PETUNJUK PRAKTIKUMBIOKIMIA II

Oleh :Tim Biokimia

LABORATORIUM BIOKIMIAJURUSAN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGIUNIVERSITAS ISLAM MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG

2017

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT. yang telah melimpahkan rahmat,

taufiq dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penyusunan Diktat

petunjuk Praktikum Biokimia. Diktat ini disusun untuk mempermudah proses

penyelenggaraan kegiatan Praktikum Biokimia II. Tujuan umum dari praktikum ini adalah

untuk memberikan bekal kemampuan bagi mahasiswa dalam rangka persiapan

pelaksanaan penelitian tugas akhir. Sedangkan tujuan khusus adalah pengaplikasian

teori biokimia yang sudah diperoleh mahasiswa di bangku kuliah.

Laboratorium Biokimia berusaha untuk mengatasi segala kesulitan yang

dihadapi pada saat persiapan dan pelaksanaan Praktikum biokimia. Persiapan ini

meliputi pembekalan atau breafing asisten dan praktikan. Diktat petunjuk praktikum ini

masih terdapat kekurangan di sana sini, untuk itu kritik dan saran yang bersifat

konstruktif selalu kami harapkan demi lebih sempurnanya diktat petunjuk praktikum

selanjutnya. Akhir kata, kami mengucapkan selamat bekerja dan mencoba. Semoga

diktat ini dapat memberikan manfaat bagi kita semua, Amin.

Malang, Februari 2017

Penulis

2

DAFTAR ISI

Kata Pengantar................................................................................................3

Daftar Isi........................................................................................................ ...4

Percobaan 1 Uji Aktivitas Enzim Amilase.......................................................5

Percobaan 2 Uji Aktivitas Enzim Proteolitik....................................................9

Percobaan 3 Uji Aktivitas Enzim Lipase.......................................................10

Percobaan 4 Uji Aktivitas Enzim Katalase....................................................16

Percobaan 5 Elektroforesis SDS PAGE.......................................................20

Percobaan 6 Uji Amilase dalam air Liur...................................................... 25

Percobaan 7 Pemeriksaan Glukosa dan Protein pada Urine ….…………. .28

Lampiran........................................................................................................ 32

3

PERCOBAAN IUJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE

A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk melakukan deteksi bakteri penghasil amilase secara

kualitatif dan menguji aktivitas enzimnya.

B. Dasar Teori Amilase merupakan enzim pendegradasi pati. Enzim ini mendegradasi dengan

cara memutuskan ikatan glikosidik pada pati. Produk yang dihasilkan dapat berupa

oligosakarida rantai pendek, glukosa, maltose dan maltriosa. Amilase banyak terdapat

pada mikroorganisme, tanaman dan hewan. Enzim ini dapat dengan mudah diisolasi dari

bakteri seperti Bacillus subtilis dan jamur seperti Aspergillus oryzae. Amilase adalah

kompleks enzim yang terdiri dari tiga jenis enzim yaitu α-amilase, β-amilase, dan

glukoamilase.

Aktivitas amilase dapat ditentukan baik secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis

amilase secara kualitatif dapat dilakukan dengan penambahan larutan iodin. Sedangkan

analisis secara kuantitatif dilakukan dengan metode dinitrosalisilat (DNS). Metode ini

didasarkan pada kemampuan enzim menghidrolisis substrat (polisakarida) menjadi

monosakarida dalam bentuk gula reduksi. Adanya aktivitas amilase ditunjukkan dengan

interaksi produk (gula reduksi) dan DNS untuk menghasilkan warna oranye hingga merah

kecoklatan. Satu unit enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan 1 μmoL

produk (gula reduksi) per menit. Sebagaimana sifat enzim pada umumnya, akivitas enzim

amilase dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain konsentrasi substrat, pH, suhu, dan

kofaktor.

4

C. Alat dan Bahan Alat

Gelas beker Erlenmeyer Tabung reaksi Pipet tetes Cawan petri Shaker incubator Pipet ukur Spektrofotometer Bola hisap Neraca analitik

Bahan Larutan iodin Larutan bufer pH 4, 5 dan 6 Kapas Reagen DNS (asam 3,5-dinitrosalisilat) Media starch agar KNa-Tatrat 40% Pati terlarut 1% Akuades Media cair

D. Cara Kerja

1. Deteksi produksi amilase secara kualitatifIsolat bakteri digoreskan pada media starch agar yang telah ditentukan dan

diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Larutan iodin ditambahkan pada koloni

bakteri. Koloni yang mampu menghasilkan amilase akan membentuk zona bening di

sekitar biakan. Amati perubahan warna yang terjadi.

2. Ekstraksi enzim amilaseBakteri diambil sebanyak 1 ose dan masukkan ke dalam 25 mL media cair. Kultur

bakteri diinkubasi pada shaker incubator selama 18 jam pada suhu 37 °C. Kultur

disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Filtrat yang diperoleh

merupakan ekstrak kasar amilase.

3. Uji aktivitas amilase

5

Penentuan aktivitas amilase dilakukan secara kuantitatif dengan metode DNS.

