(12) Oversettelse av europeisk patentskrift (19) NO

(11) NO/EP 2190451 B1

NORGE (51) Int Cl. C07K 7/08 (2006.01) A61K 38/04 (2006.01) A61P 9/10 (2006.01)

Patentstyret

(21) Oversettelse publisert 2014.03.03

(80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet

2013.10.16

(86)

Europeisk søknadsnr 08782809.1

(86)

Europeisk innleveringsdag 2008.08.08

(87)

Den europeiske søknadens Publiseringsdato

2010.06.02

(30) Prioritet 2007.08.10, AT, 12582007

(84)

Utpekte stater

AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR

(73) Innehaver Affiris AG, Karl-Farkas-Gasse 22, 1030 Wien, AT-Østerrike

(72) Oppfinner BRUNNER, Sylvia, Lange Gasse 67/20, A-1080 Vienna, AT-Østerrike

LÜHRS, Petra, Römersthalgasse 1/27, A-1110 Vienna, AT-Østerrike MATTNER, Frank, Cobenzlgasse 134, A-1190 Vienna, AT-Østerrike SCHMIDT, Walter, Böcklinstrasse 19, A-1020 Vienna, AT-Østerrike WITTMANN, Barbara, Josef Ressel-Strasse 3N, A-2514 Traiskirchen, AT-Østerrike

(74) Fullmektig Protector Intellectual Property Consultants AS, Oscarsgate 20, 0352 OSLO, Norge

(54) Benevnelse Behandling av aterosklerose

NO/EP2190451

1BEHANDLING AV ATEROSKLEROSE

Foreliggende oppfinnelse vedrører forhindrelse og behandling av aterosklerose,

aterosklerose risikable sykdommer og aterosklerose følgesykdommer.

Følgesykdommer av aterosklerose, så som perifere arterielle okklusjonslidelser,5

koronar hjertesykdom så vel som apoplektisk cerebral insult, er fremdeles blant

hovedårsakene til dødsfall i USA, Europa og i store deler av Asia. Utviklingen

av aterosklerose er ansett å være en kronisk progressiv inflammasjon av

hjertekar-veggen som er kjennetegnet ved en kompleks interaksjon av

vekstfaktorer, cytokiner og celle-interaksjoner. I henhold til ”respons-til-skade”-10

hypotesen, utgjør ”skaden” på endotelium den innledende hendelsen ved

lidelsen, hvilket fører til en endotelial dysfunksjon som trigger en kaskade av

cellulære interaksjoner som kulminerer i dannelse av de aterosklerotiske

lesjonene. Som risikofaktorer som fremmer en slik ”skade” er det nevnt

eksogene og endogene påvirkninger, hvilket korrelerer statistisk signifikant med15

aterosklerose. For eksempel økt og modifisert LDL, Lp(a), arteriell hypertensjon,

diabetes mellitus og hyperhomocysteinemi regnes som de viktigste av disse

endotel-ødeleggende faktorene. Siden endotelium ikke utgjør en stiv, men mye

heller en ekstremt dynamisk barriere, skjer det et mangfold molekylære

endringer i forløpet med den endoteliale dysfunksjonen i tilegg til en økt20

permeabilitet for lipoproteiner, hvilke molekylendringer har en avgjørende

påvirkning på interaksjonen til monocytter, T-lymfocytter og endotelial-celler.

Ved uttrykket av endotelial-adhesjonsmolekyler av typen E, L og P selektiner,

integriner, ICMA-1, VCAM-1, og blodplate-endotelialcelle-adhesjonsmolekyl-1,

skjer det en adhesjon av monocytter og T-lymfocytter på innsiden. Den25

etterfølgende migreringen leukocytter over endotelium blir mediert av MCP-1,

interleukin-8, PDGF, M-CSF og osteopontin. Via den såkalte

fjerningsreseptoren (scavenger receptor) er makrofager og monocytter som

holder til i intima i stand til å ta opp de penetrerte LDL partiklene og avsette dem

som vakuoler av kolesterolestere i cytoplasmaet. Skumcellene som blir dannet30

på denne måten akkumuleres hovedsakelig i grupper i området til intima-karet

og danner ”fettstrek”-lesjoner som opptrer allerede i barndommen. LDL er

lipoproteiner med lav tetthet og blir dannet av katabolske effekter av

NO/EP2190451

2

lipozyttenzymer fra VLDL partikler som er rike på triglyserid. I tillegg til sine

skadelige egenskaper på endotelialceller og glatte muskelceller i mediet, har

LDL videre en kjemoaktisk effekt på monocytter og er i stand til å øke

ekspresjonen av MCSF og MCP-1 til endotelialcellene via geneforsterkninger. I5

kontrast til LDL, er HDL i stand til å ta opp kolesterolestere fra fylte makrofager

mediert ved apolipoprotein E, under dannelse av såkalte HDLc komplekser.

Ved interaksjon av SR-B1 reseptorene, er disse kolesterolester-fylte partiklene i

stand til å binde seg til hepatocytter eller til celler til adrenal korteks og tilføre

kolesterol for dannelsen av henholdsvis gallesyrer steroider. Denne10

mekanismen er kalt omvendt kolesteroltransport og belyser den beskyttende

funksjonen til HDL. Aktiverte makrofager er i stand til å presentere antigener via

HLA-DR og derved aktivere CD4 og CD8 lymfocytter, som deretter stimuleres til

å utsondre cytokiner, så som IFN-gamma og TNF-alfa, og videre bidra til å øke

den inflammatoriske reaksjonen. I det videre forløpet av lidelsen vil de glatte15

muskelcellene til mediet starte å vokse inn i området til intima som har blitt

endret av inflammasjon. På denne måten dannes de intermediære lesjonene

ved dette trinnet. Ved å starte fra den intermediære lesjonen, vil den

progressive og kompliserte lesjonen utvikles over tid, hvilket er morfologisk

karakterisert av en nekrotisk kjerne, cellulært avfallsmateriale og en fibrinøs20

krone rik på kollagen på siden av lumen. Dersom celletallet og andelen av

lipoider øket kontinuerlig, vil det oppstå rifter i indotelium og eksponere

overflater med trombotiske egenskaper. På grunn av adhesjonen og

aktiveringen av trombocytter ved disse riftene, vil det bli frigjort granuler som

inneholder cytokiner, vekstfaktorer og trombin. Proteolytiske enzymer av25

makrofager er ansvarlige for fortynningen av den fibrinøse kronen, som til slutt

vil føre til at forkalkningene brister med påfølgende trombose og stenosering av

karene og en akutt iskemi hos endekarene.

Forskjellige risikofaktorer blir holdt ansvarlig for dannelsen av aterosklerotiske30

lesjoner. Hyperlipoproteinemi, arteriell hypertensjon og misbruk av nikotin er

spesielt signifikant i denne forbindelse. En lidelse som innebærer en stort

overskudd av totalt og LDL kolesterol er den familiære hyperkolesterinemi (FH).

NO/EP2190451

3

Denne tilhører en av de hyppigste monogenetisk arvede metabolske lidelser.

Den moderate heterosygøse form oppstår ved en frekvens på 1:500, den

homozygotiske formen med 1:1 million, klart mer sjelden. Årsaker til

hyperkolesterinemi er mutasjoner i LDL reseptorgenet på den korte armen til5

kromosom 19. Disse mutasjonene kan være ødeleggelser, innsettinger eller

punktmutasjoner. De karakteristiske funnene av lipoproteiner i familiær

hyperkolesterinemi er en økning av totalt og LDL kolesterol ved høyst normale

triglyserid og VLDL konsentrasjoner. Ofte blir HDL redusert. Fenotypisk er det

en type IIAa-hyperlipoproteinemi. I den heterozygotiske formen blir det totale10

kolesterolet økt to til tre ganger, i den homozygotiske formen blir den økt med

en faktor fem til seks, sammenlignet med det normale nivået. Klinisk

manifesterer familiær hyperkolesterinemi seg ved en tidlig koronarsklerose. Hos

heterozygotiske menn opptrer som regel de første symptomene på en koronar

hjertelidelse (CHD) mellom deres 30. og 40. leveår, hos kvinner i gjennomsnitt15

10 år senere. 50 % av de påvirkede mennene dør som en konsekvens av dere

koronarsklerose før de fyller 50 år. I tillegg til massivt økede LDL nivåer, er også

reduserte HDL konsentrasjoner ansvarlig for en rask utvikling av aterosklerose.

Aterosklerotiske endringer kan også bli manifestert på kar utenfor hjerte, så

som aorta, halsartier og perifere arterier. Med den homozygotiske formen av20

lidelsen utvikles koronarsklerose allerede i barndommen. Det første

hjerteinfarktet skjer ofte før 10 års alder, og i de fleste tilfellene dør de berørte

personene før de er 20 år gamle. Utviklingen av xantomatose er en funksjon av

nivået av serum kolesterol og varigheten til lidelsen. Tilnærmet 75 % av de

berørte heterozygotiske individene som er mer enn 20 år gamle oppviser sene25

xantomatose. De homozygotiske individene har hud og sene-xantomatose i

nesten 100 %. Lipidavsetninger kan også skje på øyelokket og hornhinnen

(xantelasma; Arcus lipoider). Imidlertid er disse ikke et spesifikt tegn på

hyperkolesterinemi, siden de også finnes ved normale kolesterolnivåer. Videre,

med FH, opptrer akutte artritter og tendosynovitider hyppig. De individuelle30

lipoproteinene skiller seg med hensyn til størrelse og tetthet, siden de

inneholder forskjellige store andeler av lipider og proteiner, såkalte

apoproteiner. Tettheten øker med økende protein og avtagende lipidandel.

NO/EP2190451

4

På grunn av deres ulike tettheter, kan de separeres i forskjellige fraksjoner ved

ultrasentrifugering. Dette er grunnlaget for klassifiseringen av lipoproteinene i

deres hovedgrupper: chylomikroner, lipoproteiner med meget lav tetthet (VLDL),

lipoproteiner med mellomliggende tetthet (IDL), lipoproteiner med lav tetthet5

(LDL), lipoproteiner med høy tetthet (HDL), lipoprotein (a) (Lp(a)). Blant

lipoproteinene med høy aterogent potensiale er det primært LDL, Lp(a) og

VLDL. LDL har en tetthet på tilnærmet d=1.006-1.063 g/ml. Kjernen er dannet

av estrifiserte kolesterolmolekyler. Denne svært hydrofobe kjernen er omgitt av

omhylning av fosfolipider, ikke-estrifisert kolesterol og et enkelt Apo B10010

molekyl. I tillegg er apoprotein E funnet på overflaten av LDL partiklene.

