1. Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab Dan Transformasi Plasmid Biner

Zuriat, Vol. 19, No. 2, Juli-Desember 2008 130

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi

Plasmid Biner dengan Metode Tri Parental Mating

Construction and transformation of binary plasmid Cry 1Ab gene carrier using tri-

parental mating

Liberty1, M. Herman2, dan G.A. Watimena3

Key words : Cloning binary vector, Cry1Ab gene, transformation, tri parental mating.

Kata kunci : vektor cloning binary, gen Cry 1Ab, transformasi, persilangan tiga tetua.

Abstract

In order to develop seed borer resistant

soybean cultivar, the research to

construct and transform binary plasmid

Cry1Ab gene carrier into Agrobacterium

tumefaciens were done in Laboratorium

Biologi Molekuler dan Rekayasa

Genetika and in Laboratorium Fasilitas

Uji Terbatas Balai Besar dan

Pengembangan Bioteknologi dan

Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor

Indonesia from August 2003 to October

2004. The DNA cloning works were

including DNA restriction,

dephosphorilation, ligation,

transformation, and plasmid isolation.

Tri-parental mating method was used to

transform binary plasmid into A.

tumefaciens. 14.762 bp Cry1Ab gene

fragment were transformed in to E. coli.

Through tri-parental mating method, this

gene construction was successfully

introduced into A. tumefaciens.

Sari

Penelitian untuk mengkonstruksi plasmid

biner pembawa gen cry1Ab dan

mentransformasi plasmid biner tersebut

ke dalam Agrobacterium tumefaciens dalam upaya merakit tanaman kedelai

tahan penggerek polong dilakukan di

Laboratorium Biologi Molekuler dan

Rekayasa Genetika dan di Laboratorium

Fasilitas Uji Terbatas Balai Besar dan

Pengembangan Bioteknologi dan

Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor

pada bulan Agustus 2003 hingga

Oktober 2004.

Kloning DNA pada vektor plasmid

meliputi kegiatan restriksi DNA,

defosforilasi, ligasi, transformasi, dan

isolasi plasmid. Transformasi plasmid

biner ke dalam A. tumefaciens dilakukan

dengan metode triparental mating.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa

transformasi E. coli dengan gen cry1Ab

telah berhasil dilakukan dan diketahui

ukuran fragmen gen cry1Ab yang

diperoleh adalah 14.762 bp. Konstruksi

gen cry1Ab berhasil diintroduksikan

kedalam A. tumefaciens dengan metode

triparental mating.

Pendahuluan

Tanaman kedelai merupakan salah satu

tanaman pangan penting di Indonesia

setelah padi dan jagung, yang hingga

saat ini masih perlu diimpor. Kebutuhan

kedelai Indonesia terus meningkat

sebesar 2.24 juta ton setiap tahunnya,

padahal kapasitas produksi kedelai

nasional hanya mencapai 1.19 juta ton

dari luas areal tanam 967.002 ha (Badan

Pusat Statistik, 2002).

Kendala dalam peningkatan produksi

tanaman kedelai adalah tingginya

serangan penyakit dan hama tanaman,

terutama hama penggerek polong

kedelai yang disebabkan oleh Etiella

zinkenella dari ordo Lepidoptera. Hama

ini merupakan hama penting tanaman

1) Universitas Islam Negeri Sunan Gunung

Djati Bandung

2) Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya

Genetik Pertanian

3) Institut Pertanian Bogor

Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab dan Transformasi Plasmid Biner 131

kedelai yang hingga saat ini masih sulit

untuk diatasi, karena sifat

penyerangannya yang sulit dideteksi

secara cepat dari luar (Soekarno dan

Harnoto, 1985).

Penggunaan varietas kedelai tahan hama

penggerek polong merupakan cara yang

paling efektif, efisien, dan aman.

Namun, perakitan tanaman secara

konvensional masih menemukan

kendala, yaitu belum ditemukannya

sumber gen ketahanan di dalam plasma

nutfah kedelai yang ada saat ini.

Perakitan tanaman tahan dengan teknik

rekayasa genetik dapat dilakukan untuk

mengatasi masalah di atas. Teknologi

rekayasa genetik memberikan peluang

bagi pemulia tanaman untuk

memperoleh kelompok gen yang baru

dan lebih luas (Herman, 2002). Gen

yang ditransfer ke dalam genom

tanaman bisa berasal dari species lain

seperti, bakteri, virus, atau tanaman dari

jenis lain (Bennet, 1993).