Filtrat sebanyak 1 mL dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian, ditambahkan 1 mL

pati terlarut (telah dilarutkan dalam pH 4, 5, 6). Mulut tabung ditutup dengan aluminium

foil. Tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Setelah itu, tambahkan

1 mL DNS dan kocok menggunakan vortex. Tabung reaksi dipanaskan dalam air

mendidih selama 15 menit hingga larutan berwarna merah kecoklatan. Selanjutnya,

ditambahkan 1 mL larutan KNa-Tatrat 40%. Tabung reaksi didinginkan, ditambahkan

aquades hingga volumenya menjadi 10 mL dan dihomogenkan. Larutan sampel diukur

absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.

Aktivitas enzim amilse dapat dihitung menggunakan rumus berikut.

Dimana, AE adalah aktivitas enzim (U/mL), C adalah konsentrasi glukosa, BM adalah

berat molekul glukosa, 180 gr/mol, t adalah waktu inkubasi (menit), H adalah volume total

enzim substrat (mL), dan E adalah volume enzim (mL).

4. Pembuatan Kurva Standar Glukosa Larutan glukosa dibuat dengan berbagai konsentrasi yaitu 0, 200, 400, 600, 800

dan 1000 ppm. Diambil 1 mL larutan glukosa dengan berbagai konsentrasi dan

masukkan dalam tabung reaksi. Kemudian, ditambahkan 1 mL DNS dan dihomogenkan.

Mulut tabung reaksi ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan dalam dari mendidih

selam 15 menit hingga larutan berwarna merah kecoklatan. Setelah itu, tambahkan 1 mL

KNa-Tatrat 40%. Tabung reaksi didinginkan, ditambah akuades hingga volumenya

menjadi 10 mL dan dihomogenkan. Larutan sampel diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 540 nm menggunakan spektofotometer.

Daftar Pustaka6

Aiyer, P.V. (2005): Amylases and Their Applications, Afr. J. Biotechnol., 4, 1525-1529.

Miller, G. L. (1959): Use of Dinitrosalicyclic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar, Anal. Chem., 31, 426-428.

Sauza, P.M., dan Magalhaes, P.O. (2010): Application of Microbal α-Amylase in Industry– A Review, Brazilian J. Microbiol., 41, 850-861.

7

PERCOBAAN IIUJI AKTIVITAS ENZIM PROTEOLITIK

A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas enzim proteolitik (papain).

B. Dasar teoriEnzim proteolitik merupakan kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk

menghidrolisis ikatan peptida. Enzim ini juga disebut sebagai peptidase, protease atau

proteinase. Protease terdapat pada semua makhluk hidup seperti manusia, hewan,

tanaman, dan mikroba (bakteri, jamur dan virus). Berdasarkan mekanisme kerjanya,

protease dapat dibagi menjadi exopeptidase dan endopeptidase. Exopeptidase

mengkatalisis proses hidrolisis ikatan peptide pada ujung rantai, sedangkan

endopeptidase menghidrolisis ikatan peptide pada tengah rantai.

Gambar 1 Hidrolisis enzim endopeptidase

Papain adalah salah satu enzim protease yang berperan aktif dalam proses hidrolisis

ikatan peptida. Enzim ini banyak ditemukan pada seluruh bagian pohon pepaya yang

meliputi daun, buah, getah dan akarnya. Papain merupakan enzim sederhana yang

terdiri dari 212 asam amino dengan 4 ikatan disulfide. Papain banyak digunakan

diberbagai bidang industri terutama industri farmasi.

C. Alat dan Bahan Alat

8

Waterbath Gelas beker 250 mL Buret Pipet volume 10 mL Neraca analitik Pengaduk Erlenmeyer Pipet tetes Gelas ukur 50 ml Blender Corong Penyangga + statif Bola hisap Neraca analitik

Bahan Buah pepaya muda Akuades Susu skim 5% Indikator pp Formaldehida NaOH 0,1 N Kertas saring

D. Cara Kerja1. Ekstraksi enzim papain

Lima puluh gram buah pepaya dipotong kecil-kecil ditambahkan 100 mL akuades.

Setelah itu, dihaluskan menggunakan blender dan diambil filtratnya. Filtrat yang diperoleh

merupakan ekstrak kasar enzim papain. Filtrat dibuat tiga konsentrasi yang berbeda yaitu

20%. 30% dan 40%.

2. Uji Aktivias Enzim PapainSusu skim 5% dimasukkan ke dalam empat erlenmeyer (E1, E2, E3 dan E4) yang

masing-masing berisi 40 mL larutan. Kemudian, tiga buah erlenmeyer (E1, E2, E3)

dimasukkan dalam waterbath pada suhu 37 °C selama 10 menit, sedangkan erlenmeyer

sisa (E4) dibiarkan pada suhu ruang. Ketiga erlenmeyer (E1, E2 dan E3) masing-masing

ditambahkan 10 mL ekstrak kasar enzim papain, sedangkan erlenmeyer sisa (E4)

ditambahkan 10 mL akuades. Semua erlenmeyer diinkubasi pada suhu 37 C selama 1

jam dan ditambah 2 mL formaldehida. Kemudian, ditambahkan 3 tetes indikator pp dan

dititrasi menggunakan NaOH 0,1 N.

Aktivitas enzim dapat ditentukan menggunakan persamaan berikut.

