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14
Identificación por PCR
De los cultivos analizados con cebadores específicos de Fibrobacler succinogenes,
la cepa de referencia GC5 y 3 aislamientos nativos mostraron la amplificación de
fragmentos de tamaño teórico esperado mientras que las cepas de referencia de
Ruminococcus usadas como control negativo, no presentaron amplificación (figura
4).
Figura 4. Amplificados especificas de ADNr de Fibrobacter succinogenes. MP, marcador de peso molecular; 1 cepa de referecia F. succinogenes GC5; 2 aislado nativo (6); 3, aislado nativo (L6); 4, aislado nativo (3) ; 5 Cepa de referencia R. albus (AlCC 27210); 6, cepa de referencia R. f1avefaciens (AlCC 19208); 7 Control (H 20) .
Los perfiles térmicos diseñados para R. albus y R. f1avefaciens permitieron la
amplificación específica de los fragmentos de 1.195 y 258 pb, en las respectivas
cepas de referencia (fig . 5). En el grupo analizado con los cebadores específicos de
R. albus no se observó amplificación en ninguno de los aislados nativos de esta
especie, excepto en la cepa de referencia; mientras que el análisis del mismo grupo
con cebadores específicos de R. flavefaciens, mostró amplificación específica de un
aislado nativo y la cepa de referencia R93-68, A TIC 19208 (figura 6, carril 15). Las
demás no presentaron amplificación con ninguno de los cebadores analizados.
15
Figura 5. Amplificación especie específica de ADNr en las cepas de referencia Ruminococcus albus, ATCC 27210 (Carriles 1-5) y Ruminococcus flavefaciens , ATCC 19208 (carriles 7,8,10,11). Carril 5: control negativo (con agua) .
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 15 16 17 18 .
Figura 6. Amplificación específica de ADNr de R. flavefaciens en aislamientos nativos. Carril 1: Marcador de peso molecular, carril 2: Cepa de referencia Ruminococcus flavefaciens ATCC 19208, carril 3: Cepa de referencia Ruminococcus albus ATCC 27210 y carriles 4-18: Cepas nativas 8,19, AR205, 14, 16,20,10, 18, 17,13, 11 , 9,12,15,22, respectivamente.
16
Durante la determinación de las condiciones de amplificación por PCR se encontró
que a temperaturas por debajo de 60°C, la cepa de referencia Ruminococcus albus
amplifica con el cebador específico para Ruminococcus f1avefaciens (RF1). El
análisis de restricción teórico reveló que este segmento es blanco de la enzima de
restricción Hpa I en el amplicón de R. albus pero está ausente en el amplicón de R.
flavefaciens (Anexo1).
17
Identificación por análisis de secuencias.
Se obtuvieron secuencias editadas en un rango de 1396 a 1550 nucleótidos en
longitud, correspondiente a la secuencia de ADNr 16S, los cuales se utilizaron en el
análisis Blast. Para la construcción del árbol filogenético se utilizaron secuencias
editadas de 1396 nucleótidos de longitud . El análisis Blast mostró que las
secuencias de los aislamientos nativos presentaron similitudes entre el 98 -100%
entre 855 a 1430 posiciones.
Los aislados previamente identificados con cebadores específicos como Fibrobacter
succinogenes y Ruminococcus flavefaciens mostraron una similitud del 98% con
secuencias de la base de datos de estas especies (878/893 y 911/928,
respectivamente) . Los otros aislamientos que no amplificaron con los cebadores
específicos presentaron similitudes con las especies Butyrivibrio fibrisolvens (99%),
Clostridium algidixylanolyticum (99%), Streptococcus bovis (96% , 98-100%) Y
Clostridium putrefaciens (91%, 99%) .
En las dos últimas especies se encontraron secuencias con porcentajes de similitud
96% y 91%, respectivamente (aislamientos 17 y 4), los cuales están por debajo al
punto de corte propuesto por Drancourt et al, 2000, debido a que las secuencias con
las cuales había una mayor similitud correspondían a especies no identificadas.
