BIOQUMICA Y NUTRICIN

Duplicacin y Transcripcin

Dra. Elena Benavides Rivera

ADNCONTENIDO:

-Composicin y estructura del ADN. Organizacin gentica del ADN.

-Reacciones de replicacin del ADN en procariotes y eucariotes.

-Fragmentos de Okasaki. Reacciones de reparacin del ADN. Mutaciones.

COMPONENTES DEL ADNEl ADN est compuesto por dos polinucletidos enormes, cada uno de ellos con forma de hlice, una doble hlice.

AZUCAR (DESOXIRRIBOSA)

citosinaBASE NITROGENADA

NUCLEOTIDOLas bases nitrogenadas absorben intensamente la luz UV corta , en la longitud de onda de 259nm (medio importante para el dosaje rpido de cidos nucleicos)Compuesto orgnico formado por tres componentes: un radical del cido fosfrico, un azcar y una base nitrogenadaGRUPO FOSFATO o RADICAL DEL ACIDO FOSFORICO

BASES NITROGENADAS

Las bases nitrogenadas pueden formar uniones de hidrogeno (uniones relativamente lbiles) en algunos de sus tomos al encontrarse en la vecindad inmediata de otro compuesto similar; este es el fundamento de las uniones complementarias de las bases de las dos hlices.

AZUCAR (DESORRIBOSA)Desoxirribosa (ADN)ribosa (ARN)32143124

Por medio del grupo oxhidrilo se unen a dos cidos fosfricos diferentes en cada cadena de ADN y determinan la polaridad

ION FOSFATO

El Ion fosfato presenta 3 valencias capaces de combinarse. se pueden unir al carbono 5 o 3 menos al C2 ya que carece del grupo oxhidrilo Los nucletidos usados en la sntesis de ADN poseen el fosfato unido al C5 ya que el ADN se lee en sentido 5-3En el ADN, 2 valencias de cada fosfato se unen con 2 desoxirribosas distintas y queda una valencia libre por cada fosfato, lo que le da un carcter fuertemente cido y su caracterstica carga negativa

ADNEl fosfato de cada nucletido convierte al ADN en un polmero con carga negativa, es decir, un polianin. Por ello las cargas negativas (como la de otros cidos nucleicos) lo repelen.

En cambio las cargas positivas pueden ser de cationes comunes como son el Na+ y el K +( monovalentes) y mucho ms las de cationes divalentes como el Ca++ o el Mg++ hacen precipitar los cidos nucleicos.

ESTRUCTURA DEL ADNLa forma B o ADN fisiologico sigue un trayecto de hlice derecha, es decir, las hlices giran en el sentido de las agujas del reloj.Ancho: 2,3nm , 10 nucletidos por cada giro y 0.34 nm entre cada par de base.

2,3nm

ESTRUCTURA DEL ADN-La nica forma de unin entre las dos hlices est dada por las uniones hidrgeno entre las bases de una y otra cadena uniones que son muy dbiles individualmente, pero que sumadas a lo largo de un segmento, pueden unir fuertemente las dos hlices. -Adems, dos hlices derechas, para ser complementarias , deben caminar en sentidos opuestos; es decir; antiparalelas, lo que se observa mejor al mirar la posicin de las desoxirribosas en cada una de las cadenas: mientras una avanza con el C5 la otra lo hace con el C3.

La columna vertebral de cada hlice est formada por los iones fosfato que establecen uniones con dos desoxirribosa contiguas (uniones fosfodister), de manera que la ruptura de una unin fosfodister significa cortar una de las dos cadenas o hlices.

En el espacio, las bases nitrogenadas quedan situadas hacia el centro de la columna formada por la doble hlice mientras que las columnas vertebrales de fosfatos quedan hacia fuera.

En el espacio existente entre las dos columnas vertebrales exteriores, formadas por las uniones fosfodister, cabe exactamente un par de bases, una grande (purina) y una chica ( pirimidina) solo permitir C-G, G-C, A-T, o T-A.

