Prof. Augusto Dinis

BIOLOGIA CELULAR 1

Biologia Celular

Tráfego das proteínas de secreção

Alberts et al., 2008

A maior parte das proteínas destinadas ao Retículo

Endoplasmático (RE), complexo de Golgi, lisossomas,

membrana plasmática e exterior celular (exportação)

são sintetizadas em ribossomas que aderem ao RE

→ mecanismo de transporte co-traducional

Via da Secreção ou Via Secretora

O transporte de moléculas entre os compartimentos

desta via (compartimentos topologicamente

equivalentes mas sem continuidade espacial) é feito

por vesículas transportadoras

→ mecanismo de transporte vesicular

Biologia Celular

Tipos de Retículo Endoplasmático

Microfotografias TEM do Retículo Endoplasmático Rugoso (RER) e Retículo Endoplasmático Liso (REL)

Retículo Endoplasmático em microscopia de fluorescência

RE

RR

EL

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BIOLOGIA CELULAR 2

Biologia Celular

Síntese das proteínas de secreção

Representação esquemática da síntese de proteínas em ribossomas livres e em ribossomas ligados ao

retículo endoplasmático (proteínas de secreção) e microfotografias TEM de uma secção transversal

(à direita) e uma secção tangencial (encaixe superior) do Retículo Endoplasmático Rugoso

Biologia Celular

O que determina a síntese das proteínas de secreção em

ribossomas que aderem ao Retículo Endoplasmático?

Sequência-sinal de endereçamento para o Retículo Endoplasmático

� Sequência de 16 a 30 a.a. localizados no terminal N da cadeia peptídica eque inclui um ou mais a.a. carregados positivamente adjacentes a umsegmento contínuo de 6 ou mais a.a. hidrofóbicos (núcleo hidrofóbico).

� A sequência sinal é reconhecida e ligada por uma Partícula deReconhecimento do Sinal (PRS).

� A sequência sinal é clivada por uma peptidase durante a translocação parao lúmen do RER.

Extremo amina

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BIOLOGIA CELULAR 3

A Partícula de Reconhecimento do Sinal (PRS)

Biologia Celular

� Partícula ribonucleoproteica que liga simultaneamente a sequência sinal para o RER, a subunidade maior do ribossoma e o recetor proteico localizado na membrana do RER (recetor PRS).

� Consiste de seis polipeptídeos diferentes, dos quais cinco ligam uma pequena molécula de RNA (RNA da PRS) que medeia a interação com o RNA ribossómico:

P54 – liga a sequência sinal e o recetor PRS.

P68/P72 – necessárias para a translocação da

proteína.

P9/P14 – interagem com a subunidade maior do

ribossoma e provocam a interrupção temporária

da síntese da proteína.

O recetor da Partícula de Reconhecimento do Sinal

(recetor PRS)

Biologia Celular

� Proteína transmembranar integral

formada por duas subunidades

(subunidade α e subunidade β).

� A subunidade α interactua com o

complexo PRS + Sequência sinal +

Ribossoma e possui, juntamente com a

unidade P54 da PRS, actividade

GTPásica essencial para o ciclo de

ligação e dissociação da PRS com o seu

recetor.

� A subunidade β interactua com o

complexo translocador por onde

ocorre a passagem da proteína.

SRP

mRNA

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BIOLOGIA CELULAR 4

Biologia Celular

Características do transporte de proteínas para o Retículo

Endoplasmático (RE):

•A síntese da proteína precursora ocorre em ribossomas

ligados à membrana do retículo endoplasmático

• A síntese e a translocação ocorrem geralmente em simultâneo (translocação co-traducional)

• A proteína é translocada na sua conformação distendida

• A sequência sinal (localizada no extremo N) é clivadadurante a translocação da proteína para o lúmen do RE

• A translocação co-traducional requer GTP e a translocação

pós-traducional requer ATP

Translocação co-traducional de uma proteína para o lúmen do RE

Lodish et al., 2008

Biologia Celular

Etapa 2 – tradução da proteína é interrompida Etapa 4 – tradução da proteína é retomada

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BIOLOGIA CELULAR 5

Biologia Celular

Translocação pós-traducional de uma proteína para o lúmen do RE

Biologia Celular

• Nas leveduras, algumas poucas proteínas são transferidas para o RE após a sua completa tradução no citosol.