9

Dimana, ts adalah titrasi sampel, tb = titrasi blanko (E4), berat sampel adalah berat susu

skim dalam gram, Fp adalah faktor pengenceran.

Daftar PustakaAmri, E., dan Mamboya, F. (2012): Papain, a Plant Enzyme of Biological Importance: A Review, American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 8(2), 99-104.

Hitesh, P., Manjobhai, B., Mayuri, B., Ashvinkumar, D., dan kiraben, D. (2012): Extraction and Application of Papain Enzyme on Degradation of Drug, Research Article Pharmaceutical Sciences, 2(3), 113-115.

Jisha, N.V., Smitha, R.B., Pradep, S., Sreedevi, S., Unni, K.N., Sajith, S., Priji, P., Josh, M.S., dan Benjamin, S. (2013): Versatility of Microbial Proteases, Advances in Enzyme Research, 1 (3), 39-51.

Macalood, J.S., Vicente, H.J., Boniao, R.D., Gorospe, J.G., dan Roa, E.C. (2013): Chemical Analysis of Carica papaya L. Crude Latex. American Journal of Plant Science, 4, 1941-1948.

Motyan, J.A., Toth, F., dan Tozser, J. (2013) Research Applications of Proteolytic Enzymes in Molecular Biology, Biomolecules, 3, 923-942.

10

PERCOBAAN IIIUJI AKTIVITAS ENZIM LIPASE

A. Tujuan percobaanPercobaan ini bertujuan untuk menentukan aktivitas lipase dari dedak padi dan kacang

tanah.

B. Dasar teoriLipase (triacylglycerol acylhydrolase) termasuk dalam keluarga hydrolase. Lipase

mengkatalisis hidrolisis trigliserida menjadi gliserol dan asam lemak bebas. Produk hasil

hidrolisis yang lain adalah monogliserida dan digliserida. Enzim ini larut dalam air dan

menghidrolisis substrat yang tidak larut menjadi produk yang lebih polar. Enzim lipase

diproduksi oleh tanaman, hewan dan mikroorganisme. Lipase banyak diaplikasikan di

berbagai bidang industri, seperti industri makanan, deterjen, kertas, dan kosmetik. Reaksi

hidrolisis trigliserida oleh lipase adalah sebagai berikut.

Penelitian lipases telah banyak dilakukan dari berbagai sumber. Beberapa sumber

lipase diantaranya dedak padi dan kacang tanah. Lipase dari kacang tanah banyak

tersimpan dalam biji selama masa perkecambahan, sedangkan lipase pada padi banyak

terdistribusi pada kulit padi (dedak).

C. Alat dan Bahan

11

Alat Corong Pipet volume 10 mL Magnetik stirer Bola hisap Sentrifugasi Gelas ukur 50 ml Mortar Gelas beker 250 ml Waterbath Buret Erlenmeyer 100 mL Pengaduk Neraca analitik Pipet tetes Inkubator Shaker incubator

Bahan Dedak padi Akuades Kacang tanah Etano Susu sapi segar Indikator pp Petroleum eter NaOH 0,1 N Bufer fosfat 50 mM pH 7 Kertas saring Bufer fosfat 50 mM pH 6,5

D. Cara Kerja 1. Ekstraksi enzim lipase dari dedak padi

Sebanyak 5 gr dedak padi ditambah 25 mL petroleum eter dan diaduk-aduk untuk

melarutkan lemak. Saring campuran tersebut dan ambil bagian ampasnya. Ampas yang

diperoleh ditambah dengan 20 mL bufer fosfat 50 mM pH 7. Campuran tersebut dishaker selama 30 menit. Selanjutnya, disaring campuran tersebut dan disentrifugasi pada

kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak

kasar enzim lipase.

2. Ekstraksi enzim lipase dari kacang tanahKacang tanah sebanyak 2,5 gram dihaluskan menggunakan mortar. Kemudian,

ditambahkan dengan 25 mL petroleum eter sambil diaduk-aduk. Campuran tersebut

disaring dan diambil bagian residu (ampas). Residu ditambahkan 25 mL bufer fosfat 0,1

M pH 6,5. Campuran tersebut diaduk menggunakan shaker selama 10 menit, disaring

12

dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Filtrat yang diperoleh

merupakan ekstrak kasar enzim lipase.

3. Uji aktivitas enzim lipaseSusu sapi segar dipanaskan suhu 100 oC selama 10 menit. Susu hasil pemanasan

diambil sebanyak 4 mL dan dimasukkan dalam erlenmeyer dan diseimbangkan suhu air

dalam waterbath 37 oC. Sampel ditambahkan 1 mL ekstrak kasar enzim dan diinkubasi

pada suhu 37 oC selama 30 menit. Setelah itu, ditambahkan 20 mL etanol.

Blanko dibuat dengan mengambil 4 mL susu hasil pemanasan ditambah 2 mL

bufer fosfat (pH disesuaikan dengan sampel). Setelah itu, ditambah 20 mL etanol tanpa

dilakukan proses inkubasi. Masing-masing sampel dan blanko ditambah 2 tetes indikator

pp dan dititrasi menggunakan NaOH 0,1 N hingga berubah warna menjadi merah muda.

Aktivitas enzim dinyatakan dalam µmoL/menit mL enzim atau Unit/mL. Adapun

penentuan aktivitas enzim dilakukan menggunakan persamaan berikut.

