Univerzitet u Novom Sadu Fakultet tehnikih nauka Odsek inenjerstvo zatite ivotne sredine ______________________________________________________________________

PRIMENA GASNE HROMATOGRAFIJE U IZSPROJEKAT

Nastavnik: Prof. emeritus Mirjana Vojinovi Miloradov Asistent: Radoni dr Jelena

Student: Tijana Simin 436

______________________________________________________________________ Novi Sad, septembar 2009

SADRAJ PRIMENA GASNE HROMATOGRAFIJE U IZS......................................................1 .01 UVOD U HROMATOGRAFSKE METODE............................................................3 .02 OPTI OPIS HROMATOGRAFIJE..........................................................................3 2.1. Podela hromatografskih metoda...........................................................................3 2.2. Brzine kretanja analiziranih sastojaka..................................................................7 2.3. Dejstvo hromatografske kolone..........................................................................10 2.4. Optimizacija rada kolone....................................................................................18 2.5. Pregled vanih odnosa za hromatografiju...........................................................25 2.6. Primena hromatografije......................................................................................26 .03 GASNO-TENA HROMATOGRAFIJA................................................................28 3.1. Principi gasno-tene hromatografije...................................................................29 3.2. Ureaji za gasno-tenu hromatografiju...............................................................30 3.3. Tene faze u gasno-tenoj hromatografiji...........................................................38 3.4. Primena gasno-tene hromatografije..................................................................41 3.5. Uobiajne primene gasne hromatografije...........................................................42 .04 TENA HROMATOGRAFIJA VISOKOG DEJSTVA...........................................44 4.1. Ureaji za tenu hromatografiju visoke delotvornosti........................................45 4.2. Visokodelotvorna razdelna hromatografija.........................................................49 4.3. Visoko delotvorna adsorpcijska hromatografija.................................................52 4.4. Visoko delotvorna hromatografija jonske izmene..............................................53 4.5. Visokodelotvorna hromatografija na gelu...........................................................58 4.6. Poreenje visokodelotvorne tene hromatografije sa gasno-tenom hromatografijom........................................................................................................59 4.7. Hromatografija sa superkritinim tenostima.....................................................60 4.8. Linearna hromatografija......................................................................................65 .05 LITERATURA ......................................................................................................69

2

.01 UVOD U HROMATOGRAFSKE METODEHromatografska analiza slui za analizu, identifikaciju i kvantitativno odreivanje hemijskih sastojaka prisutnih u sloenim smeama. Nijedna druga metoda hemijske analize nije tako mona i nema tako svestranu mogunost primene kao hromatografija. Hromatografiju je izumeo ruski botaniar Mikail Semenovi Cvet poetkom dvadesetog veka. Primenio je hromatografsku tehniku za analizu rastvora biljnih pigmenata hlorofila i ksantofila prolaskom kroz staklenu kolonu napunjenu kalcijumkarbonatom. Razdvojeni sastojci vide se na koloni kao obojene trake po kojima je tehnika dobila naziv (grki chroma znai boja, a graphein pisati). Hromatografija je tehnika u kojoj se sastojci smee razdvajaju zavisno od brzina kojima ih gasna ili tena mobilna faza nosi kroz kolonu stacionarne faze.

.02 OPTI OPIS HROMATOGRAFIJETeko je precizno definisati re hromatografija, jer se njom oznaava veliki broj analitikih sistema i tehnika. Meutim, svim hromatografskim postupcima zajedniko je postojanje stacionarne (nepokretne) i mobilne (pokretne) faze. Pri hromatografskim analizama gasovita ili tena mobilna faza nosi sastojke uzorka kroz stacionarnu fazu, a razdvajanje sastojaka temelji se na njihovim razliitim brzinama kretanja kroz stacionarnu fazu.

2.1. Podela hromatografskih metodaPostoje dve vrste hromatografskih metoda. U hromatografiji na koloni, stacionarna faza ispunjava usku cev kroz koju mobilna faza kree pod uticajem pritiska ili gravitacije. U laminarnoj hromatografiji stacionarna je faza naneta na plou ili u pore papira. Mobilna faza u hromatografiji na ploi prolazi kroz stacionarnu fazu pod uticajem kapilarnih sila ili gravitacije. Laminarna hromatografija i hromatografija na koloni osnivaju se na istim vrstama ravnotee. U ovom poglavlju se potanko obrauje hromatografija na koloni. Tena hromatografija izvodi se u kolonama i na ravnim povrinama, a gasna hromatografija i hromatografija sa superkritinim tenostima ograniene su na postupke u kolonama. Prva kolona u tabeli 2.1 prikazuje tri vrste hromatografskih metoda, u zavisnosti od prirode mobilne faze. Mobilne faze mogu biti tenosti, gasovi i tenosti pri superkritinim uslovima. Druga kolona tabele 2.1 odnosi se na pet vrsta tene hromatografije, zatim na tri vrste gasne hromatografije koje se meusobno razlikuju po prirodi stacionarne faze i vrsti ravnotee koja se uspostavlja izmeu mobilne i stacionarne faze.

3

Opta podela

Specifina metoda

Stacionarna faza

Vrsta ravnotee Podela izmeu tenosti koje se ne meaju Podela tene i povrine Apsorbcija Jonska izmena izmeu vezane

Tena Teno-teno, ili Tenost apsorbirana hromatografija (LC) raspodela na vrstoj materiji (mobilna faza : tenost) Tena-vezana faza Organski spojevi vezani na vrstu Teno-vrsto, ili povrinu apsorbcija vrsta materija Jonska izmena Jonski izmenjiva Razdvajanje na temelju veliine Tenost u estica prostorima polimera Gasna hromatografija (GC) (mobilna faza: gas) Gasno-tena Gasna vezana faza Gasno-vrsta

Hromatografija sa superkritinom tenou (SFC) (mobilna faza: tenost pri superkritinim uslovima) Tabela 2.1 Podela hromatografskih metoda na koloni

Podela/prosejavanj e Tenost apsorbirana Podela izmeu na vrstoj materiji tenosti koje se ne meaju Organski spojevi vezani na vrstu Podela izmeu povrinu tene i vezane povrine vrsta materija Apsorbcija Organski spojevi Podela izmeu vezani na vrstu superkritine povrinu tenosti i vezane povrine

2.1.1. Eluacijska hromatografija Slika 2.1 je shematski prikaz razdvajanja sastojaka A i B u koloni eluacijskom hromatografijom. Eluacija je ispiranje sastojaka koji prolaze kroz kolonu, dodavanjem novih koliina rastvaraa. Eluacija je proces u kojem mobilna faza ispira analizirane sastojke sa stacionarne faze. Eluens je rastvara koji nosi sastojke smee kroz stacionarnu fazu. Na vrh kolone unese se uzorak rastvoren u mobilnoj fazi (vreme t 0 na slici 2.1). sastojci A i B prolaskom kroz kolonu rasporeuju se izmeu mobilne i stacionarne faze. Dodavanjem mobilne faze (eluensa) pomera se rastvoreni uzorak niz kolonu uz dalju raspodelu sastojaka izmeu mobilne aze i sveeg dela stacionarne faze (vreme t1).

4

Slika 2.1 (a)dijagram pokazuje razdvajanje smee sastojaka A i B eluacijskom hromatografijom na stubu (b)izlazni zapis odziva detektora na razliitim stepenima eluacije prikazane u (a) Dodavanjem rastvaraa molekuli uzorka putuju niz kolonu uz uspostavljanje ravnotee izmeu mobilne i stacionarne faze. Sastojci uzorka kreu se samo u mobilnoj fazi, pa zato, prosena brzina kojom se sastojak kree kroz kolonu zavisi od vremena koje provede u mobilnoj fazi. To je vreme kratko za sastojke koje snano vee stacionarna faza (sastojak B na slici 2.1), a drugoza sastojke koje snanije vee mobilna faza (sastojak A). Zbog razliitih brzina kretanja, sastojci smee se razdvajaju, pri emu du kolone nastaju trake ili zone (slika 2.2).

Slika 2.2 koncentracijski profil traka sastojaka A i B u razliitim vremenima njihove eluacije niz kolonu (sa slike 2.1). Vremena t1 i t3 prikazana su na slici 2.1. Potpuno razdvajanje sastojaka omogueno je proticanjem dovoljne koliine mobilne faze kroz kolonu. Tada iz kolone izlaze razdvojeni sastojci (trake se eluiraju iz kolone) koji se mogu skupiti u za to pripremljene posudice (vreme t3 i t4 na slici 2.1). 5

Hromatogrami Hromatogram je zapis bilo koje funkcije koncentracije analizirane materije u zavisnosti od vremena ili volumena eluacije. Ako se na izlaz iz kolone postavi detektor, iji odziv zavisi od koncentracije sastojka u uzorku, a koji se belei kao funkcija vremena (ili volumena dodate mobilne faze), dobie se niz simetrinih eluacijskih kriva odnosno pikova poput onih prikazanih na donjem delu slike 2.1. Takav prikaz, nazvan hromatogram, koristan je i za kvalitativnu i za kvalitativnu analizu. Poloaj pika na vremenskoj osi moe posluiti za identifikaciju sastojaka, a iz povrine ispod pika moe se izraunati koliina svakog razdvojenog sastojka. Uticaj relativnih brzina kretanja i irenja zone eluiranog sastojka na razdvajanje Slika 2.2 prikazuje koncentracijske profile trake sa sastojcima A i B u koloni sa slike 2.1 u vremenu t1 i u kasnijem vremenu t3. Stacionarna faza snanije vee sastojak B nego A, pa zato sastojak B tokom kretanja niz kolonu zaostaje. Udaljenost izmeu njih se poveava kako se pomeraju niz kolonu. Istovremeno se zone ire i time smanjuju dejstvo kolone kao jedinice za razdvajanje. Dakle, kao to prikazuje slika 2.2, potpuno razdvajanje sastojaka mogue je ako je kolona dovoljno dugaka. Na brzinu razdvajanja zona eluiranih sastojaka i na njihovo irenje utie nekoliko hemijskih i fizikih veliina. Razdvajanje se moe poboljati nadziranjem onih veliina koje ili poveavaju brzinu razdvajanja ili smanjuju brzinu njihovog irenja. Te mogunosti pokazuje slika 2.3. Relativne brzine eluacije i irenje zona eluiranog sastojka odreuju dejstvo hromatografskog razdvajanja.

Slika 2.3 Hromatogram uzorka na kojem su pokazane dve metode za poboljanje razdvajanja: (a)izvorni hormatogram sa pikovima koji se preklapaju, (b)poboljanje u poveanoj razdvojenosti, (c)smanjenje irine pikova U sledeoj glavi opisane su veliine koje utiu na relativne brzine kretanja sastojaka kroz stacionarnu fazu. Nakon toga obrauju se veliine koje utiu na irenje zona eluiranih sastojaka. 6

2.2. Brzine kretanja analiziranih sastojakaDejstvo hromatografske kolone u pogledu razdvajanja sastojaka zavisi od njihovih relativnih brzina isticanja iz kolone. Te se brzine mogu odrediti iz odnosa raspodele sastojaka izmeu stacionarne i mobilne faze. 2.2.1. Odnosi raspodele u hromatografiji Sva hromatografska odvajanja temelje se na razliitoj raspodeli analiziranog sastojka izmeu mobilne i stacionarne faze. Za sastojak A ravnoteu opisuje sledea jednaina : Amobilna Astacionarna Konstanta ravnotee K te reakcije naziva se odnosom raspodele ili koeficijentom raspodele , i definie se kao K= cS cM (2.1)

pri emu je cS molarna analitika koncentracija sastojka u stacionarnoj fazi, a cM je njegova analitika koncentracija u mobilnoj fazi. Idealno gledajui, odnos raspodele stalan je u irokom podruju koncentracije analiziranog sastojka, to znai da je cs srazmeran cm. Uz visoke koncentracije analiziranog uzorka primeuje se odstupanje od linearnosti. Na sreu, veina hromatografskih analiza obavlja se pri uslovima koji zadovoljavaju jednainu 2.1 , to pojednostavljuje izvoenje izraza kojima se opisuju procesi razdvajanja. Hromatografiju pri uslovima priblinog, stalnog K nazivamo linearnom hromatografijom. 2.2.2. Vreme zadravanja Vreme zadravanja je vreme od unoenja uzorka u kolonu do pojave sastojka u detektoru smetenom na izlazu iz hromatografske kolone. Slika 2.4 prikazuje tipini hromatogram dobijen za uzorak sa jednim analitom. Vreme potrebno tom analitu da nakon unoenja uzorka stigne u detektor naziva se vremenom zadravanja i oznauje se simbolom tg. Mali pik sa leve strane odnosi se na spoj koji kolona ne zadrava. Uzorak ili mobilna faza esto sadre materije koje kolona ne zadrava. Ako uzorak ne sadri takav sastojak on se u njega moe dodati, ime se olakava identifikacija sastojka. Vreme tM koje je potrebno da materija koju kolona ne zadrava stigne u detektor katkad se zove mrtvo vreme. Brzina kretanja spoja koji kolona ne zadrava jednaka je prosenoj brzini kretanja molekula mobilne faze.