Funksjonen til LDL består i å transportere kolesterol til perifert vev hvor –

formidlet av apoproteinet B-100 – blir tatt opp i cellene via LDL reseptoren. I

omfattende epidemologiske studier har det blitt vist en positiv korrelasjon

mellom nivået av serum kolesterol og hyppigheten av en koronar hjertelidelse.15

LDL kolesterolnivåer høyere enn 160 mg/dl utgjør en høy kardiovaskulær risiko.

Ved siden av nivået av LDL kolesterol, spiller også nivået av kar-beskyttende

HDL kolesterol en viktig rolle ved vurdering av risikoprofilen for kardiovaskulære

lidelser. Nivåer under 35 mg/dl er forbundet med en økt risiko. VLDL er

lipoproteiner med en lav tetthet (d=0,94 – 1,006 g/ml) og en høy andel20

triglyserid. I det vesentligste inneholder VLDL apoprotein C, og små andeler av

apoproteiner B-100 og E. Til forskjell fra chylomikroner, vil ikke VLDL bestå av

matvarelipider, men blir syntetisert i leveren fra endogent dannede triglyserider

og sekretert inn i sirkulasjonen. Som med chylomikronene, blir triglyseridene

hydrolysert av apoprotein C-II-aktivert lipoprotein-lipase, og de frie fettsyrene25

blir tilført til muskler og fettvev. De gjenværende kolesterolrike VLDL restene blir

kalt lipoproteiner med intermediær tetthet på grunn av sin høyere tetthet.

Lipoprotein (a) (Lp(a)) har en tetthet på 1,05 til 1,12 g/ml og ligner LDL i sin

sammensetning. I tillegg til apoprotein B-100, består dets proteinandel av

apoprotein (a) som har karakteristikken til Lp(a). Hittil er det kjent veldig lite om30

fysiologien og funksjonen til Lp(a). Siden apoprotein (a) molekylet har en høy

sekvenshomologi til plasminogen, er det antatt at Lp(a) både fremmer

dannelsen av tromber på aterosklerotiske forkalkninger og også har en

NO/EP2190451

5

aterogen effekt. Retrospektive studier har vist en korrelasjon mellom økt Lp(a)

og en CHD. Likeens har metaanalyse av et antall prospektive studier vist at

Lp(a) er en uavhengig risikofaktor for opptreden av et CHD. Nivåer på mellom

15 og 35 mg/dl er ansett å være normalt. Så langt kan Lp(a) påvirkes av verken5

diett eller medikamenter. Derfor er terapimålene begrenset til å redusere

ytterligere risikofaktorer. Spesielt synes en senkning av LDL kolesterolet å

senke den kardiovaskulære risikoen med Lp(a). I patogenese av aterosklerose

er imidlertid betydelig patofysiologisk betydning tilegnet koaguleringsfaktorer.

Epidemologiske funn foreslår en korrelasjon mellom fibrinogenkonsentrasjonen10

i plasma og utviklingen av en koronar hjertelidelse, og primært et myokardial

infarkt. I denne kontekst, har økte fibrinogennivåer (>300 mg/dl) vist seg å være

en uavhengig indikator og risikofaktor for kardiovaskulære lidelser. Også høye

konsentrasjoner av vevsplasminogen aktivator inhibitor tPA-I er forbundet med

opptreden av CHD. Forholdet mellom hyper-triglyseridemi og koronar risiko er15

en forskjellige i hvert tilfelle, avhengig av årsaken til økningen av blodlipider. PÅ

tross av diskusjonen om hvorvidt eller ikke triglyserider skal anses som en

uavhengig risikofaktor er det uomtvistelig at de spiller en viktig rolle i

patogenesen til koronare hjertelidelser. Forekomsten av lidelsen er høyest hos

pasienter som oppviser høyt LDL kolesterol og en høyt triglyserid nivå.20

Kolesterolester overføringsproteinet (CETP) er et stabilt plasma glykoprotein

som er ansvarlig for overføringen av nøytrale lipider og fosfolipider mellom

lipoproteiner og som nedregulerer plasmakonsentrasjonen av HDL.

Inhiberingen av CETP lipidoverføringsaktiviteten har allerede blitt foreslått som25

en terapeutisk tilnærmelse for å øke HDL plasmanivået. Det er utallige årsaker

som foreskår at reduksjonen av CETP aktivitet i plasma vil føre til en økning av

HDL nivåene. CETP reduserer derved HDL konsentrasjonen ved overføringen

av kolesterolestere fra HDL til LDL og VLDL. I dyreforsøk med kaniner og

hamstere, førte transient inhibering av CETP med anti-CETP monoklonale30

antistoffer, antisens oligonukleotider eller CETP inhibitorer til økte HDL nivåer.

Varig CETP inhibering med antisens oligonukleotider økte HDL nivåene og førte

NO/EP2190451

6

derved til en reduksjon av aterosklerotiske lesjoner i kanin-pattedyrsmodellen

for aterosklerose.

I litteraturen er det beskrevet flere CETP inhibitorer, noen av hvilke er under5

klinisk utprøvning (for eksempel Anacetrapib (Krishna R., Lancet 370 (9603)

(2007) : 1904-14) og Torcetrapib (Sikorski, J. A., J. Med. Chem. 49 (1) (2006):

1-22).

I US 5.512.548 og i WO 93/011782 er det beskrevet polypeptider som er i stand10

til å inhibere CETP som katalyserer overføringen av kolesterolestere fra HDL til

VLDL og LDL, og som derfor har anti-aterosklerotisk aktivitet dersom de

administreres til en pasient. I henhold til disse dokumentene er en slik CETP

polypeptid inhibitor avledet fra apolipoprotein C-I av forskjellige kilder, hvor

spesielt N-terminalfragmentene opp til aminosyre 36 har blitt identifisert som15

CETP inhibitorer.

Også i US 5.880.095 A er det beskrevet et CETP-bindende peptid som er i

stand til å inhibere aktiviteten til CETP hos et individ. CETP-inhiberende protein

innbefatter et N-terminalfragment av porcin apolipoprotein C-III.20

I US2006/0276400 og WO 96/034888 er det beskrevet peptider som er avledet

fra CETP og innbefatter T-celle og/eller B-celle epitoper. Disse peptidene er i

stand til å indusere in vivo dannelsen av CETP spesifikke antistoffer.

I US 2004/0087481 og US 6.410.022 B1 er det beskrevet peptider, som på25

grunn av induksjonen av en CETP-spesifikk immun respons, kan brukes for

behandlingen og forhindrelse av kardiovaskulære lidelser som for eksempel

aterosklerose. Disse peptidene innbefatter en T-hjelpercelle epitope som ikke er

avledet fra CETP. Og minst en B-celle epitope som kommer fra CETP og kan

avledes direkte fra sistnevnte. T-hjelpercelle epitopen er fordelaktig avledet fra30

tetanus toksoid og er kovalent bundet til minst en B-celle epitope av CETP. Ved

å bruke en T-hjelpercelle epitope som er fremmed for organismen, blir det mulig

NO/EP2190451

7

å indusere antistoffer i kroppen til et individ, hvilke antistoffer er rettet mot den

peptiddelen som består av i det minste en CETP-B-celle apitope.

5

I Mao et al (Vaccine 24(2006) : 4942-4950) er det beskrevet bruk av et plasmid

inneholdende et nukleinsyremolekyl som koder for en B-celle epitope av CETP

som vaksine.

10

I WO 2006/029982 er det beskrevet CETP mimotoper som skal brukes for

fremstilling av et medikament for behandling eller forhindrelse av aterosklerose.

I den senere tid har det allerede vært forslag om en vaksinetilnærmelse med

hensyn til CETP. For eksempel har kaniner blitt behandlet med en vaksine som15

inneholdt det peptidet av CETP som er ansvarlig for kolesterol-ester overføring

som antigen. De immuniserte kaninene hadde en redusert CETP aktivitet og

endret lipoprotein-nivåene med økte HDL og reduserte LDL verdier. Videre

oppviste de behandlede forsøksdyrene i aterosklerosemodellen også reduserte

aterosklerotiske lesjoner sammenlignet med kontrolldyr.20

Resultatene av en fase II klinisk studie ble publisert, hvilken studie var publisert

av det amerikanske bioteknologi firmaet Avant med vaksinen CETi-1

(BioCentury Extra For Wednesday, October 22, 2003). I denne fase II studien,

akkurat som i de foregående fase I studiene ble det vist en meget god25

sikkerhetsprofil uten noen tvilsomme bivirkninger, hvilket tillot at man kunne

trekke den grunnleggende konklusjonen at det ikke kan forventes noen

bivirkninger med en anti-CETP vaksinasjonstilnærmelse. Avant var imidlertid

skuffende med hensyn til effektiviteten, siden det ikke førte til økte HDL nivåer

som var signifikant bedre enn de som ble erholdt med en placebobehandling.30

Problemet med CET-1 vaksinen er at den anvender endogent antigen. Det

humane immunsystemet er tolerant o forhold til endogene strukturer, siden med

NO/EP2190451

8

de fleste endogene molekylene, bortsett fra ned CETP – er det avgjørende at

de ikke dannes noen auto-antistoffer. Hensikten med CETi-1 vaksinene var å

bryte den endogene toleransen som tilsynelatende ikke har blitt erholdt i

tilstrekkelig grad.5

En hensikt med foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe antigener for

en anti-CETP vaksine som er valgt slik at det blir betraktet som fremmede av

immunsystemet og derfor ikke trenger å bryte en selvtoleranse. Disse

antigenene kan brukes for å forhindre og/eller behandler aterosklerose og10

aterosklerose følgesykdommer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører derved en forbindelse innbefattende

aminosyresekvensen FGFPAHVFIDWLQSLS eller FGFPAHVYIDWLQSLS eller

FGFPAHVFIDWLQSLN for bruk for å forhindre og/eller behandle aterosklerose,15

perifer arteriell okklusiv lidelse, koronar hjertelidelse eller apoplektisk cerebral

insultus.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer CETP mimotoper for disse hensikter.