Dimana, ts adalah volume titrasi sample, tb adalah volume titrasi blanko, t adalah waktu

inkubasi (menit). Angka 1000 merupakan hasil dari konversi 1 mmol menjadi 1000 μmol.

Daftar Pustaka

13

Bhardwaj, K., Raju, A., dasn Rajaseharan, R. (2001): Identifikasi, purification, and characterization of a thermally stable lipase from Rice bran. A New member of the (Phospho) Lipase Family, Plant Physiology, 127, 1728-1738.

Huang, A.H., dan Moreau, R.A. (1978): Lipases in the storage tissues of peanut and other oil seeds during germination, Planta, 141(1), 111-116.

Lason, E., dan Ogonowski, J. (2010): Lipase - Characterization, applications and methods of immobilization, CHEMIK 2010, 64(2), 97-102.

Sharma, M.K. (2011): Aqueous Two phase extraction - of Lipase from Rice Bran, Advance in Applied Science Research, 2(2), 265-271.

Sharma, R., Chisti, Y., dan Banerjee, U.C. (2001): Production, purification, characterization and applications of lipases, Biotechnology Advances, 19, 627-662.

Thakur, S. (2012): Lipase, Its Sources, Properties and Applications: A Review, International Journal of Scientific & Engineering Research, 3(7), 1-29.

Tseng, C.G. (2005): Characterization of Rice Bran Lipase and Its Application, Journal of Engineering Technology and Education, 2(4), 413-426.

14

PERCOBAAN IVUJI AKTIVITAS ENZIM KATALASE

A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas enzim katalase secara kualitatif.

B. Dasar Teori Katalase adalah enzim yang memiliki kemampuan sebagai antioksidan karena

enzim ini dapat mendegradasi hidrogen peroksida (H2O2). Enzim ini terdapat pada

peroksisom sel mamalia, seperti manusia dan hewan. Selain itu, enzim katalase dapat

diisolasi dari tanman dan mikroorganisme seperti bakteiri dan jamur. Di dalam makhluk

hidup, katalase dapat menguraikan zat-zat oksidatif yang berbahaya seperti fenol, asam

format, alkohol dan H2O2. Hidrogen peroksida merupakan produk yang biasa dihasilkan

dari metobelisme sel. Enzim katalase bertanggung jawab untuk mempercepat

pemecahan hidrogen peroksida menjadi air (H2O) dan oksigen (O2). Reaksi kimia yang

ditunjukkan dalam persamaan berikut.

2 H2O2 2 H2O + O2

Saat ini beberapa metode penentuan aktivitas katalase baik kualitatif maupun

kuantitatif sudah banyak dilakukan. Salah satu metode kualitatif yang paling sederhana

dalam menentukan keberadaan katalase pada kultur bakteri adalah dengan

menggunakan H2O2. Senyawa ini akan dipecah menjadi gelembung O2 oleh katalase.

Identifikasi adanya enzim katalase didasarkan pada terbentuknya gelembung oksigen

pada waktu reaksi terjadi.

15

katalase

C. Alat dan bahan Alat

Tabung reaksi Kaki tiga + kasa Rak tabung reaksi Pembakar spiritus Gelas ukur 10 mL Pipet Tetes Gelas beker 50 mL Pipet volume 1 mL Gelas beker 250 mL Hole punch Bola hisap Stopwatch Kaca lengkung Pipa karet

Bahan Ekstrak hati Ekstrak kunyit Ekstrak jantung Ekstrak daun pepaya Kultur bakteri/jamur Kertas saring H2O2 3% Es batu Akuades NaOH 1 M HCl 1 M

D. Cara Kerja1. Uji aktivitas katalase dengan kertas saring

Kertas saring direndam dalam kultur bakteri selama 2 menit. Kemudian, kertas

saring diambil dan ditempatkan pada bagian dasar gelas beker yang berisi 25 mL larutan

H2O2 3%. Amati dan hitung waktu ketika kertas saring mulai naik ke permukaan larutan.

Ulangi perlakuan diatas sebanyak 3 kali. Ulangi langkah diatas pada sampel A, B , dan

C.

Keterangan: Larutan A (1:4) = campuran 5 mL larutan H2O2 3% dan 20 mL air

Larutan B (1:9) = campuran 2,5 mL larutan H2O2 3% dan 22.5 mL air

Larutan C (1:49) = campuran 0,5 mL larutan H2O2 3% dan 24.5 mL air

Tabel 1. Aktivitas katalase dengan kertas saring

Sampel Waktu yang diperlukan kertas saring naik ke permukaan gelas (s)1 2 3 Rata-rata

16

H2O2 3% (kontrol)A (1:4)B (1:9)C (1:49)

Buat grafik antara konsentrasi pada sumbu x dan waktu pada sumbu y.

2. Uji aktivitas katalase terhadap berbagai kondisiSiapkan dua buah tabung reaksi dan dimasukkan masing-masing 10 mL akuades.

Pada tabung 1 ditambahkan 1 mL akuades. Tabung ini akan digunakan sebagai kontrol.

Pada tabung 2 ditambahkan 1 mL ekstrak hati. Setelah itu, rangkai alat seperti pada

gambar berikut.