7

Slika 2.4 Tipini hromatogram smee koja sadri dva sastojka. Mali pik sa leve srane predstavlja sastojak koji se ne zadrava u koloni pa u detektor dospeva neposredno nakon poetka eluacije. Dakle, vreme zadravanja tM je priblino jednako vremenu potrebnom da molekuli mobilne faze prou kroz kolonu Prosena linearna brzina kretanja analiziranog sastojka, V je V = L tR (2.2)

pri emu je L duina punjenja u koloni. Slino tome, prosena linearna brzina kretanja, u, molekula mobilne faze je u= L tM (2.3)

pri emu je tM vreme potrebno da molekuli mobilne faze prou kroz kolonu. 2.2.3. Odnos izmeu vremena zadravanja i odnosa raspodele Kako bismo doveli u vezu vreme zadravanja nekog analita sa njegovim odnosom raspodele potrebno je njegovu brzinu kretanja izraziti kao deo brzine kretanja mobilne faze : V = u udeo vremena koje analizirani sastojak provede u mobilnoj fazi Taj deo vremena jednak je odnosu prosenog broja molova analiziranog sastojka u mobilnoj fazi u svakom trenutku i ukupnog broja molova tog sastojka u koloni: V =u molovi sastojka u mobilnoj fazi ukupni broj molova sastojka

Ukupni broj molova sastojka u mobilnoj fazi jednak je prizvodu molarne koncentracije cm tog sastojka u mobilnoj fazi i volumena mobilne faze Vm. Slino tome, broj molova 8

sastojka u stacionarnoj fazi dat je proizvodom koncentracije cs toga sastojka u stacionarnoj fazi i njenog volumena Vs. Iz toga sledi v = u c M VM 1 = u . c M V M + c sV s 1 + c sV s / c M V M

Uvrtavanjem jednaine 2.1 u ovu jednainu dobija se izraz za brzinu kretanja analita u funkciji njegovog odnosa raspodele i volumena stacionarne i mobilne faze v = u 1 1 + KV S / VM (2.4)

Volumeni stacionarne faze i mobilne faze mogu se dobiti iz postupka kojim se pravi kolona. 2.2.4. Brzina kretanja analita: faktor kapaciteta Faktor kapaciteta je vaan parametar kojim se opisuje brzina kretanja analita u koloni. Za analit A faktor kapaciteta k definie se kao A k = A K AVS VM (2.5)

Gde je KA odnos raspodele za analit A. Uvrtavanjem jednaine 2.5 u 2.4 nastaje v = u 1 1+ k A (2.6)

Da bi se pokazalo kako se k moe izraunati iz hromatograma, uvrste se jednaine 2.2 i A 2.3 u jednainu 2.6: L L 1 = tr tm 1 + k A Ta se jednaina moe napisati i kao k = A tR tM tM (2.8) (2.7)

Kao to pokazuje slika 2.4, tR i tM mogu se lako oitati iz hromatograma. Kad je faktor kapaciteta nekog analita mnogo manji od jedan, eluacija je tako brza da je teko tano oitati njegovo vreme zadravanja. Kad je faktor kapaciteta vei od 20 ili 30, vreme 9

eluacije postaje jako dugo. Idealno je sprovoditi razdvajanja pri uslovima uz koje faktori kapaciteta za analize u smei iznose izmeu 1 i 5. Faktori kapaciteta u gasnoj hromatografiji menjaju se promenom temperature i punjenja kolone. Menjanjem faktora kapaciteta u tenoj hromatografiji poboljava se razdvajanje, a to se postie menjanjem sastava mobilne i stacionarne faze. 2.2.5. Diferencijalne brzine kretanja: koeficijent selektivnosti Koeficijent selektivnosti kolne za dvaanalita A i B definie se kao:

=

KB KA

(2.9)

gde je KB odnos raspodele za snanije zadrani analit B, a KA je odnos raspodele za slabije zadrani odnosno bre eluirani analit A. Prema toj definiciji, je uvek vee od jedan. Koeficijent selektivnosti neke hromatografske kolone izraunat za dva razliita analita pokazuje koliko e dobro ta hromatografska kolona razdvojiti te sastojke. Uvrtavanjem jednaine 2.5 i iste jednaine za analit B u jednainu 2.9, posle sreivanja dobija se odnos izmeu koeficijenta selektivnosti i faktora kapaciteta za dva analita:

=

kB k A

(2.10)

gde su k B i k faktori kapaciteta za sastojak B odnosno A. Uvrtavanjem jednaine 2.8 A za ta dva sastojka u jednainu 2.10 dobija se izraz kojim se moe odrediti iz hromatograma:

=

(tR ) B tM (tR ) A tM

(2.11)

2.3. Dejstvo hromatografske koloneDejstvo hromatografske kolone oznaava veliina irenja eluirane zone sastojka. irenje zona nastaje tokom kretanja sastojka niz kolonu. Pre definisanja dejstva kolone kvantitativnim izrazima, ispitaemo razloge irenja zone eluiranog sastojka. 2.3.1. Kinetika teorija hromatografije Kinetika teorija hromatografije opisuje oblik i otrinu eluacijskih kriva kvantitativnim izrazima koji se temelje na mehanizmu sluajnog kretanja molekula tokom njihovog putovanja niz kolonu. Kvalitativno se mogu opisati uzroci irenja zona kao i varijacije koje ograniavanjem tog irenja, poboljavaju dejstvo kolone. Ako posmatramo hromatograme prikazane u ovom i sledeem poglavlju, videemo da eluacijske krive izgledaju kao Gausove krive greaka. Normalna kriva greaka moe se pojednostaviti uz pretpostavku da su nepouzdanosti vezane za svako pojedinano 10

merenje, zbir velikog broja malih, pojedinano neodreenih i sluajnih nepuzdanosti, od kojih svaka ima istu verovatnou da bude pozitivna ili negativna. Na slian nain, tipian Gausov oblik hromatografske krive odnosno pika, moe se pripisati aditivnoj kombinaciji sluajnih kretanja molekula u zoni za vreme njenog putovanja niz kolonu. Pouno je posmatrati pojedinani molekul sastojka kako tokom eluacije prelazi vie hiljada puta izmeu stacionarne i mobilne faze. Vreme zadravanja sastojka u stacionarnoj i mobilnoj fazi moe se znatno razlikovati. Za prelaz iz jedne faze u drugu potrebna je energija koju molekul uzima iz svog okruenja. Dakle, vreme zadravanja u datoj fazi moe biti kratko za neke molekule i relativno dugo za druge. Molekul putuje niz kolonu samo dok je u mobilnoj fazi. Zato neki molekuli, zbog sluajnog boravka u mobilnoj fazi tokom dueg vremena, putuju brzo, a drugi molekuli se ugrauju u stacionarnu fazu vie od prosenog vremena. Rezultat tih sluajnih pojedinanih procesa jeste simetrino razlaganje brzine oko srednje vrednosti, koja predstavlja ponaanje prosenog molekula analita. Zone se ire kako se sastojak pomera niz kolonu. Naime, to se zona eluiranog sastojka due nalazi u koloni, to ima na raspolaganju vie vremena za irenje, zbog razliitih mehanizama koji na to irenje utiu. Dakle, zona irenja je direktno srazmerna vremenu zadravanja u koloni, a obrnuto srazmerna brzini mobilne faze. 2.3.2. Kvantitativna definicija uticaja kolone Uticaj hromatografske kolone moe se kvantitativno izraziti sa dve srodne veliine, a to su: (1) visina tavana H i (2) broj teorijskih tavana N. Ta dva pojma vezuje jednaina N= L H (2.12)

gde je L duina (najee u centimetrima) punjenja kolone. Kolona je delotvorna kad je H malo a N veliko. Visina odseka H ponekad se oznaava kao visina ekvivalentna teorijskom tavanu. Dejstvo hromatografske kolone poveava se sa poveanjem broja tavana i sa smanjenjem njihove visine. Dejstva hromatografskih kolona mogu se meusobno znatno razlikovati, zavisno od vrste kolone i od razlika izmeu mobilne i stacionarne faze. Ako se govori o broju tavana u kolonama, postoje kolone sa nekoliko stotina do nekoliko stotina hiljada tavana. Visine tavana mogu biti od nekoliko desetinki do nekoliko hiljada centimetara. Definicija visine tavana Naglasili smo da je irina Gausove krive najbolje opisana standardnim odstupanjem i varijacijom 2. Budui da hromatografske trake imaju oblik Gausove krive, a dejstvo kolone utie na irinu hromatografskog pika, hromatografiari izraavaju dejstvo kolone varijacijom po jedinici duine kolone. Iz toga sledi da je visina tavana H izraena jednainom H= Eksperimentalna procena H i N 11

2 L

(2.13)

Slika 2.6 prikazuje tipini hromatogram u kojem je vremenska osa apscisa. Jedinice za varijaciju pika analiziranog sastojka, koja se moe izraunati jednostavnim grafikim postupkom, su sekunde na kvadrat. Varijacija se oznaava sa 2 da bi se razlikovala od 2 ije su jedinice kvadratni centimetri. Standardna odstupanja i mogu se povezati izrazom:

=

2 L / tR

(2.14)

pri emu je L/tR prosena linearna brzina kretanja analizirnog sastojka u centimetrima po sekundi. Tangente u takama infleksije sa obe strane hromatografskog pika produe se do osnove hromatograma, pa tako nastaje trougao. Moe se pokazati da povrina tog trougla iznosi priblino 96% ukupne povrine ispod pika. Dakle, odseak se nalazi na priblino 2 od maksimuma, a W = 4 , pri emu je W duina osnove trougla. Uvrtavanjem tog izraza u jednainu 2.14 i sreivanjem iste, dobija se:

=

LW . 4t R

Uvrtavanjem te jednaine umesto u jednainu 2.13 dobija se: H= LW 2 16t 2 R (2.15)

N se dobije uvrtavanjem i sreivanjem jednaine 2.12: t N = 16 R (2.16) W Da bi se uporedili N i H za dve kolone, mora se razmatrati isti sastojak. Dakle, N se moe izraunati iz dva merenja vremena, tR i W. Za izraunavanje H potrebno je imati podatak o duini punjenja kolone duine L. N se moe priblino izraunati na drugi, za neke pouzdaniji nain, iz W 1/2, tj. iz irine na polovini maksimalne visine pika. Tada se broj teorijskih tavana izraava kao: t N = 5,54 R W 1/ 2 (2.17) Spomenuta dva parametra N i H esto se susreu u literaturi, a proizvoai opreme pomou njih izraavaju dejstvo svojih kolona. Da bi se tim parametrima mogle uporediti dve kolone, bitno je da se izraunati podaci odnose na isti sastav.2 2

12

2.3.3. Kinetike veliine koje utiu na irenje zona irenje zone eluiranog sastojka posledica je konane brzine kojom se dogaaju procesi prenosa mase tokom kretanja sastojaka niz kolonu. Neke od tih brzina se mogu nadzirati nametanjem eksperimentalnim promenljivim, ime se ujedno poboljava razdvajanje. U tablici 2.2 propisane su najvanije od tih promenljivih. Uticaji tih veliina na dejstvo kolone, izraene visinom tavana H , opisani su u sledeim delovima. Veliina Oznaka Uobiajene jedinice Linearna brzina mobilne faze u cm s 1 Koeficijent difuzije u mobilnoj fazi DM cm 2 s 1 Koeficijent difuzije u stacionarnoj fazi DS cm 2 s 1 k Faktor kapaciteta(jednaina 26.8) Nema jedinice Duina zrna punjenja dp cm Debljina tenog sloja na stacionarnoj fazi df cm Tabela 2.2 Veliine koje utiu na dejstvo kolone Uticaj brzine protoka mobilne faze Veliina kinetikog uticaja na dejstvo hromatografske kolone zavisi od vremena koje mobilna faza provede u dodiru sa stacionarnom fazom, a to vreme opet zavisi od brzine protoka mobilne faze. Iz tog razloga, prouavanja dejstva kolone uglavnom su voena uz odreivanje H (jednaina 2.16 ili 2.17, zatim 2.12) kao funkcije brzine mobilne faze. Podaci dobijeni takvim prouavanjem, grafiki su prikazani na dva dijagrama na slici 2.5.