Disse mimotopene er i stand til å indusere antistoffer som er i stand til inhibere20

CETP enzymaktivitet. CETP mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse

er fortrinnsvis antigene polypeptider som i sin aminosyresekvens varierer fra

aminosyresekvensen til CETP eller fra fragmenter av CETP. Antigenene i

henhold til oppfinnelsen som induserer anti-CETP antistoffer kan være

sammensatt av D- eller L-aminosyrer eller kombinasjoner av DL-aminosyrer og25

de kan eventuelt ha blitt endret ved ytterligere modifikasjoner, ringlukninger eller

derivatiseringer. I henhold til oppfinnelsen kan imidlertid også lengre peptider

meget godt anvendes som anti-CETP-antistoffinduserende antigener. Videre

kan mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse også være en del av et

polypeptid og derved innbefatte ved deres N- og/eller C-terminus minst en30

ytterligere aminosyrerest.

NO/EP2190451

9

Mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse er i stand til å binde seg til

antistoffer som kan være erholdt ved administrering av C-

FGFPEHLLVDFLQSLS (16-C-terminale aminosyrer av CETP protein) koblet til

KLH eller an annen bærer til pattedyr. Når det er administrert til et pattedyr, er5

mimotopene i stand til å indusere en korresponderende immunrespons, slik at

antistoffene rettet mot CETP blir produsert i pattedyret.

CETP-mimotopene (det vil si anti-CETP-antistoff-induserende antigener) i

henhold til foreliggende oppfinnelse kan identifiseres og fremstilles ved

forskjellige metoder, inkludert fag-samlinger eller peptid-samlinger. De kan10

fremstilles og identifiseres for eksempel ved hjelp av kombinatorisk kjemi eller

ved hjelp av screeningteknikker med høyt gjennomløp for de mest varierende

strukturene (Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Red.), et al.;

Willates WG Phage display; practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002;

50(6): 837-54).15

Videre, i henhold til oppfinnelsen, kan det også anvendes anti-CETP-antistoff-

induserende antigener basert på nukleinsyrer (”aptamer”) og disse kan også

finnes med de mest varierende (oligonukleotid) samlingene (for eksempel med

2-180 nukleinsyrerester) (for eksempel Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug20

Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000),

591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, etc). I anti-CETP-antistoff-

induserende antigener basert på nukleinsyrer, kan nukleinsyrestammen for

eksempel være forsynt med naturlige fosfor-di-ester forbindelsene, eller også av

fosfortioater eller kombinasjoner eller kjemiske variasjoner (for eksempel as25

PNA), hvor det som baser i henhold til oppfinnelsen kan anvendes primært U,

T, A, C, G, H og mC. 2’-restene av nukleotidene som kan brukes i henhold til

foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis H, OH, F, Cl, NH2, O-metyl, O-etyl, O-

propyl eller O-butyl, hvor nukleinsyrene også kan være forskjellig modifisert. Det

vil si for eksempel med beskyttende grupper, siden de vanligvis anvendes i30

oligonukleotidsyntese. Aptamer-baserte anti-CETP-antistoff-induserende

antigener er også foretrukne anti-CETP-antistoff-induserende antigener innen

omfanget av foreliggende oppfinnelse.

NO/EP2190451

10

I henhold til foreliggende oppfinnelse refererer begrepet ”mimotope” til et

molekyl som har en konformasjon som har en topologi som er tilsvarende til

epitopen av hvilken den er en etterligning. Mimotopen binder seg til det samme

antigen-bindende området til et antistoff som binder immunospesifikt til et5

ønsket antigen. Mimotopen vil fremkalle en immunologisk respons i en vert som

er reaktiv til antigenet til hvilket det er en etterligning. Mimotopen kan også virke

som en konkurrent for epitopen av hvilken den er en etterligning i in vitro

inhiberingsassays (for eksempel ELISA inhiberingsassay) som involverer

epitopen og et antistoff som binder seg til epitopen. En mimotopen i henhold til10

foreliggende oppfinnelse trenger nødvendigvis ikke å forhindre eller konkurrere

med bindingen av epitopen av hvilken den er en etterligning i en in vitro

inhiberingsassay selv om den er i stand til å indusere en spesifikk

immunrespons når den administreres til et pattedyr.

15

Som brukt her refererer begrepet ”epitope” til et immunogent område av et

antigen som er kjennetegnet ved et spesielt antistoff molekyl. Generelt vil et

antigen inne en eller flere epitoper, som hver er i stand til å binde et antistoff

som kjennetegner den spesielle epitopen.

20

Forkortelsene for aminosyrerestene beskrevet i foreliggende oppfinnelse følger

IUPAC anbefalingene:

Aminosyre 3.bokst. kode 1-bokst. kodeAlanin Ala A

Arginin Arg R

Asparginin Asn N

Aspartisk Asp D

Cystein Cys C

Glutamisk Glu E

Glutamin Gln Q

Glysin Gly G

Histidin His H

Isoleucin Ile I

Leucin Leu L

Lysin Lys K

Metionin Met M

Fenylalanin Phe F

Prolin Pro P

Serin Ser S

Treonin Thr T

Tryptofan Trp W

NO/EP2190451

11Tyrosin Tyr Y

Valin Val V

Mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan fremstilles syntetisk ved

kjemiske syntesemetoder som er vel kjent innen området, enten som et isolert

peptid eller som en del av et annet peptid eller polypeptid. Alternativt kan peptid

mimotopen fremstilles i en mikroorganisme som produserer peptid mimotopen5

som deretter blir isolert og om ønskelig ytterligere renset. Peptid mimotopen

kan fremstilles i mikroorganismer så som bakterier, gjær eller sopp, i eukaryote

celler så som en pattedyr- eller insektcelle, eller i en rekombinant virusvektor så

som adenovirus, poxvirus, herpesvirus, Simliki forest virus, baculovirus,

bakteriofag, sindbid virus eller sendai virus. Passende bakterier for fremstilling10

av peptid mimotopen inkluderer E. coli, B. subtilis eller enhver annen bakterie

som er i stand til å uttrykke peptider så som peptid mimotopen. Passende

gjærtyper for å uttrykke peptid mimotopen inkluderer Saccharomyces

cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris eller enhver

annen gjær som er i stand til å uttrykke peptider. Korresponderende metoder er15

vel kjent innen området. Også metoder for å isolere og rense rekombinant

fremstilte peptider er vel kjent innen området og innbefatter for eksempel

gelfiltrering, affinitetskromatografi, ionebyttekromatografi etc.

For å forenkle isoleringen av peptid mimotopen, kan det fremstilles et20

fusjonspolypeptid hvor peptid mimotopen blir translasjonelt fusjonert (kovalent

bundet) til et heterologt polypeptid som muliggjør isolering ved

affinitetskromatografi. Typiske heterologe peptider er His-Tag (for eksempel

His6; 6 histidin rester), GST-Tag (Glutation-S-transferase) etc.

Fusjonspolypeptidet fremmer ikke bare rensingen av mimotopene med25

forhindrer også mimotop polypeptidet fra å nedbrytes under rensing. Dersom

det er ønskelig å fjerne det heterologe polypeptidet etter rensingen kan

fusjonspolypeptidet innbefatte et kløvingssted ved forbindelsen mellom

polypeptid mimotopen og det heterologe polypeptidet. Kløvingsstedet består av

en aminosyresekvens som blir kløvd med et enzym som er spesifikt for30

aminosyresekvensen ved stedet (for eksempel proteaser).

NO/EP2190451

12

Mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan også modifiseres ved

eller nær deres N- og/eller C-ender slik at det ved disse posisjonene kan være

bundet en cysteinrest. I en foretrukket utførelsesform kan de terminalt plasserte

cysteinrestene (plassert ved N- og C-endene til peptidet) brukes til å syklisere5

peptidene via en disulfid-binding.

Mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan også brukes i forskjellige

assay og sett, spesielt i immunologiske assays og sett. Det er derfor spesielt

foretrukket at mimotopen er en del av et annet peptid eller polypeptid, spesielt10

et enzym som blir brukt som en rapportør i immunlogiske assays. Slike

rapportørenzymer inkluderer for eksempel alkalisk fosfatase eller pepperrot

peroksidase.

Lidelsene som kan forhindres eller behandles innbefatter blant annet periferisk15

arteriell okklusiv lidelse, koronar hjertelidelse og apoplektisk cerebral insultus

(se for eksempel Steinberg D. J. Lipid Res. (2005) 46: 179-190; Steinberg D et

al. J. Lipid Res (2006) 14: 1339-1351).

I henhold til en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er20

forbindelsen koblet til en farmasøytisk akseptabel bærer, fortrinnsvis KLH

(Keyhole Limpet Hemocyanin), tetanus toksoid, albumin-bindende protein,

bovin serum albumin, en dendrimer (MAP; Biol. Chem. 35: 581), peptid bindere

(eller flankerende områder) så vel som hjelpemiddeltilsetninger beskrevet i

Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (spesielt de i tabell 1 i25

dokumentet) og Hogan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003),

727-735 (spesielt de endogene immuno-potensierende forbindelsene og

tilførselssystemene beskrevet i denne), eller blandinger derav.

Konjugasjonskjemien (for eksempel via hetero-bifunksjonelle forbindelser så

som GMBS og selvfølgelig alle andre som beskrevet i ”Bioconjugate30

Techniques”, Greg T. Hermanson) i denne kontekst kan velges fra reaksjoner

som er kjent for fagmannen innen området. Videre kan

vaksinesammensetningen formuleres med et hjelpemiddel, fortrinnsvis en

NO/EP2190451

13

aluminiumsforbindelse med lav løselighet, spesielt aluminium hydroksid.

Selvfølgelig kan det benyttes hjelpestoffer så som MF59 aluminium fosfat,

kalsium fosfat, cytokiner (for eksempel IL-2, IL-12,GM-CSF), saponiner (for

eksempel QS21), MDP derivater, CpG oligoer, LPS, MPL, polyfosfazener,5

emulsjoner (for eksempel Freunds, SAF), liposomer, virosomer, iscomer,

cokleater, PLG mikropartikler, poloksamer-partikler, viruslignende partikler,

varmelabile enterotoksin (LT), kolera toksin (CT), mutant toksiner (for eksempel

LTK63 og LTR72), mikropartikler og/eller polymeriserte liposomer.

10

Forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis bundet til

bæreren eller hjelpstoffet via en linker, som er valgt fra gruppen bestående av

NHS-poly (etylen oksid), (PEO) (for eksempel NHS-PEO4-maleimid).