Larutan H2O2 3% sebanyak 2 mL ditambahkan ke dalam kedua tabung reaksi dan

sesegera mungkin ditutup. Biarkan selama 3 menit sambil dihitung jumlah gelembung

yang terbentuk. Ulangi perlakuan diatas sebanyak 2 kali.

Ulangi langkah diatas pada sampel lain dengan berbagai kondisi berbeda.

Pada kondisi asam : sampel + 3 tetes HCl 1 M

Pada kondisi basa: sampel + 3 tetes NaOH 1 M

Pada kondisi suhu rendah: sampel direndam dalam air es

17

Pada kondisi suhu tinggi: sampel direndam dalam air mendidih

No. Jenis Ekstrak + H2O2

Jumlah gelembung

pH netral Kondisi asam

Kondisi basa

Kondisi suhu rendah

Kondisi suhu tinggi

1. Ekstrak Hati2. Ekstrak Jantung3. Ekstrak Daun Pepaya4. Ekstrak Kunyit

Tabel 2. Uji aktivitas katalase terhadap berbagai kondisi

Daftar PustakaAlfonso-Prieto, M., Biarnes, X., Vidossich, P., dan Rovira, C. (2009): The Molecular Mechanism of the Catalase Reaction, J. Am. Chem. Soc., 131(33), 11751-11761.

Anonim (2016): Investigating the effects of temperature on enzyme activity, http://www.mayfieldschools.org. Diakses tanggal 16 Februari 2016.

Iwase, T., Tajima, A., Sugimoto, S., Okuda, K., Hironaka, I., Kamata, Y., Takada, K dan Mizunoe, Y. (2013): A Simple Assay for Measuring Catalase Activity: A Visual Approach, Scientific Reports, 3, 3081-3084.

Scibior, D., dan Czeczot, H. (2006): Catalase: Structure, Properties, Functions, Postepy Hig Med Dosw, 60, 170-180.

St. Rosemary Educational Institution. "Factors Affecting the Activity of Catalase and Amylase Lab Answers." http://schoolworkhelper.net/. St. Rosemary Educational Institution, Last Update: 2016. Web. Diakses pada: Rabu 16 Februari 2016. http://schoolworkhelper.net/factors-affecting-the-activity-of-catalase-and-amylase-lab-answers/.

18

PERCOBAAN VELEKTROFORESIS SDS PAGE

A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk mengetahui karakterisasi protein dari kecambah

menggunakan SDS PAGE (Sodium Dedocyl Sulphate Polyacrilamide Gel

Electrophoresis)

B. Dasar Teori Elektroforesis adalah teknik untuk memisahkan molekul yang memiliki muatan

listrik pada sebuah matriks (misalnya gel) menggunakan medan listrik

sebagai tenaga penggerak molekulnya. Untuk elektroforesis protein, ada beberapa teknik

yang digunakan, yaitu proteinnya yang dibuat terdenaturasi (SDS PAGE) atau tidak

(NATIVE PAGE).

Pada teknik SDS-PAGE, proteinnya dibuat terdenaturasi (dengan menambahkan

larutan SDS) sehingga bermuatan negatif, protein tersebut bergerak dari negatif ke positif

dan kecepatan pergerakannya hanya dipengaruhi oleh ukuran molekul. Protein yang

terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan

berat molekul protein tersebut (Dunn,1989). Denaturasi protein dilakukan dengan

merebus sampel dalam buffer yang mengandung β-merkaptoetanol (berfungsi untuk

mereduksi ikatan disulfide), gliserol dan SDS (Wilson dan Walker,2000). Muatan

asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang teikat sehingga

kompleks protein-SDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang konstan.

(Hames, 1987).

Sampel-sampel enzim yang diinjeksikan ke dalam sumur gel diberi warna

dengan bromphenol biru yang dapat terionisasi. Fungsi pewarna adalah untuk

membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat molekul protein dapat diketahui

dengan membandingkan Rf protein dengan protein standar yang berat molekulnya

telah diketahui (Wilson dan Walker,2000).19

Pada teknik yang native, pergerakan molekul protein selain dipengaruhi oleh faktor

ukuran, juga oleh besarnya muatan molekul. NATIVE PAGE digunakan untuk

mempelajari konformasi, self-asosiasi atau agregasi, dan pengikatan protein oleh

senyawa lain.

C. Alat dan bahan Alat

Seperangkat alat elektroforesis vertikal Mikropipet Penangas air Gelas beker 250 mL Pipet ukur 10 mL Pipet ukur 5 mL Sentrifuge Vortex Blender

Bahan Kecambah UGB Metanol p.a. TEMED Kloroform APS 10% Etanol 95% RSB Aquabidest Running buffer T-akrilamid 30% Marker LGB Larutan staining Kertas saring Larutan destaining

D. Cara Kerja3. Isolasi Protein dari Kecambah

Kecambah ditimbang sebanyak 10 gram dan ditambahkan dengan 100 mL

aquabidest kemudian diblender. Hasilnya diambil 7 mL kemudian di sentrifuge dan

diambil bagian supernatan sebanyak 5 mL. Supernatan tersebut ditambahkan 4 mL 20

etanol, 2 mL kloroform, dan 3 mL aquabidest kemudian divortex. Setelah itu disentrifuge

dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Dari hasil sentrifugasi tersebut, lapisan

atas dibuang sedangkan lapisan bawah ditambah dengan 3 mL methanol kemudian di

vortex kembali. Larutan disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit.

