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DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Varios mecanismos de control biológico se han descrito para la reducción o supresión de fitopatógenos, los cuales involucran antibiosis, competencia y exclusión del nicho, parasitismo y lisis, resistencia sistémica inducida, hipovirulencia y biosurfactantes. Actualmente existen amplias revisiones en la literatura acerca de la significancia de los antibióticos en el control biológico (Fravel, 1988), considerándose que éstos juegan un papel importante en la supresión de enfermedades, siendo producidos principalmente por bacterias (Chet et al.,1990). Por otro parte existe un gran número de bacterias capaces de producir antibióticos como mecanismo de supresión de enfermedades causadas por hongos. Algunas de las principales bacterias que se han citado para control biológico se encuentran dentro de los géneros: Agrobacterium, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium , Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces y Xanthomonas (Weller, 1988), siendo los géneros mas estudiados por su producción de antibióticos son Bacillus y Pseudomonas. La especie bacteriana estudiada en este trabajo es del género Bacillus, el cual ha sido ampliamente estudiado porque se encuentra normalmente en suelo, distribuida con una alta densidad de población que sobrevive con largos períodos, tolera temperaturas altas mejor que otros organismos y por su capacidad antagónica (Tschen, 1987). Se ha comprobado que B. subtilis tiene un amplio espectro de actividad antifúngica la cual reside por la presencia de un metabolito termoestable extracelular que tiene una estructura típica de péptido cíclico (Rodgers, 1989), dentro de la familia de las iturinas (Gueldner et al., 1988). Los resultados conseguidos con el microscopio electrónico de barrido (MEB) demostraron que el mecanismo de control que se puede sugerir con relación al antagonismo que presenta la cepa 21 de B. subtilis contra los hongos Rhizoctonia solani (DCHR-26) y Fusarium verticillioides (DCHF-32) es por antibiosis, ya que se puede observar la presencia de una sustancia inhibitoria producida por la cepa bacteriana de B. subtilis al enfrentarse con el hongo F. verticillioides (Fig 1), la cual evita el crecimiento del hongo produciendo halos de inhibición entre la cepa y los hongos F. verticillioides y R. solani (Figs. 2 y 4). Dicha sustancia podría ser la causa de las alteraciones morfológicas sucesivas de las estructuras del hongo como se demuestra en las figuras 3 y 5 donde se presentan deformación, plasmólisis y colapso de las hifas.

A la vista de los resultados, se deberían plantear ensayos en condiciones de campo que aborden el empleo de la cepa 21 de B. subtilis dentro de programas de control integrado contra los hongos que afectan al cultivo de fresón en México. BIBLIOGRAFIA Blumer C., D. Hass. 2000. Mechanism, regulation and ecological role of bacterial

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Chet I., J. Invar. 1994. Biological control of fungal pathogens. Journal Invar Applied Biochemical Biotechnology. 48, 1, 37-43.

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La figura 5 muestra la diferencias de la estructura celular de hifas procedentes del cultivo puro de R. solani y del cultivo con antagonismo frente a la cepa 21 de B. subtilis de 1, 2 y 3 semanas, donde se observa la deformación y plasmolisis de las hifas.

Figura 5. Microfotografías de la estructura celular de hifas normales (Figs. 5a, 5b y 5c) y deformadas (Figs. 5d, 5e y 5f) de R. solani después de 1 (a y d), 2 (b y e), y 3 (c y f) semanas de crecimiento en cultivo puro y del enfrentamiento con la cepa 21 de B. subtilis respectivamente.

5a 5d

5b 5e

5c 5f

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Antagonismo “in vitro” de la cepa 21 de B. subtilis frente R. solani La figura 4 muestra la comparación de un cultivo puro de R. solani y el halo de inhibición de este hongo con la cepa 21 de B. subtillis en cultivos de 1, 2 y 3 semanas de edad. Se aprecia que el halo de inhibición después de la primera semana es superado por las hifas aéreas del hongo.

Figura 4. Antagonismo de R. solani con B. subtilis

1 semana 2 semanas 3 semanas

Rhizoctonia solani

Rhizoctonia solani + Bacillus subtilis

Rhizoctonia solani + Bacillus subtilis

5

La figura 3 muestra las diferencias de la estructura celular de hifas procedentes del cultivo puro de F. verticilloides y del cultivo con antagonismo frente a la cepa nº 21 de B. subtilis de 1, 2 y 3 semanas, donde se observa deformación, plasmolisis de hifas y un aumento en el número de células hinchadas (“swollen cells”) en las mismas y que podrían ser fácilmente confundidas con clamidosporas.