ESTRUCTURA DEL ADN

Tamao:Ejm. E. coli 4.6 Mb que codifican alrededor de 4300 genes(1Mb=1x10 6 bases)Capacidad codificadora son compactos y continuos contienen poco DNA no codificadorExpresin gnica: Los genes estn organizados en operones. Un opern es un conjunto de genes ligados que estn regulados como una unidad. Una cuarta parte de los genes estn organizados en operones.Pueden presentar pequeas piezas de DNA plsmidos genes no esenciales para el desarrollo pero si para su supervivencia

Tamao del genoma: mucho ms grande que procariotasCapacidad codificadora: Secuencias no codificadoras extensas Solo el 1,5% del genoma humano codifica proteinas.Continuidad codificadora: La mayora son discontinuas. Las secuencias no codificadoras (intrones) estn intercaladas entre las secuencias codificadoras(exones).Presentan repeticiones tandem: Son secuencias de DNA en las que muchas copias estn cerca unas de otras. Se denominaron originalmente DNA satlite varan desde 10pb hasta 2000pb

GENOMA EUCARIOTAGENOMA PROCARIOTA

REPLICACION DEL ADNReplicacin es el proceso mediante el cual el DNA produce copias de si mismo que garantizan la transmisin y conservacin de la informacin gentica que contiene. Tiene lugar antes de cada divisin celular.

Caractersticas (E.coli)La replicacin es semiconservadora: En cada ciclo de replicacin se mantiene intacta una de las hebras paternas que se combina con una de las hebras recin sintetizadas. Fue demostrado mediante los experimentos realizados por M. Meselson y Stahl en 1957

La replicacin empieza en un punto de origen J.Cairns y colaboradores (1963) observaron molculas de DNA en su fase de replicacin ,marcada con Timina radioactiva. Concluyeron que en E. coli se inicia en un lugar especfico del cromosoma(oriC) y avanza de manera bidireccionalEl punto dinmico de la replicacin se denomina horquilla de replicacin

La sntesis del DNA transcurre en direccin 5 a 3 y es semidiscontinuaLas cadenas de DNA siempre son sintetizadas en la direccin 5 3, siendo el 3OH libre el punto de elongacin del DNA

En 1960 Okasaki descubri que una de las hebras es sintetizada de modo continuo(cadena conductora) y la otra es sintetizada de modo discontnuo(cadena rezagada). Los fragmentos de Okasaki tienen una longitud variable entre cientos a millares de nucletidos.

Polimerasas mltiples en las clulasDNA polimerasa I: Caracterizada por Korn-berg(1955)No es la enzima que replica la mayor parte del DNA en E. coli. Juega un papel crtico en la replicacin y reparacin del DNA. Tiene actividad exonuclesica 5 3 y 3 5

DNA POLIMERASAS

-Las DNA polimerasas son las responsables de la sntesis del DNA.-Catalizan la adicin de un desoxinucletido trifosfato (dNTP) complementario al extremo 3'OH de una cadena polinucleotdica.

DNA POLIMERASASTodas la DNA polimerasas requieren para su actividad lo siguiente: Una hebra de DNA que sirva de molde. Una cadena cebadora o primer con un extremo 3'OH libre. Los 4 desoxiribonucletidos trifosfatos.Mg++

Se requiere de un cebadorEl cebador es una cadena preformada a cuyo extremo 3 se adicionen dNTPs. El cebador es un corto segmento de RNA

Enzimas y protenas accesoriasDNA helicasa, se mueve a lo largo del DNA separando las hebras . Usa ATP. DNA girasa, libera el stress topolgico de la estructura del DNA, hace cortes en las 2 hebras del DNA y produce la rotacin de las hebras del DNA. Primasa, Sintetiza los cebadores o primers, los cuales son segmentos cortos de RNA. Protenas SSB , (Single Strand Binding) protenas que se unen a una cadena simple de DNA , mantienen las hebras separadas .

HelicasasSeparan las hebras del DNA al frente de la horquilla replicativa en movimiento.

En E. coli se han usado los nombres de helicasa II y protena rep.

TopoisomerasasCambian el estado de superenrrollamiento del DNA. Las mejores estudiadas son:

DNA girasa que induce la formacin de sper enrollamientos negativos a expensas del ATP

Topoisomerasas del tipo I tienden a producir relajamiento del DNA superenrrollado

Protenas fijadorasLas proteinas de fijacin a hebras sencillas(ss binding) no consumen ATP y no presentan actividad enzimtica.

Su papel es mantener las hebras separadas el tiempo suficiente y protegerlas del ataque de las nucleasas.