Hasilnya, supernatan dibuang dan endapan ditambahkan dengan etanol ±3 mL dan siap

untuk diuji.

4. Uji Kualitatif Protein Hasil Isolasi dengan SDS PAGE1. Disiapkan dan dijepitkan 2 plate kaca elektroforesis pada penjepit elektroforesis

2. Dicek kebocoran plate dengan cara mengaliri air perlahan-lahan pada plate

3. Dibuat larutan separating gel 12% dengan ketentuan :

a. Dipipet dan dimasukkan 1700 µL dH2O

b. Dipipet dan dimasukkan 2000 µL T-acrylamid 30%

c. Dipipet dan dimasukkan 1300 µL LGB

d. Divortex ketiga komposisi diatas ± 5 menit

e. Dipipet dan dimasukkan 70 µL APS (dibuat dalam keadaan fresh),

(APS 10% dibuat dengan cara 10 mg APS dilarutkan dalam 100 µL ddH2O)

f. Divortex keempat komposisi diatas ± 5 menit

g. Dipipet dan dimasukkan 7 µL TEMED

h. Divortex kelima komposisi diatas ± 5 menit

i. Dimasukkan separating gel dalam plate dan ditunggu hingga mengeras

4. Dibuat larutan stacking gel 3% dengan ketentuan :

a. Dipipet dan dimasukkan 812 µL dH2O

b. Dipipet dan dimasukkan 220 µL T-acrylamid 30%

c. Dipipet dan dimasukkan 344 µL UGB

d. Divortex ketiga komposisi diatas ± 5 menit

e. Dipipet dan dimasukkan 8,25 µL APS (dibuat dalam keadaan fresh),

(APS 10% dibuat dengan cara 10 mg APS dilarutkan dalam 100 µL ddH2O)21

f. Divortex keempat komposisi diatas ± 5 menit

g. Dipipet dan dimasukkan 5,5 µL TEMED

h. Divortex kelima komposisi diatas ± 5 menit

i. Dimasukkan separating gel dalam plate dan ditunggu hingga mengeras

5. Dimasukkan stacking gel 3% dalam plate, 1500 µL

6. Dimasukkan sisir, ditunggu hingga mengeras

7. Dipindahkan dan dimasukkan plate dalam bak elektroforesis berisi running buffer

8. Dipanaskan sampel+RSB (1:1) dalam oven 95oC, selama 3 menit (kapasitas

setiap well maksimal 15 µL), begitu pula dengan marker. Jika sampel berbentuk

padatan, maka sampel ditambahkan aquabidest (ddH2O). Komposisi RSB

adalah sebagai berikut (BIO-RAD) :

a. B-mercaptoethanol 25 µL

b. Stock Sampel Buffer 475 µL

Sedangkan komposisi stock sampel buffer adalah sebagai berikut (BIO-RAD) :

a. Distilled Water 4,8 mL

b. 0,5 M Tris-HCl pH 6,8 1,2 mL

c. Glycerol 1,0 mL

d. 10% (w/v) SDS 2,0 mL

e. 0,1% (w/v) Bromophenol Blue 0,5 mL

9. Didinginkan sampel + RSB hasil pada langkah 8.

10. Dimasukkan sampel + RSB ke dalam setiap well (maksimal 15 µL/well), kecuali

marker protein, yakni 5 µL/well

11. Dirunning dengan tegangan konstan 100 volt, selama ± 80 menit.

12. Diambil dan diwarnai gel selama 1 jam dengan larutan staining (dilakukan pada

mesin penggoyang atau shaker)

13. Dilakukan destaining selama 24 jam, destaining dihentikan ketika larutan destaining jernih

22

14. Gel dibungkus dengan mika dan diamati profil protein yang terdapat pada gel

dengan cara discan.

Komposisi Larutan Staining :a. Comasie brilliant blue = 0,25 g

b. Metanol absolut = 45,4 mL

c. Asam Asetat Glasial = 9,2 mL

d. ddH2O = 100 mL

Komposisi Larutan Destaininga. Metanol absolut = 70 mL

b. Asam Asetat Glasial = 70 mL

c. ddH2O = 1 L

PERCOBAAN VIUJI ENZIM AMILASE DALAM AIR LIUR

A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk mempelajari kondisi daya cerna enzim amilase dalam air

liur.

B. Dasar TeoriAmilase merupakan enzim yang berfungsi memecah pati dan glikogen. Enzim ini

banyak terdapat dalam hasil tanaman dan hewan. Disamping itu amilase juga dapat

diisolasi dari mikroorganisme, misalnya Aspergillus oryzae dan Bacillus subtilis. Enzim

amilase dapat dikelompokkan menjadi tiga golongan yaitu: α-amilase, β-amilase dan

glukoaminase. Kerja enzim sangat khusus dan spesifik. Artinya, suatu enzim hanya 23

menjalankan satu fungsi saja. Misalnya adalah enzim α-amilase yang bekerja spesifik di

dalam mulut, enzim ini terdapat bersama dengan air liur (saliva), enzim α-amilase

berperan dalam melakukan hidrolisis awal makanan terutama yang mengandung pati.

