2’,5’-dideoxiadenosina (Sabouni et al., 1991), el efecto relajante de berberina se

redujo significativamente (Gráfica 9A, Cuadro 8). Estos experimentos sugieren

que en el mecanismo de acción de berberina esta implicada la vía de

estimulación de la enzima adenilil ciclasa.

Por otra parte, berberina relajó solamente la precontracción inducida con

carbacol y no las inducidas con histamina y KCl (Gráfica 5A, B, C). En cambio el

extracto de diclorometano, relajo las precontracciones inducidas con carbacol, e

histamina y fue incapaz de relajar a KCl (Gráficas 2A, B y C). Estos resultados

indican participación de receptores colinérgicos en el efecto relajante tanto del

extracto de diclorometano como en el de berberina. Además, es sugerente de

que el efecto observado en la Gráfica 9A, implica la estimulación de la enzima

adenilil ciclasa, y probablemente tenga una relación con los receptores

muscarínicos, pués de lo contrario se hubiera esperado un efecto relajante de

berberina sobre las precontracciones provocadas tanto con histamina como con

KCl.

Considerando estos resultados, se determinó el efecto anticolinérgico de la

berberina, utilizando como fármaco de referencia a ipratropio, un antagonista de

los receptores muscarínicos, con uso clínico en el tratamiento del asma y las

enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (Eglen et al., 1999). En estos

experimentos la berberina produjo un desplazamiento hacia la derecha de las

curvas concentración-respuesta de carbacol de manera competitiva (Gráfica 13

A) con un valor de pA2 = 3.87 ± 0.045 (Gráfica 13 B). El efecto antagonista de


65

la berberina fue considerablemente menor en comparación con el efecto

antagonista de ipratropio el cuál presentó un valor de pA2 de 9.05 ± 0.057

(Gráfica 14 B). Asimismo el efecto relajante de ipratropio fue mucho mayor que

el efecto relajante de la berberina (Gráfica 15). Estos experimentos apoyan el

planteamiento de la acción de la berberina sobre receptores muscarínicos.

Se ha establecido que la estimulación de los receptores muscarínicos M3,

median la contracción del músculo liso, sin embargo del 50 al 80% de los

receptores muscarínicos de las vías aéreas son del tipo M2, cuya función no es

totalmente clara. La estimulación de los receptores M2 en MLA, inhibe la

activación de la enzima adenilil ciclasa, resultando en una disminución de la

concentración de AMPc (Fryer and Jacoby, 1998). Por otra parte, otros estudios

proporcionan evidencia del papel contráctil de los receptores M2 cuando los

receptores M3 están bloqueados (Ehlert, 2003; Walker et al., 2004) pero

también se ha sugerido que la estimulación prolongada de los receptores

muscarínicos M2 sensibilizan a la enzima adenilil ciclasa. De acuerdo con lo

anterior los receptores M2 pueden desempeñar dos papeles: a corto plazo

inducen una inhibición de la enzima adenilil ciclasa y a largo plazo, medían una

regulación a la alta de la expresión de la enzima adenilil ciclasa, contrarestando

con ello, la acción contráctil ocasionada por agonistas M3 (Hall, 2000; Michal et

al., 2001; Mistry et al., 2005). Los resultados obtenidos en el presente estudio

plantean que la berberina podría estar actuando como antagonista de los

receptores M3, pero quizá también esté implicada su acción activadora sobre

los receptores M2, planteamiento basado en los resultados presentados en la

Gráfica 9A. En el 2001, Lee y col., plantean que el fármaco antimuscarínico

ideal, para el tratamiento del asma y de las EPOC, debería inhibir la

broncoconstricción y disminuir la secreción de moco al antagonizar a los

receptores M1 y M3, pero no a los M2, pues la inhibición de ellos lleva a un

incremento en la liberación de acetilcolina. De tal forma, los fármacos

anticolinérgicos futuros deberían proteger o incrementar la función o expresión

de los receptores M2, y al mismo tiempo disminuir la secreción de moco y la


66

broncoconstricción a través del bloqueo de los receptores M1 y M3. Los

resultados obtenidos proporcionan un punto de partida para la identificación de

los subtipos de receptores muscarínicos implicados en el efecto relajante de la

berberina.

En lo relativo a la acción de la berberina sobre receptores muscarínicos, Tsai y

Ochillo en 1991, señalaron que en íleo aislado de cobayo, a bajas

concentraciones se comporta como un antagonista competitivo y a altas

concentraciones como un antagonista no competitivo de la acción de

acetilcolina, sin embargo, Piacente y col., en el 1997 reportaron un incremento

en la contracción inducida por acetilcolina utilizando concentraciones de

berberina, a las cuáles de acuerdo a Tsai y Ochillo (1991), se comportaría como

antagonista competitivo. Mientras que Kim et al., (2004); Cho et al., (2006) e

Ingkaninan et al., (2006), indican que la berberina inhibe a la enzima

acetilcolinesterasa en modelos in vitro. En el 2000 Ko y col., ya habían

reportado ciertas discordancias en los mecanismos de acción propuestos para

berberina en determinados tejidos, debidas probablemente al uso de diferentes

preparaciones biológicas y/o distintas especies.