• A incorporação destas proteínas no RE não requer PRS. A sequência sinal é reconhecida por receptores proteicos distintos � complexo Sec62/63 associado ao translocador Sec61 da membrana do RE.

• Chaperonas Hsp70 citosólicas mantêm a cadeia polipeptídica numa conformação distendida para poder entrar no translocador.

• Chaperonas Hsp70 do RE, designadas BiP (binding proteins), auxiliam a cadeia peptídica a atravessar o canal funcionando como roquetes (com gasto de ATP).

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BIOLOGIA CELULAR 6

Biologia Celular

Inserção de proteínas na membrana do RE

� As proteínas destinadas à integração na

membrana dos organelos da via da secreção

são inseridas inicialmente na membrana do

RE em vez de serem libertadas no lúmen.

� Da membrana do RE, estas proteínas são

transportadas até ao seu destino final como

componentes membranares e não como

proteínas solúveis.

� Durante o transporte, a orientação da

proteína membranar é sempre preservada.

A orientação final das proteínas

membranares é estabelecida durante

a sua síntese na membrana do RER

Biologia Celular

Classes I, II e III � proteínas com uma só α-hélice na membrana (unitransmembranares ou “single-pass”):

• Tipo I – proteína ancorada com o segmento do terminal N na face luminal (exoplasmática) e o segmento do

terminal C na face citosólica ̶ sequência sinal presente no terminal N, a qual é clivada.

• Tipo II – proteína ancorada com o segmento do terminal N na face citosólica e o segmento do terminal C na

face lumenal ̶ proteínas sem sequência sinal no terminal N.

• Tipo III – proteínas com orientação similar às do Tipo I, mas sem a sequência sinal clivável.

Classe IV � proteínas com múltiplos segmentos hidrofóbicos inseridos na membrana � proteínas “multipass”.

Categorias das proteínas integrais de acordo com a sua topologia

Lodish et al., 2008

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BIOLOGIA CELULAR 7

Biologia Celular

Inserção de proteínas na membrana do RE

� As diferentes topologias das proteínas membranares refletem mecanismos distintos

usados pela célula para estabelecer a orientação dos segmentos peptídicos na bicamada

lipídica durante a síntese da proteína no RER

Síntese e integração de uma proteína transmembranar (Tipo I) na membrana do RE

(STA)

Lodish et al., 2008

Biologia Celular

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BIOLOGIA CELULAR 8

Processamento Proteolítico no RE

• Clivagens proteolíticas específicas (remoção de sequências

peptídicas)

Biologia Celular

• Algumas enzimas e hormonas formam-se a partir deprecursores de grandes dimensões (preproproteínas)

• Exemplo: insulina

- O precursor inicial (preproinsulina) contém umasequência sinal no terminal N que a endereça para o RE.

- A clivagem desta sequência durante a translocação namembrana do RE origina um segundo precursor(proinsulina).

- Este precursor é convertido em insulina após a união dasduas cadeias através de ligações dissulfureto e remoçãoproteolítica de um segmento peptídico interno.

Processamento Proteolítico no RE

• Formação de ligações dissulfureto (S-S)

Biologia Celular

A formação de pontes S-S entre as cadeias laterais de cisteínas é importante para o

enovelamento correcto das proteínas de secreção e manutenção da sua estrutura.

No citosol, os resíduos de cisteínas são mantidos no estado reduzido (–SH). No RE,

o ambiente oxidativo aí encontrado promove a formação de ligações S–S.

A formação de ligações S-S é catalisada pela enzima dissulfureto isomerase, uma das

proteínas residentes do lúmen do RE.

Insulina RNAse

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BIOLOGIA CELULAR 9

Processamento Proteolítico no RE

Biologia Celular

As proteínas translocadas para o RE atingem a sua conformação final por acção

sequencial de chaperonas presentes no lúmen do RE.

As chaperonas BiP ligam-se à cadeia logo que ela atravessa a membrana, mediando o

enovelamento da proteína e a montagem de proteínas com várias subunidades. Outras

proteínas importantes são as calnexinas e calreticulinas (chaperonas glicoproteicas).

