Upload
hanh-my
View
227
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
8/18/2019 01004 acid amin.doc
1/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
Phaàn 2
P!"#N T$C!"CI% "&IN '"(N) *+,
C!-./0N !1" PITC
I3 &-,C 4$C! T!$ N)!I/5&
6aùc 78nh tha9nh phaàn :a9 ha9m ;öt caù baèng phö
8/18/2019 01004 acid amin.doc
2/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
II3 C *J . T!-./KT C-J" P!+N) P!"P L3 Khaùi nieäm veà phöông phaùp HPLC:Phöc ;oaïi sa?c @yù co>t coù
pha 7o>ng ;a9 chaFt ;oAng3 4aây ;a9 @y thua>t phaân tích sa?c @í du9ng7eå taùch caùc ion hoaOc caùc phaân töA ho9a tan t=ong dung d8ch3Co>t !PC coù theå ;a9 co>t sa?c @yù phaân boFG sa?c @yù haFp phuïG
t=ao 7oåi ion hay ;oïc ge;3 *öï phaân taùch caùc caFu töA 7aït 7ö
8/18/2019 01004 acid amin.doc
3/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
7o>ng yeFu h
8/18/2019 01004 acid amin.doc
4/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
"cid nuc;eic
"cid höu c<
);ucid
*teo=it
ThuoFc @haùng sinhG döc toF B aatoRin D ThuoFc t=ö9 saâu Bca=bamateD ThuoFc die>t coA Phuï gia coâng nghie>p :a9 thöïc phaåm
ChaFt @ích thích
III3 !/5 T!1KN) *"C W. 1JN) C"1 "P
!/5 T!1KN) !PC *+J %-,N) L P!" 415N)L3 'nh chöùa pha 7o>ng3 f3 Wim b pha>n naïp maVu3H3 't sa?c @í3X3 1Kng daVn pha 7o>ng3 LL3 o9 oån nhie>t3\3 ;o sp;itte=3 L23 4aàu do933 4oàng hoà aùp suaFt3 LH3 &aùy ghi @eFt EuaA33 P=eco;umn3 LX3 'o> pha>n thu saAn
phaåm3
T=ang 2
8/18/2019 01004 acid amin.doc
5/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
o9 7ieàu nhie>t
!/5 T!1KN) !PC *+J %-,N) 2 P!" 415N)L3 Nguyeân taéc hoaït #oäng cua heä tho(ng HPLC )ö 'uïng
* pha #oäng: !ai pha 7o>ng " :a9 ' 7ön dung moâi3 'ttheo chöt phaân tích tPicoTag @ích thöt ;a9 si;icage; coù ga?ndaây CLf3 Coù theå tieFn ha9nh phaân tích t 7o> thö X] M \]oC3 &uoFn giö nhie>t 7o> nhö :a>y phaAi söA duïng;o9 7ieàu nhie>t3
Pha 7o>ng 7i ngang Eua se cuoFn maVu caàn phaân tích 7i theo3Whi :a9o t=ong co>t sa?c @íG chaFt na9o coù aùi ;öïc maïnh :ngse theo pha 7o>ng 7i =a t=ö pha>n 7ieàu
'nhchöùa
'nhchöùa
'o>pha>noop chích&aVu
Co>t sa?c @yùBCo>t Pico Tag HG R L\]
4aàu do9 -ZG bö
8/18/2019 01004 acid amin.doc
6/37
8/18/2019 01004 acid amin.doc
7/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
phaAi 7ön h pha>n ;aFy maVu töï 7o>ng caFu taïo tö9 mo>t :o9ng Roay hoaOcmo>t giaù 7 pha>n chính cuAa he> thoFng thieFt b8 !PCG 7où
chính ;a9 n
8/18/2019 01004 acid amin.doc
8/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