Slika 2.5 Uticaj brzine protoka mobilne faze na visinu tavana u (a)tenoj i (b)gasnoj hromatografiji

13

Jedan se dijagram odnosi na tenu a drugi na gasnu hromatografiju. Oba prikazuju minimum za visinu tavana H (ili maksimum u dejstvu) pri malim brzinama protoka. Minimum za krivu visine tavana u tenoj hromatografiji uglavno mse nalazi uz protoke, koji su mnogo manji od onih u gasnoj hromatografiji, a esto su tako mali da se ne mogu opaziti pri normalnim radnim uslovima. Uopteno, hromatogrami u tenoj hromatografiji dobiju se uz manje brzine protoka nego u gasnoj. Nadalje, kako prikazuje slika, visine tavana za kolone u tenoj hromatografiji su desetak puta manje od gasnohromatografskih kolona. Iz toga sledi da je nepraktina primena tenih kolona duih od 25 do 50 cm (zbog velikog snienja pritiska), a gasnohromatografske kolone mogu biti duge 50 ili vie metara. Posledica toga je da je ukupan broj tavana, pa prema tome i dejstvo kolone, uglavnom vei u gasnohromatografskim kolonama. Teorija irenja zona eluiranog sastojka Tokom zadnjih tridesetak godina radilo se mnogo na teorijskom i eksperimentalnom podruju sa ciljem pronalaenja kvantitativnih odnosa kojima se izraava uticaj eksperimentalnih veliina na visinu tavana za razliite vrste hromatografskih kolona. Napisano je vie od desetak izraza za izraunavanje visine tavana koji su primenjivani sa vie ili manje uspeha. Oigledno da ni jedan od njih nije potpuno objasnio sloene fizike interakcije i uticaje koji deluju na irenje zona i time smanjuju dejstvo kolone. Neke od tih jednaina, iako nisu bez mane mnogo se primenjuju jer upuuju na bolji rad kolone. Jedna od tih jednaina je i ovde navedena. Dejstvo najveeg broja hromatografskih kolona moe se aproksimirati izrazom: H = B / u + CS u + CM u (2.18)

u toj jednaini H je visina tavana u centimetrima, a u je linearna brzina u centimetrima po sekundi. Veliina B je koeficijent longitudinalne difuzije a CS i CM su koeficijenti prenosa mase u stacionarnoj i mobilnoj fazi. Jednaine navedene u tabeli 2.3 pokazuju kako karakteristine veliine kolone utiu na tri spomenuta lana iz jednaine 2.18. Izraz u Izrazi koji povezuju Broj jednaini osobine kolone* i jednaine 26.18 rastvorenog sastojka B/u Longitudinalna difuzija B 2k D D M = 2.19 u u Prenos mase prema i iz C S u qk d 2 f u CS u = 2.20 tene stacionarne faze (1 + k ) 2 D S Prenos mase prema i iz C S u 2t k u CS u = d 2 2.21 vrste stacionarne faze (1 + k ) Prenos mase mobilnoj C M u f d 2 p , d 2c ,u CM u = u 2.22 fazi DM Tabela 2.3 Kinetiki procesi koji doprinose irenju eluacijskih kriva Proces

(

)

14

* u,DM,DS,df,dp, k - definisani su u tablici 2.2 f- funkcija od kD,q- konstante td- proseno vreme desorpcije analita sa povrine: td = 1/kd, pri emu je kd konstanta brzine prvog reda za desorpciju. dc- duina kolone B- koeficijent longitudinalne difuzije CS, CM koeficijenti prenosa mase u stacionarnoj i mobilnoj fazi. Longitudinalna difuzija B/u Difuzija je proces kretanja molekula iz sredine vee koncentracije u sredinu manje koncentracije. Brzina kretanja molekula srazmerna je razlici u koncentraciji tih sredina kao i koeficijentu difuzije DM analiziranog sastojka. Koeficijent difuzije, kao mera za pokretljivost sastava u odreenom medijumu, je konstanta jednaka brzini kretanja uz jedinini koncentracijski gradijent. Longitudinalnu difuziju u hromatografiji uzrokuje kretanje anliziranog sastojka od koncentrisanog centra zone prema razreenim podrujima, i to u smeru kretanja mobilne faze i u suprotnom smeru. Longitudinalna difuzija je uobiajeni izvor irenja zona u gasno hromatografiji, ali ima malu vanost u tenoj hromatografiji. Naime, u gasnoj hromatografiji brzina difuzije molekula u gasnom medijumu veoma je velika a u tenoj hromatografiji difuzije su mnogo manje. Izraz B u jednaini 2.18 zavisi od koeficijenta difuzije DM analita u mobilnoj fazi i srazmeran je toj konstanti (2.19). Kako pokazuje jednaina 2.18, doprinos longitudinalne difuzije visini tavana obrnuto je srazmeran linearnoj brzini eluensa. Budui da je analit prisutan u koloni krae vreme ako je brzina protoka velika, ovaj odnos ne iznenauje. Zbog toga difuzija analita od centra prema krajevima eluacijske trake ima na raspolaganju manje vremena. Poetna smanjenja H , prikazana krivama na slici 2.5 direktna su posledica longitudinalne difuzije. Treba uoiti da je uticaj longitudinalne difuzije mnogo manji u tenoj hromatografiji, zbog mnogo manjih difuzija u tenoj mobilnoj fazi. Razlika u visini tavana, prikazana na dve krive na slici 2.5, moe se objasniti posmatranjem relativnih brzina longitudinalne difuzije u razliitim mobilnim fazama. Naime, koeficijenti difuzije u gasovitom medujumu mnogo su vei nego u tenom, pa je zato irenje zona vee u gasnoj nego u tenoj hromatografiji. Koeficijenti prenosa mase CS i CM Koeficijenti prenosa mase CS i CM potrebni su u jednaini 2.18 zato to se ravnotea izmeu mobilne i stacionarne faze uspostavlja tako sporo da hromatografska kolona uvek radi pri neravnotenim uslovima. Zbog toga molekuli analita odlaze sa prednjeg dela trake pre uspostavljanja ravnotee sa stacionarnom fazom, koja bi ih mogla zadrati. Slino tome, ravnotea se ne postie na razvuenom kraju trake, pa molekuli analita zaostaju za mobilnm fazom, koja se brzo kree niz kolonu.

15

irenje zona zbog prenosa mase nastaje zato to veliki broj tokova mobilne faze kroz kolonu i sloj nepokretne tenosti koja ini stacionarnu fazu imaju konane irine. Iz toga sledi da je potrebno odreeno vreme da molekuli sastojka difuzuju iz unutranjosti tih faza na povrinu, gde se deavaju prenosi. To zaostajanje podrava ne ravnotene uslove du cele kolone. Ako bi brzine prenosa mase u mobilnoj i stacionarnoj fazi bile beskonane, ne bi bilo irenja zona ove vrste. irenje zona izazvano longitudinalnom difuzijom kao i prenosom mase zavisi od brzine difuzije molekula analita ali je smer difuzije tada razliit. Longitudinalno irenje potie iz nastojanja molekula da se kreu u smeru paralelnom sa smerom protoka, a irenje izazvano prenosom mase nastaje zbog difuzije koso na smer protoka. Posledica toga je da je longitudinalno irenje uvek obrnuto srazmerno brzini protoka. irenje trake izazvano prenosom mase je manje to je brzina protoka mobilne faze vea, jer tada za uspostavljanje ravnotee ima manje vremena. Dakle, kako pokazuju dva poslednja izraza u jednaini 2.18, delovanje prenosa mase na visinu tavana srazmerno je brzini u kretanja mobilne faze. Izraz za prenos mase u stacionarnoj fazi CSu Kad je stacionarna faza nepokretna tenost, koeficijent prenosa mase je srazmeran kvadratu debljine sloja nanesenoga na zrnca vrstog nosaa df2 , a obrnuto srazmerna koeficijentu difuzije DS analiziranog sastojka u tom sloju (jednaina 2.20). Takvo dejstvo moe se objasniti injenicom da oba prenosa smanjuju prosenu uestalost kojom molekuli analita dolaze na povrinu sa koje mogu prei u mobilnu fazu. Iz toga sledi smanjenje brzine prenosa mase i poveanje visine tavana. Kad je stacionarna faza vrsti nosa, koeficijent prenosa mase CS srazmeran je vremenu koje je potrebno za adsorpciju ili desorpciju analiziranih sastojaka, a ono je obrnuto srazmerno konstantama brzine prvog reda (jednaina 2.21) tih procesa. Izraz za prenos mase u mobilnoj fazi CMu Procesi prenosa mase koji se mogu pojaviti u mobilnoj fazi suvie su sloeni tako da i do danas nisu potpuno proueni. S druge strane, veliine iz tog izvora koje utiu na irenje traka kvalitativno su dobro objanjene, to je znatno unapredilo sve vrste hromatografskih kolona. Poznato je da je koeficijent prenosa mase CM u mobilnoj fazi obrnuto srazmeran koeficijentu difuzije analita u mobilnoj fazi DM. CM takoe zavisi od kvadrata duine zrna punila dp2, kvadrata duine kolone dc2 i brzine protoka (jednaina 2.22). Doprinos prenosa mase u mobilnoj fazi visini tavana izraava se proizvodom koeficijenta prenosa mase CM (koji je funkcija brzine protoka eluensa) i same brzine protoka rastvora. Dakle, isti doprinos CMu visini tavana nije linearan u u (pogledati krivu oznaenu sa CMu na slici 2.7), ali na sloen nain zavisi od brzine eluensa. Zona irenja u mobilnoj fazi delimino je posledica velikog broja puteva kojima se molekuli (ili joni) mogu kretati niz punjenu kolonu. Kako prikazuje slika 2.6, duine tih puteva mogu se meusobno znatno razlikovati. Iz toga sledi da je vreme, koje molekuli istog sastojka provedu u koloni, takoe razliito. Molekuli analiziranog sastojka dospevaju na kraj kolone u odreenom vremenskom periodu, to uzrokuje irenje traka.

16

Slika 2.6 Tipini putevi dva molekula tokom eluacije. Udaljenost koju pree molekul 2 vea je od one koju proe molekul 1 Taj uticaj, koji se ponekad zove vrtlona difuzija, ne bi zavisio od brzine protoka eluensa kad ne bi delimino bio uzrokovan obinom difuzijom. Ta difuzija naime, uzrokuje da molekuli iz struje koja sledi jedan tok prelaze u struju drugog toka. Ako je brzina protoka vrlo mala, moe biti vrlo mnogo prelaza, pri emu svaki molekul koji ide niz kolonu sledi puno puteva, kratko ostajui u svakom od njih. Posledica toga je da se brzina svakog molekula koji se kree niz kolonu pribliava prosenoj brzini. Dakle, pri malim brzinama kretanja mobilne faze, molekuli ne mogu, zbog prirode punjenja da omogue mnotvo puteva. Pri umerenim ili veim brzinama, nema dovoljno vremena za stvaranje prosene difuzije, pa se dogaa irenje traka zbog razliitih duina puteva. Pri dovoljno velikim brzinama dejstvo vrtlone difuzije ne zavisi od brzine protoka mobilne faze. Na vrtlonu difuziju nadovezuje se dejstvo depova u stacionarnoj fazi, u kojima se zadrava mobilna faza. Dakle, kad je stacionarna faza vrsta materija, njene pore napunjene su statinim volumenom mobilne faze. Molekuli analita moraju difuzovati kroz te depove pre nego to je omoguen njihov prolaz izmeu mobilne faze koja se kree i stacionarne faze. Navedeno ne vredi samo za vrstu stacionarnu fazu nego i za tenu stacionarnu fazu nanesenu na providnu vrstu materiju, jer ona najee ne ispunjava pore punjenja potpuno. Postojanje depova s mobilnom fazom usporava proces zamene. To utie na visinu tavana koja je srazmerna koeficijentu difuzije za analit u mobilnoj fazi. Poveanje duine zrna dp posredno utie na visinu tavana jer je poveanje unutranjeg volumena praeno poveanjem dimenzija zrna punjenja. Uticaj brzine mobilne faze na izraze u jednaini 2.18 Promenu tri izraza iz jednaine 2.18 u funkciji brzine mobilne faze pokazuje slika 2.7. Kriva na vrhu je zbir navedenih dejstava. Obratite panju na to da postoji optimalna brzina protoka pri kojoj je visina tavana minimalna, a dejstvo razdvajanja maksimalno.

17

Zakljuno o metodama koje smanjuju irenje zona Duina zrna punjenja i duina kolone su dve merljive veliine koje utiu na dejstvo kolone. Dejstvo kolona poveavala se zadnjih godina primenom sve uih kolona. Uz gasove tene faze longitudinalna difuzija moe se smanjiti sniavanjem temperature, ime se smanjuje i koeficijent difuzije DM , a visine tavana postaju sve manje. To se ne primeuje u tenoj hromatografiji, jer je difuzija dovoljno mala da izraz za longitudinalnu difuziju samo neznatno utie na ukupnu visinu tavana. Uz tene stacionarne faze, debljina adsorbovanog tenog sloja mora biti minimalna jer je CS u jednaini 2.18 srazmeran kvadratu veliine df u jednaini 2.20. irenje zona eluiranog sastojka moe se smanjiti upotrebom punjenja i kolone malog prenika. Koeficijent difuzije DM ima vei uticaj u gasnoj nego u tenoj hromatografiji.

