12
1 H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin q Yasuhiko Yamamoto * , Kenji Takemoto, Hitomi Matsuo Department of Chemistry, University of Tsukuba, Tsukuba 305-8571, Japan Received 6 February 2001; accepted 27 February 2001 Abstract NMR signals arising from His EF5 and His GH1 N e H protons of sperm whale myoglobin and apomyoglobin have been assigned, and the protein folding has been studied through the analysis of these signals. His EF5 and His GH1 N e H protons participate in the internal hydrogen bonds at the B±GH and EF±H interfaces, respectively, and their signals are remarkably sensitive to local structural alterations at these sites. The shifts of these signals in alkaline pH condition were only slightly affected by the removal of heme, indicating that the overall protein folding is essentially retained in apoprotein. The line width of His EF5 proton signal, however, increased largely in the spectra of apomyoglobin and this result suggests a conformational lability of the EF±H interface in the absence of heme. Furthermore, the His EF5 proton signal was found to be in¯uenced by not only the orientation of heme relative to the protein, but also by the type of hemin used to reconstitute apomyoglobin. These results clearly demonstrate the presence of a long-range structural correlation between the heme active site and the EF±H interface. q 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved. Keywords: NMR; Myoglobin; Heme orientation; Hydrogen bonds; Protein folding 1. Introduction The active site of an enzyme is usually formed from about 10 to 15% of all the constituent amino acid residues. The function of the remaining residues is assumed to maintain the structure of the active site, to recognize other molecules, and/or to transmit structural information between the active site and remote sites of the molecules as observed in allosteric proteins. Hemoglobin Hb), tetrameric oxygen transport hemoprotein, is one of the best, albeit incompletely, understood allosteric proteins in terms of its structure and function [1]. The molecular basis of cooperative oxygen binding of Hb has been proposed to involve transmission of structural infor- mation between the two types of subunits by altering contacts between speci®c heme and amino acid side- chains. Hb is proposed to be evolved from myoglobin Mb), monomeric oxygen-binding hemoprotein [1]. Hence, although Mb does not exhibit allostery in its function, it may be worthwhile to look for an origin of a long-range structural correlation between the active site and other portions of this molecule, which is essential for allosteric protein. Crystallographic study has provided a powerful tool for elucidating three-dimensional structure of Mb [2±6] and revealed tertiary structural differences among different ligation states of the protein from Journal of Molecular Structure 602±603 2002) 133±144 0022-2860/02/$ - see front matter q 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved. PII: S0022-286001)00715-3 www.elsevier.com/locate/molstruc q Dedicated to Professor Graham A. Webb on the occasion of his 65th birthday. * Corresponding author. Tel./fax: 181-298-53-6521. E-mail address: [email protected] Y. Yamamoto).

1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

�� ��� ��� �� � � ������ �� ��� ��������� �� � � ������ ��������������

���� ��� ���������� ����� ��������� ������ ������

���������� ���� ����� �� ���� �� �������� ������� ��������� �����

����� � ! "������ #$$�% ������� #& "������ #$$�

��������

��� ������� ������� ���� ��� '"( �� ��� )�� ��� ������� �� ����� * ��� �������� �� ����������� � � ����

�������� �� � � ������� ������ �� ���� ����� � ���� � � ������� �� � ��� �������+ ��� '"( �� ��� )�� ��� �������

����������� �� � � �������� ����� ���� �� � � ,-)� �� '"-� ����������� �������� ��� �� � ��� ������� ��� ���������

������� � �� ����� ���������� ����������� �� � ��� �����+ � � � ���� �� � ��� ������� �� �������� �� �������� *��� ��� ���� ��

������� � � � ���� �� �� ���� ��������� � �� � � � ����� ������� ������ �� ���������� ������� �� ����������+ � � ���� *��

�� ��� '"( ������ ������� �*� ��� �������� ������ �� � � ������� �� ����������� �� � �� ������ �������� � ��������������

������� �� � � '"-� ��������� �� � � ������� �� ���+ "��� ������� � � ��� '"( ������ ������ *�� ���� �� �� ��.����� � ���

��� � � ����������� �� ��� ������ � �� � � �������� ��� ���� � � � ��� �� ���� ��� �� ������������ �����������+ � ���

������� ������ ���������� � � �������� �� � ����/����� ���������� ����������� ���*��� � � ��� ���� � ���� �� � � '"-�

���������+ � #$$# '��� ��� 0������ ,+1+ 2�� ��� �� ����� �+

��� �!�3 ���% ��������% ���� �����������% ������ ����% 4������ ������

� ���� ������

� � ���� � ���� �� �� ��5�� �� ������ ����� ����

����� �$ �� �(6 �� ��� � � ����������� ����� ���

�������+ � � �������� �� � � ��������� ������� ��

������ �� �������� � � ��������� �� � � ���� � �����

�� �������5� �� �� ���������� ��7�� �� ��������

���������� ����������� ���*��� � � ���� � ���� ��

������ ����� �� � � ��������� �� ����� � �� ����������

��������+ ���������� 8��9� ���������� �:���

��������� ����������� �� ��� �� � � ����� ������

������������ �������� ���������� �������� �� �����

�� ��� ��������� �� �������� ;�<+ � � ��������� �����

�� ��������� � �:��� ������ �� �� �� ����

������� �� �� �� � ������������ �� ���������� �����/

������ ���*��� � � �*� ���� �� �������� � ��������

�������� ���*��� �����=� ��� �� ����� ��� ���/

� ����+ �� �� ������� �� �� � �� � ���� ��������

8��9� ��������� �:���/������ ���������� ;�<+

������ ��� ��� �� ��� ��� �: ���� �������� �� ���

��������� �� �� �� *��� * ��� �� ���� ��� �� ������ ��

� ����/����� ���������� ����������� ���*��� � � ���� �

���� �� �� �� �������� �� � �� ��������� * �� ��

��������� ��� ���������� �������+

>����������� �� ��� �� ��� �� � ��*�����

���� ��� ���������� � ���/���������� ��������� ��

�� ;#-!< �� �� ���� ������� ���������� ����������

����� �������� �������� ������ �� � � ������� ����

?������ �� ��������� 0�������� !$#-!$@ 8#$$#9 �@@-�AA

$$##/#B!$7$#7C / ��� ����� ������ � #$$# '��� ��� 0������ ,+1+ 2�� ��� �� ����� �+

4DD3 0$$##/#B!$8$�9$$&�(/@

***+���� ���+���7������7��������

� E������ �� 4�������� )�� �� 2+ F��� �� � � �������� �� ��

!(� ���� �+

� >����������� ��� ��+ ���+7��:3 �B�/#GB/(@/!(#�+

"��� # �!!����$ �������H�����+� ��+�������+��+��

8�+ ��������9+

Page 2: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

�����/�I���� ���������������� �� � � ��������� ����/

������ ;@�(<+ ��*� ��� �� ��� ������� �� �� ��=����

�� ���� � ������ ���������� ��� ��� ������� �� � �

��������� ������ ���������� ��������� �� ��5����� ��

������ ������� ������� ������� �� ���� ����������

��� ��������������+ J� � � �� �� ��� ���

��� ��� � ������� ��� �� � ��=��� ����������

���������� ���*��� ��������� �� ��������� �������

��� � ���� �������� ��.��� �� �I��������� ���������

�� � �������� �: ������� � *�� ����� �� ����������

.����������+ � � ������� ����� �� �� �������� ��

��� � ������� 2-�� � �� ��� ����� � � ��� ������/

��� ��������+ F� � � � �*� � �� ��� �������

������� ���� ��� ���/� ��� �� ������� ������

�� �� � �� �������� ����� ���� �� �� � �

���� ����� � �� *���/����� � ������ �� � � �������

;&-G<+ � � ������� ������������ �� ��� ,( ��� ��

��� '"( ��� ������� �������� �� ��� ������ 8,( ��

'"( ��� � � ��� �������� ���� ��������� �� � � ����/

���� �� � � ������ �� � � ������ ��������� �� �� ��

��������� � � =�� ������� �� � � , ���: �� � � ���/

������ '" ���� ���*��� � � ' �� " ������� ������/

�� ��9+ ��� ,( ��� ������ �� ������� � � � ������

������� �:��� �� 2�� ,� �� ���� � �����

��� �� � � �� �� ��� ,( ���� ��������� *�� ���

)�� ��� ������ �� ���� ���� �� ����� ���

;#<+ � �� ���I�� ����� ��� ���*��� �������5��

� � ����������� �� � � )� ������ *�� ������� ��

� � , ���: ;#�!��$���<+ J� � � �� �� ��� ���

'"( ��� ������ �� �����/���� �� ���/

� ��� �����:� �:��� �� 2�� ��B �� � ��

����� ��� �������5�� � � '"-� ��������� ;#<+

� � ���������� �� � � ��� ������ ������� �����

��� �� ������ �������� ������ �� ���� � � �����/

������� �� ���������� ����������� ���*��� � �

���� � ���� �� � ��� ���������� * �� ��� �� �����

�+� �� �*� ���� � � ��� ;G<+

D� � �� ���� *� �� �������� � � ������� �� � �

���/������� �������� �� �� �� � � ��������� �� � �

,-)� �� '"-� ����������+ ��� ��� �� ��

�� ���� � �� � ��� ��� �*� �������� ������ �������

����� �� �������� �� �I���������� * �� ����� �� � �

����������� �� � � ��� � � �B$� �������� ����� � �

(��(/��� �:�� ;�#��@<+ � � ������� ���� ���������

� � ���� ��� ����������� �� ���� �� � � ������

������ 82 �� "��+ �9 �� �� ����� � � ����� ����+

� � ������� *�� � � �� ���� ��� ����������� 8,

�� "��+ �9 �� ����� � � ����� ����+ 2�� ��� � �

������������� �� � � ����� ���� ������ � �� � �� ��

� � ����� ���� �� ����� �� ���� � ��� �� ��� ��

�������� ����� � � �������������� ��� ��I�� ;�#��@<+

0���� � ��� �� �� �� ����� ��� ���*��� ��� �� � �

������� ����� �� ��� ��� ��� �� �:������ ������

�� ������� � � ���������� ;�A<+ � � �������������� ��

���������� *�� ��� �������� ������� ����3� ��:����

�� � � �*� ����� ;�#��@< �� � � ����� ���� ��

��� ���� �� � � ����� ���� *�� ������ ���� ��

���� � � �I��������� ����� ���� �� ���� � ��

;�@��(��!<+ � �� � �������� �� ���*� �� � � ���

������ �� � � �������� ������ ���*��� � � �*�

����� �� ����� � � ��� ������������� ��������+

E����������� ���/������� �������� �� �� � � �����/

���� �� � � ����������� �� ��� ������ � �� � � �������

*��� ��.����� � � ��������� �� � ��� ����������

� ���� � ����/����� ���������� ����������� *�� ��

� � ��������+

F� ������ ����� � � ������� �� �� ��� ��� ��

� � �������������� ����� ���� �� � � ,-)� ��

'"-� ���������� �� ����� * ��� �� ���������� �*�

�������� ��� ������������� * �� ���������� � ��

� � ��������� �� � � '"-� ��������� �� ������� � � �

���/������� ��������+ � � ������� ��� �� ����

� �� � � ���������� � ���� �� � � ���� � ���� ��

��� �:���� � � ������ ��������� �� � � ���/

������� ��������� ��.������ � � ��������� �� ������

����� �� � � ��������+ � � �������� �� � ����/

����� ���������� ����������� ���� �� �� ��

� � ����������� *�� ���������� ��������� ����������

�� ��+

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00�@A

"��+ �+ 0�������� �� ��������� ����� �� ����� ��� �� � � ���+

� �� ->��>�# ��� ����� ����� ->�#>�@ ��� ���� ����� �� -�

��� ������ ����+ �*� �������� ����������� �� ���� ������ � �� ���

"B3 829 ���� �� � � ������ ��������� �� ����� * ��� �� �� 8,9

*�� � � ���� ������ � �B$� ����� � � (��(/��� ������ �:��

���� � �� �� 829+

Page 3: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

� ������������

,&�& 1(2 ����#� �������� �

0���� * ��� �������� �� *�� ���� ��� ����

,��5�� �� ��� *�� ��� ���� �� ����=������+ ���/

�� *�� ������� � ����� ��� #( �� �� ��*�� ��

$+( �@ G$6 �#J7�$6#�#J �� ���/���� �� *��

������� ���� ���/�� � � � ������ �� �$/���

����� �:���� �� ��������� �����+

2��������� �� �� *�� ������� ����� � � ��� �

������� � ����� ;�A<+ 4������ 8($ ��9 *��

����� � �� � ���� *���� 8�$$ �@9� ����=� �� ��

#+! *�� $+� ��� ��@ �>� �� ������ ���� �����

*�� � ���� #/�������� �� �:����� � � �������

���+ � � �I����� ����� �������� *�� ���5�

�: ����� �� ������� � ���� *���� �� ���� � #/����/

����� � �� ������� ($ ���� ��@ ,��/���� ������ 8��

!+B9 �� =���� ������� � ���� *���� �� ���� � �����+

2� ����������� *�� ���� � � ��������������+ � �

����� �������� *�� ����������� �� ����� ( �@ �

�����=�������� 82������ 0����� ���� B#$$9+ 2����

*�� � �� ������������ *�� ���� �� ������� �����/

������� ��+ 4���� ���� *�� ������� ���� 0����

> ��+ >�+ ���� ���� 8��� � � ��������� �� "��+ �9

*�� ������� � � � ���� ��������� �� �������� ���

DK 80���� > ��+ >�+9 ����� � � ������ ��� ��I��

;�&< �� ������ ���� 8��� "��+ �9 *�� ��� ���5� �

� � �������� �� ����� ���� *�� ���������� ��

������� ��� ����� ;�B<+ "�� � � �������������� ��

����� *�� ����� ���� 8�+$ ��9 *�� ����� � ��

������� ������ �� $+# ��� ��@ ��J� �� � �

���� �������� *�� ����� �� � � ���� �������������

�� �$ �� ��@+ � � ����� �������� *�� ������� *��

� � ���� �������� ����� ������� �����������+ � ��

����� *�� ������������ *�� ����� �������� �������

�� ���� � ���������� � � �� ����+ 2���� ��������/

������ �� ���� � �� ������������ � � �������� *��

����������� �� ����� $+( ���� ��@ � �����=����/

���� 82������ B�>9+ � � �� �� � � ������ *��

������ ����� $+# ��� ��@ ��J� �� $+# ��� ��@

�>� �� � � ���� *�� ������� � � ������ "/## ��

����� *�� � ������ ��� !$!G/�$> ��������+

,&,& 1(2 ���)���)��

� � ��� ������� *��� ������ �� � ,����� 2>/

A$$4 "� ��� ������������ ��������� �� � � ��

���I���� �� A$$ ��5+ 2 ������ �������� ��� ���/

�� *�� ������ *�� �� ����������� �$$� �5 ��������

*�� � B� ��� ������ �� � ������ ���� �� $+( �+

������� J �� ����� ������ 8�J'9 *�� ����� � �

������� �� ���������� � ����� ���� ��� @$ �� ��

� � ������� *��� �������� �� � � ���� �� �J' �����/

���� �������+ � � ������/��/����� ����� �� � � ��������

*�� ����� � � ����5������ * �� �������� (-

�$ �5 ���� ���������+ > ������ � ���� ��� �� �� ��

��� �*�=�� ���� ����� #�#/���� �/#/�������/

����/(/��������� *�� � � ������� �#�J �� ��������

���������+

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00 �@(

"��+ #+ 829 � � �*�=�� ������� �� � � A$$ ��5 �� ��� ����/

���� �� ���/�� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�> �� �� G+A&+ 4����

�-� ��� ����� � ����* G+( ���+ 8,9 � � �J' ��������� ��������

������� ���� ���������� �� ���� �+ � � ����� �� !+A� �� &+AG ���

�: ���� �J'�+ 8>9 � � �J' ��������� �������� ������� ����

���������� �� ���� �+ � � ����� �� !+A# �� &+A! ��� �: ����

�J'�+ 8E9 � � �J' ��������� �������� ������� ���� ����������

�� ���� �+ � � ����� �� &+#� �� &+A� ��� �: ���� �J'�+ � � ������

����������� ��� ������� �� ������ ,-E 8��� ��:�9 �� ����� -�

� � ���� ������� �� )�� >@ ���� ��� 2�# ���� �� ��� 2�# ���

�������� �������� �� ;�G<+

Page 4: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

� �������

�&�& * 3��# ��� 3����� � � 14" )���)� � � ��

� � �*�=��/� ���� ������� �� � � A$$ ��5�� ��� �������� �� ���/�� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� �� G+A& �� (�> �� � �*� �� ����� 2 ��

"��+ #+ 4���� �-� ��� ����� � ����* �� ��� ��

� � �J' ��������� ������� ������ *�� � � �����/

�� � ���������� �� ��� ���� ��� � �*� �� ������

#,-#E+ 4��� � ��� �� ����� � ���� � � ������

�:���������� ��������� �� ��* ����������� ��

�� � G�(+ � � ���������� �� ���� � ���� �J'

�� � � ����� �� !+A� �� &+AG ���+ ,�� � � �J'

�������� ����� �� � ��� � ���� ������� ������� � ��

���� � ����� ���� ��� ���/� ��� ����5��� ���

������ * �� �� �� �� � �� �� �������� �����

��� �� � �� � � ����� �� !+A� �� &+AG ��� ���

�� �� >�� �� >�� �������� �������� ��� �� � �

���� ������+ 2������� �� � � K/�� ��������� ;!<�

� ��� ��� �*� ��� ������� � �� ��� �� � ����� ��

� � ������� �����: �� ����������� �� ��������������

����� ���� � ���� ��� ������+ J�� �� ��� B#

8'"(9 �� * �� ��� ������ �� ������� � �����:�

�:��� �� 2�� �A� 8��B9 ���/� ��� �� ���� �

����� ��� �� � � �� �� �� ��� ��G 8)��9 ��

* �� ��� ������ �� �����/���� �� �� �� ���

#A 8,(9+ 4��� � ���� �: ����� � ������� �J'