Las otras nueve secuencias, las cuales no fueron analizadas previamente por PCR
específico de especie, mostraron similitudes con R. albus (99%), Bacteroides sp ,
(98%, 100%), Clostridium algidixylanolyticum (99%, 99%), Streptococcus bovis
(99%, 100%, 99%), R. flavefaciens (99%) y Clostridium putrefaciens (99%) .
El dendograma NJ utilizando la distancia Kimura de 2 parámetros generó 11 grupos.
El primero agrupa un aislamiento nativo con secuencias publicadas de Butyrivibrio
fibrisolvens, el segundo agrupa aislamientos nativos con secuencias de Clostridium
algidixylanolyticum, el tercero agrupa un aislamiento nativo con el género
18
Clostridium, el cuarto agrupa tres aislamientos nativos con R. flavefaciens, el quinto
dos aislamientos nativos con C. putrefaciens, el sexto, seis aislamientos nativos con
S. bovis, el séptimo un aislamiento nativo con F. succinogenes, del octavo al
décimo, secuencias de especies utilizadas como grupos extemos y undécimo,
agrupa dos aislamientos nativos con el género Bacteroides. Estos agrupamientos
presentaron valores bootstrap de 100.
19
Figura 1. Dendograma Neighbor-joining de secuencias de ADN ribosomal 165 en bacterias anaerobias ruminales de ganado criollo BON. En la parte superior de la rama se indican los valores bootstrap y en la parte inferior la distancia Kimura 2 parámetros.
88
0 .00 100
0.03
54
0 .00
100
100 0 .03
0 .04
004
100
0 .08
95
0 .02 58
0.01 100
0 .03 I 100
0 .04 100 I
0 .02
0.01 100
0 .09 79
0.02 0 .00 93
0 .00
100 I 0 .13 I
0.09
0 .12
0 .02
100 0.07
0 .09 100
0.06 66
0 .00
991 0 .00
0 .00 1
0 .00
99 0 .00
0 .00 0 .00
002
60 0 .01
0 .00 0 .00
731 0 .01
0 .00 1 0.00
0 .02
100 0 .00
67 0 .00
0 .00 0 .00
0 .00
0.00
0.00
95 0.01
0 .00 0 .00
0 .01
0 .01
94 0 .01
0 .01 0 .00
100 0.00
0 .00
0 .01
76 0 .01
0.00 0.00
0.01
99 0 .00
0.01 0.01
96 0.08
0 .09
0.01
0.00
84 0 .00
0 .00 0.00
22F
24 F
7F
C /ostridium U201
C/ostridium a/gidiJ<ylano/yficum AF09.
C/ostridium sp. HAAP-2
1F
Butyrivibrio CF316
Butyrivibrio fibriso/vens OB 189
Butyrivibrio fibriso/vens
Butyrivibrio fibriso/vens
4F
C/ostridium sp. sukashi-2
C /ostridíum putrefaciens
C/ostridíum putrefacíens AF127024
C /ostndium putrefacíens DSM129
5F
2F
21 F
Rummococcus flevefacíens JM 1
9F
Rumínococcus a/bus Ra 8- A TCC 27
16 F
Rumínococcus a/bus RUMRGOAG
17 F
26F
11 F
Streplococcus bovis B315
23F
Streplococcus bovis 1
20F
18 F
Fíbrobacter succinogenes A TCC191,
6F
Fíbrobacter succinogenes HM2-2
Agrobacterium tumefaciens
Wo/inella succinogenes
Mixococcus xanthus
Bdellovibrio sto/pii
Bacteroides AR 29
8F
Bacteroides sp. 1
25F
Bacteroides sp. 2
-- - -=--p-' ~..;... ......--..
20
DISCUSiÓN
En el presente trabajo se utilizaron como cebadores, sondas oligonucleotídicas
especie específicas previamente publicadas (Odenyo et al 1994, Briesacher et al
1992 y Aman, et al, 1990), para la identificación molecular por PCR de cultivos
bacterianos nativos del rumen de ganado criollo BON. Las amplificaciones especie
específicas permitieron la identificación de las respectivas cepas de referencia, tres
aislados nativos de F. succinogenes y uno de R. flavefaciens, lo cual fue
corroborado mediante análisis de secuencias de la región ADNr 16S.