Slika 2.7 Doprinos razliitih koeficijenata prenosa mase na visinu tavana kolone

2.4. Optimizacija rada koloneHromatografsko razdvajanje moe se optimizirati menjanjem eksperimentalnih uslova. Ti se uslovi menjaju sve dok se sastojci smee dobro ne podele uz minimalnu potronju vremena. Optimizacija razdvajanja moe se postii: Smanjenjem irenja zona eluiranog sastojka Promenom relativnih brzina kretanja sastojka. irenje zona poveavaju one kinetike veliine koje poveavaju visinu tavana kolone. Brzine kretanja, sa druge strane, menjaju se promenom onih veliina koje utiu na faktor kapaciteta i koeficijent selektivnosti rastvorenih sastojaka. 2.4.1. Odvajanje Odvajanje Rs kolone je kvantitativna mera kojom se izraava sposobnost razdvajanja dva analita na toj koloni. Vanost tog izraza prikazuje slika 2.8 sa dva hromatograma za

18

sastojke A i B na tri kolone razliite moi razdvajanja. Odvajanje svake kolone definisano je izrazom: Rs = 2[ ( t R ) B ( t R ) A ] 2 Z = W A + WB W A + WB (2.23)

Iz slike 2.8 vidljivo je da odvajanje od 1,5 omoguava potpuno odvajanje sastojaka A i B, a odvajanje od 0,75 to ne omoguava. Uz odvajanje od 1,0 zona A ssri otprilike 0,4% B, a zona B sadri priblino 4% A. Uz odvajanje od 1,5 preklapanje iznosi otprilike 0,3%. Odvajanje za odreenu stacionarnu fazu moe se poboljati produavanjem kolone, ime se poveava broj teorijskih tavana. Nepogodnost pri poveanju broja tavana je u produenju vremena koje je potrebno za postizanje boljeg odvajanja. Odnosi izmeu odvajanja i osobina kolone i osobina analita Postoji korisna jednaina koja povezuje odvajanje kolone sa brojem tavana, faktorima kapaciteta i koeficijentima selektivnosti za dva analizirana sastojka na hromatografskoj koloni. Moe e pokazati da je za dva rastvorena sastojka A i B na slici 2.1 odvajanje dato jednainom: N 1 k B (2.24) 1+ k 4 B pri emu je k B faktor kapaciteta za sastav koji se pomera sporije, a je faktor selektivnosti. Ta se jednaina moe preurediti da bi se dobio broj tavana potrebnih za dobijanje traenog odvajanja: Rs = N = 16 R s 12 2

1 + kB k B

2

(2.25)

Odnos izmeu odvajanja i vremena eluacije Kao to je pre spomenuto, optimum u hromatografiji je kad se postigne najbolje mogue odvajanje u najkraem moguem vremenu. Na alost, ta se dva pojma meusobno iskljuuju, pa je zato potrebno postii nekakav kompromis. Vreme (tR)B potrebno za eluaciju dva sastojka sa sike 2.8 uz odvajanje RS iznosi:

(tR ) B

16 Rs H (1 + k B ) = u 2 1 ( kB )2 2

3

(2.26)

gde je u linearna brzina kretanja mobilne faze.

19

Slika 2.8 Razdvajanje na tri kolone Primer 1. Vreme zadravanja sastava A i B iznose 16,40 i 17,63 minuta na koloni duine 30 centimetara. Nezadravana supstanca prolazi kroz kolonu za 1,30 minuta. irina pika u bazi za A iznosi 1,11 a za B 1,21 minuta. Izraunajte: 1. odvajanje kolone 2. prosean broj tavana 3. visinu tavana 4. duinu kolone potrebnu za postizanje odvajanja od 1,5 5. vreme potrebno za eluaciju sastojka b na duoj koloni. Primenom jednaine 26.16 moe se izraunati N: Rs= 2(17,63-16,40)/(1,11+1,21) = 1,06 Jednainom 26.16 moe se izraunati N. 16,40 N = 16 = 3493 1,11 2

i

17,63 N = 16 = 3397 1,21

2

N sr = ( 3493 + 3397 ) / 2 = 3445 = 3,4 10 3 H = L / N = 30,0 / 3445 = 8,7 10 3 cm k i ne menjaju se poveanjem N i L. Dakle, uvrtavanje N1 i N2 u jednainu 26.24 i meusobno deljenje nastalih jednaina dae: 20

, N2 pri emu se indeksi 1 i 2 odnose na izvornu i duu kolonu. Uvrtavanje odgovarajuih vrednosti za N1, (Rs)1 i (Rs)2 daje 1,06 3445 = 1,5 N2 1,5 N 2 = 3445 = 6,9 10 3 . 1,06 Ali L = NH = 6,9 10 3 8,7 10 3 = 60 cm. Uvrtavanjem (Rs)1 i (Rs)2 u jednainu 26.26 te deljenjem nastaje:2

( Rs ) 1 ( Rs ) 2

=

N1

(tR )1 (tR ) 2

(R ) = s 1 ( Rs ) 2 (tR ) 2

17,63 (1,06) = = ( t R ) 2 (1,5) 2

2

= 35 min Dakle, za poboljanje odvajanja mora se udvostruiti vreme odvajanja. 2.4.2. Tehnike optimizacije Jednaine 2.24 i 2.26, koje se sastoje od tri dela, temeljne su jednaine za izbor uslova pri kojima se postie eljeni stepen odvajanja uz minimalno trajanje. Prvi deo izraza sa N odnosno H , opisuje dejstvo kolone. Drugi deo je koeficijent koji sadri , a predstavlja izraz za selektivnost i zavisan je od osobina oba analita. Trei deo je koeficijent koji sadri k B , a odnosi se na kapacitet kolone. Ovaj izraz zavisi od osobina analita i hromatografske kolone. Promene visine tavana Iz jednaine 2.24 vidi se da se odvajanje kolone poveava sa poveanjem kvadratnog korena broja tavana. Primer 1 pokazuje da poveanje broja tavana prati due trajanje analize ako se postie produenjem kolone, a ne smanjenjem visine tavana. Optimizacija brzine protoka mobilne faze takoe doprinosi poboljanju odvajanja. Smanjenje visine tavana se moe postii smanjenjem: Dimenzije zrna punjenja Prenika kolone Debljine tenog sloja (tena hromatografija) 21

Snienjem temperature kolone (gasna hromatografija). Promene faktora kapaciteta Menjanjem faktora kapaciteta k B moe se esto uticati na mo odvajanja. Poveanje k B najepe poboljava odvajanje (ali na utrb vremena). Da bi se odredilo optimalno podruje za vrednosti k B , poeljno je jednainu 2.24 pisati u obliku: Rs = Q a jednainu 2.26 kao: kB , 1+ kB

(tR ) B

= Q

(1 + k B ) 3 (kB ) 2

gde Q i Q sadre ostatak izraza te dve jednaine. Slika 2.9 prikazuje Rs/Q i ( t R ) B / Q u zavisnosti od k B uz pretpostavku da su Q i Q priblino stalni. Jasno je da treba izbegavati vrednosti k B vee od 10, jer one neznatno poveavaju odvajanje, ali zato znatno produavaju vreme potrebno za razdvajanje sastojaka. Minimum na krivi eluacija vreme pojavljuje se pri k B 2. Zato je esto optimalna vrednost k B u podruju izmeu 1 i 5.

Slika 2.9 Uticaj faktora kapaciteta k B na razdvajanje Rs i na vreme eluacije (tR)B Odvajanje kolone najjednostavnije se moe poboljati optimizacijom k . Uz primenu gasnih mobilnih faza k se moe optimizovati menjanjem temperature. Promene sastava rastvora, uz tene mobilne faze, mogu delovati na k tako da se postiu bolja razdvajanja. Primer snanog uticaja relativno male promene u sastavu rastvora pokazuje slika 2.10. Neznatne promene odnosa metanol/voda pretvaraju nezadovoljavajue hromatograme (a i b) u hromatograme sa dobro razdvojenim pikovima svih sastojaka (c i d). Za najiru

22

primenu esto je optimalno reenje hromatogram (c) na kojem je zadovoljavajue razdvajanje postignuto u minimalnom vremenu.

Slika 2.10 Uticaj sastava eluensa na hromatograme Promene koeficijenta selektivnosti Optimizacija k i poveanje N ne osiguravaju zadovoljavajue razdvajanje sastojaka uzorka u razumnom vremenu kad se pribliava jedinici. Trebalo bi pronai naine kojima bi se poveao , a k odmah ostao izmeu 1 i 10. to se moe postii: Promenom sastava mobilne faze Menjanjem temperature kolone Menjanjem sastava stacionarne faze Primenom posebnih hemijskih reakcija Primer za promenu sastava mobilne faze je razdvajanje anisola (C6H5OCH3) i benzena. Uz mobilnu fazu, koja se sastoji od smee 50% vode i 50% metanola, k iznosi 4,5 za anisol i 4,7 za benzen, a je samo 1,04. Zamena vodene faze mobilnom fazom koja sadri 37% tetrahidrofurana daje k od 3,9 i 4,7 uz vrednost 1,20. Pikovi su se znatno preklapali uz sastav rastvora metanol/voda, a neznatno uz tetrahidrofuran/metanol. Manje pogodna, ali esto vrlo delotvorna metoda poboljanja odvajanja uz istovremeno odravanje k u optimalnom podruju, sastji se u hemijskoj promeni sastava stacionarne faze. Mnoge laboratorije imaju nekoliko razliitih kolona, koje se mogu relativno lako zameniti, pa se i tako mogu poboljati odvajanja. Porast temperature esto izaziva poveanje k , ali neznatno utie na vrednosti za hromatografiju u sastavu tenost- tenost ili tenost- vrsta materija. Nasuprot tome, u hromatografiji jonske izmene uticaj temperature moe biti dovoljno veliki da ne treba posezati za promenom punjenja kolone.

23

etvrta metoda poboljanja odvajanja sastoji se u ugradnji spojeva u stacionarnu fazu, koji sa jednim sastojkom uzorka ili vie njih stvaraju komplekse ili neke druge spojeve. Dobro poznat primer takvog naina jeste kada adsorbens impregniran sa soli srebra poboljava odvajanje olefina stvaranjem kompleksa srebra jona sa nezasienim organskim spojevima. 2.4.3. Opti problem eluacije Na slici 26.14 nalaze se hipotetiki hromatogrami smee kojase sastoji od est sastojaka. Ti sastojci ine po tri para sa vrlo razliitim koeficijentima raspodele, dakle i sa vrlo razliitm faktorima kapaciteta. U hromatogramu (a) uslovi su tako izabrani da faktori kapaciteta za sastojke 1 i 2 ( k1 i k 2 ) imaju optimalnu vrednost izmeu 1 i 5. faktori za druge sastojke su pri tome mnogo vei od optimalnih. Zbog toga se pikovi sastojaka 5 i 6 pojavljuju tek nakon dosta vremena i tako su iroki da se teko mgu identifikovati. Kako pokazuje hromatogram (b), promena uslova u cilju optimizacije razdvajanja sastojaka 5 i 6 skuplja pikove prva etiri sastojka tako da je njihovo odvajanje nezadovoljavajue. Meutim, u ovom je primeru ukupno vreme eluacije idealno. Trei izbor uslova, uz koje su k vrednosti za sastojke 3 i 4 optimalne, daje hromatogram (c). Ni ovde razdvajanje preostala dva para nije potpuno zadovljavajue.

Slika 2.11 Opti problem eluacije u hromatografiji Fenomen prikazan na slici 2.11 susree se tako esto da zasluuje naziv opti problem eluacije. Razumno reenje tog problema je u menjanju uslova koji odreuju vrednost k tokom samog procesa razdvajanja. Spomenute promene mogu se unositi postepeno ili neprekidno. Dakle, za smeu sa slike 2.11, na poetku razdvajanja mogu se postaviti uslovi koji e dati hromatogram (a). Odmah nakon eluacije sastojaka 3 i 4 8hromatogram c) postaje optimalno. Sa pojavom tih pikova, eluacija se dovrava pri uslovima nastajanja hromatograma (b). esto se takvim pristupom postigne zadovoljavajue razdvajanje smee u to je mogue kraem vremenu. U tenoj hromatografiji promene u k postiu se menjanjem sastava mobilne faze tokom eluacije (gradijentna eluacija ili programiranje rastvora). U gasnoj hromatografiji

24

porastom temperature (temperaturno programiranje) stvaraju se optimalni uslovi za razdvajanje

2.5. Pregled vanih odnosa za hromatografijuU hromatografiji postoji mnogo razliitih izraza i odnoa koji ponekad mogu stvarati zabune. Tablice 2.4 i 2.5 daju pregled najvanijih definicija i jednaina koje se spominju u ovom tekstu. Naziv Oznaka za eksperi-mentalnu Izvedeno iz veliinu nezadravanog tM Slika 2.11 (tR)A,(tR)B ( t R ) A WA, WB L F VS Slika 2.11 ( t R ) A = (tR)A - tM Slika 2.11 Merenja duine Merenja protoka Podaci iz pripreme punjenja Podaci iz analize i pripreme

Vreme kretanja sastava Vreme zadravanja, sastojci A i B Ispravljeno vreme zadravanja, sastojak A irina pikova, sastojci A i B Duina punjenja kolone Brzina protoka Zapremina stacionarne faze