4oFi :t ;oaïi sinh :a>t na9o cung coù chöùa p=otein3 Thöïcphaåm coù nguoàn goFc tö9 sinh :a>t neân t=ong thöïc phaåm cung coùchöa p=otein3 "cid amine t=ong thöïc phaåm ít toàn taïi
8/18/2019 01004 acid amin.doc
9/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
T=eân theF gi
8/18/2019 01004 acid amin.doc
10/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
a) -aá$ maãu:&aVu 7em phaân tích ;uoân phaAi 7oàng nhaFt :a9 mang tính 7aïi die>nneân :ie>c 7oàng nhaFt maVu t=ö
8/18/2019 01004 acid amin.doc
11/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
*au 7où t=o>n 7eàu maVu 7a ;aFy 7eå tieFn ha9nh ;aFy maVu thöA
t=ung bnh3b) hua.n b/ thuoác thöû: Dung &/ch pheno, 01:
Tö9 pheno; daïng tinh theå nga>m nöt chính Raùc3
Dung &/ch H, 2+: Tö9 bnh dung d8ch !C; L2NG pha theo tyA ;e> Z!C; Z!21 ^ LLG cuï theå
;aFy Z!C; ^ Z!21 ^ L]]m;G ta 7ön : !C; L2N coù @haA naUng bay h
8/18/2019 01004 acid amin.doc
12/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
P=otein ^ N toång soF G2\P=otein thoâ chieFm \] maVu3 Za>y ;öt caù ;aFy
phaân tích ;a9
caùbo>tmg L2\\] \]
NitRNitt
7uoåi @hí 12 ;a9 taùc nhaân gaây oRy hoùa acid amin @hi tieFn ha9nhthuAy phaân p=otein t=ong moâi t=ö cao3 Neân suïc@hí :a9o tha9nh bnhG @hoâng 7aâm thaqng :a9o dung d8ch 7eå t=aùnh@hí ;a9m :aUng dung d8ch =a ngoa9i3 Z Euaù t=nh 7uoåi 12 @hoâng 7aAmbaAo hoa9n toa9n neân ta cho theâm pheno; :a9o cung ;a9 taùc nhaânchoFng oRy hoùa3
&) 8huû$ g*aû*:
4oFt noùng ;o9 L]\ M LL2oC t=ong 2] H] phuùt t=ö mong muoFn mn phaAn öùng thuAy giaAi b oån 78nh3 Tht 7o> chöa 7aït th Euaù t=nh thuAyphaân RaAy =a @hoâng hoa9n toa9n3
4aOt maVu :a9o ;o9 :a9 thuAy giaAi
8/18/2019 01004 acid amin.doc
13/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
37 ;u$ tt sa?c @í @hoâng b8 phaù hoAng do co>t
sa?c @í ch_ ch8u 7ö
8/18/2019 01004 acid amin.doc
14/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
hua.n ;a9 dung d8ch goàm L acid amin coù noàng 7o> 78nh t=öaá$ #hoâ:
4em saFy @hoâ maVu baèng bnh huùt aåm chaân @hoâng 7eå ;oaïiboA hoa9n toa9n N!H :a9 caùc dung moâi @haùc t=ong maVu nhaèm ;a9mhaïn cheF toFi thieåu söï coù maOt cuAa caùc chaFt na9y gaây nhieVupea@ sa?c @í3
?eâu ca(u bnh huùt aåm chaân @hoâng phaAi saïch se :a9@hoâng co9n ;aVn aåm t=ong bnh3
&aVu sau @hi 7ö
8/18/2019 01004 acid amin.doc
15/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
&) a%ch t*eán haønh: Chuaån b8 dung d8ch taïo daVn RuaFt goàm /thano;T/"nö LLL3
%ung d8ch daVn RuaFt na9y ;uoân 7ö
8/18/2019 01004 acid amin.doc