En este trabajo no se utilizaron protocolos de extracción que emplearan partículas
de zirconio o de vidrio para lograr la ruptura de la pared celular; por tal razón el
tiempo de incubación de los cultivos a partir de los cuales se extraería el ADN, es
una variable crítica considerando el comportamiento variable de la composición de
la pared de especie tales como F. succinogenes. En efecto, los mejores resultados
se obtuvieron de células con menos de 48 horas de cultivo aun cuando había mayor
cantidad de células a las 72 y 96 horas de cultivo. Estos datos son congruentes con
el comportamiento Gram variable descrito para todos los aislamientos analizados,
los cuales muestran un aumento de la proporcion de celulas Gram positivas, a
medida que los cultivos tienen mas tiempo de incubación.
Durante el proceso de estandarización de la PCR específica de F. succinogenes, se
encontró que cantidades por encima de los 700ng/l-ll generan bandas inespecíficas
en los amplificados, debido al exceso de molde. En el caso de la PCR específica de
R. flavefaciens, se encontró que a temperaturas menores a 60°C, los cebadores
RF1 y Universal, amplificaron inespecíficamente la cepa de referencia de R. albus,
generando un fragmento de 258 pb, de tamaño similar al esperado para R.
flavefaciens. Por esta razón, no es aconsejable utilizar con estos cebadores,
temperaturas inferiores a las reportadas en el presente trabajo. Sin embargo, el
análisis teórico de restricción de estos fragmentos reveló que el fragmento
amplificado para R. albus presenta una diana de corte para la enzima Hpal mientras
que el de la otra especie no, lo cual puede ser utilizado para la identificación de
I 21
1'0...0 l'I ...C'(l~~E.~~~~\' ''' ~"'T' ''' 'rf Cf\<:
BiBU O .P V'PTO. DE ., r, ," ,
r.r " EH r '1"-UOTL,-A -
estas dos especies de Ruminococcus utilizando los mismos cebadores y evaluando
la presencia o ausencia de corte con la enzima Hpa 1.
El uso de sondas previamente reportadas como cebadores forward y una sonda
universal como cebador reverso, permitió la identificación específica de F
succinogenes, R albus y R flavefaciens utilizando perfiles térmicos similares Estos
resultados en conjunto con la posibilidad de discriminar amplicones especie
específicos con la enzima Hpal, sugieren la posibilidad de desarrollar PCR multiplex
para identificar en un solo tubo de reacción la presencia de las tres principales
especies bacterianas con solo 2 cebadores específicos y un cebador universal, lo
cual agilizaría los análisis.
En relación con la secuenciación, no se encontraron datos ambiguos en las
secuencias de ADNr 16S característicos de cultivos mixtos, debido a que la
extracción de ADN se realizó a partir de cultivos puros. Tampoco se encontraron
picos dobles en los electroferogramas que evidenciaran la presencia de operones
quiméricos dentro de los mismos aislados.
En el presente trabajo se encontraron porcentajes de similitud en longitudes de
secuencia menores a los propuestos por Drancourt et al., 2000 para la identificación
de géneros (97% de similitud) y especies (99%) entre secuencias de por lo menos
1500 nucleótidos de longitud. Con base en esta propuesta, es claro que el análisis
Blast como criterio único, no permitiría hacer una identificación inequívoca de los
aislamientos nativos; sin embargo, permitió elegir las secuencias de especies
bacterianas con las cuales analizar las relaciones filogenéticas.
Este punto es importante si se tiene en cuenta que en este estudio, se encontraron
varios aislamientos cuya identidad genética es compatible con las especies
Clostridium putrefaciens y Clostridium algidixylanolyticum, dos especies que no han
sido previamente reportadas en el ambiente ruminal, sino en carnes en
22
descomposición (Borda et al., 2000). La presencia de estas dos especies en las
muestras bacterianas nativas, podría ser el producto de una contaminación de la
sonda utilizada para extraer el contenido ruminal a través de la fístula infectada del
animal.