Perakitan tanaman transgenik

melibatkan beberapa tahap dalam teknik

biologi molekuler dan seluler (Herman,

1996). Teknik rekayasa genetik yang

sering dipakai dan memberikan hasil

yang memuaskan adalah melalui

perakitan tanaman transgenik dengan

teknik transformasi. Menurut Sudarsono

(1994) teknik transformasi sangat

dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu

(1) tersedianya gen yang diinginkan, (2)

tersedianya cara untuk mentransfer dan

mengintegrasikan gen tersebut ke dalam

sel tanaman, dan (3) tersedianya cara

untuk meregenerasikan tanaman

transgenik untuk mengekspresikan gen

yang telah diintroduksikan tersebut.

Gen cry1Ab merupakan gen yang

mengkode Bt toksin dan terbukti efektif

mengatasi hama dari golongan

lepidoptera, sehingga dapat digunakan

untuk mengendalikan hama penggerek

polong kedelai. Gen cry1Ab tersebut

harus dikonstruksi dalam suatu vektor

plasmid untuk dapat ditransfer ke dalam

suatu tanaman. Plasmid yang digunakan

untuk transformasi tanaman tidak hanya

menggunakan gen dari karakter yang

diinginkan, tetapi juga gen marka untuk

seleksinya..

Konstruksi plasmid dan metode transfer

yang tepat merupakan salah satu faktor

penetu keberhasilan perakitan tanaman

transgenik. Dalam penelitian ini

dilakukan konstruksi plasmid biner

untuk mengatasi sulitnya menemukan

sisi pemotongan yang unik dengan

enzim restriksi pada plasmid Ti yang

sangat besar (Loedin et al. 1998).

Transformasi plasmid biner ke dalam A.

tumefaciens dilakukan dengan metode

triparental mating.

Bahan dan Metode

Penelitian dilakukan pada bulan

Agustus 2003 hingga Oktober 2004 di

Laboratorium Biologi Molekuler dan

Rekayasa Genetik Balai Besar

Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik

Pertanian (BB-Biogen) Bogor.

Bahan yang digunakan dalam percobaan

ini adalah dua macam plasmid, yaitu

pSBB (pembawa gen cry1Ab yang

dikendalikan oleh promotor 35S CaMV

dan terminator nos) dan pCambia 1301

(pembawa gen penyeleksi bakteri kanR,

penyeleksi tanaman hph, gen gus, dan

multiple cloning site pada T-DNA),

serta Agrobacterium tumefaciens strain

LBA 4404 (koleksi Balai Penelitian

Perkebunan (Balitbun) Bogor.

Kloning DNA pada vektor plasmid

meliputi kegiatan restriksi DNA,

defosforilasi, ligasi, transformasi, dan

isolasi plasmid (Sambrook et. al 1989).

Restriksi plasmid pSBB dan pCambia

1301 dilakukan dengan menggunakan

enzim HindIII. Defosforilasi dilakukan

dengan metode calf intenstinal akaline

phaspatase (CIP) terhadap vektor

pCambia yg sudah dipotong dan diligasi


dengan fragmen cry1Ab mengikuti

metode GibcoBRL.

Transformasi plasmid ke dalam E. coli

DH5α dilakukan dengan metode kejutan

panas dan isolasi DNA plasmid dari

kultur cair bakteri dilakukan dengan

metode lisis alkalis mengikuti metode

Sambrook et al. (1989). Transformasi

gen cry1Ab ke dalam A. tumefaciens

LBA 4404 dilakukan dengan metode

triparental mating mengikuti metoda

yang dikemukakan oleh Ditta et al.

(1980). Konfirmasi hasil integrasi gen

cry1Ab ke dalam A. tumefaciens

dilakukan dengan teknik PCR dengan

menggunakan primer spesifik untuk gen

cry1Ab. Primer yang digunakan adalah :

5’-CGA CAT CTC CTT GTC CTT

GAC AC-3’ dan 5’-ACA CCC TGA

CCT AGT TGA GCA AC-3’.

Hasil dan Pembahasan

Konstruksi plasmid biner diawali

dengan pemotongan dua plasmid

(pCambia 1301 dan pSBB)

menggunakan enzim restriksi HindIII.

Berdasarkan peta plasmid, pSBB

memiliki gen cry1Ab yang lengkap

dengan promotor dan terminatornya

berada di antara dua sisi enzim restriksi

HindIII tersebut.