�������� ����� 8����� #>9 �� � ��� �� ����� #, ��

���� �� �� � � ����� �� !+A# �� &+A! ��� � �

���� ������� �� ���� >��� �� >�� ������� �� ���

'"(� �������� �� ;&-G<+ ������ � � ����� ����� �

�� ����� #, � ��� �� ��������� �� ���/� ���

����5��� ������� �� ��� )��+ 4��� � �� ����

������� �� ��� ������ �� ��� ,( �� � � ������/

���� �� � �� ������ �: ����� �J' �� ��� ������ ��

8���9 �� ���/� ��� ����5��� >�� ������� �� &+#�

�� &+A� ���� �������� �� 8����� #E9+ "��� �������

����� -� � � ���� ������� �� )�� >@ ���� ���

2�# ���� �� ��� 2( ��� �������� �������� �� ;�G<+

� � �*�=��/� ���� ������� �� � � A$$ ��5 ��

��� �������� �� ����� �� G$6 �#J7�$6#�#J ��

�� B+(( �� (�> �� � �*� �� ����� 2 �� "��+ @+ � �

���� �� �� ��� ������� �� ����������� ��������� ��

� � ����� �� ��A ���+ �J' ��������� ������� *��

� � ���������� �� � � ��� ���� ���� ��� � �*� ��

������ @,-@E �� ������� ������� � ���� �������

��� ����� ;B<+ � � �� �������� �� � � �*�=��/

� ���� ������� �� ����� �� ������� *�� � �� ��

���/�� �� "��+ A+ D� "��+ A2� � � ���� *�� �� ���

'"( ��� ������ ������ �� ���������� ��������� ��

�� �� �������� ��������� * ����� � �� �� ��� )��

��� ������ ������ �: ����� � � ������� �� �� �G+(

�� ��������� ���������� �� �� � �����+ >������ ��

� � ��� ���� ���������� ;B<� ����� � � �� � � �� �����

@2 ��� ��������� �� ��� )�� �� ��� '"( ���

�������� �������� ��� ���� �� ��� � � ������������

��������� �� � � �� �������� �� � � ���� *��

���*��� � ��� �*� ��� ������ �������+ D� �������

���� � � �� ���� ������� �� ��� ������ �� ���

,( ;B<+

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00�@!

"��+ @+ 829 � � �*�=�� ������� �� � � A$$ ��5 �� ��� ����/

���� �� ����� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�> �� �� B+((+ 4����

� �-� � ��� ����� � ����* �� ���+ 8,9 � � �J' ��������� ��������

������� ���� ���������� �� ���� � �+ � � ����� �� !+@! �� &+(@ ����: ���� �J'�+ 8>9 � � �J' ��������� �������� ������� ����

���������� �� ���� � �+ � � ����� �� !+(� �� &+@B ��� �: ����

�J'�+ 8E9 � � �J' ��������� �������� ������� ���� ����������

�� ���� � �+ � � ���� �� &+A! ��� �: ����� �� �J'+ � � ������

����������� ��� ������� �� ������ ,-E 8��� ��:�9+

Page 5: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

�&,& � ���� � ��(� �� ��� �

� � �*�=��/� ���� �������� �� � � A$$ ��5 ��

��� ������� �� ����� �� � � �������� �� ������

�������������� �� ����� ����� �� *�� � �� �� ���/

��� ��� ����������� �� (�> �� �� &+#@ ��� � �*�

�� "��+ (+ F�� � � ������ �� ����� ������� �������

���� ������������ �� �������� �� � � �:����� �� � ���

�� �� �����+ 2���� � � ���� �������������/

������� ������ :�-:(� ����� :#� :@� �� :( ��� ��

������������ ������� �� ��� '"( ���� ��� ,( ����

�� )�� >@ ��� �������� �������� ��� �� ��������/

���� ��� ���� �� � � ��������� �� � � � ���� ��

� ��� �� � � ������������ ������� �� � � ��������

�� ���/��+ 4���� :� �� :A ��� ��� ����� � �� � �

�������� �� ���/��+ 2�� ��� ��� ������ ������� ��

��� ��� '"( �� ��� )�� �������� �� ��@+( ����

���� :� �� ������������ ��������� �� ��� '"( ���

������ ������� ��� )�� ������ ������� ��� ������

��������� �� �� &+#@ �� � � ������� �� ��� �����

�� ���/�� 8��� "��+ A9+ "��� ������� ���� :A ��

������� �� ������� �� )�� >@ ��� ������+

D� �� ���� *���/�������� � �� � � �������� ��

����� *�� ���� ���� ��3� ��:���� �� � � �*�

������� ���������� � � �*� ��� ������������

�������� � � �B$� �������� ����� � � (��(/��� �:��

;�#-�!<+ � ��� ������� ��� �� ��� ������� �����/

=� � �� ��� ������� �� ���/���� �� ;�!�#$<+

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00 �@&

"��+ A+ �� �������� �� � � �*�=�� �������� �� � � A$$ ��5 �� ��� ������� �� ���/�� 829 �� ����� 8,9 �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�>

�� � � ������� �� �����+ � � ���� *�� �� ���� � �: ����� � ������� �� �������� �� � �� �� ���� � �+

"��+ (+ � � �*�=�� �������� �� � � A$$ ��5 �� ��� ��������

�� ����� �� G$6�#J7�$6#�#J �� (�> �� �� &+#@ �� � � ��������

�� � � ������� ����� �������� ����� �� ����� ����+ � � �������� ��

���/�� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�> �� �� &+## �� ���������� ��

� � ��� ����� ��� ����������+ 4���� :�-:( ������ *�� � � ������

�� � � ����+

Page 6: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

� � �*�=�� ���=��/� ���� �������� �� �� ���

������� �� ������������ �� ���� � ���/���� ��� ���

������� �� 2 �� "��+ !+ 4���� �� �� � � ����� ����

��� ������� � �� ����* �� � � ������ ����� �� "��+

!2 �� � ��� ����������� � � ���� �������

��� ����� ;�@�#$<+ � � ����� �� � � �������� ���*���

��� �#/>�@ ������ ������ �� � � ����� ���� ��

��� �B/>�@ ������ ������ �� � � ����� ���� ��

���� ��� �� �� �������� �� � � ������ � ���������/

����� �� � � �*� �����+ 0���� � � ��� �������������

�������� �� ���������� I���� � � � � ������ ��

��������� ����� �� �� �� �:������ ���* ��������

�� ���/���� �� ;�@��!<� � � ����/� ������� �� � �

��� ������������� �������� ��� �� �������� � ����

� � ������� �� � � ������� �� �#& ���+ � � �*�/

=��/� ���� ������� �� �� ��� �������� �� ���� �

������������ ���/�� �� � �*� �� � � ������ ����� ��

"��+ !> �� � ��� �� � � ������� ������ �� $+( ��

A ����� �������������� ��� � �*� �� � � ������ �� ���

������ �� "��+ !>� �������� ��+ 2� � � ������� *���

��� ���� �� ���/���� ���� � � � ������ �� �$/

��� ����� �:���� �� ��������� ����� ���������

����� � � ������������ �� � � ������� �� � � ���������

#!-#B+( ���� �� � � ������� ������ �� � � ���������

���/���� ��� ��� � �*� �� "��+ !,+ 2� � �*� ��

"��+ !>� ����� :� �� :A ������� *�� ���� �� � ���

��� ���� �� ������ ������ �� � � �I����������� ���� ��

� � ��� ������������� �������� �� ��.���� �� � � ����

� ������� �� � � ������� � �*� �� "��+ !,+ � ��� �����

:� �� :A ��� ����� �� �� ������� �� ��� '"( ��� ��

)�� >@ ��� ������� �� � � ����� ����� �������� ��+

� � ��������� �� � ��� ������� �� �� � � ��� ������

�������� � �� � � ������� ��������� �� �� �� ��.�����

� � � ����������� �� ���+ � � � ��� ��������� ��

$+$B ��� ���*��� ��� '"( ��� ������ ������� ��

� � ����� �� ����� ����� ������� � �� � � ����

����� �� ��� ������������� �������� �� � @ ���+ � �

�������� =���/���� ���� �������� �� ( � �$�! ��� ���

� � ��� ������������� �������� �� � � ���/�� �����/

������� *�� ����� ���� ;�(< �� *��� *�� �� � �� �����+

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00�@B

"��+ !+ 829 � � �*�=�� �������� �� � � A$$ ��5 �� ��� �������� �� ���� � ������������ ���/���� �� *�� ����� ���� 8� � ������

�����9 �� ���� � ���/���� �� 8� � ��� �����9 �� G$6 �#J7�$6#�#J �� #(�> �� �� G+(&+ � � ������ ����������� ;#$< ��� �� �� *�� � �

�������+ 4���� ������� � �� ����* ����� ���� � � ����� ���� 8, �� "��+ �9+ 8,�>9 � � ���� � ������� �� � � ������� �� ���� � ������������

���/�� *�� ����� ���� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�> �� �� &+@#+ 8,9 � �*� � � ��� �#/ �� �B/>�@ ������ ������� �� � � ���/���� ��

��� ���� ���� � � ������������ ���/��� �� * �� �������� �� � �*� �� 8>9� ��������� ����� � � �����������+ 8>9 � �*� � � �*�=��

�������� �� � � A$$ ��5 �� ��� ������� �� ���� � ������������ ���/�� *�� ����� ���� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�> �� �� &+@#�

������ �� � � ������ ����+ � � ���� � ������� �� � � �������� �� ���� :� �� 8>9 ��������� � �� �� ��� �B/>�@ ������ ������ �� � � �����

���� �� 8,9+

Page 7: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

� � �*�=��/� ���� �������� �� � � A$$ ��5 ��

��� ������� �� ����� �� � � �������� �� ������

�������������� �� ����� ����� ����� �� *�� � �� ��

���/��� ��� ����������� �� (�> �� �� B+#A �� G+((

��� � �*� �� "��+ &+ 2 ���� ������ ������� ���� ���

)�� ��� ������ �� ����� � �� �� B+#A 8"��+ &29 ��

� �� ������ �� ���� �������� �� �� G+(( 8"��+ &,9+ J�

� � ������� �� ��� '"( ��� ������ ������� � � �����/

���� �� �� � � ��� ������ �� ��� ����� � ��� ���

)�� ��� ������ ������+

� � �*�=��/� ���� �������� �� � � A$$ ��5 ��

��� ������� �� ����� �� � � �������� �� ������

�������������� �� ���� ���� �� ������ ���� ��

(�> �� ������� �� �������� �� ����� ��� �������

�� "��+ B+ 2� �� ���� ����� � �� � � ������� �� "���+

(� !> �� &� � ������� ��������� �� ��� '"( ��� ������

������� �� ����� � ��� � � �� ������������ *��

���� ���� �� �� G+A& �� � � ��������� �� ��� '"(

������ �� ��������� �� � � ��� ������+ � � � ���

��������� �� ��� '"( ��� ������ ������ ���*���

� � �*� �������� ��� ������������� ����� �������

� �� � � ��� ������������� �������� ��� ���� ����

�� � A$ ��� �� � �� ���� �� ���������� *�� � �

������� �������� =���/���� ���� �������� ��

( � �$�A ��� ;�(<+ J� � � �� �� ��� � � ��������� ��

��� '"( ��� ������ ������ �� �� � � ��� ������

���� ��� �� ����� � ��� � � �� ������������ *��

������ ����+ � � ������� �� ��� '"( ��� ������

������ �� � � ����� ���� �� "��+ B> �� E �� ��� ��

�� ���� �I����������� ��� ������ ����� ������� �������

�� �� � � ��� ������ ��� ������ ����� � �� � �

�������� �� ���/���� ���� ��� ����� � � � ��/

���� �� ��������� ������ ��������� ����� � �

����������� �� � � ������� �� "��+ &> �� E 8�������

��� � �*�9+ � � � ���� �� ��� ,(� ��� '"(� �� ���

)�� ���/� ��� �� ������ ������� �� � � ������������

���/��� �������� ���� ����� �� *�� � ��� �� ���� �

���/�� �� ������ ��� �������5� �� ����� �+

�&�& 1(2 ���)��� ��)��� ����! (��

� � �*�=��/� ���� �������� �� � � A$$ ��5 ��

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00 �@G

"��+ &+ � � �*�=�� �������� �� � � A$$ ��5 �� ��� �������� �� ����� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�> �� �� B+#A 829 �� �� G+(( 8,9 ��

� � �������� �� � � ������� ����� �������� ����� �� ����� ����+ � � ������� �� ���/�� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�> �� � � ������������

�� ����� ��� � �*� �� � � ��� ������ ��� ����������+ � � ������ ����������� ��� ������� *�� � � �������+

Page 8: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

��� ������� �� ���� � ������������ ��� *�� �����/

����� ���� ����� �� ������ ���� �� (�> �� ��

�G+( ��� ������� �� "��+ G+ 2�� ��� � � �����/

������� ������� ����� � � ������� �� � ��� ��������

������������ ��� ��� I���� ������� �� � � � ���� ��

� ��� ����������� ��������� � � ��� ���� ��

�������� �� � � ����������� �������� �� � �

���� *�� + � � ��������� �� � � �:� ���� ����/

��������� �� � ��� ��� � � ������������ ���

�� ������ ������� ����� � � � ��� ������������

��� ������� �������� � �� � � ��������� �� � �

'"-� �� ,-)� ���������� �� �� �� �������

� � � ���/������� ��������+

� ����������

0&�& "�)�� ��� ���� � ����� � � ��� 5-67 ��!