Disamping kerjanya sangat spesifik, kerja enzim juga sangat dipengaruhi oleh faktor-

faktor lain. Diantaranya adalah konsentrasi substrat pH, suhu, kofaktor. Karena organism

di alam, termasuk manusia dapat mencerna pati, maka enzim α-amilase secara alamiah

banyak ditemukan, seperti dalam air liur manusia dan system sekresi pankreas.

C. Alat dan BahanAlat Gelas ukur Termometer Tabung reaksi Penangas air Penjepit tabung Kertas saring Glass wool Pipet tetes

Bahan Air liur (saliva) Air es Asam asetat encer HCl Aquadest Na Karbonat 0,1% Larutan kanji 1% Kertas pH universal Reagen iodine Reagen biuret Reagen benedict Reagen Molisch

D. Cara Kerja1. Persiapan Air Liur

Rongga mulut dibersihkan dengan cara berkumur berkali-kali. Air liur dikumpulkan

sekitar 30 mL, disaring dengan glass wool. Sifat dan susunan air liur diuji dengan

mengukur pH dan mereaksikan dengan dengan berbagai pereaksi yaitu biuret dan

molish.

2. Uji Biuret dan Molisch

24

Disiapkan 2 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 10 tetes air liur. Tabung 1

ditambahkan 15 tetes reagen biuret dan tabung 2 ditambahkan 5 tetes reagen molish.

3. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Amilase Air LiurDisiapkan 4 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 2 mL air liur dan 2 mL

akuades kemudian dikocok. Tabung 1 diletakkan pada air es, tabung 2 pada suhu ruang,

tabung 3 pada suhu 37oC dan tabung 4 pada suhu 85oC selama 15 menit. Setelah itu

setiap tabung diisi dengan 2 mL larutan kanji, dikocok dan direaksikan pada masing-

masing kondisi suhu selama 10 menit. Isi tabung dipindahkan menjadi 2 bagian, satu

bagian diuji dengan reagen iodium dan satu bagian dengan reagen benedict.

4. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Amilase Air Liur Disiapkan 4 tabung reaksi masing-masing diisi dengan 2 mL HCl, 2 mL asam

asetat, 2 mL akuades dan 2 mL Na-karbonat dan diukur pH nya. Setiap tabung

ditambahkan 2 mL larutan kanji dan 2 mL air liur, dikocok dan diletakkan di penangas air

37oC selama 15 menit. Isi tabung dipindahkan menjadi 2 bagian, satu bagian diuji dengan

reagen iodium dan satu bagian dengan reagen benedict.

.

25

PERCOBAAN VIPEMERIKSAAN GLUKOSA DAN PROTEIN PADA URINE

A. Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk menentukan adanya glukosa dan protein pada urine

secara kualitatif.

B. Dasar TeoriUrine atau air kencing merupakan cairan sisa yang diekskresikan oleh ginjal

kemudian dikeluarkan dari dalam tubuh melalui proses urinasi. Eksreksi urine diperlukan

untuk membuang molekul-molekul sisa dalam darah yang disaring oleh ginjal dan untuk

menjaga homeostasis cairan tubuh. Urine disaring di dalam ginjal, dibawa melalui ureter

menuju kandung kemih, dan akhirnya dibuang keluar tubuh melalui uretra. Urine normal

biasanya berwarna kuning, berbau khas jika didiamkan berbau ammoniak, pH berkisar

4,8 – 7,5 dan biasanya 6 atau 7. Berat jenis urine berkisar antara 1,002 – 1,035. Volume

normal perhari 900 – 1400 mL.

Warna urine biasanya dipengaruhi oleh jenis makanan yang dimakan, jenis

kegiatan atau dapat pula disebabkan oleh penyakit. Namun biasanya warna urine normal

berkisar dari warna bening sampai warna kuning pucat. Urine mengandung berbagai zat

yaitu air sebanyak 95 %, urea, asam ureat, ammonia, zat warna empedu (Bilirubin dan

Biliverdin), dan garam mineral, terutama NaCl. Selain itu, urine juga mengandung zat-zat

bersifat racun seperti sisa obat dan hormon.

26

C. Alat dan BahanAlat Tabung reaksi Lampu spiritus Rak tabung reaksi Pipet tetes Centrifuge dan tabungnya Gelas ukur Penjepit

Bahan Urine Glucotest strip CuSO4.5H2O Akuades Natrium sitrat Asam asetat 10% Na2CO3 anhidrat Natrium asetat Sitrat karbornat Asam asetat glasial

D. Cara Kerja1. Pembuatan Reagen Benedict

CuSO4.5H2O sebanyak 1,73 g dilarutkan dengan 10 mL akuades. Larutan tersebut

ditambahkan 17,3 g natrium sitrat dan 10 g Na2CO3 anhidrat dalam 60 mL akuades

dengan pemanasan, kemudian disaring. Perlahan-lahan dengan adukan yang konstan

tambahkan larutan sitrat karbonat. Bersihkan seluruh CuSO4 dengan akuades dan

tambahkan aquadest hingga mencapai volume 100 mL.

2. Uji Glukosa dalam UrineReagen benedict dimasukkan 2,5 mL kedalam tabung reaksi dan ditambahkan

0,25 mL (4 tetes) urine dan campurkan. Campuran tersebut diletakkan dalam air

mendidih selama 2-3 menit. Angkat tabung reaksi dan amati perubahan yang terjadi.