Hasil pemotongan pada plasmid

pCambia 1301 dengan enzim restriksi

HindIII diperoleh satu fragmen

berukuran 11.837 kb dan pada plasmid

pSBB diperoleh dua fragmen berukuran

2.925 kb (fragmen gen cry1Ab) dan

2.74 kb (Gambar 1). Pemotongan

plasmid pSBB dengan enzim HindIII

bertujuan untuk memisahkan fragment

gen cry1Ab dari vektor awalnya

(pSBB). Ukuran fragmen-fragmen yang

diperoleh tersebut sesuai dengan ukuran

fragmen insersi pada peta plasmid yang

dikeluarkan oleh Cambia Co. Australia.

Fragmen gen cry1Ab dan pCambia

1301 selanjutnya dielusi dari gel

agarose untuk digunakan pada proses

ligasi. Defosforilasi merupakan tahap

yang paling penting dan dilakukan

sebelum ligasi. Defosforilasi dapat

mengurangi terbentuknya hasil ligasi

sendiri. Proses defosforilasi pada

umumnya dilakukan dengan

menggunakan enzim akaline fosfatase

seperti calf intestinal phasphatase

(CIP). CIP sendiri merupakan

glikoprotein yang berfungsi untuk

memindahkan ikatan 5’-phasphatase

dari DNA linear (Sambrook et al.

1989). Proses defosforilasi ini dilakukan

pada pCambia 1301 dan berfungsi untuk

mencegah tersambungnya kembali

fragmen tersebut. Penyambungan

kembali fragmen dapat menghambat

penyisipan gen cry1Ab pada plasmid

biner.

Gambar 1. Pola restriksi pCambia 1301 dan pSBB

M = Marka, 1 =pCambia 1301, 2 = pCambia 1301+HindIII, 3 = pSBB dan HindIII, 4 = pSBB diencerkan 10 x, 5 = pSBB, dan λ = 50 ng/µl, a = pCambia ukuran 11.837 kb, b = gen cry1Ab ukuran 2.935 kb, c = PGEM-4z ukuran 2.74 kb.


Hasil penyambungan gen cry1Ab

dengan fragmen pcambia 1301 (plasmid

biner modifikasi) menggunakan enzim

T4 DNA ligase diintroduksi dengan

proses transformasi kedalam bakteri E.

coli (sel kompeten DH5α) dan

ditumbuhkan pada media LB

padat+kanR selama 16 jam pada suhu

37oC. Koloni-koloni yang terbentuk dari

masing-masing perlakuan (Gambar 2)

mengindikasikan keberhasilan

konstruksi plasmid rekombinan yang

telah membawa gen cry1Ab di bawah

kontrol promotor 35S CaMV.

Gambar 2. Koloni bakteri hasil transformasi ke dalam E. Coli 1 = Plasmid rekombinan ulangan 1, 2 = Plasmid rekombinan ulangan 2, 3 = Plasmid rekombinan ulangan 3

Dari koloni-koloni yang terbentuk dapat

diketahui bahwa konstruksi plasmid

rekombinan dilakukan dengan

menyisipkan gen cry1Ab di bawah

kontrol promotor 35S CaMV ke dalam

plasmid vektor pCambia 1301. Proses

ligasi antara DNA vektor pCambia 1301

dengan fragmen gen cry1Ab

menghasilkan plasmid rekombinan

pCambia-cry1Ab berukuran 14.762 bp

(Gambar 3) yang merupakan gabungan

dari vektor pCambia 11.837 bp dan

fragmen cry1Ab 2.935 bp.


Gambar 3. Peta plasmid rekombinan pCambia-cry1Ab

DNA rekombinan yang diperoleh

kemudian ditransformasikan kedalam

sel kompeten E. coli melalui metode

kejutan panas. Transformasi ke dalam

sel E. coli bertujuan untuk

memperbanyak plasmid rekombinan.

Verifikasi terhadap E. coli yang

mengandung plasmid biner (pCambia

dengan fragmen gen cry1Ab) dilakukan

dengan cara uji pola restriksi

menggunakan enzim restriksi terhadap

delapan sampel DNA plasmid dari

koloni replika. Pada tahap awal

dilakukan deteksi pola plasmid

rekombinan melalui pemotongan

delapan sampel DNA plasmid dari

koloni replika menggunakan enzim

HindIII.