En vaksine som innbefatter foreliggende forbindelse (mimotope) og den15

farmasøytisk akseptable bæreren kan administreres ved enhver egnet

applikasjonsmetode, for eksempel i.d., i.v., i.p., i.m., intranasalt, oralt,

subkutant, etc. og i enhver passende tilførselsanordning (O’Hagan et al., Nature

Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). Forbindelsen i henhold til

foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis formulert for intravenøs, subkutant,20

intradermal eller intramuskulær administrering /se for eksempel ”Handbook of

Pharmaceutical Manufacturing Formulations”, Sarfaraz Niaza, CRC Press Inc,

2004).

Typisk inneholder vaksinen forbindelsen i henhold til foreliggende oppfinnelse i25

en mengde på fra 0,1 ng til 10 mg, fortrinnsvis 10 ng til 1 mg, spesielt 100 ng til

100 µg, eller alternativt for eksempel 100 fmol til 10 µmol, fortrinnsvis 10 pmol til

1 µmol, spesielt 100 pmol til 100 nmol. Typisk kan vaksinen også inneholde

ytterligere substanser, for eksempel buffere, stabilisatorer etc.

30

Et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører et peptid innbefattende minst en

aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av FHFPAHVFIDWLLQSLS,

FGFPAHVYIDWLQSLS og FGFPAHVFIDWLQSLN. Peptidene i foreliggende

NO/EP2190451

14

oppfinnelse viste seg å være mimotoper for CETP og derved var mimotopene i

stand til å binde seg til antistoffer som binder seg til CETP fragment C-

FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-terminale aminosyrer av CETP protein).

5

Et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk

formulering innbefattende minst et peptid i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Peptidene i foreliggende oppfinnelse kan være formulert i en farmasøytisk

formulering som kan administreres til et individ. Disse formuleringene kan for

eksempel brukes for å forhindre og/eller behandle aterosklerose, periferisk10

arteriell okklusiv lidelse, koronar hjertelidelse eller apoplektisk cerebral insultus.

Peptidene i formuleringen kan være kombinert av gruppen av peptider

beskrevet her. Videre er det også mulig å tilveiebringe farmasøytiske

formuleringer som innbefatter et eller flere av peptidene i henhold til15

foreliggende oppfinnelse, og som kan administreres separat eller sammen til et

individ som trenger dette.

Peptidene i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være blandet i en enkelt

farmasøytisk formulering eller i en kombinasjon av to eller tre. Den resulterende20

formuleringen kan administreres med en gang eller ved forskjellige tidspunkter.

I henhold til en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er

peptidet som er tilstede i formuleringen koblet til en farmasøytisk akseptabel

bærer, fortrinnsvis KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin).

25

Foreliggende oppfinnelse blir videre illustrert ved de følgende figurer og

eksempler, imidlertid uten å være begrenset til disse.

Fig. 1 viser resultatet av en representativ konkurrerende ELISA etter screening

av fagdisplay biblioteket Ph.D. 7 med monoklonalt antistoff ”Paula”.30

Fig. 2a og 2b viser resultatet av to typiske konkurrerende ELISA’er etter

screening av fagdisplaybiblioteket Ph. D. 12 med monoklonalt antistoff ”Paula”.

NO/EP2190451

15

Fig. 3a og 3b viser resultatene av to representative konkurrerende ELISA’er

etter screening av fagdisplaybiblioteket Ph. D. 7 med mAb Frida.

Fig. 4a viser resultatene av en representativ konkurrerende ELISA etter5

screening av fagdisplaybiblioteket Ph. D. 12 med monoklonalt antistoff ”Frida”.

Fig. 4b viser binding av monoklonalt antistoff ”Frida” til ELISA plater belagt med

mimotope-BSA.

10

Fig. 5a og 5b viser resultene fra viser resultatene av en representativ

konkurrerende ELISA’er etter screening av fagdisplaybiblioteket Ph. D. 12 med

monoklonalt antistoff ”Frida”.

Fig. 6 viser resultatene av en konkurrerende ELISA med to mimotoper etter15

screening av fagdisplaybiblioteket Ph. D. 12 med monoklonalt antistoff ”Frida”.

Fig. 7a til 7d viser antistoff titer (anti mus IgG) fra in vivo forsøk, hvorved

følgende mimotope-BSA konjugater ble injisert i mus:

20

Fr12/3/26/65ext4 C-FGFPYHQVQDVLQSLS p4286

Fr12/3/55ext2 C-FGFPSHLIIDRAQSLS p4294

Fr12/3/55ext2 W i stedet for R C-FGFPSHLIIDWAQSLS p4324

Fr12/3/55ext2 WL i stedet for RA C-FGFPSHLIIDWLQSLS p4325

Fr12/3/84ext2 C-FGFPAHVSIDWLQSLS p4298

Fr12/3/40 ext4 C-FGFPQHLTTDRAQSLS p4302

Fr12/2/6 ext6 C-FGFPTHYYADFSQSLS p4278

Fr12/2/11 ext7 C-FGFPGHLIWDSLHSLS p4282

Fr12/3/1/19/88 ext4 C-FGFPYHHLVDQLHSLS p4284

Fr12/3/68 ext5 C-FGFPSHHLQDSLQSLS p4289

Fr12/3/83 ext5 C-FGFPLHFRSDRIQSLS p4292

Fr12/3/63 ext4 C-FGFPKHLYADMSQSL p4296

Fr12/3/7 ext4 C-FGFPAHLSRDLRQSL p4300

Fr12/3/35 ext4 C-FGFPFHFAQDSWQSLS p4304

Fig. 8a og 8b viser resultatene fra to representative konkurrerende ELISA etter

screening fagdisplaybiblioteket Ph.D. 7C7 med monoklonalt antistoff ”Frida”.

25

NO/EP2190451

16

Fig. 9 viser en in vitro ELISA test for deteksjon av bindingen mellom ”Frida” og

sykliske mimotoper.’

Fig. 10a og 10b viser resultatene fra en inhiberings-ELISA assay med5

FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS og FGFPAHVYIDWLQSLS.

;QP& )(L "6OTOPP ) aA XOX[QN$ 8O[OSZRWV L] c>P<)#

Frida 2,5 ng mAb Frida

Pept. Nr. 2 µgpeptid

20 µgpeptid

p4073p1358

Kun bufferOriginal epitopeIrrelevant peptid

-C-FGFPEHLLVDFLQSLSIrrelevant peptid

1,050,441,08

0,960,10,91

p4361p4362

FGFPAHVFIDWLQSLSFGFPAHVYIDWLQSLS

;Y)*'+'0, O^[* IF>eI;>;Y)*'+'0, O^[* IF>eIK>

0,820,75

0,160,15

;QP& )(M "6OTOPP ) aA XOX[QN& 8O[OSZRWV L] c>P<)#10

Frida 2,5 ng mAb Frida

Pept. Nr. 2 µgpeptid

20 µgpeptid

p4073p1358

Kun bufferOriginal epitopeIrrelevant peptid

-C-FGFPEHLLVDFLQSLSIrrelevant peptid

0,840,640,88

0,750,150,77

p4325 ;<;CF=@>>8J@DF@F ;Y)*'+'-- O^[* E5eJ@ 0,42 0,1

Fig. 11 viser in vivo induksjon av antistoffer rettet mot CETP ved mimotoper i

henhold til oppfinnelsen som blir administrert i mus. Balb/c mus / 30 µg peptid, 2

injeksjoner med 2 ukers intervaller. S3 = 2 uker etter tredje injeksjon. Alum som

hjelpestoff. Titere mot original epitope (p4073) indusert ved injeksjon av15

mimotoper. Brønnbelegg: 50 µl av 1 230M p4073-BSA eller 1 µg / ml aktivert

?@=& 8O[OSZRWV2 c>P<2

Injisert peptid-BSA

Originalepitope-BSA

Irrelevantpeptid-BSA

Gruppe 1 KLH KLH 2.040 400

Gruppe 2 Original epitope p4073-KLH 8.600 10

Gruppe 3 C-FGFPQHLTTDWLQSLS p4369-KLH 14.000 12.900 10

Gruppe 4 C-FGFPSHLIIDWAQSLS p4324-KLH 12.570 7.600 10

Gruppe 5 C-FGFPSHLIIDWLQSLS p4325-KLH 2.930 1.820 10

Gruppe 6 C-FGFPSHLIIDWSQSL p4366-KLH 4.700 3.600 10

Gruppe 7 C-FATPSHLIIDWLQSLS p4345-KLH 8.380 1.270 10

Gruppe 8 C-FAFPAHVSIDWLQALA p4328-KLH 10.100 2.740 400

Gruppe 9 C-PGFPAHVSIDWLQSLS p4340-KLH 18.100 15.640 10

Gruppe 10 C-WGFPAHVSIDWLQSLS p4341-KLH 10.350 5.500 10

Gruppe 11 C-FSFPAHVSIDWLQSLS p4342-KLH 4.620 1.610 10

Gruppe 12 C-FYFPAHVSIDWLQSLS P4343-KLH 5.580 2.900 10

Gruppe 13 C-FDFPAHVSIDWLQSLS P4344-KLH 12.200 3.580 10

Gruppe 14 C-FGFPAHVSIDWLQSLS P4347-KLH 12.000 9.160 10

NO/EP2190451

17Gruppe 15 C-FGFPAHVSIDWLQYLS P4351-KLH 2.950 2.400 10

Gruppe 16 C-FGFPAHVSIDWLQSIS P4352-KLH 19.680 12.070 10

Gruppe 17 C-FGFPAHVSIDWLQSLT P4353-KLH 11.200 8.650 10

Gruppe 18 C-FGFPAHISIDWLQSLS P4358-KLH 16.500 12.940 10

Gruppe 19 C-FGFPAHIIIDWLQSLS P4359-KLH 8.540 5.340 10

Gruppe 20 C-FGFPAHVFIDWLQSLS P4361-KLH 17.940 9.530 10

Fig. 12a og 12b viser in vivo induksjon av CETP spesifikke antistoffer ved

administrering av mimotopene i henhold til foreliggende oppfinnelse. Titre til

p4073 og dets korrelasjon til titre mot CETP fra valgte grupper (som viser høye

titre mot p4073) : gr. 4, gr. 9, gr. 10, gr. 14, gr. 16-20 /gr. 1 (KLH), gr. 25

(opprinnelig epitope) som kontroller. Belegg: henholdsvis rekombinant GST-

CETP eller renset kanin CETP:

Fig. 12a

RekombinantGST-CETP

Kanin CETP

Gruppe 1 KLH KLH/alum 0,35 0,19

Gruppe 2 Original epitope p4073-KLH/alum 1,49 1,25

Gruppe 3 C-FGFPQHLTTDWLQSLS p4369-KLH/alum 0,45 0,21

Gruppe 4 C-FGFPSHLIIDWAQSLS p4324-KLH/alum 0,58 0,28

Gruppe 9 C-PGFPAHVSIDWLQSLS p4340-KLH/alum 0,49 0,21

Gruppe 10 C-WGFPAHVSIDWLQSLS p4341-KLH/alum 0,39 0,18

Gruppe 14 C-FGFPAHVSIDWLQSLS P4347-KLH/alum 0,35 0,2

Gruppe 16 C-FGFPAHVSIDWLQSIS P4352-KLH/alum 0,48 0,28

Gruppe 17 C-FGFPAHVSIDWLQSLT P4353-KLH/alum 0,57 0,39

Gruppe 18 C-FGFPAHISIDWLQSLS P4358-KLH/alum 0,68 0,58

Gruppe 19 C-FGFPAHIIIDWLQSLS P4359-KLH/alum 0,79 0,54

Gruppe 20 C-FGFPAHVFIDWLQSLS P4361-KLH/alum 1,64 1,51

10

Fig. 12b

RekombinantGST-CETP

Kanin CETP

Gruppe 1 KLH KLH/alum 0,18 0,47

Gruppe 2 Original epitope p4073-KLH/alum 1,26 1,42

Gruppe 5 C-FGFPSHLIIDWLQSLS p4325-KLH/alum 0,59 0,85

Gruppe 6 C-FGFPSHLIIDWSQSL p4366-KLH/alum 0,4 0,65

Gruppe 7 C-FATPSHLIIDWLQSLS p4345-KLH/alum 0,39 0,46

Gruppe 8 C-FAFPAHVSIDWLQALA p4328-KLH/alum 0,45 0,43

Gruppe 11 C-FSFPAHVSIDWLQSLS p4342-KLH/alum 0,38 0,41

Gruppe 12 C-FYFPAHVSIDWLQSLS P4343-KLH/alum 0,61 1,05

Gruppe 13 C-FDFPAHVSIDWLQSLS P4344-KLH/alum 0,35 0,43

Gruppe 15 C-FGFPAHVSIDWLQYLS P4351-KLH/alim 0,54 0,59

Fig. 13 viser in vivo induksjonen av antistoffer rettet mot CETP av mimotoper i

henhold til oppfinnelsen som blir administrert til mus. Sera fra hver gruppe (5

Balb/c mus hver) ble kombinert, fortynnet 1:100 og testet på ELISA plater belagt15

med henholdsvis rekombinant GST-CETP eller kanin CETP. Deteksjon av

bundede antistoffer var med algG.

RekombinantGST-CETP

Kanin CETP

NO/EP2190451

18Gruppe 1 KLH KLH/alum 0,23 0,17

Gruppe 2 Original epitope p4073-KLH/alum 1,08 0,46

Gruppe 3 C-FGFAAHVSIDWLQSLS P4335-KLH/Alum 0,26 0,14

Gruppe 4 C-FGFPAHVSIDWLQWLS P4348-KLH/Alum 0,33 0,16

Gruppe 5 C-FGFPAHLTTDWLQSLS P4360-KLH/Alum 0,4 0,23

Gruppe 6 C-FGFPAHVYIDWLQSLS P4362-KLH/Alum 0,86 0,94

Gruppe 7 C-FGFPAHVSIDWLQSLY P4354-KLH/Alum 0,29 0,23

Gruppe 8 C-FGFPAHVSIRWLQSLS P4337-KLH/Alu, 0,24 0,14

Fig. 14 viser en CETP aktivitetsassay, hvor 0,6 µl humant serum (med endogen

CETP aktivitet) er blandet med serum fra ville mus (ikke inneholdende CETP

aktivitet) vaksinert med henholdsvis KLH/Alum (negativ kontrollgruppe), p4703-

KLH/Alum (opprinnelige CETP epitope), eller p4361 (eller p4362 eller p4325)5

mimotope. Det kunne ikke påvises at tilsetning av 1,2 µl og 0,6 µl serum fra

p4361-KLH/Alum vaksinerte mus fullstendig inhiberer CETP aktivitet og

tilsetningen av 0,2 µl serum reduserer signifikant denne aktiviteten i motsetning

til tilsetning av et serum fra mus vaksinert med kun KLH/Alum kontroll eller med

den opprinnelige epitopen (p4073-KLH/Alum).10

Fig. 15 viser at tilsetningen av p4325-KLH/Alum til humant serum signifikant

inhiberer CETP aktivitet.

Fig. 16 viser at tilsetning av p4361-KLH/Alum til humant serum signifikant15

inhiberer CETP aktivitet.

Fig. 17 viser at tilsetningen av p4362-KLH/Alum til humant serum signifikant

reduserer CETP aktivitet.

20

Fig. 18a viser en inhiberings ELISA med mimotoper (belegg 1 µ; 4073 peptid,

NO[OSZRWV L] c>P<)#&

Frida 2,5 ng mAB Frida

Peptid nr. lav Høy

Kun buffer Kun buffer Kun buffer 1,084 1,079

4 % DMSO 4 % DMSO 4 % DMSO 1,180 1,201

p4073 C-FGFPEHLLVDFLQSLS,positiv kontroll peptid

p4073 0,537 0,094

p1208 Positiv kontrollpeptidFGFPEHLLVDFLQSLS-C

p1208 0,712 0,093

p1358 Negativt kontrollpeptid p1358 1,158 1,050

p4474 C-PAHVYIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2IF>dI;> F@FdF@B

1,452 0,179

p4475 C-FGFPAHFSIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2IF>d;F>

2,211 1,429

NO/EP2190451

19p4476 C-FGFPAHVSFDWLQSLS Fr12/3/84 ext2

IF>dIF;2,000 1,417

p4477 C-FGFPEHVFIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2IF>dI;> C5=dC9=

0,808 0,116

p4478 C-FKPAHVFIDWLQSLS Fr12/3/84 ext1IF>dI;>

2,231 1,206

p4479 C-GFKPAHVFIDWLQSLS Fr12/3/84 ext1IF>dI;> XT\ZZ < X`N-terminus

2,165 1,591

p4480 C-DFGPAHVFIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2IF>dI;> XT\ZZ 8 X`N-terminus = 4361pluss D

0,521 0,103

p4481 C-FGFPQHLFTDWLQSLS Fr12/3/40 ext4E5dJ@ UON\[M_[[QVP Gd;

0,551 0,156

Fig. 18b viser en inhiberings-ELISA med mimotoper (belegg 12 µM 4073 peptid,

NO[OSZRWV L] c >P<)#&

p1208 Positivt kontrollpeptid p1208 0,264 0,079

p1358 Negativt kontrollpeptid p1358 1,902 1,661

p4629 C-PAHVYIDWLQSLS C-terminus til p4362; p4362minus 3 aa på N-terminus

0,313 0,118

p4630 C-FGFPAHVYIDWLQ N-terminus til p4362 (minus3 aa på C-terminus)

2,131 2,115

p4631 C-FGFPAHVFIDWLQ N-terminus til p4361 (minus3 aa på C-terminus)

2,111 2,147

p4642 C-DFGPSHLIIDWLQSLS Fr12/3/55 ext2 RA-WL plussD; p4325pluss D på N-terminus

0,171 0,082

p4818 7%8;<;C5=I;>8J@DF@B ;Y)*'+'0, O^[* IF>eI;>SLSeF@B XT\ZZ 83 4 ,+.)N etter pluss D foran

0,332 0,091

p4819 C-PSHLIIDWLQ =4325 minus 3AA på N ogpå C-terminus

2,226 2,158

p4820 C-PAHVFIDWLQ =4361 minus 3AA på N ogpå C-terminus

2,310 2,374

p4989 C-DFGFPAHVTIDWLQSLN Fr12/3/84 ext2 VSIeIG>3 4p4361 F erstattet med T,pluss D på N-term og N istedet for S på C-terminus

0,932 0,274

p4990 C-DFGFPAHVLIDWLQSLN Fr12/3/84 ext2 VSIeI@>3=p4361 F erstattet med L.pluss D på N-term og N istedet for S på C-term

0,263 0,073

p5067 FGFPAHVYIDWLQSLS-C P4362 C på C-terminus 0,563 0,217

p5068 FGFPAHVFIDWLQSLN-C P4474 C på C-terminus 0,757 0,271

Fig. 18c viser en inhiberings-ELISA med mimotoper screen PhD12 Frida og5

Ala-utbytting for mimotope karakterisering / mAb Frida (belegg 1 µM 4073.

8O[OSZRWV c>P<)#

Frida 2,5 ng mAb Frida

Pept. Nr. Lav Høy

Kun buffer Kun buffer 0,964 0,964

4 % DMSO 4 % DMSO 0,973 0,923

Positivt kontrollpeptid p4073 0,554 0,088

NO/EP2190451

20p1208 p1208 0,942 0,101

Negativt kontrollpeptid p1358 0,986 0,93

p4432 C-FGFPSHIIIDWLQSLS Fr12/3/55 ext2exch2 L -> I 0,635 0,096

p4433 C-FGFPSHLIIEWLQSLS Fr12/3/55 ext2exch2 D -> E 1,114 0,672

p4434 C-AAFPAHLLADAAQALA Ala-utbytting for mimotopekarakterisering

1,74 1,461

p4435 C-AAFPAHAAADFLQALA Ala-utbytting for mimotopekarakterisering

1,281 1,969

p4436 C-AAFAAHLLADFLQAAA Ala-utbytting for mimotopekarakterisering

1,632 1,691

p4437 C-AAAPAHLLVDAAQAAA Ala-utbytting for mimotopekarakterisering

1,84 1,674

Fig. 19a viser et peptid ELISA, immunisering med C-DFGFPAHVYIDLQSLS

(p4328-KLH/Alum), titre til opprinnelig epitope.

Fig. 19b viser en peptid ELISA, immunisering med C-FGFPAHVFIDWLQSLN5

(pp4474-KLH/Alum), titre til opprinnelig epitope.

Fig. 19c viser en peptid ELISA, immunisering med C-FGFPAHVFIDWLQSLN

(p4474-KLH/Alum), titre til injisert mimotope.

10

Fig. 19d viser et anti-protein ELISA. Mus ble injisert 3 ganger med 30 µg av de

indikerte mimotopene koblet til KLH med Alum som hjelpestoff. Sera fra hver

gruppe (innbefattende 5 mus) ble samlet, fortynnet 1:100 og testet på ELISA

plater belagt med renset kanin CETP.