Koncentracija sastojka u mobilnoj i c S c M , stacionarnoj fazi Tabela 2.4 Vane eksperimentalne hromatografske veliine i odnosi Naziv Izraunavanje izvedenih veliina Linearna brzina u = L / tM mobilne faze Zapremina VM = t M F mobilne faze Faktor kapaciteta Koeficijent raspodele Koeficjent selektivnosti Odvajanje Broj tavana Visina tavana k = (tR tM ) / tM k VM VS (t ) t = R B M (tR ) A tM K= Rs =

Veza sa ostalim veliinama

2[ ( t R ) B ( t R ) A ] W A + WB2

KV S VM c K= S cM k K = B = B k KA A k = Rs = N 1 k B 1+ k 4 B2 2

2

t N = 16 R W H = L/ N

N = 16 R s 1

1 + kB k B

25

Vreme zadravanja

(tR ) B

16 Rs H (1 + k B ) u 2 1 ( kB ) Tabela 2.5 Vane izraunate veliine i odnosi2 2 3

=

2.6. Primena hromatografijeHromatografija je postala metoda koja ima apsolutnu prednost pri razdvajanju slinih hemijskih spojeva. Osim toga, hromatografska analiza se moe primeniti za kvalitativno dokazivanje i kvantitativno odreivanje razdvojenih hemijskih vrsta. 2.6.1. Kvalitativna analiza Hromatografska analiza se uveliko primenjuje pri utvrivanju prisutnosti ili odsutnosti nekog sastojka u smei poznatog sastava. Na primer, 30 ili vie aminokiselina u proteinskim hidrolizatima moe se identifikovati na hromatogramu uz razuman stepen pouzdanosti. Sa druge strane, hromatogram prua samo jedan podatak o svakom sastavu prisutnom u uzorku (vreme zadravanja), pa je zato primena te tehnike na sloene uzorke nepoznatog sastava ograniena. Iz tog razloga je postalo uobiajeno da se hromatografske kolone poveu sa ultraljubiastim, infracrvenim ili masenim spektometrima koji imaju vee identifikacijske sposobnosti. Tako nastali povezani ureaji odnosno kombinovane tehnike mono su sredstvo za odreivanje sastava sloenih smea. Naveemo nekoliko kombinovanih tehnika: (1) gasna hromatografija- spektrometrija masa (GC- MS). Visoko delotvorna tena hromatografija- spektrometrija masa (HPLC- MS). Gasna hromatografija- IR spektroskopija (GC- IR). Treba naglasiti da hromatogram ne mora nuno potvrditi prisutnost nekog sastojka, ali on sigurno potvruje njegovu odsutnost. Dakle, injenica je da se na hromatogramu uzorka uz isto vreme zadravanja koje ima standard, a pogotovo uz pretpostavku da su dobijeni uz iste radne uslove, ne nalazi pik, neosporno je potvrda da tog sastojka u uzorku nema 8ili je prisutan u koncentracijama koje su manje od praga osetljivosti primenjenog postupka). 2.6.2. Kvantitativna analiza Hromatografija se razvila zahvaljujui svojoj brzini, jednostavnosti, relativno niskoj ceni i mogunosti primene kao ureaja za razdvajanje. Najvea prednost hromatografije sastoji se, ipak, u mogunosti i kvantitativne analize. Kvantitativna hromatografija temelji se na poreenju visine ili povrine analiziranog pika sa visinom ili povrinom pika standarda. Ako su radni uslovi hromatografske analize strogo ponovljivi, ovi se parametri menjaju linearno sa koncentracijom. Analize koje se temelje na visini pika Visina pika je duina kosine sputene od maksimuma pika do osnovne crte pika. Ta se udaljenost moe izmeriti prilino tano. Izraunati rezultati koliine prisutnih sastojaka u uzorku su tani uz pretpostavku da promene uslova, pri kojima se rade analize standarda i uzorka, ne menjaju irinu pika u vremenu potrebnom za dobijanje hromatograma uzorka i 26

standarda. Veliine koje pri analizi treba briljivo nadzirati su temperatura kolone, brzina protoka mobilne faze i brzina unoenja uzorka. Pored toga treba paziti da se kolona ne preoptereti. Brzina unoenja uzorka posebno utie na pikove koji se nalaze na poetku hromatograma. Relativne greke od 5 do 10% nisu neuobiajene pri unoenju uzorka mikrolitarskom prskalicom. Analize koje se temelje na povrini pika Povrina pika ne zavisi od uticaja irenja zone koja uzrokuje veliine navedene u prethodnom poglavlju. Sa tog gledita, povrina za izraunavanje koliine nekog sastojka je povoljniji parametar od visine pika. Sa druge strane, visinu pika je jednostavnije izmeriti od njegove povrine, a osim toga, merenje visine uskih pikova tanije je od merenja njihove povrine. Mnogi savremeni hromatografski ureaji sadre elektronske integratore kojima se mogu izmeriti relativne povrine pikova. Ako takva oprema nije dostupna, mogu se napraviti rune procene. Jednostavna metoda, koja vredi za simetrine pikove umerene irine, sastoji se u mnoenju visine pika sa njegovom irinom na polovini visine. Zatim, se moe upotrebiti planometar, ili se dobijeni pikovi mogu isei i izmeriti. Izmerena masa iseenog pika sa papira uporeuje se sa izmerenom masom papira poznate povrine koja odgovara poznatoj koncentraciji. Runa integriranja omoguavaju reproduktivnost izraunavanja povrina od 2 do 5%, a digitalna su nekoliko desetina puta tanija. Badarenje primenom standarda Najpogodnija metoda kvantitativne hromatografske analize sastoji se u pripremi niza standardnih badarenih rastvora koji su po sastavu sline analiziranom uzorku. Standardnom rastvoru snimi se hromatogram, a visine pikova ili njihove povrine prikau se na dijagramu u zavisnosti od koncentracije. Takvim prikazom mora se doboti pravac, koji prolazi poljem koordinatnog sistema i predstavlja temelj za kvantitativnu analizu ispitivanih uzoraka. Radi postizanja velike tanosti, ovaj postupak je potrebno esto ponavljati. Najei izvor greaka u analizama metodom badarenja sa standardima je u nepouzdanosti uneene zapremine u kolonu. Ponekad na greke utie i brzina unoenja uzorka. Koliine uzorka su esto male ( 1L ), tako da nepouzdanosti vezane za reproduktivno unoenje uzorka mogu iznositi nekoliko posto. Jo su najpovoljnije okolnosti u gasno- tenoj hromatografiji kad se uzorak unosi u zagrejani deo ureaja. Pri takvom nainu unoenja uzorka mogu se pojaviti velike razlike u uneenoj koliini uzorka, zbog isparavanja na vrhu igle. Greke zbog unoenja uzorka mogu se smanjiti na 1-2% upotrebom rotacionog ventila za unoenje uzorka, prikazanog na slici 2.12.

27

Slika 2.12 Rotacioni ventil za unoenje uzorka: (a)poloaj ventila za punjenje petlje ACB; (b)poloaj ventila za unoenje uzorka u kolonu Petlja ACB u (a) napunjena je tenou. Okretanjem ventila za 45 stepeni u struju mobilne faze unosi se reproduktivna zapremina uzorka (zapremina sadrana u ACB). Metoda unutranjeg standarda Pri hromatografskoj analizi postiese najvea preciznost primenom metode unutranjeg standarda. Tom se metodom izbegavaju nepouzdanosti koje nastaju zbog razlika u uneenoj koliini uzorka i standarda u hromatografsku kolonu. Tom se metodom u standardni rastvor i uzorak dodaje briljivo izmerena koliina unutranjeg standarda. Pri tome je analitiki parametar iznos povrine (ili visine) pika analiziranog sastojka i povrine ( ili visine) pika unutranjeg standarda. Da bi ta metoda bila uspena, pik unutranjeg standarda mora biti dobro podeljen od pikova ostalih sastojaka (Rs>1,25) i mora se nalaziti u blizini pika analiziranog sastojka. Sa pogodnim unutranjim standardom mogu se postii preciznosti od 0,5 do 1%.

.03 GASNO-TENA HROMATOGRAFIJAU gasnoj hromatografiji inertni gas nosa, koji je mobilna odnosno pokretna faza, eluira sastojke smee iz kolone napunjene stacionarnom fazom. Za razliku od tene hromatografije u gasnoj hromatografiji analit ne reagira sa mobilnom fazom, pa zbog toga njegova brzina kretanja kroz kolonu ne zavisi od hemijske strukture mobilne faze. Stacionarna je faza u gasnoj adsorpcijskoj hromatografiji vrsta materija velike specifine povrine, na kojoj se adsorbiraju analizirani sastojci. U adsorbcijskoj hromatografiji sastojci uzorka razdvajaju se zbog razlika u poloaju ravnotee koja se uspostavlja izmeu gasovitog sastojka uzorka i vrste povrine stacionarne faze. Primena gasne adsorbcijske hromatografije ograniena je na gasovite spojeve male molekularne mase kao to su oksidi ugljenika, kiseonik, azot i ugljovodonici. Polarniji sastojci

28

zadravaju se polutrajno na vrstoj povrini, to najee suava primenu vrstih adsorbensa za gasno-hromatografska razdvajanja. Gasno-tena hromatografija (gas-liquid cromatography, GLC) o kojoj je u ovom poglavlju re analitika je tehnika sa najveom primenom za razdvajanje i kvantitativno odreivanje veine sloenih smea. Stacionarna faza je u gasno-tenoj hromatografiji tenost, nanesena na povinu vrstog nosaa adsorpcijom ili hemijskim vezivanjem. Brzinu prolaza analita kroz kolonu odreuje njegov raspon raspodele izmeu pokretne gasovite faze i imobilizirane, tene faze. Iako su model gasno-tene hromatografije 1941. godine najavili Martin i Synge, njegova korisnost za razdvajanje srodnih hemijskih spojeva pokazana je tek desetak godina posle. Tri godine nakon prvog javnog predstavljanja, na tritu se pojavio komercijalni gasni hromatograf. Od tog vremena se gasna hromatografija neizostavno primenjuje u analitici. Zanimljivi su podaci o broju objavljenih radova iz gasne hromatografije kojih je do 1965. godine bilo dve hiljade godinje, a do 1985. godine taj broj se poveao na pet hiljada.

3.1. Principi gasno-tene hromatografijeOsnovni principi hromaotgrafije iznesena u prethodnom poglavlju i matematiki odnosi prikazani u tabelama 2.4 i 2.5 mogu se primeniti i na gasnu hromatogafiju uz male izmene za korekcije u pogledu mogunosti gasnih mobilnih faza. Jednaina 2.18 za izraunavanje visine tavana moe se primeniti za gasnu i za tenu hromatografiju. Longitudinalna difuzija (B/u) iz te jednaine ima vei uticaj kad je mobilna faza gas, jer su brzine difuzije u gasovima 104 puta vee od onih u tenostima. Zbog toga je minimum u dijagramu na kojem se prikazuje visina tavana u odnosu prema brzini protoka mnogo iri u gasnoj hromatografiji (slika 2.5 b) nego u tenoj. To se takoe odnosi i na krive sa slike 3.1 na kojoj je pokazano kako smanjenje obima zrna punjenja poveava visinu tavana.

Slika 3.1 Uticaj veliine zrna na visinu tavana. Brojevi sa desne strane oznaavaju prenike zrna

29

3.2. Ureaji za gasno-tenu hromatografiju3.2.1. Dovod gasa nosaa Kao gas nosa, koji mora biti hemijski inertan, mogu se upotrebljavati helijum, argon,vodonik i azot. Najee se upotrebljava helijum. Izvor gasa nosaa esto zavisi od primenjenog detektora. Na dovod gasa nosaa postavljaju se regulatori pritiska, ventili i merai protoka, a esto i molekularna sita koja slue za uklanjanje vode i ostalih neistoa. Brzine protoka nadziru se regulatorima pritiska. Ulazni pritisci su otprilike od 0.7 do 3.5 105 Pa (iznad pritiska okoline), a protoci od 25 do 150 mL/min. Brzina protoka moe se izmeriti jednostavnim meraem protoka sa mehuriem sapunice. Na putu gasa nosaa stvori se mehuri sapunice. Vreme, tokom kojeg se tako nastala opna pomakne izmeu dve oznake na bireti prerauna se u brzinu protoka. 3.2.2. Sistem za ubrizgavanje uzorka Kako bi se smanjilo irenje zone eluiranog sastojka, u kolonu treba uneti malu koliinu uzorka, i to brzo. Teni uzorak se najee unosi kroz gumenu ili silikonsku membranu odnosno septum u zagrejani deo ureaja smeten na vrhu kolone najee pomou mikrolitarskog ubrizgivaa. Mesto na kojem se unosi uzorak (slika 3.2) uglavnom se greje otprilike 50 C iznad temperature vrenja najmanje isparljivog sastojka, tako da uzorak za vreme unoenja u kolonu trenutno ispari. Koliina uzorka uneena u anlitiku kolonu moe biti od nekoliko desetina mikrolitara do 20 L. Pri radu sa kapilarnim kolonama u koje se unose mnogo manje koliine uzorka ( 10 3 L), upotrebljava se razdvaja toka gasa nosaa, tako da samo vrlo mali, najee hiljaditi deo uzorka ue u kolonu, a ostatak se isputa u atmosferu.