Sintesis del DNA en procariotas 1.-INICIACINDesenrrollamiento del DNA: Se abre la hlice del DNA y establece el complejo precebador.La proteina dnaA se une en la regin de repeticiones de 9 pb en el origen y desnaturaliza la regin de repeticin de 13pb. Requiere ATP y proteina HU.Proteina dnaB (helicasa) en presencia de dnaC desenrrollan el DNA dplex.

ETAPAS DE LA REPLICACION

La sntesis de una molcula de DNA puede dividirse en 3 etapas: iniciacin , elongacin y terminacin. Cada una de ellas se diferencia por las reacciones y enzimas que intervienen.

En general cualquier reaccin de polimerizacin puede dividirse en 3 etapas que tambin ocurren durante la sntesis del RNA y sntesis de protenas.

INICIACION

La iniciacin de la sntesis del DNA en E. coli empieza en oriC , que es el origen de la replicacin cromosmica. OriC , es una regin del cromosoma de 245 pares de bases (pb), que tiene 2 conjuntos de secuencias conservadas . 3 repeticiones en tamden de una secuencia de 13 pb en un extremo del origen. 4 copias de una secuencia de 9 pb distribuidas en orientaciones invertidas en el otro extremo del origen.

Iniciacin en E. coliEl complejo de DnaA denatura las repeticiones de 13 pb y forma un "complejo abierto" de 45 bp. Esta reaccin tambin requiere ATP.

Iniciacin en E. coliUn complejo formado por las protenas DnaB y DnaC se une a la regin denaturada para formar un "complejo precebador" o "complejo prepriming" . La protena DnaB es una helicasa que desenrolla el DNA bidireccionalmente y crea dos horquilla de replicacin potenciales. En presencia de las protenas SSB y la DNA girasa, La DnaB desenrrolla an mas el DNA. Esto permite la entrada de la primasa ( producto del gen DnaG).

PRIMOSOMALa iniciacin de la replicacin requiere de un complejo que se conoce como primosoma , compuesto de la protena helicasa o DnaB y de la primasa o DnaG. Sus funciones son: Separar las hebras en la horquilla de replicacin Catalizar la sntesis de los cebadores.

2.Sntesis del cebadorLa formacin de segmentos cortos de RNA que se denominan cebadores, necesarios para la iniciacin de la replicacin del DNA est catalizada por la primasa, una RNA polimerasaSe denomina primosoma a un complejo multienzimtico que contiene primasa y varias proteinas auxiliares

ELONGACION

Es un proceso en el cual participan muchas protenasLa cadena lider (leading) es sintetizada en forma continua en direccin 5'->3La cadena retrasada (lagging) es sintetizada en direccin 5'->3 pero en forma discontinua.

ELONGACION

RNA primers o cebadores, son segmentos de RNA de 1 a 60 nt complementarios a una cadena patrn de DNA.En E. Coli son sintetizados por la RNA polimerasa y por la primasa.

Sntesis de la hebra gua

La sntesis de esta hebra se realiza en forma continua. El RNA cebador o RNA primer es sintetizado por la primasa y luego la DNA polimerasa III sintetiza el DNA procesivamente hasta el final.

Sntesis de la hebra retrasada

La sntesis de esta hebra se realiza en forma discontinua y en direccin opuesta al movimiento de la horquilla de replicacin Se sintetiza usando fragmentos cortos, llamados fragmentos de Okazaki, los cuales son unidos a aquellos que fueron sintetizados previamente. Los RNA cebadores con el que empieza cada fragmento de Okazaki tiene que ser retirado

3.-Sntesis de DNALa holoenzima polimerasa III es la principal enzima que sintetiza DNA en los procariotas Est formada por al menos 10 subunidades. La polimerasa central est formada por tres subunidades: alfa, psilon y theta.La proteina beta forma un anillo alrededor de la cadena molde de DNA. El complejo gamma formado por cinco subunidades reconoce las cadenas sencillas de DNA con cebadores y transfiere la proteina beta a la polimerasa central

Modelo del ReplisomaLa hebra gua se asocia al complejo de manera directa. La hebra retrasada se asocia al complejo envolvindose alrededor de este.De esta manera, tanto las hebra gua como la hebra retrasada pueden replicarse al mismo tiempo por intermedio de un complejo de protenas que se mueven en una sola direccin

Modelo del ReplisomaEl modelo del Replisoma, tiene como finalidad tratar de explicar los movimientos contradictorios que ocurren durante la sntesis del DNA.En este modelo todas las protenas que deben estar presentes en la horquilla de replicacin forman un complejo grande. Sin embargo, la manera como las 2 hebras que estn siendo replicadas se asocian con el complejo es distinto.