15

Fig. 19e viser et anti-protein ELISA, hvor mus ble injisert 3 ganger med 30 µg

av de indikerte mimotopene koblet til KLH med Alum som hjelpestoff. Musesera

(fra enkeltmus) ble fortynnet 1:100 og testet på ELISA plater belagt med renset

kanin CETP.

20

EKSEMPLER:

Det foreligger et sterkt inverst forhold mellom plasmakonsentrasjonen av

kolesterol i lipoproteiner med høy tetthet (HDL’er) og utviklingen av koronar

hjertelidelse (CHD). Faren for CHD er derfor høyere når HDL’er avtar. Selv om

33 % av pasienter med CHD har lave plasmanivåer av HDL’er, er det foreløpig25

ingen effektiv terapi for å øke plasmakonsentrasjonen av HDL’er. Diett og

NO/EP2190451

21

moderat trening er ineffektivt, statiner oppnår kun en lav 5 til 7 % økning av

HDL og niacin har bivirkninger og compliance-profiler som begrenser dets bruk.

Inhiberingen av CETP aktivitet har blitt foreslått som en terapeutisk tilnærmelse5

for å øke plasma HDL nivåene. CETP er et plasma glykoprotein som fremmer

overføring av nøytrale lipider og fosfolipider mellom lipoproteiner og regulerer

konsentrasjonen av plasma HDL. Inhiberingen av CETP aktiviteten er forventet

å øke plasma HDL konsentrasjonene av flere årsaker. CETP senker HDL

konsentrasjonene ved å bevege kolesteryl estere fra HDL’er til VLDL’er og10

LDL’er. Transient inhibering av CETP hos kaniner og hamstere med

monoklonale antistoffer, små molekyler (Sikorski, J.A., J. Med. Chem. 49 (1)

(2006) : 1-22), eller antisens oligonukleotider medfører HDL økning.

Vedvarende CETP inhibering med antisens nukleotider økte plasma HDL og

reduserte aterosklerotiske lesjoner hos en kaninmodell med aterosklerose.15

CETP-transgene mus og rotter viser redusert plasma HDL. Mennesker med

redusert CETP aktivitet har forhøyet plasma HDL.

I den senere tid har det vært foreslått en vaksine tilnærmelse. Kaniner ble

immunisert med et humant CETP-avledet peptid inneholdende et område med20

CETP kritisk for nøytral lipid overføringsfunksjon. Vaksinerte kaniner harr

redusert CETP aktivitet og en endret lipoprotein profil med lavere LDL og

høyere HDL konsentrasjon. Videre oppviste CETP-vaksinerte kaniner mindre

aterosklerotiske lesjoner enn kontrolldyrene.

25

Problemet med anti-CETP vaksine tilnærmelsen diskutert over er at

vaksineformuleringene inneholder et selvpeptid og må derfor bryte den naturlige

toleransen mot selv-antigener. Oppfinnelsen beskriver en CETP mimotope som

kan brukes for vaksinering. Mimotopen skal indusere produksjonen av

antistoffer mot CETP. CETP mimotopen har ingen selv-sekvens og trenger30

derfor ikke å bryte toleransen. Induksjonen av en anti-CETP antistoffrespons

blir derved sterkt fremmet. Mimotopen blir identifisert med et monoklonalt

antistoff (mAb) og (kommersielt tilgjengelig) peptidbiblioteker. Det blir brukt et

NO/EP2190451

22

anti-CETP antistoff som nøytraliserer CETP aktiviteten. Dette mAb detekterer

en sekvens i C-terminale 26 aminosyrer til CETP som er nødvendig for nøytral

lipid overføringsaktivitet.

5

Eksempel 1: generering av monoklonale antistoffer som kan brukes for

screening av fagdisplaybiblioteker

A.) 2 antistoffer avledet fra ”Fusion F”:

Balb7c mus ble immunisert med opprinnelig CETP epitope C-

FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-terminale aminosyrer av CETP protein) koblet10

til KLH og Alum som hjelpestoff.

To hybridoma kloner (begge IgG1) ble renset og brukt for screening:

F5AF9G2 (”Paula”) og F6F11D1 (”Felix”).

Disse to monoklonale antistoffene gjenkjenner den injiserte epitopen så vel som15

CETP protein i ELISA: De kan også brukes i Western Blot for å detektere CETP

protein (rekombinant protein uttrykt i bakterier så vel som protein isolert fra

kaninserum). Begge antistoffene oppviser ingen CETP enzymaktivitet (testet

med Roar CETP Activity Assay Kit, se for eksempel US 5.585.235; US

5.618.683; US 5.770.355).20

B.) To antistoffer avledet fra ”Fusion I”:

Balb/c mus ble immunisert med opprinnelig CETP epitope C-

FGFPEHLLVDFLQSL (16 C-terminale aminosyrer av CETP protein) koblet

med KLH og Alum som hjelpestoff.25

To hybridoma kloner (begge IgG1) ble renset og brukt for screening: I2G6H5

(”Frida”) og I2G6H7 (”James”).

Disse to monoklonale antistoffene gjenkjenner den injiserte epitopen så vel

som CETP protein i ELISA. De kan også brukes i Western Blot for å30

detektere CETP protein (rekombinant protein uttrykt i bakterier så vel som

protein isolert fra kaninserum). I motsetning til antistoffene avledet fra

NO/EP2190451

23

”Fusion F” (se A.)) inhiberer begge antistoffene ”Frida” og ”James” CETP

enzym aktivitet (testet med Roar CETP Activity Assay Kit).

Eksempel 2: Fagdisplay, in vitro inhibering ELISA og in vivo testing av5

mimotoper

Fagdisplay biblioteker som ble brukt i dette eksempelet var:

Ph. D. 7: New England BioLabs E8102L (linjær 7mer bibliotek)

Ph. D. C7C: New England BioLabs E8121L (7mer bibliotek, sykliserte10

peptider)

Ph. D. 12: New England Biolabs E8111L (linjær 12mer bibliotek)

Fagdisplay ble utført i henhold til produsentens protokoll (www.neb.com).

Etter 2 eller 3 etterfølgende runder med panorering ble det plukket ut15

enkeltfagkloner og fagsupernatantene ble utsatt for ELISA på plater belagt

med antistoffet som ble brukt for panoreringsprosedyren. Fagkloner som var

positive i denne ELISA (sterkt signal for målet men ikke noe signal for

uspesifisert kontroll) ble sekvensert. Fra DNA sekvensene ble

peptidsekvensene utledet. Disse peptidene ble syntetisert og karakterisert i20

inhiberings-ELISA.

1. In vitro inhiberingsassay (ELISA)

Forskjellige mengder av peptider (2 og 20 µg, som angitt de respektive

figurene) avledet fra fagdisplay, ble inkubert men de monoklonale antistoffet25

som ble brukt for screeningsprosedyren. Peptider som ble redusert etter

binding av antistoffet til den opprinnelige CETP epitopen (C-terminal 16

aminosyrer av CETP protein) belagt på ELISA plater, ble ansett som

inhiberende. (Resultater, se bl.a. Fig. 19a til 19c).

30

2. In vivo testing av mimotoper

Inhiberende så vel som noen ikke-inhiberende peptider ble koblet til KLH og

injisert i mus (vill type eller CETP-transgene mus, subkutant i flanken eller

NO/EP2190451

24

intradermalt i ørene) eller kaniner (subkutant i flanken) sammen med et

passende hjelpestoff (aluminium hydroksid og Gerbu 100 for mus og

aluminium hydroksid eller CFA/IFA for kaniner).

5

Titre til injiserte peptider så vel som til en opprinnelige CETP epitopen ble

bestemt. I tillegg, for valgte sera, ble også immunrespons til CETP protein

målt. (Resultater, se fig. 7a til 7d og fig. 19a til 19e).

3. Resultater10

3.1. Screening med to antistoffer avledet fra ”Fusion F”, ”Paula” og

”Felix”.

3.1.1. Fagdisplay bibliotek Ph.D. 7

3.1.1.1 Screening med monoklonalt antistoff ”Paula”

15

17 sekvenser ble identifisert i denne screeningen:

P2_8 SYHATFL

P2_9 TMAFPLN

P2_11 HYHGAFL

P2_12 EHHDIFL20

P2_15 SSLELFL

Ps_16 TGLSVFL

P3_2 WMPSLFY

P3_6, 14, 28 SMPWWFF

P3_9 TMPLLFW25

P3_13 DTWPGLE

P3_16 SMPPIFY

P3_17 MPLWWWD

P3_18 SMPNLFY

P3_19 RMPPIFY30

P3_21 NPFEVFL

P3_25 TLPNWFW

P3_26 SMPLTFY

Resultatene en representativ konkurrerende ELISA er vist i fig. 1.35

NO/EP2190451

25

3.1.1.2 Screening med monoklonalt antistoff ”Felix”

Det ble identifisert 6 sekvenser som inhiberer binding av monoklonalt

antistoff ”Felix” i in vitro konkurrerende forsøk:5

F2_9 C SFLDTLT

F3_6 C NFLKTLS

F3_18 D DFLRTLT

F3_23 C AFLDTLV10

F3_34 C TFLSSLA

F3_38 C GFLDSLM

Det ble identifisert ytterligere 12 sekvenser som ikke inhiberer binding

av monoklonalt antistoff ”Felix” i in vitro konkurrerende forsøk:15

F2-2+5 SPHPHFL

F2-6 NFMSIGL

F2-16/F3-30 SQFLASL

F2-29 SNFLKTL20

F3-1-_ TGFLATL

F3-11-_ WSWPGLN

F3-17- IAWPGLD

F3-32- SKFMDTL

F3-41- SDFLRAL25

F3-44-_ SMPMVFY

F3-49- YEWVGLM

F3-64- KGFLDHL

Alle mimotopene som inhiberer bindingen av monoklonalt antistoff ”Felix” in30

vitro var koblet til KLH og injisert subkutant (inn i flanken; s.c.) eller intradermalt

(i. d. ) i henholdsvis vill-type mus (mus som ikke hadde CETP protein), CETP-tg

mus, eller kaniner og indusert immunrespons til det injiserte peptidet med alle

hjelpestoffene ble undersøkt (Alum og CFA (Complete Freud’s Adjuvant);

Gerbu).35

NO/EP2190451

26

For alle in vitro inhiberende mimotoper angitt over kunne antistoffer som

reagerer med den opprinnelige CETP epitopen detekteres hos mus og hos

kaniner.