Warna yang terjadi adalah simbol jumlah glukosa yang terkandung dalam urine.

a. Biru tidak ada endapan (-) 0,0 – 0,1 g/dL

27

b. Hijau dengan endapan kuning (+) 0,5 – 1,0 g/dL

c. Kuning (++) 1,0 – 1,5 g/dL

d. Orange (+++) 1,5 – 2,5 g/dL

e. Merah (++++) 2,5 – 4,0 g/dL

3. Uji Glukosa dengan Glucotest StripCelupkan strip ke dalam urine selama 30 detik. Baca hasil tersebut dengan

membandingkan warna yang didapat dengan warna standard.

4. Uji Protein dalam UrineTabung reaksi diisi urin sebanyak ¾ nya dan dididdihkan selama 1-2 menit.

Kemudian tambahkan 3 tetes asam asetat 10% secara perlahan dalam keadaan

mendidih. Amati dan catat perubahan yang terjadi.

Kekeruhan yang dihasilkan menandakan banyak sedikitnya protein dalam urine.

a. Tidak ada kekeruhan (-)

b. Kekeruhan sedikit sekali (±)

c. Kekeruhan sedikit (+) 10-50 mg %

d. Kekeruhan jelas (++) 50-200 mg %

e. Kekeruhan hebat (+++) 200-500 mg %

f. Kekeruhan menggumpal (++++) >500 mg %

5. Uji Protein dengan Metode BangReagen bang dibuat dengan melarutkan natrium asetat 2,36 g dan 5 mL asam

asetat glasial. Campuran tersebut ditambahkan akuades sampai volumenya 20 mL. Lima

milliliter urine dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah 0,5 mL reagen Bang.

28

Setelah itu, dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit. Amati perubahan yang

terjadi. Terbentuknya kekeruhan pada sampel menunjukkan adanya protein dalam urine.

6. Uji Protein dengan Metode Heller’sHNO3 2 M sebanyak 2 mL dimasukkan dalam tabung reaksi. Kemudian,

ditambahkan 2 mL urine secara perlahan. Terbentuknya gumpalan berwarna putih

menunjukkan adanya protein dalam urine.

Daftar PustakaBCM 101 Biochemistry Week 9 Pratical “Urine Analysis”. Diakses tanggal 18 Februari

2016 dari http://www.pua.edu.eg/Version2/Courses2/Dentistry%20Courses/Freshmen

/Spring/BCM101/Practical/Week%209%20Practical%20_Urine%20analysis_.pdf

29

LAMPIRANLampiran 1. Format Laporan

SAMPUL LAPORAN

BAB I PENDAHULUAN1.1 Latar Belakang1.2 Tujuan

BAB II TINJAUAN PUSTAKA2.1 Dasar Teori (teori-teori baku yang menunjang pembahasan)

2.2 Tinjauan Bahan (MSDS bahan yang digunakan)

BAB III METODE PERCOBAAN3.1 Alat3.2 Bahan3.3 Cara kerja (ditulis dalam bentuk paragraf)

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Data Hasil Pengamatan4.2 Analisis prosedur dan analisa hasil

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

DAFTAR PUSTAKA min. 5 referensi, 2 atau lebih diantaranya dari artikel penelitian.

LAMPIRAN Lampiran berisi diagram alir, data-data mentah, tabel pengamatan, dan perhitungan.

30

Lampiran 2. Contoh Cover Laporan Praktikum

ISOLASI ASAM NUKLEAT(...............judul percobaan.............)

Disusun Oleh:

Nama : Moh. TaufiqNIM : 03530014Jurusan : KimiaAsisten : Taufiq HidayatKelompok : VI

LABORATORIUM BIOKIMIAJURUSAN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGIUNIVERSITAS ISLAM NEGERI MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG

2016

31

Lampiran 3. Limbah Praktikum Biokimia II

Percobaan Jenis Limbah Kategori WadahI Larutan iodine + bakteri +

enzim amilaseOrganik halogen Kuning

Reagen DNS + bakteri Asam basa Putih Reagen DNS + Glukosa Asam basa Putih

II Enzim papain + susu skim + pp + NaOH

Asam basa Putih

III Dedak padi /kacang tanah+ petroleum eter + buffer

Organik Hijau

Susu + Enzim lipase + pp + NaOH

Asam basa Putih

IV Kertas saring + kultur bakteri + H2O2

Asam basa Putih

Aquadest + H2O2 + HCl Asam basa Putih Aquadest + H2O2 + NaOH Asam basa Putih Aquadest + H2O2 Asam basa Putih

V Gel akrilamid + protein Organik HijauVI Air liur + biuret/molisch Organik Hijau

Air liur + aquadest + iodium

Organik Hijau

Air liur + aquadest + benedict

Organik halogen Kuning

Air liur + HCl / NaOH/ asam asetat + iodium

Asam basa Putih

Air liur + HCl / NaOH/ asam asetat + iodium

Asam basa Putih

VII Benedict + urine Logam MerahAsam asetat + urine Asam basa PutihReagen Bang + urine Asam basa PutihHNO3 + urine Asam basa Putih

32