Figura 3. Microfotografías de la estructura celular de hifas y agrupaciones de conidias normales (Figs. 3a, 3b y 3c) y deformadas (Figs. 3d, 3e y 3f) de F. verticillioides tras 1 (a y d), 2 (b y e), y 3 (c y f) semanas de crecimiento en cultivo puro y del enfrentamiento con la cepa 21 de B. subtilis respectivamente.

3a

3b

3c

3d

3e

3f

4

La figura 2 muestra la comparación de un cultivo puro de F. verticillioides y el halo de inhibición de este hongo con la cepa 21 de B. subtillis en cultivos de 1, 2 y 3 semanas de edad. Donde se observa el antagonismo de forma puntual y lineal a partir de la primera semana de enfrentamiento.

Figura 2. Antagonismo de F. verticillioides con B. subtilis

Fusarium verticillioides + Bacillus subtilis

Fusarium verticillioides

Fusarium verticillioides + Bacillus subtilis

1 semana 2 semanas 3 semanas

3

Preparación de las muestras para su observación en microscopía electrónica de barrido (MEB). Secciones de 7-10 mm del agar con crecimiento fúngico (control) así como de crecimiento fúngico y bacteriano, incluyendo el área de inhibición, fueron fijadas por congelación (crio-fijación) con Nitrógeno líquido durante 10 min a -190ºC. Seguidamente las muestras fueron sublimadas (de -190 a -85ºC) durante 10-15 min y finalmente las muestras fueron recubiertas con orgetal (oro) en una unidad de alto vacío. Las muestras fueron observadas en el MEB (Jeol JSM-5410 Scanning Microscope). RESULTADOS Antagonismo “in vitro” de la cepa 21 de B. subtilis frente a F. verticillioides En la figura 1 se observa una barrera de color translúcida de 4,5-5 mm de anchura que separa la colonia bacteriana (parte superior) del hongo (parte inferior) que no permite su crecimiento, y una zona más obscura cerca de la colonia bacteriana de 1-1,5 mm, que corresponde a la secreción de sustancias inhibitorias.

Figura 1. Antagonismo de F. verticillioides con B. subtilis de 2 semanas de edad (vista en lupa a 8x).

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para combatir a los hongos fitopatógenos de papa y fresón, y los resultados con la bacteria fueron muy superiores (Torres y Basurto, 2002). Actualmente ya están comprobados los efectos negativos de los plaguicidas químicos sobre el medio ambiente y la salud humana (Invar et al., 2000). Las demandas que hacen continuamente los consumidores de productos agrícolas para que los alimentos estén libres de contaminantes, en particular de residuos de plaguicidas químicos, han inspirado a muchos investigadores a obtener nuevos agentes menos drásticos para el control de plagas y enfermedades (Dunne et al., 1996). La biotecnología desde sus inicios constituyó un medio sumamente eficaz, económico y útil que le permitió al hombre, a partir de organismos vivos, crear nuevos productos. Estos han traído como resultado la aparición de los agentes de biocontrol, potente alternativa para lograr disminuir los daños y por tanto las pérdidas en los cultivos. Para el control de bacterias y hongos patógenos, existen amplios reportes sobre productos biológicos, cuyas acciones se basan esencialmente en el fenómeno de antagonismo (Weeden et al., 2001). Dentro de los microorganismos biofungicidas de mayor espectro de acción, está el hongo Trichoderma spp (Chet , 1994). Es ampliamente discutido el mecanismo de acción donde intervienen quitinasas, que degradan la pared celular del hongo hospedero. Por otro lado, existen evidencias experimentales de la acción quitinolítica de las bacterias empleadas como biocontroladores de enfermedades fungosas tales como Serratia marcescens, Streptomyces sp y Bacillus circulans (Robertus y Monzingo, 1999). Sin embargo no es éste el único medio de acción de las bacterias sobre los hongos fitopatógenos, existiendo otras formas de acción como la producción de metabolitos secundarios, antibiosis, etc. (Blumer et al., 2000) El objetivo de este estudio fue conocer el mecanismo de acción que presenta Bacillus subtilis contra los hongos patógeno Rhizoctonia solani (DCHR-26) y Fusarium verticillioides (DCHF-32), los cuales tienen incidencia en la enfermedad de la secadera en el Estado de Guanajuato, mediante la observación de los efectos causados en sus estructuras celulares a través del microscopio electrónico de barrido (MEB). MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico: A) Cepas fúngicas: Los hongos Rhizoctonia solani Kühn (DCHR-26) y Fusarium verticillioides (Sacardo) Nirenberg (DCHF-32) fueron aislados de plantas enfermas del cultivo de fresón, variedad Chandler, del Municipio de Irapuato, Guanajuato. Los cultivos puros de estos hongos fueron crecidos sobre PDA durante 1, 2 y 3 semanas. B) Cepa bacteriana: La cepa nº 21 de Bacillus subtilis fue aislada de plantas sanas del cultivo de fresón, variedad Chandler, del Municipio de Irapuato, Guanajuato. Ensayos de antagonismo de B. subtilis frente a R. solani y F. verticillioides “in vitro”: En placas de PDA con crecimiento micelial de 2 cm aproximadamente de cultivos puros de R. solani y F. verticillioides se sembró la cepa nº 21 de B. subtilis en cuatro puntos alrededor de los hongos y a una distancia de 4,5 cm y también en forma lineal. Las placas se incubaron a 25ºC durante 1, 2 y 3 semanas.