"8-7 �����)� ����)���� (�

��� ������� ������� ���� ��� ,( ��� �� ���

)�� ��� ������� ��� ������� � �� � � ��������� ��

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00�A$

"��+ B+ � � �*�=�� �������� �� � � A$$ ��5 �� ��� �������� �� ����� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�> �� �� &+#A 829 �� �� G+A& 8,9 ��

� � �������� �� � � ������� ����� �������� ����� �� ���� ���� �� �� �� &+#$ 8>9 �� �� G+@# 8E9 �� � � �������� �� � � �������

����� �������� ����� �� ������ ����+ � � ������� �� � � ������������ ���/�� *�� � � ������������ ���� �� G$6 �#J7�$6#�#J �� (�>

�� � � ������������ �� ����� ��� ���������� �� � � ��� ������+ ��� '"( ��� ������ ������ �� � � ����� ���� �� ����� � �� 8,9+

����� �

> ������ � ���� 8���9 �� ��� ,(� ��� '"(� �� ��� )�� ���/� ��� �� ������ ������� �� ��� �� (�>

�� �� ��� ,( ��� ��� '"( ��� ��� )�� ���

����� �����

���� � ���/�� G+A& ��+(& �@+!# �++ �@+B&

2���� G+@@ ��+&@ �@+($� �A+$A

2�)��� ����! ����(�

4���� ���� G+(� ��+(& �@+!� �@+&� �@+B&

���� ���� G+(@ ��+($ �@+!A �@+&( �@+B#

E������ ���� G+(# ��+(# �@+!( �@+!( �@+B&

� �� ��� ������ �� �����+ �++3 ��� ������+

Page 9: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

,-)� ��������� �� � �� ��� ��� '"( ��� ������ ��

�������� �� � � '"-� ��������� ��������� ;&-G<+ � �

��������� �� ����� �� ���� �� �������� � ���

�� �� ���� � �*� �� �� I���� ������� �� � �� ��

�� ;#�-#(<+ � � ��������� �� � � ����� ���

���*��� � � ���/� ���� �� ��� ,( �� ��� )�� ���(�/������ ����� �� ���� ���=��� � � � ����/

���� �� � � ����-���� �������� �������� ���*��� �(���

�� � � �*� ������� � ���� � � ����� ����� �����

��� ;#!<+ � � ����� ����� �� ��� ,( ��� ������

������ �������� � ���� ����* �� ���� ����� �� *��

��� ����� �:� ���� ���� �� � @ � �$@ ��� 8����/

���� ���� ��� � ��� ������ � �� � �� �� *���� ������9�

���=��� � � ��������� �� � � 2�� ,�-��� ,(

����� ��� �� ��� � � ������������ ���+ >����/

I������ �� �� ����� � �� � � ���I�� ���� �����

���� 2�� ,�-��� ,(-��� )��� �� ����� �� ���

� � �������� �������� �� � �� ���+ � � ���� � ��

� � � ���� �� ��� ,( ��� �� ��� )�� ��� ������

������� ��� ��� ���� �� ��.����� � ��� ���� ��

8����� �9 ������� � �� � � 2�� ,�-��� ,(-��� )��

����� ��� �� �� �� ���������� �������5�

*�� �� � ��� ���� ������� ������� �� 2� ,� )�

�� � ������� �� �� ���� �������� ��� ����� ;#&-

@$<+

2�� ��� � � � ��� �� ��� '"( ��� ������ ������ ��

��� ���� �� ������� � � � ��� ���� ��� ��� ����

*�� �� �������� ������+ � � �������� ���� *�� ��

��� '"( ��� ������ ������ �� � � ������� �� �����

�������� � �� � � ����� ��� ���*��� ��� '"( ��

2�� ��B �� *������ �����=����� � � � ���

���� ��+ � �� ���� �� ��������� �� ��������������

� ������� �� � � " ���: �� � � ������� �� ���

;#(�@�<+ "��� ������� ��� '"( ��� ������ ������

������� �� �� ������� � �� � � ��� ����������� �� � �

���� � ���� �� ��+ � � �������� �� ��� '"( ���

������ ������ *�� � � ������ �� ���� �� � �*� ��

� � ������� �� "���+ (� & �� B� �������� � �� � � '"-�

��������� �� �������5� � � � ������������� �� ���

���� �����+ D� ������� �*� ������� ����� � ��

��@+( ��� �� � � ������� �� ���� � ������������

���/�� �� �� &+#@� ����� :� �� :# �� "��+ (� ���

������� �� ��� '"( ��� ������ �� � � ��������� ��

��� ������ �� ��������� �� � � �������� �� �*� ��������

��� ������������� ����� 82 �� , �� "��+ �9+ � ��

������ ���������� �� ������� �� � � ����� �� � � ����/

����� �� � � ���� � ������� �� � � ������ ��������

���*��� � ��� ������� �� � ��� ������� ���� � �

��� ������ 8"��+ !9+ � � ��������� �� ��� '"( ������

��� �� ���������� �� � � ������� � �� � � ��.����� ��

� � ��������� �� � � ���/������� ��������� �� �� � �

�������� �� � � �*� �������� ������������ �� ���

������ � �� � � �������� �� � � ��������� �� � � '"-�

���������+ 2 ������� ��������� �� ���� ����� � ��� � �

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00 �A�

"��+ G+ ����������� �������� �� ���� � ������������ ���/��� *�� ����� ���� �� �� G+(� 829� ���� ���� �� �� G+(@ 8,9� �� �����/

