定序上常見之 trouble shooting~

PART I

• Too much template DNA

• Too little DNA template

• Chemical contaminant

• DNA contamination

Sample preparation:

Signal intensity: G(13694), A(13557), T(12394), C(11252)

原因 : 在 PCR 過程中 ,template 濃度過高所造成

特徵 : 分析軟體顯示一般 G intensity 皆大於 (10000) 以上

Eletrophorgram 之圖示會有很強之 background 影響到 major band 之判讀

解決方式 : 直接將上機之樣品重新以 HiDi formamide 稀釋後再重跑即可

Too much template DNA

Ave signal intensity:G(101),A(69),T(76),C(71)

原因 : 在 PCR 過程中 ,template 濃度過低所造成特徵 : 分析軟體顯示一般 G intensity 皆小於 (300) 以下 Eletrophorgram 之圖示會發現序列讀到 600bps 後因 DNA 不足導致 background 會拉高且序列讀不長解決方式 : 重新再一次 PCR, 增加反應中 DNA 的 template

Too little DNA template

Signal intensity: G(427), A(302), T(216), C(247)

原因 : 在 PCR 過程中 ,因樣品本身製備過程不當或是遭到污染 例如 :鹽類 ,蛋白質 ,清潔劑或是其他抑制劑污染，進而影響到 PCR 的過程

特徵 : Eletrophorgram 之圖示會有很強之 background 影響到 major band 之判讀 且序列通常都讀不長 解決方式 : 直接將樣品重新純化後再重新做定序反應

•Chemical contaminant

處理前

處理後

原因 : 在點菌過程中挑菌污染 , 挑到 two clone

特徵 :Eletrophorgram 之圖示會發現一般前 60-70bps 序列是非常 sharp 但是之後的序列會有很強的兩個 peak 重疊且訊號也不低

解決方式 : 重新挑菌抽 plasmid 定序

DNA contamination

定序上常見之 trouble shooting~PART II

定序報告常見之 Eletrophogram~• No signal

• Signal noise

• Excess dye peaks

•Secondary structure

• N-1, N-2, N-3... Priming Sequencing Trace

原因 :(1) PCR 反應失誤 (2) Clone 失敗 (3) primer 錯誤

特徵 :Eletrophorgram 之圖示無訊號 (No signal)

解決方式 (1) 重新做定序反應排除人為失誤因素 (2) 建議重新 clone

Signal intensity: G(32), A(37), T(40), C(34)No signal

• Signal noise Signal intensity: G(44), A(46), T(49), C(48)

原因 :(1)PCR 反應過程中 DNA 濃度不足

(2)PCR 反應人為操作失誤

(3)primer 合成效率不佳 = (PCR 過程中 primer Tm 過低 ) = (primer 品質變差 ) (4)DNA 品質不佳 (degraded)

特徵 :Eletrophorgram 之圖示會發現訊號微弱 且雜亂 ,定序讀不長 signal intensity lower ，導致 free big dye 殘留 解決方式 : (1) 重新反應調整 DNA 濃度並排除人為 操作失誤 (2)check primer quality and Tm 值 調整 PCR annealing Tm (3)Run Gel check DNA quality 重新純化或製備樣品

• Noise data through sequence, with good signal strength

原因 :multiple primer binding area

特徵 (1)Eletrophorgram 之圖示會發現有兩個訊號幾乎等高之 peak (2)sinal intensity high (3) 序列一開始即很雜亂， two peak overlapping 解決方式 :更換 primer

T7(+): 5-`TTA TAC GAC TCA CTA TAG G-3` T7(-)=5`-att atg ctg agt gat atc c-3`

第一次定序結果 Primer: T7

第二次定序結果 Primer: M13F

範例 (1):

第一次定序結果 Primer: T7

第二次定序結果 Primer: M13F

=發現有兩個 T7 binding 位點

範例 (2):

Excess dye peaks

原因 :(1)PCR 反應中 DNA 濃度過低 (2) 酒精沉澱不完全，有 ddNTP 螢光殘留

特徵 :Eletrophorgram 之圖示在 70-80bp 及 110-120bp 有很強 signal , 影響 major peak

的判讀 解決方式 :(1)重新 PCR, 調整 DNA 濃度 (2) 酒精沉澱步驟確實

Secondary structure

原因 :DNA self-ligation 或是形成 hair pin /loop structure

特徵 :Eletrophorgram 之圖示會發現訊號從二級結構位點開始訊號突然低下且雜亂

解決方式 :調整反應試劑或是反應之條件

Secondary Structure 範例 (1)使用一般 PCR 條件之定序結果

更改之條件如下 ~Denature temperature: 98

Denature time : 3 min

Buffer : DMSO

Dye : B5

Ta ： 55

調整 PCR 條件之定序結果

Secondary structure 範例 (2)~

原因 :連續 GCA rich 導致 PCR 過程中 Polymerase shift, 因而影響後面序列之判讀

特徵 : Eletrophorgram 之圖示會發現訊號從 GA rich 後開始訊號突然變低且雜亂

解決方式 :調整使用可解除二級結構之反應試劑或是反應之條件

Secondary structure 範例 (3)~

原因 :連續 poly A or T 有可能形成 hair pin structure 導致 PCR 過程中 primer binding mismatch 因而影響後面序列之判讀

特徵 :Eletrophorgram 之圖示會發現訊號從 poly A/T 後開始訊號突然低下且雜亂

解決方式 : (1) 建議更換另一端 primer (2)調整使用可解除二級結構之試劑或是反應之條件

原因 : primer 品質不佳 ,有 N-1 情形

特徵 :Eletrophorgram 之圖示會發現 major band peak 下會有 miner peak 而且 miner peak 可與後一個 base 相對應。

解決方式 :重新合成 primer

•N-1, N-2, N-3... Priming Sequencing Trace

• Noise up to or after a specific point in the sequence

inserction

Point mutation (SNP=single nucleotide polymorphism)

其他 ~

Clogged capillary array 所造成

Capillary has bubble 所造成

原因 :毛細管中有雜質或氣泡影響 DNA migration

特徵 : Eletrophorgram 之圖示會不隨機出現，再不特定的位置產生雜訊干擾結果

解決方式 : 重新更換位置重跑一次