Dada la gran cantidad de actividades biológicas descritas para berberina se ha

planteado la posibilidad de ser un fármaco prometedor para el tratamiento de:

diabetes, hiperlipidemia, enfermedades cardiacas e inflamatorias crónicas, y

asimismo podría tener un beneficio en la enfermedad de Alzheimer (Zhu y

Quian, 2006).

Pero no se menciona nada respecto a su utilidad en enfermedades

respiratorias, y relativo a su potencial en estos padecimientos se tiene un

estudio realizado por Lee et al., (2003), donde la berberina incrementó la

liberación de mucina por acción directa sobre las células de goblet, y se plantea

la posibilidad de utilizarla como expectorante ligero en enfermedades

respiratorias, finalmente, Kim et al., (2003), describen que la administración in

vivo de berberina induce la producción de interleucina (IL-12) en macrófagos, e

in vitro lleva a la inhibición del perfil de citocinas del tipo Th2 (disminuye la IL-4

e incrementa la producción del interferon-γ) esta respuesta es importante y


67

sugiere la utilidad de berberina o plantas medicinales que contienen berberina

en el tratamiento del asma alérgica (Kim et al., 2003).

De esta forma la identificación de berberina como principio activo en A.

ochroleuca puede relacionarse con el uso tradicional que le da la población

mexicana en el tratamiento de enfermedades respiratorias, y se realiza un

aporte adicional al uso potencial de berberina para el tratamiento de

enfermedades respiratorias, como es el asma.


68

XI. CONCLUSIONES Las conclusiones que se desprenden del presente trabajo son:

A través de un estudio biodirigido se identificó al alcaloide berberina

como uno de los compuestos responsables de la actividad relajante de

Argemone ochroleuca Sweet. Se demuestra que berberina actúa como un antagonista competitivo de

los receptores muscarínicos, además de ejercer una activación parcial de

la enzima adenilil ciclasa.

Se observó que berberina potencía el efecto relajante de isoproterenol,

forskolina y nitroprusiato de sodio.

Se descarta la activación de receptores β-adrenérgicos, de canales de

K+ATP, y de guanilil ciclasa soluble en el efecto relajante de berberina.


69

XII. PERSPECTIVAS

1.- Identificar los subtipos de receptores muscarínicos implicados en el efecto

relajante de berberina.

2.- Evaluar el efecto de Argemone ochroleuca Sweet y de berberina en un

modelo de asma.

3.- Identificar él o los compuestos responsables de la actividad relajante de la

fracción de AcOEt obtenida del primer fraccionamiento del extracto de

diclorometano.

4.- Explorar los mecanismos de acción relajante del o los compuestos aislados

de la fracción anterior.


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81

XIV. ANEXOS

Espectro 1. Espectro de infrarrojo de bicarbonato de berberina.

82

Espectro 2. Espectro de RMN de 1H (300 MHz, DMSO-d6) de bicarbonato de berberina.

N

O

O

OCH3

OCH3

123

4 56

8

9

1011

12

13

13a

13b

4a

8a

12a

83

Espectro 3. Espectro de RMN de 13C (125 MHz, DMSO-d6) de bicarbonato de berberina.

N

O

O

OCH3

OCH3

123

4 56

8

9

1011

12

13

13a

13b

4a

8a

12a

84

Espectro 4. Espectro de masas, FAB+ MS de bicarbonato de berberina.

85

Resultados del análisis de difracción por rayos-x de berberina.

Identification code berberine bicarbonate

Empirical formula C21 H19 N O7

Formula weight 397.38

Temperature 293(2) K

Wavelength 0.71073 A

Crystal system, space group monoclinic, P21/n

Unit cell dimensions a = 7.0340(18) A alpha = 90 deg.b = 15.760(2) A beta = 100.185(12) deg.c = 16.295(2) A gamma = 90 deg.

Volume 1777.9(6) A^3

Z, Calculated density 4, 1.346 Mg/m^3

Absorption coefficient 0.096 mm^-1 F(000) 772

Crystal size 0.40 x 0.38 x 0.38 mm

Theta range for data collection 2.54 to 27.47 deg.

Limiting indices 0<=h<=7, -18<=k<=18, -19<=l<=19

Reflections collected / unique 7171 / 3638 [R(int) = 0.0398]

Completeness to theta = 27.47 89.2 %

Refinement method Full-matrix least-squares on F^2

Data / restraints / parameters 2052 / 0 / 300

Goodness-of-fit on F^2 0.998

Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0488, wR2 = 0.1149

R indices (all data) R1 = 0.1068, wR2 = 0.1398

Largest diff. peak and hole 0.226 and -0.200 e.A^-3

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