Slika 3.2 Grejani deo za unoenje uzorka 30

Gasovite uzorke najbolje je unositi u kolonu pomou gasnih (dozatorskih) ventila slinih onima prikazanim na slici 2.12. vrsti uzorci najee se unose nakon rastvaranja. 3.2.3. Kolone Prva prouavanja gasno- tene hromatografije ranih pedesetih godina radila su se na punjenim kolonama kod kojih je sloj tenosti bio zadran na povrini sitno mlevenog, inertnog vrstog nosaa. Teorijska razmatranja iz tog ranog perioda pokazala su da su uplje kolone prenika nekoliko desetina milimetara delotvornije i bre od punjenih kolona. U takvim kapilarnim kolonama stacionarna faza je jednoliki sloj tenosti debljine nekoliko desetina milimetara kojim je jednako podvuena unutranji zid cevi. Kasnih 50ih godina izraene su kolone kapilarnih dimenzija praznih cevi tzv. Cevaste otvorene kolone, a predvieni vidovi ponaanja tih kolona tokom primene, potvrene su u nekoliko laboratorija na kolonama sa trista hiljada tavana ili vie. Uprkos tako izvanrednim vidovima ponaanja u primeni, kapilarne kolone su se masovno poele upotrebljavati tek desetak godina nakon njihovog pronalaska. Razloga za odlaganje ire primene kailarnih kolona bilo je vie: mali kapacitet za uzorak, lomljivost, mehanike potekoe vezane sa unoenjem uzorka i spajanjem kolone na detektor, potekoe oko reproduktivnog prevlaenja kolone, kratki vek trajanja loe pripremljenih kolona, mogunost zaepljenja i patenti koji su onemoguavali komercijalni razvoj (izvorni patent je istekao 1977. godine). Kasnih 70ih ti su problemi reeni pa je nekoliko proizvoaa hromatografa poelo nuditi kolone ove vrste po umerenoj ceni. Posledica toga bila je da se kapilarne kolone masovno primenjuju tek zadnjih nekoliko godina. Punjene kolone Dananje punjene kolone izraene su od staklenih, metalnih (elik, bakar, aluminijum) ili teflonskih cevi, uobiajene duine 2 do 3 metra i unutranjeg prenika 2 do 4 milimetra. U njih se stavlja jednako, sitnozrnasto punjenje ili vrsti nosa na koji je naneen tanki sloj (0,05-1 m) stacionarne tene faze. Da bi se mogla smestiti u termostatiki prostor hromatografa, hromatografska kolona mora biti savijena u spirale prenika otprilike 15 centimetara. vrsti nosa u punjenoj koloni nosi tenu stacionarnu fazu. Stacionarna faza nanosi se tako da to je mogue vea povrina te faze bude u dodiru sa mobilnom fazom. Idealni nosa sastoji se od malih jednakih loptastih zrna odgovarajue mehanike vrstoe i specifine povrine od najmanje 1m2/gr. Osim toga materijal od kojeg se proizvodi vrsti nosa mora biti toplotno stabilan i jednako natopljen tenom fazom. Do sada nije pronaena ni jedna stvar koja bi udovoljavala svim navedenim uslovima. Za izradu vrstih nosaa danas se najee upotrebljavaju posebno obraene prirodne dijatomejske zemlje koju ine ostaci hiljadu vrsta jednoelijskih biljaka koje su nastanjivale nekadanja jezera i mora. Te su biljke primale hranljive materije i odlagale otpad molekularnom difuzijom kroz svoje pore. Budui da se gasna hromatografija

31

temelji na istoj vrsti molekularne difuzije, dijatomejska zemlja je pogodna za izradu nosaa stacionarne faze u punjenim kolonama. Dimenzije zrna nosaa. Kao to prikazuje slika 3.1 , dejstvo gasno- hromatografske kolone naglo se poveala sa smanjenjem prenika zrna punjenja. Razlika u pritisku, koja odrava zadati protok, poveava se sa kvadratom prenika zrna. Zbog te razlike postoji donja razlika prenika zrna. Razlika u pritisku vea od 3,5 105 Pa nije pogodna za rad u gasno-hromatografskoj koloni. Optimalni prenici zrna punjenja su prema tome 250 do 170 m ili 170 do 149 m. Kapilarne kolone Postoje dve osnovne vrste kapilarnih kolona. Jedna vrsta su cevi sa unutranjim zidom prevuenim tankim slojem stacionarne faze, ( 30 m) koju nazivamo kapilarnim kolonama. Drugu vrstu ine mikropunjene kolone koje su takoe kapilarnih dimenzija, a unutranji zidovi koji su prevueni punjenjem poput dijatomejske zemlje na koje je naneena stacionarna faza. Debljina naneenog sloja iznosi 30 m. Ove poslednje kolone sadre nekoliko puta veu koliinu stacionarne faze od prethodnih kolona, pa zato imaju vei kapacitet za uzorak. Uopteno, dejstvo mikropunjenih kolona manja je od dejstva kapilarnih, ali je mnogo vea od dejstva punjenih kolona. Prve kapilarne kolone napravljene su od elika, aluminijuma, bakra ili plastike, a posle se poelo upotrebljavati staklo. Zid staklene cevi mora se prvo nagristi hlorovodonikom, jakim rastvorom solne kiseline ili kalijumovim hidrogenfluoridom, kako bi njegova povrina postala gruba. Na tako obraenu povrinu stakla stacionarna faza se vee vre. Najnovije takve kolone, koje su se na tritu pojavile 1979. godine, izraene su od izvuenog kvarca. Kvarcni kapilari se izvlae iz posebno proienog kvarca koji sadri minimalne koliine metalnih oksida. Zidovi tih kapilara mnogo su ui od zidova staklenih kapilara. Na spoljanjem zidu se tokom izvlaenja dodaje zatitni sloj poliamida. Tako dobijene kolone su fleksibilne. Mogu se saviti u zidove prenika nekoliko centimetara. Kapilrne kolone od izvuenog kvarca dostupne su na tritu. Njihove vane prednosti su fizika vrstoa, manja reaktivnost prema sastojcima uzoraka i fleksibilnost. U najvie primena zamenile su starije vrste kapilarnih kolona. Najee upotrebljavane kapilarne kolone od izvuenog kvarca imaju unutranji prenik od 320 do 250 m. Prodaju se i kolone vee moi razlaganja, prenika od 200 do 150 m. Pri primeni tako uskih kolona ima vie nepogodnosti, a zahtevnije su u pogledu sistema za unoenje uzorka i detekcije. Uz njih mora postojati razdvaja toka gasa nosaa, kako bi se smanjila koliina uneenog uzorka u kolonu. Detektor, kojie se upotrebljava uz te kolone mora biti osetljiv i mora pokazati brz odziv. Od nedavno su se na tritu pojavili kapilari prenika 530 m, nazvani megaborama kolona. U njih se mogu unositi sline koliine uzorka kao i u punjenoj koloni. Megabore kapilarne kolone ne pokazuju u primeni tako dobra svojstva kao kapilarne kolone manjeg prenika, ali su mnogo bolje od punjenih kolona. U tabeli 3.1 uporeene su osobine kapilarnih kolona od izvuenog kvarca sa ostalim vrstama kapilarnih kolona kao i sa punjenim kolonama. Vrsta hromatografske kolone

32

Duina, m Unutranji prenik, mm Dejstvo, 2000-4000 1000-4000 600-1200 500-1000 tavan/m Koliina 10-75 10-1000 10-1000 10-106 uzorka, ng Relativni Nizak Nizak Nizak Visok pritisak Relativna Brzo Brzo Brzo Sporo brzina Hemijska Najvea Najmanje inertnost Fleksibilnost da ne ne ne Tabela 3.1 Svojstva i osobine tipine gasno-hromatografske kolone *kapilarne kolone od izvuenog kvarca (Fused-silica open tubular column) **kapilarne kolone sa prevuenim zidom (Wall- coated open tubular column) ***mikropunjene kolone, unutranji zid prevuen punjenjem (Support- coated open tubular column) Adsorbcija koju uzrokuje punjenje kolone na zidu kapilara. Tokom gasnohromatografske analize polarni ili oni sastojci, koji se mogu polarizovati, kao to su alkoholi ili aromatini ugljovodinici adsorbiraju se na povrini vrstog nosaa. Takvom adsorbciojm nastaju nepravilni pikovi, koji su proireni i esto pokazuju zavlaenje. Ustanovljeno je da adsorbciju uzrokuju silikatna jedinjenja koja nastaju na povrini dijatomejskog silikata reakcijom sa vlagom. Potpuno hidrolizirana povrina silikata ima strukturuOH O Si Si OH O Si OH O Si OH

FSTO* 10-100 0,1-0,3

WCOT** 10-100 0,25-0,75

SCOT*** 10-100 0,5

Punjene 1-6 2-4

Jedinjenja SiOH na povrini nosaa snano privlae polarne organske molekule i tee da ih zadre adsorbcijom. vrsti nosa moe se deaktivirati silikacijom sa dimetilhlorsilanom (DMCS). Reakcija je:

33

CH3 Si OH + Cl Si CH3 Cl Si O

CH3 Si CH3 Cl + HCl

Prilikom ispiranja metanolom, drugi se hlorid zameni metoksi grupom.CH3 Si O C CH3 Cl + CH3OH Si O CH3 Si CH3 OCH3 + HCl

Zaostale mineralne neistoe u dijatomejskoj zemlji mogu izazvati adsorbciju sastojaka uzorka na silikatnom nosau. Te se neistoe mogu ukloniti sa nosaa ispiranjem kiselinom pre silikacije. Drugo sredstvo za silikaciju je heksametildisilazan, formule (CH3)3SiNHSi(CH3)3. Punjenja obraena sa tim reagensom imaju oznaku HMDS. 3.2.4. Termostatiranje kolone Za precizan rad potrebno je temperaturu kolone odravati u granicama nekoliko desetina stepeni. Kolona je najee smetena u termostatikom prostoru. Optimalna temperatura kolone zavisi od vrenja uzorka i stepena traenog odvajanja. Pri temperaturi jednakoj prosenom vrenju uzorka ili neto vioj postie se prihvatljivo vreme eluacije (od 2 do 30 minuta). Uzorke irokog raspona vrenja poeljno je analizirati uz programiran porast temperature, tako da se temperatura kolone poveava neprekidno ili promenljivo tokom odvajanja. Slika 3.3c prikazuje dejstvo programiranog termostatiranja u pogledu poboljanja odvajanja. Uopteno optimalno odvajanje povezano je sa minimalnom temperaturom. Meutim pri nioj temperaturi trajanje eluacije je due a time i vreme potrebno za analizu. Slike 3.3a i 3.3b pokazuju taj princip.

34

Slika 3.3 Uticaj temperature na gasne hromatograme (a)izotermno na 45 C;(b)izotermno na 145 C; programirano na 30-180 C 3.2.5. Detektori Ureaj za detekciju u gasno-tenoj hromatografiji mora pokazati brz odziv na male promene koncentracije sastojaka tokom njihove eluacije iz kolone. Koncentracije analiziranih sastojaka u gasu nosau, u bilo kom trenutku, nisu vee od nekoliko promila ili su ak i manje za jedna red ili nekoliko redova veliine. Osim toga, vreme tokom kojeg pik proe kroz detektor, najee iznosi 1 sekund ( ili manje), pa detektor u tom vremenu mora pokazati potpun odziv. Ostala poeljna svojstva detektora su linearni odziv, stabilnost i jednak odziv za mnoge hemijske pojave ili predvidljiv i selektivan odziv za jednu vrstu ili vie spojeva. Nepotrebo je naglasiti da ni jedan detektor ne zadovoljava sve navede zahteve i mala je verovatnoa da e takv detektor ikada biti napravljen. Ovde emo opisati tri detektora koja se najee upotrebljavaju u gasnoj hromatografiji. Detektor toplotne provodljivosti Detektor toplotne provodljivosti ili katarometar je detektor koji se prvi upotrebljavao u gasnoj hromatografiji. Taj ureaj, koji se jo esto koristi, temelji se na promenama toplotne provodljivosti struje gasa nosaa koja nastaje zbog prisutnosti analita. Osetljivi

35

deo detektora na principu toplotne provodljivosti sastoji se od elektrino ugrejanog elementa temperature kojeg uz konstantnu jainu elektrine struje zavisi od toplotne provodljivosti gasa koji ga okruuje. Grejani element moe biti platinumska, zlatna ili volframova ica ili poluprovodniki termistor. Temperatura detektora meri se otporom ice ili termistora. Ta temperatura delimino zavisi od brzine kojom molekuli gasa provode toplotnu energiju od elementa detektora prema zidovima metalnog bloka u kojem je element smeten. Slika 3.4 ematski prikazuje tipian komercijalni detektor toplotne provodljivosti. U hromatografskoj primeni najee postoji sistem dvostrukog detektora u kojem je jedan deo smeten u struji gasa ispred dela za unoenje uzorka, a drugi neposredno iza kolone. Drugi nain je da se struja gasa deli. U oba se primera toplotna provodljivost gasa nosaa ponitava, a uticaj promene brzine protoka, pritiska i jaine elektrine struje je sveden na minimum. Otpori dvostukog detektora uporeuju se ugradnjom u dve grane jednostavnog Wheatstonova mosta.