• Enovelamento correcto das cadeias polipeptídicas e

montagem das subunidades de proteínas multiméricas

Processamento Proteolítico no RE

Biologia Celular

Tipos de oligossacarídeos nas glicoproteínas:

• Oligossacarídeos N-linked – ligação ao grupo amídico

da cadeia lateral da Asparagina (Asn) duma

sequência-sinal de glicosilação (Asn-X-Ser/Thr)

→ formados no retículo endoplasmático e complexo

de Golgi.

• Oligossacarídeos O-linked – ligação ao grupo

hidróxilo (OH) da cadeia lateral dos aminoácidos

Serina (Ser) ou Treonina (Thr)

→ formados no complexo de Golgi.

• Adição e processamento de carbohidratos (glicosilação)

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BIOLOGIA CELULAR 10

Glicosilação de Proteínas no RE

Lodish et al., 2008 Alberts et al., 2008

Biologia Celular

A maior parte das proteínas de

secreção (solúveis ou ligadas a

membranas) são glicosiladas.

Neste processo, um precursor

oligossacarídico é transferido em bloco

para as proteínas do RE.

Este precursor consiste de14 resíduos

de açúcar (2 x N-acetilglucosamina,

9 x manose e 3 x glucose).

O precursor é transferido para a cadeia

lateral de um grupo NH2 de uma

asparagina (Asn) que integra um sinal

de glicosilação � oligossacarídeos

“N-linked” ou “asparagine-linked”.

Biossíntese do complexo precursor dos oligossacarídeos N-linked(Lodish et al., 2008)

Biologia Celular

Glicosilação de Proteínas no RE

Prof. Augusto Dinis

BIOLOGIA CELULAR 11

Cooper & Hausman, 2009

Biologia Celular

Glicosilação de Proteínas no RE

Funções das cadeias laterais oligossacarídicas nas glicoproteínas:

• Intervêm na conformação tridimensional das glicoproteínas

• Ajudam a proteger as proteínas da proteólise

• Participam no reconhecimento e na adesão celular

• Funcionam como antigénios (ex.: nos grupos sanguíneos ABO)

Biologia Celular

Glicosilação de Proteínas no RE

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BIOLOGIA CELULAR 12

• Síntese de fosfolípidos derivados do glicerol (glicerofosfolípidos)– Fosfatidil-colina

– Fosfatidil-serina

– Fosfatidil-etanolamina

– Fosfatidil-inositol

• Síntese de colesterol

• Síntese de ceramida (precursor dos esfingolípidos)

Biologia Celular

Síntese de Lípidos no REL

Por serem extremamente hidrofóbicos, os lípidos são

sintetizados na membrana do REL (folheto citosólico), embora

os seus precursores provenham do citosol

As reações químicas necessárias à síntese dos lípidos

membranares são catalisadas por enzimas presentes no REL

Biologia Celular

Síntese de fosfoglicerídeos no REL

Lodish et al., 2008

Etapa 1: dois ácidos gordos previamente ativados com coenzima A são, sequencialmente,

esterificados a uma molécula de glicerol-3-fosfato, originando-se ácido fosfatídico

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BIOLOGIA CELULAR 13

Biologia Celular

Síntese de fosfoglicerídeos no REL

Lodish et al., 2008

Etapa 2: formação dos fosfodiésteres nos quais um dos ésteres é o 1,2-diacilglicerol e o

outro uma molécula hidrossolúvel como a colina, etanolamina, serina, inositol, etc…

Biologia Celular

Síntese de fosfoglicerídeos no REL

Lodish et al., 2008

Grande parte dos fosfoglicerídeos

sintetizados de novo no folheto

citosólico são translocados para o

folheto lumenal por ação de flipases

específicas

ane

Cooper & Hausman, 2009

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BIOLOGIA CELULAR 14

Biologia Celular

Como são distribuídos os lípidos pelos

diversos compartimentos intracelulares?

1. Lípidos membranares que se destinem a outras zonas do RE e ao invólucro

nuclear difundem lateralmente ao longo da membrana.

Alberts et al., 2008

2. Lípidos membranares que se destinem a outros compartimentos da via

da secreção são transportados em vesículas transportadoras.

3. Lípidos membranares que se destinem às

mitocôndrias, plastídeos ou peroxissomas

são transportados por proteínas solúveis

no citosol → proteínas de intercâmbio ou

transferência de fosfolípidos.