5

For 5 av 6 mimotoper (se under og tabell 1) kunne antistoffer som reagerer med

renset humant CETP og rekombinant uttrykt humant CETP detekteres i EKLISA

fra kaninsera:

F3-9 C SFLDTLT10

F3-6 C NFLKTLS

F3-18 C DFLRTLT

F3-34 C TFLSSLA

F3-38 C GFLDSLM

15

Det ble utført subkutane injeksjoner i flanken i uke 1, uke 3 og uke 7 med 30 µg

peptid-KLH per mus. Intradermale injeksjoner i øret ble utført i uke 1, uke 3 og

uke 6 med 10 µg peptid-KLH per mus. Sera ble tatt to uker etter den tredje

injeksjonen. Vaksineformulering med Alum (alltid 1 mg per mus): opp til 250 µl,

injisert i flanken. Alum-formulering med 1 ml per mus (500 µl i hver flanke) var i20

1x PBS som buffer.

Vaksineformulering med GERBU Adjuvant 100 (Gerbu Cat. Nr. #3100; alltid 50

µl hjelpestoff per mus) : 3200 µl, 100 µl injisert i flanken innbefattende 1x

HEPES som buffer.25

Tabell 1: Resultater av titerbestemmelser

Adjuvant KLH Injisertmimotope

P4073(FGFPEHLLVDFLQSLS)

Pirrelevant

Alum s.c.(30 µgpeptid)

KLH 1:20.000 n.a. 1:400 Ingen titer

p4073-KLH

C-FGFPEHLLVDFLQSLS

1:70.000 n.a. 1:20.000 Ingen titer

p4223-KLH

F2-9; C-SFLDTLT 1:15.000 1:15.000 1:6.400 Ingen titer

NO/EP2190451

27p4181-KLH

F3-6 C-NFLKTLS 1:8.000 1:6.400 1:800 Ingen titer

p4184-KLH

F3-18 C-DFLRTLT 1:5.000 1:10.000 1:3.000 1:2.500

p4187 F3-34 C-TFLSSLA 1:3.200 1:9.000 1:4.000 Ingen titer

p4188-KLH

F3-38 C-GFLDSLM 1:10.00 1:9.000 1:5.000 Ingen titer

p4227-KLH

P12-19; C-SANPRDFLETLF

1:12.800 1:10.000 1:5.000 Ingen titer

p4228-KLH

P12-21; C-RMFPESFLDTLW

1:10.000 1:4.000 1:1.000 1:400

Adjuvant KLH Injisertmimotope

P4073 (FG-FPEHLLVDFLQSLS)

Pirrelevant

KLH/Gerbus.c. (30 µgpeptid)

KLH 1:70.000 n.a. 1:6.000 1:8.000

p4073-KLH

C-FGFPEHLLVDFLQSLS

1:25.000 n.a. 1:15.000 1:200

p4223-KLH

F2-9; C-SFLDTLT 1:40.000 1:25.000 1:50.000 1:1.000

p4181-KLH

F3-6 C-NFLKTLS 1:20.000 1:20.000 1:8.000 1:400

p4184-KLH

F3-18 C-DFLRTLT 1:27.000 1:35.000 1:15.000 1:6.000

p4187 F3-34 C-TFLSSLA 1:20.000 1:20.000 1:15.000 Ingen titer

p4188-KLH

F3-38 C-GFLDSLM 1:40.000 1:35.000 1:35.000 1:400

p4227-KLH

P12-19; C-SANPRDFLETLF

1:20.000 1:30.000 1:3.000 1:400

p4228-KLH

P12-21; C-RMFPESFLDTLW

1:27.000 1:8.000 1:5.000 Ingen titer

p4073-KLH

C-FGFPEHLLVDFLQSLS

1:10.000 1:10.000 Ingen titer

KLH/Alumi.d. (10 µgpeptid)

KLH 1:12.800 n.a. Ingen titer Ingen titer

p4073-KLH

C-FGFPEHLLVDFLQSLS

1:10.000 n.a. 1:3.200 Ingen titer

p4223-KLH

F2-9; C-SFLDTLT 1:6.400 1:3.200

p4181-KLH

F3-6 C-NFLKTLS 1:10.000 1:1.500 1:600 Ingen titer

p4184-KLH

F3-18 C-DFLRTLT 1:15.000 1:5.000 1:1.500 Ingen titer

p4187 F3-34 C-TFLSSLA 1:50.000 1:6.400 1:3.200 1:500

p4188-KLH

F3-38 C-GFLDSLM 1:12.000 1:5.000 1:2.000 Ingen titer

p4227-KLH

P12-19; C-SANPRDFLETLF

1:6.400 1:6.400 Ingen titer Ingen titer

p4228-KLH

P12-21; C-RMFPESFLDTLW

1:20.000 1:2.000 1:1.600 Ingen titer

p4298-KLH

Fr12/3/84 ext2; C-FGFPAHVSUDWLQSLS

1:25.000 1:3.200 1:1.600 Ingen titer

3.1.2 Fagdisplay bibliotek Ph.D. 12

3.1.2.1. Screening med monoklonalt antistoff ”Paula”.5

Av 20 aminosyresekvenser avledet fra denne screeningen, var tre inhiberende i

in vitro inhiberingsforsøk:

NO/EP2190451

28

P12-19 SANPRDFLETLF

P12-21 RMFPESFLDTLW

P12-37 TIYDSFLDSLAS5

Ikke-inhiberende peptider var:

P12-5/44/46/49 HQSDDKMPWWFF

P12-9 KPYLLKDFLEAL

P12-24/43-_ AMGPYDALDLFL10

P12-25 TWNPIESFLESL

P12-28 + 42 YVWQDPSFTTFF

P12-30 QYQTPLTFLEAL

P12-35- RHISPATFLEAL

P12-39- HTDSFLSTFYGD15

P12-42- YVWODPSFTTFF

P12-45- ADSTFTSFLOTL

P12-50- GPVSIYADTDFL

P12-51- DSNDTLTLAAFL

P12-52- NGSPALSHMLFL20

P12-53- TDYDPMWVFFGY

P12-56- IFPLDSQWQTFW

P12-58- NESMPLDLFYQPS

P12-61- DWGDKYFSSFWN

25

Resultatet fra to typiske konkurrerende ELISA’er er vist i fig. 2a og 2b.

Alle de tre mimotopene var koblet til KLH og injisert i henholdsvis mus av vill

type (mus som ikke har CETP protein), CETP-tg mus, eller kaniner, og indusert

immunrespons mot det injiserte peptidet med alle hjelpestoffene som ble30

undersøkt (Alum og CFA; Gerbu).

Mimotope P12-19; C-SANPRDFLETLF og P12-21; C-RMFPESFLDTLW

induserte en immunrespons til den opprinnelige CETP epitopen hos villtype

mus og kaniner.35

NO/EP2190451

29

I motsetning til dette induserte mimotopen P12-37 C-TIYDSFLDSLAS noen

antistoff respons mot den opprinnelige epitopen.

5

3.2 Screening med to antistoffer avledet fra ”Fusion I”; ”Frida” og ”James”.

3.2.1 Fagdisplay bibliotek Ph. D. 7

3.2.1.1 Screening med monoklonale antistoffer ”Frida” og ”James”.

De ble identifisert to forskjellige peptidsekvenser i disse screeningene. 11 av 1210

kloner som ble sekvensert hadde identiske sekvenser. Disse peptidene er ikke

inhiberende i in vitro konkurrerende forsøk.

Fr7-2-2

Fr7-2B-6515

Fr7-3-7

Fr7-3-13

Fr7-3-26

Fr7-3-32

Ja7-2-2220

Ja7-3-28

Ja7-3-41

Ja7-3-52

Ja7-3-56 VSAYNNV

25

Ja7-3-89 WPLHLWQ

Resultatene fra to representative konkurrerende ELISA’er med mAb ”Frida” er

vist i fig. 3A og 3b. Det samme mønsteret ble sett med mAb ”James”.

30

3.2.2 Fagdisplay bibliotek Ph.D. 12

3.2.2.1 Screening med monoklonalt antistoff ”Frida”

Fr12/2/6 TPTHYYADFSQL

Fr12/2/11 LPGHLIWDSLHY35

Fr12/2/27 LPQTHPLHLLED

NO/EP2190451

30

Fr12/3/1

Fr12/3/19

Fr12/3/88 IPYHHLVDQLHH5

Fr12/3/26

Fr12/3/65 YPYHVQVDVLQN

Fr12/3/68 IPSHHLQDSLQL10

Fr12/3/12 EYAHHTSLDLRQ

Fr12/3/83 EPLHFRSDRIQA

Fr12/3/55 ATPSHLIIDRAQ

Fr12/3/63 APKHLYADMSQA

Fr12/3/84 FKPANVSIDWLQ15

Fr12/3/47 MPAHLSRDLRQS

Fr12/3/80 NPKHYSIDRHQA

Fr12/3/40 SPQHLTTDRAQA

Fr12/3/35 TPFHFAQDSWQW

20

Ingen av disse 15 aminosyresekvensene identifisert ved denne screeningen var

inhiberende i in vitro konkurrerende forsøk. Sekvensanalyser avslørte imidlertid

senere en temmelig høy homologi til den opprinnelige proteinsekvensen for

mange av mimotopene. På den annen side, for enkelte peptider kunne det

påvises binding av monoklonalt antistoff ”Frida” til ELISA plater belagt med25

mimotope-BSA (se fig. 4a og 4b).

Dette viser at binding av monoklonalt antistoff til immobiliserte mimotoper ikke

nødvendigvis gjør det mulig å forutsi inhibering i in vitro konkurrerende ELISA.

30

In vitro inhiberingsforsøk med variasjoner av den opprinnelige sekvensen

FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-terminal AA til CETP protein) viste at fjerning av

mer enn to aminosyrer fra N-terminus eller mer enn en aminosyre fra C-

terminus opphever inhibering (for monoklonale antistoffer ”Frida” og ”James”.

”Paula” og ”Felix” gjenkjenner en annen del av den opprinnelige sekvensen).35

NO/EP2190451

31

I tillegg vil samtidig fjerning av to aminosyrer fra N-terminus og en aminosyre fra

C-terminus også resultere i et peptid som ikke inhiberer in vitro lenger.