Berdasarkan hasil restriksi terhadap

DNA rekombinan yang berasal dari

koloni 1.3 dan 3.2 terdapat dua fragmen

berukuran 11.,837 bp dan 2.925 bp

(gambar 4) dimana fragmen pertama

merupakan ukuran dari plasmid vektor

pCambia 1301 dan fragmen kedua

merupakan ukuran dari promotor 35S

CaMV (800 bp), gen cry1Ab (1.845)

dan terminator nos (280 bp). Dugaan

awal dari kedua plasmid ini adalah

pCambia 1301 yang telah tersisipi

fragmen gen cry1Ab.


Gambar 4. hasil restriksi plasmid rekombinan dengan HindIII

M = Marka, 1 =pCambia 1301, 2 = pCambia 1301+HindIII, 3 = cry1Ab, A = Koloni 1.1, B = Koloni 1.2, C = Koloni 1.3, D = Koloni 2.1, E = Koloni 2.2, F = Koloni 2.3, G = Koloni 3.1, H = Koloni 3.2, λ1 = 100 ng/µl, λ2 = 200 ng/µl, λ3 = 300 ng/µl, a = fragmen berukuran 2.925 kb, b = fragmen berukuran 2.925 kb

Tahap kedua dilakukan kembali deteksi

pola plasmid rekombinan melalui

pemotongan empat sampel DNA

plasmid dari koloni replika

menggunakan enzim hindIII.

Berdasarkan hasil restriksi

menggunakan enzim tersebut hanya

koloni yang berasal replika 3.5 yang

diperkirakan rekombinan. Selanjutnya

DNA plasmid dari koloni 3.2 dan 3.5

dipotong dengan enzim BamHI+EcoRI.

Hasil pemotongan dengan enzim

tersebut dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Hasil restriksi plasmid rekombinan dengan enzim BamHI+EcoRI

M = Marka, 1 = 3.5+BamHI+EcoRI, 2 = 3.5+EcoRI, 3 = 3.5+HindIII, 4 = 3.2+BamHI+EcoRI, 5 = 3.2+EcoRI, 6 = 3.2+HindIII


Berdasarkan pola restriksi

menggunakan enzim EcoRI+BamHI

plasmid rekombinan 3.2 mempunyai

empat fragmen berukuran 1845 bp, 280

bp, 37 bp, dan 12.600 bp. Hal yang

sama juga dilakukan pada plasmid

rekombinan 3.5 dan diperoleh empat

fragmen berukuran 1845 bp, 830 bp,

280 bp, dan 11.807 bp. Dari hasil

pemotongan menggunakan enzim

restriksi diperoleh dua versi penyisipan

gen cry1Ab dalam vektor pCambia

1301, yang disebabkan karena kedua

ujung DNA baik vektor maupun gen

sisipan mempunyai sekuen pengenal

yang sama (HindIII). Perbedaan pada

posisi ini disebabkan karena arah

ekspresi gen cry1Ab. Pada gen cry1Ab1

posisinya searah dengan jarum jam,

sedangkan pada gen cry1Ab2 posisinya

berlawanan dengan arah jarum jam. Hal

ini menunjukkan bahwa plasmid

pCambia-cry1Ab1 dan pCambia-

cry1Ab2 memiliki pola restriksi seperti

yang diharapkan. Plasmid yang

mempunyai pola restriksi seperti yang

diharapkan dapat digunakan untuk

transformasi ke dalam A. tumefaciens

(Gambar 5).

Transformasi bakteri E. coli DH5α

dengan gen cry1Ab yang terdapat dalam

plasmid pCambia 1301 telah berhasil

dilakukan. Keberhasilan transformasi ini

dapat dilihat dari transforman E. coli

DH5α yang tumbuh pada media seleksi

yang mengandung 50 mg/ l kanamisin.

Kemampuan tumbuh pada media seleksi

dikarenakan adanya gen nptII

(neomycine phosphotransferase)

penyandi ketahanan terhadap antibiotik

kanamisin pada plasmid pCambia 1301.

Keberhasilan transformasi ke dalam E.

coli DH5α ini dilakukan pengujian

dengan menggunakan enzim-enzim

restriksi.

Plasmid rekombinan yang telah dicek

pola restriksinya ditransformasikan ke

dalam A. tumefaciens LBA 4404

melalui metode triparental mating.

Proses ini menggunakan tiga tetua, yaitu

A. tumefaciens LBA 4404, E. coli HB

101, dan E. coli DH5α yang

mengandung plasmid rekombinan yang

ditumbuhkan dalam media seleksi

LB+50 mg/ l kanamisin+25 mg/ l

rimpafisin untuk menyeleksi bakteri-

bakteri donor.

