2015.02.14.

1

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEMÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR

www.aok.pte.hu

Abszorpciósspektroszkópia(Nyitrai Miklós; 2015 január 27.)

www.aok.pte.hu

Tartalomjegyzék

A fény;

Elektromágneses hullám kölcsönhatása anyaggal;

Az abszorpció definíciója;

Az abszorpció mérése;

Alkalmazások;

Speciális problémák, esetek.

www.aok.pte.hu

EmlékeztetõElektromágneses hullámok terjedése

A fény transzverzális elektromágneses hullám.

www.aok.pte.hu

Emlékeztetõ

vörös narancs sárga zöld kék ibolyatávolivörös

UV

390nm422nm492nm535nm586nm647nm760nm

növekvõ energia

Hogyan függ össze a frekvencia, hullámhossz és energia?

www.aok.pte.hu

Spektroszkópia

energia (eV)*

hullámhossz (nm)

frekvencia (Hz)

hullámhossz tart.

sp.-i módszer

*1eV = 1,602 x 10-19 J = 3,83 x 10-20 calwww.aok.pte.hu

Fényelnyelés híg oldatokban

- transzmittancia

- abszorpció

2015.02.14.

2

www.aok.pte.hu

Transzmittancia

anyagfényforrás detektor

T = I / I0

Általában százalékban (%) adjuk meg

I0 I

www.aok.pte.hu

Abszorpcióvagy

fényabszorpció

www.aok.pte.hu

Abszorpció

Minta(homogén)

fény

inte

nzitá

s

távolság

I0

I

Exponenciálisfüggvény!!!

I = I0 exp (-kx)

vagy

I = I0 e-kx

www.aok.pte.hu

N = N0 exp (-λt)

vagy

N = N0 e-λt

Megj.: hasonló a radioaktív bomlás egyenletéhez!

www.aok.pte.hu

minta

inte

nzitá

s

ln(távolság)

I0

I

Ez is exponenciális!

Megj.: eltérõ ábrázolások

www.aok.pte.hu

A Born-Oppenheimer közelítés:

Mag mozgás vs. elektron mozgás.

Mi áll a megfigyelések hátterében?

2015.02.14.

3

www.aok.pte.hu

Például vízmolekula rezgései

http://www1.lsbu.ac.uk/water/vibrat.html

www.aok.pte.hu

Eösszes = Eelektron + Evibrációs + Erotációs

Az egyes energia típusok megváltozása független. A megváltozás írható mint:

∆Eösszes = ∆Eelektron + ∆Evibrációs + ∆Erotációs

Az energia felbontása

www.aok.pte.hu

Energia séma: sávos spektrum

www.aok.pte.hu

Az energia típusok nagyságrendje:

∆Eelektron ~ 1,000 * ∆Evibrációs ~ 1,000,000 * ∆Erotációs

Az energia felbontása

www.aok.pte.hu

Az abszorpció értelmezése

S0

S1

Alap-állapot

S0 – S1

Gerjesztett-állapot Vibrációs relaxáció (10-12s)

gerjesztés (10-15s)

hν

T1

T1 → S0 (10-3 – 10-1s )

vibrációs szintek012345

S1 → T1: rendszerek közötti átmenet(10-10 – 10-8 s)

www.aok.pte.hu

A cél:

- legyen könnyen érthetõ

- legyen jól mérhetõ

- legyen additív

Megj.: a transzmittancia (T = I / I0) nem additív: ha az egyikkomponens átenged 50%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettõegyütt NEM 110%-ot fog átengedni!

Az abszorpció definíciója

2015.02.14.

4

www.aok.pte.hu

minta

inte

nzitá

s

távolság

I0

I

I = I0 10-ε(λ) c x

Paraméterek definíciója!Miért ε(λ) és nemcsak ε ?

A távolságfüggés más formában

www.aok.pte.hu

λ (nm)

absz

orpc

ió

Az ε értéke λ függõ!

Miért ε(λ) és nem csak ε?

www.aok.pte.hu

anyag

OD = A = - log (I / I0) = ε (λ) c x

I0 I

Röv.: „optical density” I = I0 10-ε(λ) c x

Az abszorpció definíciója

www.aok.pte.hu

fotometriai = abszorpciós spektroszkópiai

Fotometriai mérések megvalósítása

www.aok.pte.hu

fényforrás minta detektormonokromátor

Hogyan mérjük az abszorpciót?Egy fotométer egyszer; sémája.

www.aok.pte.hu

Spektrofotométer

Fõ komponensek:

1. Fényforrás

• UV fényforrás (~180-350nm): Deutérium lámpa

• Látható fény forrása (~350-800nm): Wolfram-izzó

2. Monokromátor: egyedi hullámhosszak kiválasztása.

3. Mintatartó: a minta és a referencia behelyezése a fényforrás és a detektor közé (küvetta: kisméretS, fényáteresztõ mintatároló egység)

4. fotodetektor: PMT, dióda…

5. Egyebek: lencsék, szSrõk, rések.

2015.02.14.

5

www.aok.pte.hu

Hogyan m;ködik a prizma?

www.aok.pte.hu

Hogyan m;ködik a prizma?

www.aok.pte.hu

A törésmutató hullámhosszfüggése

λ

n

λ

www.aok.pte.hu

A törésmutató hullámhosszfüggése

piros

lila

sárga

Fehér fényMonokromatikus fény

www.aok.pte.hu

Miért használunk referencia mintát?

Egy és két-utas fotométerek

www.aok.pte.hu

A fehérjék abszorpciója

2015.02.14.

6

www.aok.pte.hu

A fehérjék abszorpciója

www.aok.pte.hu

A fehérjék abszorpciójánakértelmezése

www.aok.pte.hu

A mért abszorpció: A

Szükség van egy ‘referencia’ számra (kalibráció): extinkciós koefficiens: ε

ε szokásos egységei: M-1cm-1, vagy (mg/ml)-1cm-1

Ha A = 0.55 és ε = 1.1 (mg/ml)-1cm-1

c = (A/ ε) mg/ml-ben; c = 0.5 mg/ml

Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása

www.aok.pte.hu

λ (nm)

absz

orpc

ió fluoreszcens próba

fehérje

Miért jó az additivitás?(példa)

www.aok.pte.hu

0 5 10 15 20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

S

[mDia3-FH2] (µM)

Példa egy másik alkalmazásra: elektroforézis kiértékelése

www.aok.pte.hu

- az abszorpció jelensége, értelmezése;

- az abszorpció definíciója;

- az abszorpció mérése;

- az abszorpció alkalmazásai.

A lényeg

2015.02.14.

7

www.aok.pte.hu

Köszönöm a figyelmet!