5

C-FGFPEHLLVDFLQSLS ”opprinnelig” sekvens (peptid avledet fra CETP) /

inhiberende in vitro

C-GFPEHLLVDFLQSLS sekvens N-1 / inhiberende in vitro

C-FPEHLLVDFLQSLS sekvens N-2 / inhiberende in vitro

C-PEHLLVDFLQSLS sekvens N-3 / til slutt svakt inhiberende in vitro10

C-FGFPEHLLVDFLQSL sekvens C-1 / inhiberende in vitro

C-FGFPEHLLVDFLQS sekvens C-2 / ikke inhiberende in vitro

C-FPEHLLVDFLQSL sekvens N-2 og C-1 / ikke inhiberende in vitro

”opprinnelig” FGFPEHLLVDFLQSLS15

Fr12/2/6 TPTHYYADFSQL

Fr12/2/11 LPGHLIWDSLHY

Fr12/2/27 LPQTHPLELLED

20

Fr12/3/1 IPYHHLVDQLHH

Fr12/3/19 IPYHHLVDQLHH

Fr12/3/88 IPYHHLVDQLHH

Fr12/3/26 YPYHVQDVLQN25

Fr12/3/65 YPYHVQVDVLQN

Fr12/3/68 IPSHHLQDSLQL

Fr12/3/12 EYAHHTSLDLRQ

Fr12/3/83 EPLHFRSDRIQA

Fr12/3/63 APKHLYADMSQA30

Fr12/3/84 FKPAHVSIDWLQ

Fr12/3/47 MPAHLSRDLRQS

Fr12/3/80 NPKHYSIDRHOA

Fr12/3/40 SPQHLTTDRAQA

Fr12/3/35 TPFHFAQDSWQW35

Ved bruk av den opprinnelige CETP sekvensen som et templat, ble derved

peptidsekvensene erholdt ved denne fagdisplay prosedyren forlenget på N-

NO/EP2190451

32

terminusen og/eller C-terminusen for å kontrollere hvorvidt in vitro inhibering er

mulig med lengre peptider.

5

3.2.2.2 Mimotoper Frida Ph. D. 12 og variasjoner derav:

10

NO/EP2190451

33

NO/EP2190451

34

Representative eksempler på inhiberings-ELISA er vist i fig. 5A og 5b. De lange

peptidene Fr12/3/84 ext2 og FR12/3/55 ext3 oppviste en signifikant inhibering:5

Tre ytterligere peptider var også inhiberende i denne undersøkelsen

10

Etter sekvensanalysen med sammenligning av den opprinnelige epitopen og

alle mimotopene avledet fra fagdisplay screeningen ble det dannet to ytterligere

peptider.

NO/EP2190451

35

For mimotope Fr12/3/55 ext3 C-FGFPSHLIIDRAQSLS (inhiberende i ELISA, se

over) ble aminosyreendringer undersøkt ved inhiberings-ELISA:

Sterkt inhiberende:5

Svakt inhiberende:

Peptider med endrede sekvenser (inhiberende, se fig. 6):

C-FGFPSHLIIDWAQSLS Fr12/3/55 ext2 W i stedet for R10

C-FGFPSHLIIDWLQSLS Fr12/3/55 ext2 WL i stedet for RA

Ytterligere foretrukne mimotoper har blitt karakterisert med følgende eksempel

oppsett:

NO/EP2190451

36

C45-7 ;Y)*'+'0, O^[* IF>eI;> C5=eC9= X,,//%KLH/Alum

C-FGFPEHVFIDWLQSLS

C45-8 Fr12/3/1/19/88 ext4 p4284-KLH/Alum

c-FGFPYHHLVDQLHSLS

C45-9 ;Y)*'+'0, O^[) IF>eI;> XT\ZZ < X`N-terminus

P4479-KLH/Alum

C-GFKPAHVFIDWLQSLS

7,-%)( ;Y)*'+'0, O^[* IF> eI;> XT\ZZ 8 X`N-terminus

P4480-KLH/Alum

C-DFGFPAHVFIDWLQSLS

7,-%)) ;Y)*'+',( O^[, E5 eJ@ @GG e@;G4 C,+.1 A98 HG6KGG>B< Gd;

P4481-KLH/Alum

C-FGFPQHLFTDWLQSLS

7,-%)* ;Y)*'+'-- O^[* E5eJ@ "ZO 7%+) WPC-33; serainhiberende aktivitet

P4325-KLH/Alum

C-FGFPSHLIIDWLQSLS

7,-%)+ ;Y)*'+'0, O^[* ;<;e;K; "ZO 7%++$gjenkj. protein/ikke inhiberendeaktivitet)

P4343-KLH/Alum

C-FYFPAHVSIDWLQSLS

C45-14 Kaninsekvens P4125-KLH/Alum

C-FGFPKHLLVDFLQSLS

Neg. kontroll peptid

NO/EP2190451

37

3.2.2.3. In vivo testing av mimotoper

Kvinnelige Balb/c mus, fem mus per gruppe, ble subkutant immunisert med 30

µg peptid koblet til KLH. Kontrollgrupper ble administrert KLH eller C-5

FGFPEHLLVDFLQSLS. Alum ble brukt som hjelpestoff. Alle peptidene som ble

administrert var i stand til bindes til ”Frida” og å indusere en immunrespons for

CETP, selv om enkelte av disse peptidene ikke inhiberer bindingen av CETP til

”Frida” in vitro (i en in vitro inhiberings assay). In vitro ELISA assay for å

bestemme antistoff titer ble utført med oppsamlet sera etter to vaksinasjoner10

med to ukers intervall (S2; se fig. 7a til 7d). Brønnene i ELISA platene var

belagt med KLH (positiv kontrollgruppe), mimotope-BSA konjugat, C-

FGFPEHLLVDFLQSLS og et irrelevant peptid-BSA konjugat (negativ

kontrollgruppe). Deteksjonen ble utført med anti-mus IgG.

15

3.2.3 Fagdisplay bibliotek Ph. D. 7C7

3.2.3.1. Screening med monoklonale antistoffer ”Frida” og ”James”.

20

NO/EP2190451

38

På grunn av sin sykliske natur til disse mimotope-peptidene er deres syntese

mer komplisert enn syntesen av linjære peptider. Syv av ni sykliske sekvenser

ble valgt for in vitro analyse i inhiberings-ELISA (se fig. 8a og 8b). Ingen av

disse sekvensene inhiberte binding av det monoklonale antistoffet som ble brukt5

fra fagdisplay-screening til den opprinnelige CETP epitopen. I tillegg, når disse

peptidene var koblet til BSA og belagt på ELISA plate, ble de ikke detektert av

det monoklonale antistoffet (se fig. 9). Dette var i motsetning til data med

mimotoper erholdt fra Ph. D. 7 eller Ph. D. 12 bibliotekene, hvor de

monoklonale antistoffene ble bundet til de fleste av de identifiserte mimotopene10

når disse peptidene var koblet til BSA og belagt på ELISA plater.

Eksempel 3: CETP aktivitetsassay:

CETP aktivitetsassay ble utført med kommersielt tilgjengelig assayer (for

eksempel ROAR CETP Activity Assay) og beskrevet for eksempel i US15

5.585.235, US 5.618.683 og US 5.770.355. Assayen ble utført i henhold til

produsentens anbefalinger.

20

NO/EP2190451

39P a t e n t k r a v

1.

Forbindelse innbefattende aminosyresekvensen FGFPAHVFIDWLQSLS eller

FGFPAHVYIDWLQSL eller FGFPAHVFIDWLQSLN for bruk for å forhindre

og/eller behandle aterosklerose, periferisk arteriell okklusiv lidelse, koronar5

hjertelidelse eller apoplektisk cerebral insultus.

2.

Forbindelse for anvendelse i henhold til krav 1,

k a r a k t e r i s e r t v e d at forbindelsen er koblet til en10

farmasøytisk akseptabel bærer, fortrinnsvis KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin).

3.

Forbindelse for anvendelse i henhold til hvilket som helst av kravene 1 til 2,

k a r a k t e r i s e r t v e d at forbindelsen er formulert for15

intradermal, subkutant eller intramuskulær administrering.

4.

Forbindelse for anvendelse i henhold til hvilket som helst av kravene 1 til 3,

k a r a k t e r i s e r t v e d at forbindelsen er formulert med20

en adjuvant, fortrinnsvis aluminium hydroksid.

5.

Peptid innbefattende minst en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående

av FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS og25

FGFPAHVFIDWLQSLN.

6.

Farmasøytisk formulering innbefattende minst et peptid i henhold til krav 5.

30

7.

Formulering i henhold til krav 6,

NO/EP2190451

40k a r a k t e r i s e r t v e d at peptidet er koblet til en

farmasøytisk akseptabel bærer, fortrinnsvis KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin).

NO/EP2190451

Kun b

uffer

lrre

leve

nt peptid

NO/EP2190451

Kun b

uffer

lrre

leva

nt pep

tid

lrre

leva

nt pep

tid

Kun b

uffer

NO/EP2190451

Kun b

uffer

lrre

leva

nt pep

tid

lrre

leva

nt pep

tid

Kun b

uffer

NO/EP2190451

lrre

leva

nt pep

tid

Kun b

uffer

lrre

leva

nt pep

tid

α

NO/EP2190451

Kun b

uffer

lrre

leve

nt pep

tid

NO/EP2190451

lrre

leve

nt pep

tid

Kun b

uffer

NO/EP2190451

NO/EP2190451

NO/EP2190451

NO/EP2190451

NO/EP2190451

NO/EP2190451

Kun b

uffer

Kun b

uffer

lrre

leva

nt pep

tid

lrre

leva

nt pep

tid

NO/EP2190451

lrre

leva

nt pep

tid

NO/EP2190451

NO/EP2190451

Op

pri

nn

elig

ep

ito

pe

NO/EP2190451

Op

pri

nn

elig

ep

ito

pe

NO/EP2190451

Opprinnel

ig e

pitope

Opprinnel

ig e

pitope

NO/EP2190451

NO/EP2190451

NO/EP2190451

NO/EP2190451

NO/EP2190451

Pos

itiv

t ko

ntrol

lpep

tid

Pos

itiv

t ko

ntrol

lpep

tid

Neg

ativ

t ko

ntrol

lpep

tid

Neg

ativ

t ko

ntrol

lpep

tid

NO/EP2190451

Pos

itiv

t ko

ntrol

lpep

tid

Neg

ativ

t ko

ntrol

lpep

tid

NO/EP2190451

NO/EP2190451

NO/EP2190451

NO/EP2190451

Pos

itiv

t ko

ntrol

l

NO/EP2190451

NO/EP2190451