ReplisomaLa mquina de replicacin del DNA que se denomina replisoma est formado por dos copiasde la pol III, el primosoma y las proteinas de desenrollamiento del DNA.La hebra gua o conductora se sintetiza de forma continua. La hebra retrazada se sintetiza en fragmentos de modo que la polimerizacin

5 3 conduce al crecimiento global en el sentido 3 5.

Esto se puede lograr por la formacin de un bucle del molde para la hebra retrazadaEl molde de la hebra retrazada pasara entonces a travs del centro polimerizador de una subunidad de una polimerasa III dimrica, en el mismo sentido que el molde de la hebra gua en la otra subunidadLa DNA polimerasa III abandona el molde de la hebra retrazada despus de que se ha aadido 1000 nucletidos a esta hebra. Entonces se formara un nuevo bucle.

Unin de fragmentos de DNACuando se completa la replicacin ,las brechas entre los fragmentos de la hebra retrazada se rellenan por la actividad de la DNA polimerasa I que tambin utiliza su actividad exonuclesica para eliminar el cebador ribonucleotdico.Finalmente la DNA ligasa enlaza estos fragmentos de DNA

TerminacinLas secuencias ter se encuentran dispuestas en el cromosoma en dos grupos con orientacin opuesta Los cromosomas recin completados quedan encadenados, es decir ligados topolgicamenteEn E. coli la topoisomerasa IV corta transitoriamente las dos hebras de uno de los cromosomas , permitiendo que el otro cromosoma pase a travs de la rotura.

REPLICACION EN EUCARIONTES

La replicacin en eucariontes es un proceso mucho ms complejo que la replicacin en bacteriasEl DNA de eucariontes es mucho ms grande y est organizado formando una estructura nucleoproteica compleja como es la cromatina.

DNA POLIMERASAS DE EUCARIONTES

Los eucariontes tienen 5 DNA polimerasas dos de las cuales (alfa y delta) son importantes para la replicacin de los cromosomas eucariticos

La velocidad de sntesis del DNA en las clulas eucariticas es solo 50 nucletidos por segundo, cerca de un dcimo de la velocidad de la sntesis del DNA bacteriano.

REPLICACION EN EUCARIONTESLos cromosomas de eucariontes tienen mltiples orgenes de replicacin.

En la levadura se les conoce como secuencia de replicacin autnoma o ARS . La levadura tiene aproximadamente 400 elementos ARS en 12 cromosomas.

Replicacin eucariticaLos ndices de desplazamiento de la horquilla no exceden los 30000 pb por minuto, velocidad considerablemente menor que en E. coli

Sin embargo el ciclo replicatorio se completa en horas gracias a factores de compensacin :

1.Las clulas eucariticas contienen un gran nmero de molculas de DNA polimerasa (superior a 20000 en comparacin a las dos docenas de molculas encontradas en E.coli.

Replicacin eucaritica2. Las molculas de DNA polimerasa inician la sntesis bidireccional no en uno sino en varios puntos de iniciacin a lo largo del cromosoma Los segmentos situados entre dos puntos de iniciacin se denominan replicones . Por lo tanto para una molcula que tiene 1000 replicones se puede producir la replicacin de ,manera simultnea en un mximo de 2000 horquillas

La expresin de la informacin gentica contenida en un segmento de DNA siempre requiere la sntesis de una molcula de RNA.

Durante el proceso de transcripcin , una enzima, llamada RNA polimerasa, convierte la informacin gentica de un segmento de DNA en una hebra de RNA con una secuencia complementaria a una de las hebras del DNA.

Formas de la RNA polimerasa La enzima ncleo, compuesta de 2 subunidades alfa, una subunidad beta y una subunidad beta prima. Es capaz de copiar ambas hebras del DNA pero carece de especificidad.

