대한신장학회지 : 제 18 권 제 2 호 1999

1)

서 론

A ngiotens in Ⅱ(ANG Ⅱ)는 renin- angiotens in

* 이 논문은 1997년도 대한신장학회 Cobe 연구비에 의하여연구되었음.* 이 논문의 일부는 1998년 Philadelphia에서 개최된 미국신장학회에서 발표되었음.책임저자 : 유기환, 서울시 구로구 구로동 80번지

고려대학교 구로병원 소아과T el : 02)818- 6735, Fax : 02)858- 9396E- mail : guroped@chollian. net

sys tem(RAS)의 최종 산물로서 강력한 혈관 수축 작

용에 의하여 전신의 말초혈관 저항 및 신장의 항상성

유지에 중요한 역할을 한다1-3). 또 성장을 조절하는

인자로서 신장 사구체의 메산지음 세포와 같은 배양

된 세포에서 세포 분열을 자극하며 ANG Ⅱ 수용체

를 가지고 있는 세포의 성장과 재생에 중요한 역할을

담당한다4-7). ANG Ⅱ는 다양한 고혈압성 질환에서

증가되어있고 실제로 ANG Ⅱ를 차단하는 안지오텐

신 전환효소(ang iotens in converting enzym e, ACE)

안지오텐신 Ⅱ에 의한 신장 특이적 변화에 관한 연구

고려대학교 의과대학 소아과학교실

전혜원·유기환·최병민·홍영숙·이주원·김순겸

<요 약>

ANG Ⅱ는 인체의 혈역학을 조절하고 여러 조직에서 성장인자로서의 기능을 갖는 것으로 알

려져 있으며 최근에는 고혈압과는 독립적인 profibrotic m olecule로서의 가능성이 제시되고 있

다. 특히 만성 신질환의 경우 구조적인 손상은 주로 섬유화의 형태를 보이고 이러한 변화는 안

지오텐신 전환 효소 억제제의 사용으로 호전되었다는 보고가 있다. 따라서 A NG Ⅱ를 지속적으

로 투여하여 신장에서 섬유화의 발생 여부를 알아보고, 활성화된 대식세포에서 표현되는 ED- 1,

또 대식세포에서 분비되어 콜라겐의 축적과 섬유화를 유발하는 주된 싸이토카인으로 알려져 있

는 T GFβ1의 발현여부를 알아보아 ANG Ⅱ에 의한 조직손상의 기전을 규명하고자 다음 연구

를 고안하였다.

체중 190- 200g의 수컷 S prag ue- Daw ley 백서 36마리를 3군으로 나누어 os m otic m ini-

pum p (M odel 2001D, A lza Co, US A)를 등의 견갑골 사이에 피하 삽입하였다. 대조군은 플라

시보, low ANG 군은 50ng / m in(non- hypert ens iv e dos e), hig h ANG 군은 100ng /m in(hy -

pertens ive dos e)의 ANG Ⅱ를 7일간 0.5uL/ hr의 속도로 투여하였으며 약물투여 7일 후 희생

시켜 신장을 취하였다. M as s on- T richrom e 염색을 하고 point detect ion m ethod로 섬유화의

변화를 관찰하였으며 E D- 1 발현의 차이를 보기 위하여 면역조직화학염색을 시행하고, T GFβ1

의 발현을 보기 위하여 면역조직화학염색, RT - P CR, W es tern blott ing을 시행하였다.

실험결과 M as s on- T richrom e 염색에서 간질의 용적은 대조군에 비하여 low 및 hig h ANG

군에서 유의하게 증가하였고(P < 0.05), 섬유화는 신피질에서는 차이가 없었으나 수질에서 대조군

에 비하여 low 및 hig h ANG 군에서 증가하는 양상을 보였다. 면역조직화학 염색상 ED- 1 양

성인 세포는 사구체와 간질에 고르게 분포하였으며 대조군에 비하여 low 및 hig h ANG 군에서

유의하게 증가하였다(P < 0.05). T GF β1의 m RNA와 단백질은 대조군에 비하여 low 및 high

A NG 군에서 유의하게 증가하였다(P < 0.05). 따라서 ANG Ⅱ 투여시 고혈압이 발생하지 않은

경우도 신장의 섬유화가 발생하였으며 이는 활성화된 대식세포에 의하여 분비되는 T GFβ1의

증가에 의할 가능성이 있는 것으로 생각된다.

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— Haew on Cheon, et al. : Kidney - Specific Reg ulation by Antiotens in Ⅱ—

억제제는 고혈압의 치료 목적으로 임상에서도 사용되

는 약제이다.

그러나 Peter와 Noble8)은 ANG Ⅱ가 혈압과는 독

립적인 profibrotic molecule이라고 보고하였고 No-

ble9)은 손상된 조직 재생을 위한 세포수준의 변화들

은 ANG Ⅱ의 신합성을 유도하는 분자수준의 변화들

과 관련되며, A NG Ⅱ의 차단은 t r ans for m ing grow -

th factor β(T GFβ)를 억제하여 섬유화에 저항하므

로 혈압을 정상화시키는 것보다 T GF- β의 과다표현

을 억제하여 질병의 진행을 지연시킨다고 하였다.