Otra posibilidad es que ambas especies presentes en la herida del animal, puedan
sobrevivir en el contenido ruminal gracias a sus habilidades para degradar celobiosa
y habitar ambientes anaeróbicos. Ambas posibilidades están apoyadas por el hecho
de que estos microorganismos crecieron en medios de cultivo anaeróbicos
suplementados con celobiosa y utilizados para el aislamiento de microorganismos
ruminales. Sin embargo, la presencia de estas bacterias en el líquido ruminal de ese
animal o en los cultivos de aislamiento debe ser corroborada con métodos de
hibridación o PCR.
A diferencia de las variaciones en la longitud de las secuencias comparadas
mediante Blast, en el análisis filogenético se incluyeron solo las secuencias
similares que tenían una longitud de 1396 nUcleótidos, lo cual garantiza establecer
comparaciones entre fragmentos de igual longitud. De otro lado, la confiabilidad de
los agrupamientos está apoyada por el uso de la distancia genética de Kimura de 2
parámetros, la cual puede considerar diferentes tasas de transversiones y
transiciones; el método de agrupamiento, el cual permite considerar las diferentes
tasas evolutivas entre los taxones analizados y los altos valores bootstrap
encontrados (100 en todos los casos).
El análisis conjunto de la similitud genética y agrupamiento, confirmó la identidad de
los aislados previamente identificados por PCR específico como F. succinogenes y
R. flavefaciens y apoya la idea de que la falta de amplificación de en los otros
aislados no se debe a cambios en los sitios de anclajes de los cebadores sino a la
ubicación taxonómica de las especies bacterianas analizadas, cuyas identidades
son compatibles con las especies Butyrivibrio fibrisolvens (hemicelulolítica),
Streptococcus Bovis (aprovechadora de ácidos intermedios), especies celulolíticas o
23
amilolíticas de los géneros Bacteroides y Clostridium y finalmente las especies
Clostridium putrefaciens, Clostridium algidixylanolyticum presentes en carnes en
descomposición.
Todas las especies encontradas tienen la habilidad de degradar celobiosa a pesar
de que no todas estén clasificadas en los mismos grupos tróficos principales. La
muestra analizada mostró diversidad de especies celulolíticas pero bajo número de
aislamientos por especie, en contraste con lo observado con la bacteria
aprovechadora de ácidos intermedios S. bovis la cual presentó el mayor número de
aislamientos/especie. Estos resultados están sesgados por la selección de los
aislamientos basada en criterios macroscópicos y microscópicos y evidencian una
vez más, las imprecisiones en estos métodos de identificación.
Esta consideración es particularmente importante en estudios de recuentos
bacterianos que no involucran el uso de herramientas moleculares, debido a que la
caracterización morfológica de bacterias que se presumen celulolíticas, podrían en
realidad corresponder a especies de grupos tróficos diferentes. Por ejemplo, al igual
que F. succinogenes, otras especies bacterianas ruminales de los géneros
Bacteroides, Actinobacillus y Clostridium, también pueden presentar pleomorfismo,
variabilidad en la composición de la pared celular y pueden degradar celobiosa
cuando no existen otras fuentes de carbono (Welter et al., 2002; Manual Bergey's,
2001). En efecto, en el presente trabajo se encontraron especies de los géneros
Bacteroides y Clostridium, los cuales no amplificaron con los cebadores especificos
de las principales bacterias celulolíticas. Sin embargo, es necesario adelantar
ensayos bioquímicos y morfológicos más rigurosos, que permitan establecer con
claridad la identidad de los aislados .