16/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
!e> thoFng ;oïc chaân @hoâng aùp suaFt thaFp3 )iaFy ;oïc B]GX\µmD3 Caân phaân tích chính Raùc tn cöïc cuAa maùy 7o p! :a9o bnh dung d8ch B:aVn 7ang7aOt t=eân maùy @huaFy tö9D 7eå 7o p! Bp! ^ L]Gf\ t 7o> t ^2XGHoCD3
&o>t tay giö 7ie>n cöïc t=ong bnh :a9 mo>t tay du9ng oFng huùt7eå ;aFy acid acetic ;oang cho tö9 tö9 :a9o bnh :
8/18/2019 01004 acid amin.doc
17/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
4ong X]m; dung d8ch :ö9a ;oïc 7em pha :t 1N3
'aFm nuùt Ca; 2 ;aàn M ma9n hnh RuaFt hie>n tL3
tL chuaån @y thua>t p! ^ G]]3
Chn p! ^G]]3
aFy 7ie>n cöïc =aG =öAa baèng nön giaù t=8 p! ^XG]] BhoaOc p! ^L]G]]D3
Ch
8/18/2019 01004 acid amin.doc
18/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
YöAa 7ie>n cöïc baèng nön cöïc :a9o maVu 7o3
'a>t nuùt 1N3
4oïc giaù t=8 p! t=eân ma9n hnh :a9 ghi giaù t=8 p! cuAa maVu3
'aFm nuùt 1 Bsau @hi 7a ;aFy 7ie>n cöïc =a @hoAi maVuD3
YöAa 7ie>n cöïc baèng nöt 7o> ;o9 XHoC 4ieàu ch_nh möùc nhie>t 7o> ca9i 7aOt t 7o> cho ;o93
Cho pha 7o>ng "G ' chaïy Eua he> thoFng b thoFng :a>n ha9nh3
Ca9i 7aOt bö in
hay @hoângG @ích thön t=eân sa?c @í 7oàG 7o> nhaïyG :a>n toFcchaïyG[
NhaFn /Rit
→ choïn \ ca9i 7aOt teân caùc ta>p tin 7eå ;öu t=ong oå 7Qacho caùc ;aàn chaïy theo nguyeân ta?c T/#N3C :t soF baFt @3 /67N ;a9 phaàn 7eå phaân bie>t caùc ta>p tin 7a 7öu 7a nha>p t=ön 1v
:a9 aFn tieFp /NT/Y 7eå hie>n Z"-/ =oài nha>p giaù t=8 ;öu;öp thp giaù t=8 '3 *au7où aFn tieFn /NT/Y 7eå ;öu ;aïi giaù t=8 ' :ö9a nha>p3
\3 a>p ;aïi 2 bö
8/18/2019 01004 acid amin.doc
19/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
3 "Kn nha>p L moFc th
8/18/2019 01004 acid amin.doc
20/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
;aän to(c 'ong 'ung '8ch 9 theo thôi gian
7G aø* ñaJt ma%$ v* tính EMNG7):
NhaFn fG :a9o L 7eå nha>p giaù t=8 nga9yG thaùngG[ sau 7où/Rit3
Za9o \ 7eå 7aOt teân cho ;aàn 7o maVu3 Zí duï 2//3CXX70 Bôm chua.n vaø maãu vaøo ma%$:
%u9ng @im chích 7eå bm phaAi ;aFy maVu ;ng 7i theo 7ön cu9ng :
8/18/2019 01004 acid amin.doc
21/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
LH3 ðionineL\3 Iso;eucineL3 eucineL3 Pheny;a;anineLf3 ysine
L3 /0nh noàng #oä aci' amin t2ong 'ung '8ch chua$n #em #i#o:
aFy ;aàn ;ö CD x dung d8ch saFy @hoâ → sau 7où 7em 7itaïo daVn RuaFt :n tích pea@ chuaån *chuaån → ta döïng 7ö
8/18/2019 01004 acid amin.doc
22/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söï chuyeån hoùa PITC
ZII3 W/KT j-"J T$N! T1"N
g?mol
C>mmol?