손상된 조직의 재생은 단핵구나 대식세포를 포함한

염증세포나 형질전환된 간질의 섬유모세포로서 콜라

겐 합성과 섬유조직의 형성에 영향을 주는 근섬유모

세포들과 관련된다10). 조직 손상의 초기에 조기 염증

반응은 단핵구와 대식세포의 동원으로 시작되며 활성

화된 대식세포는 섬유화를 유발하는 주된 싸이토카인

인 T GFβ를 표현한다. T GFβ는 섬유모세포를 근섬

유모세포로 형질을 전환시키고, 근섬유모세포는 T GF

β1을 표현하게 되며 이것은 fibrillar type Ⅰ, Ⅲ 콜

라겐, t issue inhibitor(T IMP) to matrix metallo-

proteinases(MMP)의 표현을 유도하여 콜라겐의 축적

과 섬유화를 유발하는 것으로 알려져 있다11).

한편 백서에서 국소적인 대식세포의 침착 및 증식

은 항 사구체 기저막 항체에 의한 신염의 발생에 중

요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며9) Lan 등12)은

이 질환의 진행은 국소적인 대식세포의 증식에 의하

여 진행되므로 대식세포의 증식이 진행성 신질환의

강력한 국소적인 effector라고 하였다. 또 대식세포에

의한 조직손상의 진행과 회복은 대식세포의 apopto-

s is에 의하여 조절된다고 하였다.

따라서 저자는 백서에서 ANG II를 지속적으로 투

여하여 섬유화를 유발한 후 대식세포의 표식자인

ED- 1과 활성화된 대식세포에서 분비되는 섬유화를

유발하는 싸이토카인인 T GFβ1의 변화를 관찰하여

섬유화의 기전 규명하고자 하며 고혈압에 의한 물리

적인 효과를 제거하기 위하여 김 등13)의 방법에 따라

차별화된 농도의 ANG Ⅱ를 투여하여 다음 연구를

시행하였다.

대상 및 방법

1 . 실험동물

체중 190- 210gram의 수컷 Sprague- Daw ley 백서

36마리(세진 동물 상사, 서울, 대한민국)를 일반적인

사료로 사육하였으며 도착 후 3일간 안정하고, 펜토탈

소디움을 복강내 주사하여 마취시킨 후 osmotic mini-

pump(Model 2001D, Alza Co, USA)를 피하 삽입하

였다. 삽입하는 장소는 양쪽 견갑골 사이의 등부분이

며 osmotic minipump는 김 등13)의 방법에 따라 ANG

Ⅱ(Sigma, St . Louis , U.S.A.)를 50ng/분(low ANG

군), 100ng/분(high ANG 군), 또는 플라시보(대조군)

를 균일하게 방출하도록 하였다. 연구 기간 동안에 체

중은 매일 측정하였고 7일 후 백서를 희생하여 신장

을 얻은 후 무게를 재고 다음의 과정을 거쳤다.

2 . M as s on- T ric hrom e 염색

신장을 10% 포르말린 용액에 고정시키고 파라핀

용액안에서 고체화한 후 4μm로 절편한 조직을 슬라

이드에 부착시키고 xylene 용액에 탈파라핀시킨 후

Hematoxylin solution(Gill No.2, Sigma, St. Louis ,

U.S.A)으로 핵을 염색하고, Bierlich scarlet- acid

fuchsin solution(Sigma, St. Louis , U.S.A)으로 세포

질을 염색한 후 methyl blue(Sigma, St . Louis ,

U.S.A)로 콜라겐을 염색하여 조직의 섬유화를 관찰하

였다. 간질용적의 수치화는 point detection method

를 사용하였으며 25×25μm 크기의 화면을 중복되지

않게 20화면을 세어 %로 표시하였다.

3 . ED - 1의 면역 조직 화학 염색(Im m une his to-chem ical s ta in)

백서 희생시에 제거한 신장은 10% 포르말린 혹은

Bouin solution(Sigma, St. Louis , U.S.A)에 넣은 후

통상적 방법에 의해 파라핀 용액 내에서 고체화하였

다. 면역반응을 보이는 ED- 1은 아비딘- 비오틴 면역

과산화효소 방법(avidin- biotin immunoperox idas e

method, Vectastain ABC kit, CA, USA)에 의해 검

출하였고 일차 항체로서 Serotec사(Oxford, England)

의 항체(1:400으로 희석)를 사용하였고 대조군은

phosphate buffered s aline(PBS)을 일차 항체 대신

사용하였다. 그 후 각 검체의 슬라이드는 0.5% me-

thyl green solution(T revigen, Gaitisburg, MD, USA)

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