La RNA polimerasa holoenzima, es la forma totalmente funcional de la enzima. Consiste de la enzima ncleo ms el factor sigma. Tiene especificidad y reconoce seales especficas de inicio de transcripcin en el DNA conocidas como regiones promotoras, debido a la presencia del subunidad o factor sigma que reconoce las regiones promotoras y que luego de la iniciacin se disocia.

Requerimientos de la RNA polimerasaPara su actividad la RNA polimerasa requiere: Un DNA molde Mg ++ o Mn++ Los cuatro ribonuclesidos trifosfatos (ATP, GTP, UTP, CTP)

El molde es el DNA

El RNA es sintetisado de 5 a 3

Mecanismo general de la transcipcion La RNA polimerasa requiere un DNA de doble cadena como molde. Sin embargo durante la transcripcin de un gen en particular, slo una de las hebras del DNA llamada hebra anti-sentido o hebra molde (antisense strand) , es copiada a RNA. La hebra de DNA complementaria a la molde se le llama hebra con-sentido (sense strand).

PROMOTORESLa sntesis del RNA se inicia en un promotor

Un promotor es una secuencia de DNA a la cual la RNA polimerasa se une, para posteriormente iniciar la transcripcin.

Secuencias de consensoReveladas por la comparacin de las secuencias de muchos promotores bacterianos.

Estn localizadas aproximadamente 10 y 35 pares de bases cuesta arriba del punto de iniciacin

Secuencias de consensoExhiben homologa.

La secuencia de consenso -10 es: TATAAT (caja TATA).

La secuencia de consenso -35 es: TTGACA

Ambas hebras codifican genes

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Pasos de la Transcripcin La RNA polimerasa se desliza a travs del DNA buscando promotores.

Cuando encuentra un promotor migra a la regin -35, formando lo que se conoce como "complejo cerrado".

Pasos IILuego el DNA es desenrollado en aproximadamente 17 pares de bases formando un "complejo abierto" que empieza en la regin -10, y que descubre la hebra molde en el sitio de iniciacin. Despus de la iniciacin la subunidad sigma se disocia de la RNA polimerasa y la enzima ncleo con el proceso de elongacin de la transcripcin.

ElongacinSubunidad sigma se separa.El RNA sintetizado forma un hbrido transitorio de 12 bp. con el DNA.50 nucletidos por seg.El DNA se enrolla detrs de la RNA polimerasa y se desenrolla delante de ella.No hay prueba de lectura.

Terminacin1. Terminacin independiente de factor, que consiste en una secuencia de nucleotidos que permite la formacin de una regin apareada con forma de alfiler en el mRNA seguida de un tramo de residuos de uracilo (U).1. Terminacin dependiente de factor, requiere de un factor proteico. El sitio de terminacin llamado rut (el nombre viene de rho utilization) , es reconocido por un factor especfico llamado rho.

Transcripcin en eucariontesEsta compartamentalizada debido a la presencia de la envoltura nuclear.

El RNA naciente de eucariontes es procesado para formar el RNA maduro.

Transcripcin en EucariontesLos eucariontes tienen 3 tipos de RNA polimerasa.

Todas nucleares.

La alfa-amanitina ,es una toxina extrada de un hongo, se une a la RNA polimersa e inhibe la elongacin

RNA Polimerasa II Ms compleja que la RNA pol de E. Coli.Consiste de 10 polipptidos (10 220 kD).RPB1, RPB2 y RPB3 son esenciales equivalen a las subunidades beta, beta prima y alfa respectivamente.RPB4 a la subunidad sigmaRPB5, RPB6 y RPB8 son componentes esenciales de las 3 RNA polimerasas de eucariontes.

Promotores de EucariontesTienen una caja TATA cerca al sitio de inicio.Otros elementos adicionales de control estn localizados entre -40 y 110.Los promotores fuertes tienen:- caja CG- caja CAAT

Promotores: Procariontes Vs Eucariontes

Transcripcin Eucariontes

Maduracin Postranscripcin.El producto inmediato de la transcripcin es una molcula de RNA precursora, el transcrito primario, que se modifica posteriormente dando una molcula funcional madura.

La suma de las reacciones enzimticas que conducen a las molculas de RNA funcionales maduras se denomina: tratamiento, maduracin o elaboracin de RNA-protena.

Estn implicados procesos como : modificaciones de bases, modificaciones de azcares, formacin de hlices, formacin de complejos RNA protena, etc.

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