mlCaa chua$n #em #i
#o
<chua$n
<ma,u
Caa ma,u #em #i#o> g?ml
Caa ma,u@an #aàu>
g?3g
L "spa=tic"cid LHH3L 23\
] ]
LX\fX 23X2/] 3X\X
ChuaånHBg`
m;D
3f/
]
fH
]Chuaån\Bg`m;D
L3/]
LLH\L]
ChuaånL]Bg`m;D
H3HH/]
L]\
2 );utamic"cid
LX3L 23\
] ]
H2L]f
H3]/] L2L322f
ChuaånHBg`m;D
L3L]/]
L2]]H
Chuaån\Bg`m;D
L3fX/]
Lf]X]
ChuaånL]Bg`m;D
H3f/]
H\]2
H *e=ine L]\3L 23\
] ]
LH\X2 f3]\/] 23X]
ChuaånHBg`m;D
3ff/]
LXX]
Chuaån\Bg`m;D
L3HL/]
2HLfHL
ChuaånL]Bg`m;D
23H/]
XHL]
X );ycine \3] 23\ ] ] 2f2X
f3/]f 23fXfChuaånHBg`m;D
\3H/]
LHX]
T=ang XX
8/18/2019 01004 acid amin.doc
23/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söï chuyeån hoùa PITC
Chuaån\Bg`m;D
3Hf/]
H]\XH
ChuaånL]Bg`m;D
L3ff/]
\2
"=ginine LX32 23\
] ]
LLLH 3X\/] H]3H
ChuaånHBg`m;D
L3HL/]
LH]\X
Chuaån\Bg`
m;D
23Lf/
]
22f
f2ChuaånL]Bg`m;D
X3H/]
\]Lf
Th=eonine LL3L 23\
] ]
L]\]\
3L\/] 2]3L]
ChuaånHBg`m;D
f3H/]
L\f]\
Chuaån\Bg`m;D
L3X/]
2\Xf2
ChuaånL]Bg`m;D
23f/]
\]]\]
f ";anine f3] 23\
] ]
L\H
3X2/] H]3ffX
ChuaånHBg`m;D
3f/]
LH]
Chuaån\Bg`
m;D
L3LL/
]
22L
XXChuaånL]Bg`m;D
232H/]
X\X\
P=o;ine LL\3L 23\ ] ] 2HfX]
f3XX/] 23]ChuaånHBg`m;D
f3H/]
2f]2
Chuaån\Bg`m;D
L3XX/]
X\LXX
T=ang X\
8/18/2019 01004 acid amin.doc
24/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söï chuyeån hoùa PITC
ChuaånL]Bg`m;D
23ff/]
HffL
LL Ty=osine LfL32 23\
] ]
\]H H3]/]f L32L2
ChuaånHBg`m;D
L3H/]
2HX\H
Chuaån\Bg`m;D
232/]
HHHL
ChuaånL]Bg
`m;D
X3\H/
]
L2L
X
L2 Za;ine LL32 23\
] ]
L2\f2
3/] 2\3\\H
ChuaånHBg`m;D
f3/]
L\]2H
Chuaån\Bg`m;D
L3X/]
22ff\
ChuaånL]Bg`m;D
23H/]
XHL
LH ðionine LX32 23\
] ]
\]X2 H3LH/] L]32\X
ChuaånHBg`m;D
L3L2/]
LH]
Chuaån\Bg`m;D
L3f/]
2f]LX
ChuaånL]Bg
`m;D
H3H/
]
L\\
H
L\ Iso;eucine LHL32 23\
] ]
fLHf 3X/] 2L322]
ChuaånHBg`m;D
3fX/]
LHL
Chuaån\Bg`m;D
L3X/]
22L2f
ChuaånL]Bg`m;D
H32f/]
XX]]H\
T=ang X
8/18/2019 01004 acid amin.doc
25/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söï chuyeån hoùa PITC
L eucine LHL32 23\
] ]
2\\]L
L3fX/] ]3LfX
ChuaånHBg`m;D
3fX/]
LHf]
Chuaån\Bg`m;D
L3X/]
2HX
ChuaånL]Bg`m;D
H32f/]
X\]fL
L
Pheny;a;anine
L\32 23\
] ]
L\H\\ 3f\/] H232L
ChuaånHBg`m;D
L32X/]
2LLfX
Chuaån\Bg`m;D
23]/]
HHL2L\
ChuaånL]Bg`m;D
X3LH/]
HH]H
Lf ysine LX32 23\ ] ] 2]fL\
H3fL/] 2\3L2ChuaånHBg`
m;DL3L]/
]2XL
LChuaån\Bg`m;D
L3fH/]
X]]\X
ChuaånL]Bg`m;D
H3/]
ff
Toång ;öt caù \L\3L
T=ang X
8/18/2019 01004 acid amin.doc
26/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
T=ang Xf
8/18/2019 01004 acid amin.doc
27/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
T=ang X
8/18/2019 01004 acid amin.doc
28/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