Los PCR utilizados resultaron útiles para la identificación molecular de las
principales bacterias celulolíticas anaerobias y abre la posibilidad de implementar en
nuestro medio , una sola prueba para detectar la presencia de las tres especies
bacterianas. Sin embargo, el bajo número de aislamientos de las bacterias de
24
interés y la utilidad en un número mayor de aislamientos queda aún por explorar. De
manera similar, es necesario secuenciar un mayor número de aislamientos por
especie, en los ambientes ruminales de los ganados criollos colombianos que
permitan no solo estimar la utilidad de secuencias diagnósticas sino también
profundizar en la biología básica y genética de la microbiota ruminal del trópico, de
la cual se tiene escasa información hasta la fecha.
25
HONGOS ANAEROBIOS DEL RUMEN DE GANADO CRIOLLO BON: ACTIVIDAD CELULOLíTICA EN RESIDUOS DE COSECHA
INTRODUCCiÓN
A pesar de la abundancia y ubiquidad de los microorganismos que degradan
celulosa, pocos de ellos producen un sistema de celulasas completo que
degrade extensivamente in vitro, la forma más recalcitrante de la celulosa: la
celulosa cristalina. Hasta el presente las especies mejor conocidas en este
sentido son los hongos aeróbicos Trichodenna y Phanerochaete; bacterias
como Clostridium thermocellum, y los hongos anaerobios ruminales,
especialmente del género Neocallimastix, los cuales han mostrado tener una
capacidad celulolítica mayor que las cepas mejoradas de Trichodenna
reesei, el modelo celulolítico más utilizado hasta el momento, (Srinivasan, K.,
et al 2001, Bhat M. K. and Bhat S., 1997).
Con base en lo anterior y teniendo en cuenta que en zonas tropicales como
la nuestra el ganado criollo como el Blanco Orejinegro (BON) se alimenta de
forrajes de baja digestibilidad, es posible pensar que en estas razas ha
habido una selección de microorganismos celulolíticos productores de
enzimas con gran capacidad degradativa. Por esta razón resulta interesante,
evaluar la capacidad celulolítica de microorganismos ruminales autóctonos;
dado que se presume que estando sometidos a rigurosas condiciones de
selección del trópico, podrían producir un complejo de celulasas más
eficiente para la degradación in vitro de los materiales lignocelulolíticos.
Este aspecto es de especial interés desde el punto de vista económico, si se
tiene en cuenta las amplias aplicaciones de las celulasas en la conversión de
materiales lignocelulolíticos, en el mejoramiento de la calidad de forrajes, la
26
extracción de jugos y sabores desde plantas y frutas, facilitación del
procesamiento cervecero, elaboración de vinos, mejoramiento de productos
de panadería, etc., lo cual estimula aún más, su estudio, obtención y
mejoramiento para fines industriales, (Uhlig, H.1998) .
Al igual que las bacterias, los hongos anaerobios ruminales presentan
pleomorfismo en cultivos in Vitro y por tal razón , es necesario establecer la
identidad taxonómica de los aislados utilizando metodologías adecuadas.
También en este caso se han desarrollado sondas oligonucleotídicas cortas
que permiten no solo la identificación sino también la cuantificación de
microorganismos del rumen. Desafortunadamente estas técnicas que
involucran la hibridación de ácidos nucleicos, presentan dificultades técnicas
(Brookman., et al. 2000) y siguen siendo costosas y dispendiosas en nuestro
medio lo cual limita su utilidad a nivel investigativo.
A pesar de que para algunas especies bacterianas se han desarrollado
técnicas diagnósticas específicas y eficientes basadas en PCR (Wang, Cao y
Cerniglia , 1997; Ossa., et al 1999), no se han encontrado reportes en los que
se utilice la técnica molecular PCR para la identificación de hongos
anaerobios ruminales.
Con el fin de contribuir a la búsqueda de enzimas celulolíticas de uso
potencial en procesos biotecnológicos agroindustriales, en el presente trabajo
se aislaron cepas nativas de hongos ruminales presentes en el rumen de
bovinos criollos BON y se evaluó su capacidad celulolítica en medios de
cultivo suplementados en residuos de cosecha. De manera adicional, se hizo
una aproximación a la identificación molecular de hongos anaerobios del