� ���� �� �� G+(# 8>9+ 4���� ������� � � ��� �� �� �������+

Page 10: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

������� �� � ��� ������������ *�� ���� ����� ��� ��

��� ��������� �� ����� � ��� � � �� ������������ *��

������ ����+ � ��� ������� ������� � �� � � �������

���*��� � � ������� �� � � ��� ���/� ���� �� � �

#/� @/� &/� �� B/��������� ��� ���������� �� � � '"-

� ���������+ � � K/�� ��������� �� ����� * ��� ��

�� ���� � �� � � ��� ���/� ���� �� � � #/� @/� &/� ��

B/ ��������� �� � � ������ ���� ��� �� ����� ������� *��

8� � '�$� 2�� '�A� L�� "A9� 8L�� '�(� L�� )(� D�� )B�

D�� )�#� 4 � ��(9� 8L�� ,�@� D�� ")(� �� )A� D�� )B9�

�� 8L�� ,�@� 4 � >E�� � � >A� L� >&� D�� ")(� ��

)A9� �������� �� ;!<+ � � ��������� �� � � ��5� �� � �

��� ���/� ���� �� � � @/ �� B/��������� ���*���

������ 8������ ����9 �� ��� ����� 8����� ����9

�� �� � ����� 8���� ����9 ������� �� �� ������� ��

���������� ����������� ���*��� � � ��� ���� � ����

�� � � '"-� ���������+ ���� � ��������� � � � ���

�� ��� '"( ��� ������ ������ �� ��������5� ���� � ���

������+ 2�����* �� �: ����� � � ���� �� �@+($ ����

�� �������� �� �� ��������� ����� �� � � �� �� �*�

������ ��� � � ����� �� ����� ����� �� ��� * ��

�: ���� � � ����� �� �@+!�-�@+!( �� �@+&�-

�@+&( ���� �������� ��+ � � ���������� ��������� ��

� � � ��� ���*��� � � ������� �� ����� �� � � ���

���������� � � ��������� ��������� �������� �� � � '"-�

���������+ D� ������� � � ���� � �� � � � ��� �� � � �����

���� �� ���������� ��������� �� � � ��� ��� ��� � �

�������������� ������� �������� � �� � � ��������

���*��� � � ������� �� � � ��� ���/� ���� �� � � #/

�� &/��������� �� � ������ ���� ��� ����������� ��� � �

������������ �� � ���������� ���������� �� � � ���� � �����

�:���� � � � ����������� ���/������� ��������� �� � �

'"-� ���������+ "��� ������� ��*������� � �� � � � ���

�� � � ��� '"( ������ �� �������� ����� �

�� ������ �� ������� �� �� � � ������5����� �� � �

�-� ��� � � � ��������� �� � ����� ���+ � �

������� �� ����� ��� ��� �� ��������� �� � �

�*�=�� � ��� �� � � ������+ ������ � � ������� ��

� � ��� '"(-2�� ��B ����� ��� �� � � '"-�

��������� �� ������ �� ����������� ����������

���� �� ���� �� ���������� � � ������� �� � � ���+ D�

���� � � ���� ��=��/� ���� ��� '"( ��� ������ ������

����� � ��� ����� �: ����� ������� �:� ���� ����/

�����+ � � ��� '"( ��� ������ ������� ��� � � �����

�� ����� ����� �: ���� ������ ���� ���� *�� +

0&,& 9�3����3� ����)����# )���#�� � ��� ��� ����

�)� �� � �� ��! "8-7 �����)�

� � ������� ��� ����������� � �� � ��� �� � ���

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00�A#

"��+ �$+ 0� ������ �������������� �� � � ����� ��� ���*��� ���������� ���*��� � � ��� ���� � ���� �� ��� '"( ����� � �� K/��

��������� �� �� ;#<+ ���� �� �������� �� � *��� ���� �� � � ������� �� �� � �� � � ����� ��� ���*��� ��� ���������� �� � ����/��/

����� ����+ � � ����� ���� ��� ���������� � � � ��� ������ ����+ 2������� �� K/�� ������ ���������� ��� ��� �� ��� ������� �� ���

"B �� �����/���� �� ������� �:��� �� L�� "A * �� �� �� ����� ���:���� �� ��� ���/� ��� �� � � #/�������� �� � � ����� ����+

>������ �:��� �� ��� '"( ������� ��� ������ �� L�� "� �� ���� � ����� ��� �� ������� �:��� �� L�� "� ������� ��� ������ �� 2��

"( �� ���� ���� �� ����� ���+ E������� �� � � ���� ������������ ������� � � ����-�������� ������� �� � � ����� ��� �� ��+