Slika 3.4 Uobiajeni detektor toplotne provodljivosti Toplotna provodljivost vodonika i helijuma priblino su 6 do 10 puta vee od toplotne provodljivosti ostalih organskih spojeva. Dakle, prisutnost malih koliina organskih materija izazvae relativno veliko smanjenje toplotne provodljivosti gasa u kolone, zbog ega e se poveati temeperatura detektora, provodljivost ostalih gasova nosaa slinije su provodljivostima organskih sastojaka, pa je zbog toga az detektor toplotne provodljivosti neophodno upotrebiti vodonik ili helijum. Prednosti detektora toplotne provodljivosti su njegova jednostavnost, veliko linearno dinamiko podruje ( 105), odaziv na organske i neorganske spojeve i nerazarajua priroda koja omoguava skupljanje sastojaka nakon detekcije. Ogranienje detektora toplotne provodljivosti je u relativno niskoj osetljivosti ( 10-8 g sastojka/mL gasa nosaa). Osetljivost drugih detektora je 104 do 107 puta vea. Treba naglasiti da mala osetljivost detektora toplotne provodljivosti spreava njegovu primenu uz kapilarne kolone, jer se u njih mogu uneti vrlo male koliine uzorka. Plamenojonizirajui detektor Najvie organskih spojeva pri sagorevanju na temperaturi plamena vodonik/vazduh stvara jonske meuspojeve i elektrone, ime nastaje mehanizam kojim se elektricitet prenosi 36

plazmom. Plamenikom poput onog na slici 3.5, sabirna elektroda, privue i prihvati naelektrisane estice, a struja nastalih jona se pojaava i belei. Elektrini su otpori u plazmi plamena veliki (moda 1012 ), pa su zato nastale struje vrlo male.

Slika 3.5 Tipini plamenoizolacijski detektor Jonizacija uglejnikovih jedinjenja u plamenu jo nije dobro objanjen proces, iako je primeeno da je broj nastalih jona srazmeran broju redukovanih ugljenikovih atoma u plazmi. Funkcionalna jedinjenja, kao to su karbonska, alkoholna, halogena i aminska, stvaraju malo ili uopte ne stvaraju jone. Detektor je nadalje ne osetljiv na gasove koji ne gore poput H2O, CO2, SO2 i NOx. Ta svojstva ine plamenojonizirajui detektor primenljivim za veinu organskih jedinjenja, ukljuujui i one neoiene vodom te azotovim i sumpornim oksidima. iroku primenu plamenojonizirajui detektor mora najpre zahvaliti svojoj velikoj osetljivosti ( 10-13gr/mL), velikom linearnog odziva ( 107), malom umu, jednostavnom upotrebom i rukovanjem. Taj se detektor upotrebljava uz kapilarne kolone. Nepogodnost plamenojonizirajueg detektora svakako je u razaranju uzorka. Detektor apsorbcije elektrona U detektoru apsorbcije elektrona gas prolazi preko beta emitera (radioaktivni spoj koji emituje elektrone) kao to nikl- 63 ili tricijum (adsorbiran na platinastoj ili titanijumskoj foliji). Emitovani elektroni jonizuju gas nosa (esto azot), ime nastaje snop elektrona. Kad u gasu nosau nisu prisutni organska jedinjenja, izmeu elektroda se pojavljuje stalna struja koja rezultuje iz spomenute jonizacije. U prisutnosti organskih molekula, koje nastoje da uhvate elektrone, struja se smanjuje. Odziv je nelinearan, ako potensijal du detektora nije pulsirajui. Odziv detektora apsorbcije elektrona selektivan je i vrlo osetljiv na elektronegativna funkcionalna jedinjenja kao to su halogeni, peroksidi, kinoni i nitro jedinjenja. Neosetljiv je na amine, alkohole i ugljovodonike. Detektor apsorbcije elektrona naroito je pogodan za detekciju i kvantitativno odreivanje hloriranih pesticida. Detektor apsorbcije elektrona je vrlo osetljiv, a njegova prednost je u tome to ne razara uzorak (nasuprot plamenojonizujuem detektoru).

37

Selektivni detektori Gasna hromatografija esto se povezuje sa selektivnim tehnikama spektroskopije i elektrohemije. Tako nastaju povezane ili kombinovane tehnike koje hemiaru pruaju velike mogunosti za odreivanje sastojaka sloenih smea. Tokom primene prvih kombinovanih tehnika, eluati odvojenih sastojaka hvatali su se kao posebne frakcije u ohlaene posudice, a nedestruktivni, neselektivni detektori su beleili njihovu prisutnost. Sastav svake frakcije bi se zatim ispitao nuklearnom magnetskom rezonancom, IR, ili masenom spektroskopijom odnosno elektrohemijskim merenjima. Ozbiljno ogranienje takvom pristupu je mala (najee mikrokolarna) koliina sastojka koju je sadravala svaka frakcija. Ipak opti postupak pokazao se vrlo korisnim za kvalitativnu analizu viekomponentskih smea. Danas se eto upotrebljavaju spektroskopski ili elektroanalitiki detektori koji neprekidno snimaju izlazni tok iz kolone. Takav postupak zahteva kompjuterizovane ureaje sa velikom memorijom za uvanje spektralnih i elektrohemijskih podataka za prikaz spektara i hromatograma.

3.3. Tene faze u gasno-tenoj hromatografijiPoeljna svojstva imobiliziranih tenih faza u gasno-tenoj hromatografiji su: (1) mala isparljivost (vrenje tenosti moralo bi biti barem 100 C iznad maksimalne radne temperature kolone); (2) toplotna stabilnost; (3) hemijska inertnost; (4) takve osobine rastvora da su k i vrednosti sastojka koji se odvaja u odgovarajuem podruju. Tokom razvitka gasno-tene hromatografije ispitano je mnogo stacionarnih faza. Danas, za najvei broj primena dosta je 12 ili manje razliitih faza. Uspeh odvajanja esto zavisi od pravilnog izbora stacionarne faze. Postoje opta uputstva koja pomau pri izboru optimalne faze, ali ipak je najpouzdanije izabrati stacionarnu fazu nakon provere u laboratoriji. Vreme zadravanja sastojka na koloni zavisi od odnosa raspodele (jednaina 2.1), koji je povezan sa hemijskom prirodom stacionarne faze. Jasno je da gasno-tena hromatografija moe biti uspena ako izabrana stacionarna faza daje razliite odnose raspodele za razliite analizirane sastojke. Osim toga, odnosi raspodele ne smeju biti ni preveliki ni premali. Preveliki uzrokuju neprihvatljivo dugo vreme analiza, a vreme zadravanja uz male odnose raspodele tako su kratka da odvajanje sastojaka nije potpuno. Za postizanje prihvatljivog vremena zadravanja u koloni potrebno je da analizirani sastojci pokazuju odreeni stepen slinosti sa stacionarnom fazom. Ovde vredi princip slino rastvara slino, pri emu se pojam slino odnosi na polarnost sastojka i imobilizirane tenosti. Pod pojmom polarnosti podrazumeva se delovanje elektrinog polja u neposrednoj blizini molekula, a meri se njenim dipolnim momentom. Polarne stacionarne faze sadre funkcionalna jedinjenja CN, -CO i OH. U ugljovodonine stacionarne faze i dialkil siloksani su nepolarni, a poliestarske faze su jako polarne. Polarni spojevi su etri, ketoni i aldehidi. Zasieni ugljovodonici su nepolarni. Uopteno uzevi, polarnost stacionarne faze mora se slagati sa polarnou sastojka uzorka. Ako je slaganje dobro, redosled eluacije zavisi od vrenja sastojka.

38

Neke stacionarne faze koje se esto upotrebljavaju Tabela 3.2 navodi najee upotrebljavane stacionarne faze za punjene i kapilarne hromatografske kolone prema rastuoj polarnosti. Tih est navedenih tenosti omoguuje zadovoljavajua deljenja za vie od 90% uzoraka zanimljivih za nauno ispitivanje. Pet navedenih tenosti u tablici 3.2 su polidimetil siloksani opte strukture

R R Si R O

R Si R O

R Si R R

Stacionarna faza polidimetilsiloksan

Nepolarna faza opte namene: ugljovodonici; 350 polinuklearni aromati; droge; steroidi; PCB-i 5% fenilpolidimetilsiloksan OV-3, Metilni estri masnih SE-52 kiselina; alkaloidi; 350 droge; halogena jedinjenja 50% fenilpolidimetilsiloksan OV-17 Droge; steroidi; 250 pesticidi; glikoli 50% OV-210 Hlorirani aromati; trifluoropropilpolidimetilsiloksan 200 nitroaromati; alkilsupstituirani benzeni polietilenglikol Carbowax Slobodne kiseline; 20M alkoholi; etri; 250 esencijalna ulja; glikoli 50% OV-275 Nezasiene masne cijanopropilpolidimetilsiloksan kiseline; kisele 240 smole; slobodne kiseline; alkoholi Tabela 3.2 Nekoliko uobiajenih stacionarnih faza za gasno-tenu hromatografiju

Uobiajeno Maksimalna trgovako temperatura, ime C OV-1, SE-30

Uobiajene primene

39

U polidimetilsiloksanu sva R jedinjenja su CH3, pa su tenosti relativno nepolarne. Kod drugih polisiloksana iz tabele deo metilnih jedinjenja zamenjen je funkcionalnim jedinjenjima fenil (-C6H5), cijanopropil (-C3H6CN) i trifluoropropil (-C3H6CF3). Oznaka procenta ispred navedenog jedinjenja pokazuje stepen zamene metilnog jedinjenja naznaenim jedinjenjem na osnovnom skeletu polisiloksana. Dakle, u 5%-tnom fenilpolidimetilsiloksanu, fenilni prstenovi su vezani na 5% silicijumovih atoma u polimeru. Polarnost tenosti se poveava takvim zamenama do razliitog stepena. U petom redu tablice 27.2 naveden je polietilenglikol sledee strukture: HO--CH2--CH2--(O--CH2--CH2)nOH Polietilenglikol esto se upotrebljava za odvajanje polarnih jedinjenja. Slika 3.6 prikazuje primenu faza iz tabele 3.2 u kapilarnim kolonama.

Slika 3.6 Tipini hromatogrami dobijeni primenom kapilarne kolone sa: (a)polidimetilsiloksanom,(b)5%-tnim fenil polidimeilsiloksanom,(c)50%-tnim trifluorpropildimetilsiloksanom,(e)polietilenglikolom, i (f)50%-tnim cijanopropilpolidimetilsiloksanom Vezane i umreene stacionarne faze Komercijalne kolone reklamiraju se injenicom postojanja vezanih ili umreenih stacionarnih faza. Svrha vezivanja i umreavanja je produavanje veka trajanja stacionarnih faza koje se mogu ispirati sa rastvorom nakon oneiavanja kolone. Poznato je da neobraene kolone tokom upotrebe gube stacionarnu fazu zbog curenja. Posledica curenja stacionarne faze jeste brza promena osobina i kratak vek trajanja

40

kolone. To se curenje naroito pojaava tokom ispiranja kolone rastvorom radi uklanjanja oneienja. Vezivanje je postupak kojim se monomolekularni sloj stacionarne faze privruje na silikatnu povrinu u koloni hemijskom reakcijom. Hemizam ove reakcije esto je tajna proizvoaa. Umreavanje se sprovodi in-situ nakon prevlaenja kolone jednim od polimera iz tabele 3.2. Jedan od naina prevlaenja sastoji se u ugradnji peroksida u imobiliziranu tenost. Pri grejanju sloja, reakcija izmeu metilnih jedinjenja i polimernog lanca zapoinje mehanizmom slobodnih radikala. Molekuli polimera umreuju se vezama ugljenikugljenik. Nastali se slojevi ne mogu lako ekstrahovati i toplinski su znatno stabilniji od neobraenih slojeva. Umreavanje takoe moe poeti izlaganjem prevuenih kolona gama zraenju. Debljina sloja Debljina sloja stacionarne faze u kolonama koje s emogu kupiti na tritu iznosi od 0.1 do 5 m. Debljina sloja ponajpre utie na karakteristike zadravanja i na kapacitet kolone. Debeli slojevi upotrebljavaju se pri analizi vrlo halapljivih uzoraka jer oni sastojke uzorka due zadravaju. Duim zadravanjem sastojaka u koloni omoguuje se njihovo bolje razdvajanje. Tanki slojevi pogodni su za razdvajanje slabo halapljivih spojeva u razumnom vremenu. U kolonama prenika 0.25-0.32 mm preporuuje se debljina sloja od 0.25 m. U megabore kolonama debljina sloja iznosi 1-1.5 m. Danas se mogu kupiti i kolone sa debljinom sloja 8 m.