T=ang \]
8/18/2019 01004 acid amin.doc
29/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
T=ang \L
8/18/2019 01004 acid amin.doc
30/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
T=ang \2
8/18/2019 01004 acid amin.doc
31/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
ZIII3 '"lN -"5N;a(n #eà -: =oät )o( va(n #eà caàn löu yù 3hi tie(n hanh phaânt0ch aci' amin
Taïp chaFt ;uoân ;uoân ;a9 mo>t :aFn 7eà Euan taâm ha9ng 7aàu
t=ong phaân tích acid amin3 Caùc chaFt hoùa hoïc coù 7o> tinh thieFt cao;a9 mo>t yeâu caàu Euan t=oïng B:í duïG acid !C; coù 7o> tinh @hieFt thaFpcoù theå ;a9m nhieVm g;ycineD3
%ung moâi söA duïng t=ong phaân tích !PC phaAi tha>t tinh @hieFt3Caùc taïp chaFt cung nhö :i sinh :a>t nhieVm :a9o t=ong dung moâi coùtheå ;a9m saïch baèng caùch ;oïc dung moâi t=öy@ín caùc bnh chöùa dung moâi :a9 @hoâng 7aOt caùc duïng cuï :a9 thieFtb8 du9ng t=ong phaân tích acid amin t=öïc tieFp döm cung se EuyeFt 78nh 7eFn chaFt ;öc phaân tích acid amin
4aOt caùc duïng cuï thí nghie>m taïi np @ínG @hoâng neâncaàm 7aàu pipet baèng tay3 Neân 7eo bao tay @hi ;a9m thí nghie>m3
!aïn cheF thngC baèng acid phospho=ic3
Neân söA duïng caùc acid t=eân
8/18/2019 01004 acid amin.doc
32/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
Whi ;oïc pha 7o>ng baèng giaFy ;oïcG ta phaAi söA duïng he> thoFngtaïo chaân @hoâng aùp suaFt thaFp 7eå Euaù t=nh ;oïc tieFn ha9nh nhanh:a9 thua>n ;
8/18/2019 01004 acid amin.doc
33/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
7ieàu @hieån chính Raùc3 Noù thích hc thuAy phaân caùcpeptid h
8/18/2019 01004 acid amin.doc
34/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
T=ang \
8/18/2019 01004 acid amin.doc
35/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
T=ang \
8/18/2019 01004 acid amin.doc
36/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
;a(n #eà : Caùc @ie$u hieän Ja(u 3hi chaïy )aéc 3yù va caùch3haéc phuïc
89nh peak &: tu;, kho%n nho$n ;öt EuaùnhieàuG caàn giaAm noàng 7o> baèng caùch pha ;oang3
89nh peak &: cheû coù nhieàu taïp chaFt3 Taïp chaFt coù theå doco>t b8 baånG phaAi =öAa ;aïi co>t baèng caùc he> dung moâi coù 7o>phaân cöïc taUng daàn3 Nhöng @hi phaân tích caùc maVu töï nhieân ththöng ;a9 dung moâi höu c< :a9 giaFyD 7eå taùch chuùng3
T=ong sa?c @yù phaân boF chuyeån 7o>ng cuAa caùc chaFt t=ong hoVnh
8/18/2019 01004 acid amin.doc
37/37
TN phaân tích Phaân tích acid amin baèng söïchuyeån hoùa PITC
Nhöu suaFt phaân tích @hoâng cao3
'/nh ,öôïng aa baOng phöông pha%p !a"c #$% baûn moûngNguyeân ;yù töt thích h