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ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ANTAGONISTA IN VITRO DE BACILLUS SUBTILIS FRENTE A LOS HONGOS PATÓGENOS DE FRESÓN FUSARIUM VERTICILLIOIDES Y RHIZOCTONIA SOLANI M. G. Basurto Cadena1, M. Vázquez Arista1, M. I. Font San Ambrosio2 y J. García Jiménez2

1Departamento de Alimentos. Instituto de Ciencias Agrícolas. Universidad de Guanajuato, Km 9 Carretera Irapuato-Silao, GTo. 36500. Email: cadenag51@yahoo.com.mx y manyvazquez@yahoo.com.mx, 2Instituto Agroforestal Mediterráneo, Universidad Politécnica de Valencia, Camino de Vera s/n 46022, Valencia. Email: mafonsa@upvnet.upv.es y jgarciaj@eaf.upv.es RESUMEN En México, uno los principales problemas fitosanitarios del cultivo del fresón es la afección conocida como “secadera” que puede provocar pérdidas de hasta el 50% de la producción. Afecta a raíz y corona de la planta y es causada por un complejo de hongos de los géneros Rhizoctonia, Fusarium, Verticillium y Phytophthora, que actualmente son controlados con productos fungicidas. Un estudio en Irapuato (México), demostró a nivel de invernadero la actividad antagonista de la cepa 21 de Bacillus subtilis frente a Rhizoctonia solani (DCHR-26) y Fusarium verticillioides (DCHF-32). El presente trabajo aborda el estudio del posible mecanismo de acción de B. subtilis frente a estos dos hongos. Crecimiento en placas de PDA de la bacteria con cada uno de los hongos de 1, 2 y 3 semanas de edad fueron observados bajo lupa y microscopio electrónico de barrido (MEB). Los estudios mostraron que las hifas de los hongos presentaban deformaciones y colapso, sugiriendo la producción de antibióticos por parte de la bacteria. A la vista de los resultados, se deberían plantear ensayos en condiciones de campo que aborden el empleo de B. subtilis dentro de programas de control integrado contra los hongos que afectan al cultivo de fresón en México. Palabras clave: Fragaria x ananassa, control, biológico, antagonismo. INTRODUCCIÓN México se encuentra entre los diez principales productores de fresón en el mundo y ocupa el segundo lugar en América (FAO, 2005). En México, el Estado de Guanajuato ocupa el segundo lugar en la producción de fresón (SAGARPA, 2005). Para México la importancia del cultivo radica en que se utiliza gran cantidad de mano de obra, debido a que la mayoría de las labores agrícolas se realizan manualmente y además genera divisas por su exportación, principalmente a Estados Unidos y Canadá (Castro y Dávalos, 1987). El Estado de Guanajuato enfrenta un serio problema en la producción de fresón, que ha llegado a una reducción de más del 50%, razón por la cual ha pasado a ocupar el segundo lugar de producción de fresón en México. La principal causa de esta pérdida es la enfermedad llamada “secadera”. Esta enfermedad es producida por un complejo de hongos (Rhizoctonia sp, Fusarium sp, Verticillium sp, y Phytophtora sp ) (Castro et al., 1993), entre los que destacan Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani (Basurto et al., 1999) los cuales son controlado por productos químicos. En Irapuato, Guanajuato, se hizo un estudio donde se demostró, a nivel de invernadero, la actividad antagónica de cepa 21 de Bacillus subtilis contra Rhizoctonia solani (DCHR-26) y Fusarium verticillioides (DCHF-32), agentes causales de la enfermedad de la secadera, Tanto la bacteria como los hongos se aislaron de plantas sanas y enfermas de fresón respectivamente. También, se comparó la efectividad de esta bacteria con el fungicida Busan (TCMTB), el cual es muy empleado en la región