3.4. Primena gasno-tene hromatografijeDa bi se procenila vanost plinsko-tene hromatografije, treba razlikovati dve uloge te metode. Jedna uloga gasne hromatografije je razdvajanje, i u toj ulozi je ona neizbean deo celokupne analize sloenih organskih organometalnih i biohemijskih smea. Njena druga, bitno razliita uloga, je sama analiza. Vremena zadravanja pritom slue za kvalitativnu identifikaciju, a visine ili povrine pika daju kvantitativne podatke. Gasnotena hromatografija ima mnogo vea ogranienja u pogledu kvalitativne analize od veine spektroskopskih metoda. Da bi se uklonila ta nepogodnost ulau se veliki napori za kombinaciju posebnih sposobnosti razdvajanja koje poseduje tehnika gasne hromatografije sa posebnim sposobnostima odreivanja masene, IR ili NMR spektroskopije. 3.4.1. Kvalitativna analiza Gasna hromatografija se esto upotrebljava za proveru stepena istoe organskih jedinjenja. Oneienja se na hromatogramu pojavljuju kao dodatni pikovi. Ta je tehnika takoe pogodna za proveru postupka proiavanja. Teorijski bi vremena zadravanja trebala biti korisna pri odreivanju sastojaka smea. U stvarnosti, primenu tih podataka ograniavaju mnogi parametri koje treba nadzirati da bi se dobili reproduktivni rezultati. Uprkos tome, gasna hromatografija pouzdano potvruje prisutnost ili odsutnost sastojaka u smei. Hromatogram smee standarda i ispitivanog

41

uzorka ne sme sadrati razliite pikove. Na hromatogramu se takoe mora uoiti poveanje postojeeg pika. Postojanje nekog sastojka potpuno je sigurno kad se njegova prisutnost potvrdi u razliitim kolonama i pri razliitim temperaturama. Videli smo da je koeficijent selektivnosti za sastojke A i B izraeno odnosom

=

K B (tR ) B tM kB = = K A (tR ) A tM k A

Ako je izabrani standardni spoj sastojak B, onda je indeks za odreivanje sastojka A. On zavisi uglavnom od temperature kolone ali ne i od drugih veliina. Iz toga sledi da se koeficijent selektivnosti istih jedninjenja mogu prikazati tabelarno u odnosu prema zahednikom standardu. Te se tablice mogu primeniti za karakterizaciju analiziranih sastojaka. Do sada u literaturi nije objavljeno mnogo takvih podataka. 3.4.2. Kvantitativna analiza Kvantitativna i semikvantitativna analiza temenlje se na odzivu detektora smetenog na izlazu iz hromatografske kolone. Pri briljivo nadziranim uslovima gasnohromaotografske analize moe se postii tanost od 1-3%. Vaan deo pri odreivanju mogue tanosti ima priroda uzorka.

3.5. Uobiajne primene gasne hromatografijeSlika 3.7 prikazuje uobiajene primene gasne hromatografije za reavanje analitikog problema. Sve primene se temenlje na gasno-tenoj ravnotei osim one na slici 3.7a gde se kolone upotrebljavaju u nizu pri emu je prva gasno-tena, a druga adsorpcijska. Gasno-tena kolona zadrava samo ugljen-dioksid, a preostali gasovi prolaze kolonom bez zadravanja. Dok ugljen-dioksid izlazi iz prve kolone, promeni se smer protoka kroz drugu kolonu, ime se spreava stalna adsorpcija tog gasa na vrsto punjenje. Nakon vraanja odziva ugljen-dioksida na nulu, protok gasa se vrati na drugu kolonu i time se omogui razdvajanje preostalih sastojaka uzorka. Slika 3.7f naroito je vredna jer pokazuje mo i brzinu razdvajanja kapilarnih kolona. Naime, razdvajanje metana i devet izomera heptana postie se tokom najvie jedne minute. Podaci o uslovima rada uz koje su dobijeni hromatogrami na slici 3.7 nalazi se u tabeli 3.3.

42

Slika 3.7 Nekoliko primera gasnohromatografskih razdvajanja

43

Hromatogra m

Kolona*

Punjenje Chromosorb 102

Detektor

10 a

b c d e f

1 S 8 1 5 S 8 1 6 G 4 1 6 S 8 1 6 G 4 6 3.4mm G 50 0.005 FSOT

Temperatura, 0 C

Gas nosa

Protok, mL/min

TCD Molekularno sito 5A1,5% OV-17 na Chromosorb G Chromosorb W 1.5% OV-17 na HP Chromosorb G 5% OV-510, 2.5% OV-17 na Supelcoport G Skvalene ECD TCD FID ECD FID

65-2000

He

30

220 190 180-230 260 20 A H2 He 30

Tabela 3.3 * S = punjena elina kolona (packed stainless steel); G = punjena staklena kolona (packet glass); FSOT = kapilarna kolona od taljenog kvarca (fused silica open tubular)

.04 TENA HROMATOGRAFIJA VISOKOG DEJSTVANajvei deo ovog poglavlja obrauje etiri vrste hromatografije na stubu sa tenom mobilnom fazom. To su: razdelna hromatografija ili hromatografija u sastavu tenosttenost; adsorpcijska hromatografija ili hromatografija u sastavu tenost-vrsta materija; hromatografija jonske izmene i hromatografija na gelu odnosno hromatografija iskljuenjem. Na kraju poglavnja ukratko se spominju laminarna hromatografija i hromatografija kod koje je mobilna faza tenost pri superkritnim uslovima. Prve hromatografske analize, ukljuujui i Tswettov izvorni rad, izvodile su se u staklenim kolonama prenika 1-5 cmi duine 50-500cm. Da bi brzine protoka kroz kolone bile prihvatljive prenici zrna stacionarne faze iznosili su od 150 do 200 m. Brzine protoka iznosile su tek nekoliko desetina mililitra u minuti. Vremena razdvajanja su, dakle, bila vrlo duga, ak nekoliko sati. Nastojanja za ubrzanjem protoka klasinom primenom vakuuma ili pumpanjem, nisu bila delotvorna jer se poveanjem brzine protoka poveava visina tavana ispod minimuma na tipinoj krivi zavisnosti visine tavana od protoka (slika 2.5a) a time se dejstvo hromatografske kolone smanjuje. Na poetku tene hromatografije primeeno je da se najvee dejstvo hromatografske kolone postie smanjenjem dimenzija zrna punjenja, kako to pokazuje slika 4.1. treba uoiti da ni u jednom od tih dijagrama nije postignut minimum sa slike 4.1a, jer se on u ovoj vrsti hromatografije pojavljuje uz nedoputeno male brzine protoka.

44

Slika 4.1 Uticaj dimenzija zrna punjenja i brzine protoka na visinu tavana u tenoj hromatografiji. Dimenzije kolone 30cm 2.4mm. Analizirani sastojak: N, Ndietilaminobenzen. Mobilna faza: smea heksana, metil hlorida, izopropil alkohola Tehnologija proizvodnje i primena punjenja prenika 10 m razvila se tek kasnih 60-ih godina. Za primenu te tehnologije bili su potrebni mnogo sloeniji ureaji od jednostavnih staklenih kolona, koje su se primenjivale u klasinoj tenoj hromatografiji. Nazivom tenahromatografija visoke delotvornosti (engl. High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) eli se naglasiti razliak izmeu tih novijih postupaka i klasinih metoda, koje se jo primenjuju u preparativne svrhe.

4.1. Ureaji za tenu hromatografiju visoke delotvornostiZa postizanje dovoljnih brzina protoka u kolonama punjenim savremenim punjenjem za tenu hromatografiju sa prenikom zrna od 10 m ili manje, neophodni su pritisci od nekoliko miliona Pa. Tako visoki pritisci zahtevaju mnogo sloeniju i skuplju opremu od one koja se susree kod drugih vrsta hromatografije. Slika 4.2 prikazuje delove tipinog tenog hromatografa velike efikasnosti.

45

Slika 4.2 ematski prikaz ureaja za tenu hromatografiju velike efikasnosti 4.1.1. Rezervoar mobilne faze i sistem za obradu rastvora Savremeni ureaji za tenu hromatografiju velike efikasnosti, kako pokazuje slika 4.2, sastoji se od jednog staklenog ili elinog rezervoara, ili vie, od 500 mL ili vie, u kojima se nalazi rastvor. esto se u sklopu sistema nalazi oprema za uklanjanje gasova i vrstih estica, iz tenosti. Gasovi, zbog stvaranja mehura, mogu prouzrokovati irenje zona eluiranog sastojka, a mehuri i estice mogu ometati rad detektora. Odstranjivai gasa mogu se sastojati od sistema vakuum pumpi, destilacijskog ureaja, grejaa i mealice ili, kako pokazuje slika 4.2, sistema za degazaciju u kojem se rastvoreni gasovi odstranjuju iz rastvora noeni mehuriima inertnog plina nerastvorljivog u mobilnoj fazi. Najjednostavniji nain razdvajanja tenom hromatografijom je izokratika eluacija, pri kojoj analit kroz kolonu nosi jedan rastvara. Pri izokratikoj eluaciji u HPLC ne menja se sastav mobilne faze tokom eluacije. Meutim, esto se bolji hromatogram dobije gradijentnom eluacijom uz upotrebu dva (nekad i vie) sistema rastvaraa polarnosti koje se meusobno znatno razlikuju. Pri gradijentnoj eluaciji u HPLC sastav mobilne faze menja se tokom eluacije kontinuirano ili promenljivo. Odnos zapremine dva rastvora menja se na unapred utvren nain, i to ponekad neprekidno, a ponekad u nizu koraka. Gradijentna eluacija esto poboljava delotvornost razdvajanja poput programiranog poveanja temperature u gasnoj hromatografiji. Savremeni teni hromatografi esto su opremljeni ventilima za unoenje tenosti iz dva ili vie rezervoara, brzinama koje se mogu neprestano menjati (slika 4.2). 4.1.2. Pumpe

46

Zahtevi kojima moraju udovoljavati pumpe u tenom hromatografu vrlo su strogi: (1) pritisci do 40 miliona Pa, (2) izlaz bez pulsiranaj pritiska, (3) brzina protoka od 0,1 do 10 mL/min, (4) produktivnost protoka od 99,5% ili bolja i (5) otpornost na koroziju izazvanu razliitim rastvorima. Za primenu u tenoj hromatografiji pogodne su dve mehanikih pumpi: pumpa sa pogonom na vijak i reciprona pumpa (slika 4.3). Protok tenosti koji stvara pumpa sa pogonom na vijak ravnomeran je i moe se jednostavno nadzirati. Nedostatak tih pumpi je mali kapacitet ( 250mL) i nepogodnost za promenu rastvora. Reciprone pumpe upotrebljavaju se ee. Sastoje se od male komore u obliku cilindra koji se puni i prazni pomeranjem klipa napred-nazad. Pomeanje klipa stvara veliki protok koji treba smanjiti. Prednosti tih pumpi su mala unutranja zapremina, visok spoljanji pritisak (70 miliona Pa), mogunost primene za gradijentnu eluaciju, stalni protoci koji ne zavise ni od povratnog pritiska u koloni, ni od viskoznosti rastvaraa.

Slika 4.3 ematski prikaz reciprone pumpe za HPLC U neke ureaje ugraene su pneumatske pumpe, koje se u najjednostavnijem obliku sastoje od rezervoara za rastvor smetenog u posudu na koju se moe vriti pritisak komprimovanim vazduhom. Pumpe te vrste su jednostavne, jeftine i rade bez promene. Njihov nedostatak je u ogranienom kapacitetu i pritisku na izlazu i u brzinama crpljenja koje zavise od viskoznosti rastvora. Osim toga one se ne mogu upotrebljavati uz gradijentnu eluaciju. Treba naglasiti da visoki pritisci, koje stvaraju pumpe u tenim hromatogramima, ne predstavljaju opasnost od eksplozije jer se na tenost ne moe vriti dodatni pritisak. Ali zbog visokog pritiska, tenosti mogu procuriti to ipak moe prouzrokovati poar. 4.1.3. Sistem za unoenje uzorka Unoenje uzorka krozelastinu membranu, tzv. septum, esto se primenjuje u tenoj hromatografiji zbog jednostavnosti. Taj nain nije posebno reproduktivan pa je ogranien na pritiske nie od 10 miliona Pa. Pri unoenju uzorka uz zaustavljanje protoka pomeri se matica na poetku kolone, a uzorak se inekcijskim ubrizgivaem unese na poetak punjenja. U tenoj hromatografiji uzorak se u kolonu najee unosi putem gasnog ventila, poput onog na slici 4.4. Gasni ventil je esto sastavni deo opreme savrmeenog tenog hromatografa. Uz njega se nalazi vie promenljivih petlji kojiam se u kolonu mogu unositi koliine uzorka od 5 do 500 L. Preciznost unoenja uzorka preko