Page 11: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

��� � � ������������ �� ���������� ����������� ���*���

� � ��� ���� � ���� �� � � '"-� ���������� * ��

��� �� ����� �+� �� �����+ � � �������� �� � �������

���������� ����������� ���*��� � � ��� ���� � ���� ��

� � '"-� ��������� �� ���� ����� � �� � ��������

��� ;@#<+ >���� �� ��+ ;@#< ������� � �� � � �������/

���� �� ��� '"( � )�� ������� ��� ����� ��

� ��������� ���������� �� � � ��� �������������

��������+ � � ���� ����� ����� ��� � � �������� *��

���� �� �� ������� � �� �? ����� ��� � � ������

������ � �� � �� ��� � � *�� ��� �� � � ����� ����

�� � � ������ �� ��������5� � �+( �? ����� ������ �

�� � �� �� *�� ���+ � ��� ������� � � ���� �����/

����� �� � � ����� �� � � ���������� �������� �� � �

'"-� ���������+

0��������� � ���� �� � � '"-� ��������� �� � ����

��������� �� � � ��� ���������� �� ��� '"( ���

������ ������ � ���� � � ���������� �� � � ��� '"(-

2�� ��B ����� ���+ 2�� ��� � � � ���� �� � �

�������� ���������� ������ �� I��������� �� �����/

����� �� ����� �� � � ��������� ������� �� � �

����� ��� ��� �� � � ��� ����� �� ����� ��

� � �������� � � ���� *�� �� ��� '"( ��� ������

������ �� �:����� �� �� ���� � ������ �� � � �������

�� � � ��� '"(-2�� ��B ����� ���+ 2� �� ����

�������� ��� �� � � ��������� �� ��� '"( ��� ������

������� ����� � ��� � � �*� ��� ������������� �����

�� � � ��� ������������ *�� ����� ���� �� ����/

����� �� � � �������� �� � ��� ������� ��� � � ��

������������ *�� ������ ���� ������� � �� � �

�������/ ��� �������� �� #/ ��7�� &/��������� �� � �

����� ���� ��� � ������� ���� ��� ���������� ��������

���*��� � � ��� ���� � ���� �� � � '"-� ���������+

� � � ���: � �� ���� ������� 2 �� ) ������ �� �

��� ���� ���� �� � � ������� �� ��� �� � � ����

������ ������ �� �� ;!<+ ����� �� �� ������� � �� � �

��������� �� � �� ���: �� ��.����� � � � ���/

������� ��������+ ����� �� �� ������ � �� � � �����/

����� ����������� ���*��� � � ��� ���� � ���� �� � �

'"-� ��������� �� ���������� � ���� '/ ��7�� "/

������+ � � ��� ���/� ��� �� � � #/�������� �����

������� � � '�$� 2�� '�A� �� L�� "A+ 2������� ��

K/�� ������ ��������� 8"��+ �$9� ��� ��� �� ���

������� �� ��� "B �� �����/���� �� �������

�:��� �� L�� "A+ >������ �:��� �� ��� '"(

������� ��� ������ �� L�� "� �� ���� � �����

��� �� ������� �:��� �� L�� "� ������� ���

������ �� 2�� "( �� ���� ���� �� ����� ���+

� �������� �� � � ������� ���*��� � � ��� ���/

� ��� �� � � #/�������� �� L�� "A ������� � � �������/

���� �� 2�� "( *�� ������� �� � � ���� � � �������/

���� �������� ���*��� � � ��� ���/� ��� �� � � #/

�������� �� L�� "A *��� �� ���������� �� � � ���

'"( � ���� � � ����� ��� ���*��� �� 2�� "(-

L�� "�-��� '"(+ J� ������� �� �� ���� �������� � �� � �

���������� ����������� �� ���������� �� � � '/ ���:�

��� ��� ���� ����� ����� ������� ��� �� �� �

������� *�� � � ��� ����� �� � � "/ ���:+

���� ���=������ ������ ;@@�@A< �� *��� �� �����

��� ����������� �:��������� �� �������� � ����/

����� ��� ����� ��� � � ����/����� ����������

�������� ���*��� � � ��� ���� � ���� �� '"-�

��������� �� �� ��� �������� �� ��������+

����������

;�< �+'+ E��������� D+ )���� ����������3 0��������� "��������

' �������� �� 4�� ����� ,�������7>�������� �����

4���� �GB@+

;#< �+ ������� ?+ ���+ ,���+ ��$ 8�G&&9 (@&+

;@< �+ ������� ?+ ���+ ,���+ ��$ 8�G&&9 (!G+

;A< 0+'+1+ 4 ������� ?+ ���+ ,���+ �A# 8�GB$9 (@�+

;(< ?+ ������� 0+ F���5� �+ �������� )+2+ 4������ ?+ ���+ ,���+

�G# 8�GB!9 �@@+

;!< K+ > ���� ,+4+ 0� �������� ?+ ���+ ,���+ ##$ 8�GG�9 @B�+

;&< �+ ��������� ?+ ,��� ��+ �#$ 8�GG!9 �#!+

;B< �+ ��������� '��+ ?+ ,��� ��+ #A@ 8�GG&9 #G#+

;G< �+ ��������� ,��� ��+ ,��� �+ 2��� �@A@ 8�GG&9 (G+

;�$< E+ ,������� "+�+ ��� ���� �+L+ ,��*��� ?+ ���+ ,���+ #@&

8�GGA9 (BB+

;��< F+ M��� �+ 0���� ���� ,+ 4������� 2+ 0� ������ '+ ��������� �

,��� ��+ ,��� �+ 2��� �#(# 8�GG(9 B&+

;�#< )+�+ L� ���� E+L+ ,�� E+,+ 1������ �+�+ 0��� � �+>+

L����� 4���+ ����+ 2��+ 0��+ N02 &( 8�G&B9 (&((+

;�@< )+�+ L� ���� �+L+ E� ��� E+F+ 4���� � �+�+ 0��� � ?+ ���+

,���+ �!B 8�GB@9 BB&+

;�A< "+F+?+ ������ ,��� ��+ ,��� �+ 2��� @( 8�G(G9 (A@+

;�(< )+�+ L� ���� �+ ���� �+ ���� ������� �� ?+ 2�+ > ��+ 0��+

�$! 8�GBA9 !@G(+

;�!< �+ ��������� )+�+ L� ���� ,��� ������ #( 8�GB!9 (#BB+

;�&< 2+F+ ?� ����� ��3 �+�+ 0��� 8'+9� 4��� ��� �� �������/

���� ����� '��� ���� 2�������� �G&( > ����� �B+

;�B< �+�+ 0��� � ��3 �+�+ 0��� 8'+9� 4��� ��� �� ����������/

� ����� '��� ���� 2�������� �G&( > ����� #+

;�G< �+ � �O������� �+>+ 4�� ����� >+ E�� ��� �+L+ > ��� 0+)+

0������ 4+'+ F��� �� ?+ ,�����+ ��� A 8�GGA9 AG�+

;#$< �+ ��������� �+ ����� ���� '+ ��*���� �+ > �P��P� ,��� ��+

,��� �+ 2��� �@BB 8�GGB9 @AG+

;#�< �+?+ >����� �+/�+ ���� 2+�+ 4 ������� ?+�+?+ L�������

,��� ������ @� 8�GG#9 !AB�+

;##< �+?+ >����� ?+�+?+ L������� ,��� ������ #G 8�GG$9 ��$!&+

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00 �A@

Page 12: 1H NMR study of the effect of heme insertion on the folding of apomyoglobin

;#@< �+?+ >����� ?+�+?+ L������� 4������ 0��+ @ 8�GGA9 #!&+

;#A< ?+�+?+ L������� �+/�+ ���� �+?+ >����� 4������� 0�����+ "����+

)����+ #( 8�GG!9 #!&+

;#(< E+ '���5��� 4+'+ F��� �� ?+ ���+ ,���+ #!@ 8�GG!9 (@�+

;#!< �+ �������� ,+�+ )������������ ?+ 2�+ > ��+ 0��+ �#�

8�GGG9 (�#@+

;#&< "+�+ ��� ���� �+L+ ,��*��� ,��� ������ #B 8�GBG9 AA�(+

;#B< "+�+ ��� ���� 4+'+ F��� �� �+L+ ,��*��� 0������ #AG

8�GG$9 �(AA+

;#G< �+0+ ��� �+L+ ,��*��� ,��� ������ @#& 8�GGB9 &B(G+

;@$< 0+'+ ,����� 0+ 0������ ?+ ?����� ,��� ��+ ,��� �+ 2��� �AB$

8#$$$9 @(@+

;@�< "+ F���� K+/?+ ����� ,��� ������ @( 8�GG!9 A$!G+

;@#< �+?+ >����� E+ ,������� 0+1+ ������ ?+�+?+ L������� ?+ 2�+

> ��+ 0��+ ��A 8�GG#9 �� $$$+

;@@< �+ ��������� �+ ������ 2+ 0�5���� ?+ ,���+ D����+ > ��+ (

8#$$$9 A((+

;@A< �+ ������ �+ ��������� 2+ 0�5���� ,���+ > ��+ 0��+ ?�� &@

8#$$$9 #@$G+

%& %����� �� �#& ' �����# (#�)�#�� *���)���� +�,-+�� .,��,/ ���-�00�AA