Proses triparental mating telah berhasil

mengintroduksikan plasmid pCambia-

cry1Ab ke dalam A. tumefaciens LBA

4404 (Gambar 6). Plasmid pCambia-

cry1Ab yang terdapat pada E. coli

DH5α hasil transformasi (sebagai

donor) dipindahkan ke dalam A.

tumefaciens LBA 4404 (sebagai

resipien) melalui konjugasi dengan

bantuan E. coli HB 101 (pRK 2013)

yang resisten terhadap antibiotik

kanamisin, rentan terhadap antibiotik

rimpafisin dan resipien A. tumefaciens

LBA 4404 resisten terhadap rimpafisin

dan rentan terhadap kanamisin. Bakteri

yang mampu tumbuh pada media seleksi

ini hanya A. tumefaciens LBA 4404

yang telah mengandung plasmid

pCambia-cry1Ab hasil triparental

mating (resisten terhadap kanamisin dan

rimpafisin).

Hasil transformasi tersebut ditandai

dengan munculnya koloni pada media

seleksi. Koloni yang tumbuh pada

media seleksi selanjutnya di uji PCR

untuk membuktikan bahwa fragmen gen

cry1Ab telah masuk ke dalam A.

tumefaciens.


Gambar 6. Transformasi triparental mating ke dalam A.tTumefaciens

a. E. coli rekombinan, b. Plasmid helper PRK2013, c. A. tumefaciens LBA 4404, d. Perkawinan dengan triparental mating, e. Triparental dalam media seleksi


Analisis PCR merupakan metode

deteksi secara cepat untuk mengetahui

keberadaan transgen di dalam jaringan

tanaman putatif trangenik. Reaksi

amplifikasi dilakukan berdasarkan

metode Wang et al. (1993) yang

dimodifikasi dengan menggunakan mesi

PCR MJ Research PCT-100.

Keberadaan gen cry1Ab diindikasikan

dengan produk PCR berukuran 100 bp.

Hasil analisis PCR menunjukkan bahwa

koloni dari triparental mating 3.2 dan

3.5 positif membawa gen cry1Ab

(Gambar 7). Hal ini menunjukkan

bahwa A. tumefaciens telah membawa

gen cry1Ab dan dapat

ditransformasikan ke dalam genom

tanaman.

Gambar 7. Hasil PCR triparental mating

M = Marka, 1 = triparental 3.2, 2 = triparental 3.%, 3 = plasmid 3.2, 4 = plasmid 3.5, dan 5 = kontrol

Kesimpulan

Berdasarkan uji pola restriksi,

transformasi E. coli dengan gen cry1Ab

telah berhasil dilakukan dan diketahui

ukuran fragmen gen cry1Ab yang

diperoleh adalah 14.762 bp. Konstruksi

gen cry1Ab berhasil diintroduksikan

kedalam A. tumefaciens dengan metode

triparental mating.

Daftar Pustaka

Badan Pusat Statistik. 2002. Statistika

Indonesia.Statistical Year Book of

Indonesia. Jakarta. Indonesia.

Bennet, J. 1993. Genese for crop

improvement. Genetic

Engineering. 16 : 93-113.

Ditta, G.S., D. Stanfield, Corbin, D.R.

Helinski. 1980. Broad host range

DNA cloning system for gram

negative bacteria : construction of

a gene bank of Rhizobium meliloti.

Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 77 :

7344-7351.

Herman. 1996. Rekayasa genetik untuk

perbaikan tanaman. Buletin

AgroBio. 1(1) : 24-34.

Sambrook, JEF Fritsch, and T.

maniatis. 1989. Molecular Cloning

A laboratory Manual (2nd

ed.).


Cold Spring Harbor Laboratory

press. New York. USA.

Soekarno, D. dan Harnoto. 1985.

Pengendalian Hama Kedelai.

Dalam S. Somaatmadja,

Mismunadji, Sumarno, Mahyudi

Syam, S.O. Manurung, dan

Yaswadi. Kedelai. Puslitbangtan.

Badan Litbang Pertanian. Halaman

: 310-330.

Sudarsono. 1994. Penggunaan protein

pembungkus (coat protein) dari

pathogen virus dan rekayasa

genetik untuk memperoleh

tanaman unggul tahan virus. JIPI.

4(2) : 34-39

Wang K., 1995. Seeds. Slater. Iowa.

USA.

Documents

1. Konstruksi Plasmid Biner Pembawa Gen Cry1Ab Dan Transformasi Plasmid Biner