2-1세부과제

약물대사기반연구사업단

장내미생물에 의한 독성 대사 경로

및 대사체 분석연구


중단위 세부과제중단위 세부과제중단위 세부과제중단위 세부과제2009~2010. / 2 12009~2010. / 2 12009~2010. / 2 12009~2010. / 2 1

세부과제2-1 2222////82828282


목 차목 차목 차목 차

최종 연구개발 목표최종 연구개발 목표최종 연구개발 목표최종 연구개발 목표1.1.1.1.

세부과제의 목표1) ··················································································5

세부과제의 목표달성2) ··········································································5

연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법2.2.2.2.

차년도차년도차년도차년도(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1 ································································································6

최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발1)

및 대사체 구조 확인··········································································6

항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구2) ··············6

장내미생물에 의한 내인성3) 대사체 변화검출을 위한

연구global metabolic profiling ···················································7

4) 및 의Geniposide Genipin precision-cut small intestine slice

에서의 독성 평가 방법의 확립·························································7

차년도차년도차년도차년도(2) 2(2) 2(2) 2(2) 2 ································································································7

항생제 투여에 의한1) pseudo 의germ-free rat model

대사변화를 위한 대사체 연구··························································7

2) Pseudo germ-free rat 에서model 아세트아미노펜의

대사변화 연구······················································································8

에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구3) Germ-free mouse ·8

장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향4) ginsenoside ··8

장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구5) baicalin ···········8

차년도차년도차년도차년도(3) 3(3) 3(3) 3(3) 3 ································································································9

및 의 투여 후 체내동태 및1) Esculetin Esculin

장내미생물에 의한 대사체의 변화·············································10

세부과제2-1 3333////82828282


장내미생물 대사가 의 약동력학에2) geniposide

미치는 영향 연구·············································································13

의 아세트아미노펜의3) Pseudo germ-free rat model

대사변화 연구···················································································18

의 아세트아미노펜의4) Germ-free mouse model

대사변화 연구···················································································18

장내미생물에 의한 내인성 대사체 변화 연구5) ···························18

연구개발 결과연구개발 결과연구개발 결과연구개발 결과4.4.4.4.

차년도차년도차년도차년도(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1 ·····························································································21

최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및1)

대사체 구조 확인·············································································21

항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구2) ···········21

장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한3)

연구global metabolic profiling ·················································22

및 의4) Geniposide Genipin precision-cut small intestine

에서의 독성 평가 방법의 확립 연구slice ···································25

차년도차년도차년도차년도(2) 2(2) 2(2) 2(2) 2 ·····························································································26

항생제 투여에 의한 의1) germ free rat model

대사변화를 위한 대사체 연구·······················································26

에서 아세트아미노펜의2) Pseudo germ-free rat model

대사변화 연구···················································································28

에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구3) Germ-free mouse 29

장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향4) ginsenoside 29

장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구5) baicalin ········29

차년도차년도차년도차년도(3) 3(3) 3(3) 3(3) 3 ·····························································································30

1) 및 의 투여 후 체내동태 및Esculetin Esculin

장내미생물에 의한 대사체의 변화···············································30

세부과제2-1 4444////82828282


장내미생물 대사가 의 약동력학에2) geniposide

미치는 영향 연구·············································································35

3) Pseudo germ-free rat model의 아세트아미노펜의

대사변화 연구···················································································45

4) Germ-free mouse model의 아세트아미노펜의

대사변화 연구···················································································47

연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론5.5.5.5.

장내미생물이 내인성 대사에 미치는 영향에 대한 연구- ············74

장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구- hesperidine 76

장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구- baicalin ······ 76

장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구- ginsenoside 76

투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화-Esculetin 77

장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구- geniposide 78

아세트아미노펜과 그 대사체의 를 이용한- LC-MS/MS

동시 정량분석방법의 개발·······························································78

-Pseudo germ-free rat model의 아세트아미노펜의 대사 및

약동력학 변화 연구···········································································79

-Germ free mouse model의 아세트아미노펜의 대사 및

약동력학 변화 연구···········································································80

참고문헌참고문헌참고문헌참고문헌6.6.6.6. ··························································································81

세부과제2-1 5555////82828282


최종 연구개발 목표최종 연구개발 목표최종 연구개발 목표최종 연구개발 목표1.1.1.1.

세부과제의 목표세부과제의 목표세부과제의 목표세부과제의 목표1)1)1)1)

약물 등이 장내미생물총에 의하여 대사를 받아 독성을 유발하는 대사경로 연o

구로 부터 독성과의 인과관계를 규명하기 위하여 다음의 내용을 확립하자고

함.

미생물 특이 대사 시스템에 의하여 독성이 유발되는 약물의 독성 발현기전o

규명하기 위하여 미생물대사를 구별할 수 있는 및 시스템을in vitro in vivo

확립.

o MSn 분석을 통한 대사체 구조 규명

미생물에 의한 대사 경로 추적 및 독성과의 인과성 확립o

세부과제의 목표달성도세부과제의 목표달성도세부과제의 목표달성도세부과제의 목표달성도2)2)2)2)

제 세부1

미생물세균총 대사활성 시스템 활용 대사체 연구In-vitro , 100

항생체 처리 모델 대사체 구조 확인 연구rat 100

천연물 및 약물 대사체의 최신 분석 기법 활용 분석 방법

개발 및 확보100

미생물 대사 경로 규명 100

세부과제2-1 6666////82828282


연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법연구개발 내용 및 방법2.2.2.2.

구분구분구분구분 연구개발 내용연구개발 내용연구개발 내용연구개발 내용 연구개발 방법연구개발 방법연구개발 방법연구개발 방법

세부1

항생제모델을 활용한 대사체

분석연구

항생제모델을 활용한 대상물질의 투여

및 시료의 확보

천연물 약물 등의 고감도 기,

기분석법 개발 및 응용

천연물 및 약물대사체의 최신LC/MS

분석기법을 활용한 분석방법의 개발

장내미생물총에 의해 대사를

받아 독성을 유발하는 대사경

로의 확인 연구

MSn 분석기법을 이용하여 장내미생

물에 의해 생성된 대사체의 구조 규명

장내미생물에 의한 내인성대사체의 변

화 검출

차년도차년도차년도차년도(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1

최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인1)1)1)1)

혈장시료 중 의 에 의한 정량분석법 확인- hesperetin LC/MS : 의Hesperetin

혈중 농도분석법을 방법으로 확립LC/MS 하였다.

분석법 개발 사용하여- Amaranth : LC/MSD iontrap mass spectrometer

MSn으로 분석

- MSn 분석기법을 이용한 의 대사체 구조 규명hesperetin : LC/MSD trap

를 사용하여 혈장 뇨 및 변에서 약물과 대사체ion trap mass spectrometer ,

분석하였다.

항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구2)2)2)2)

세부과제2-1 7777////82828282


항생제 처리 동물 모델 확립 및 투여 실험 주령 실험쥐에 항- hesperetin : 8

생제혼합액을 일 회 일간 경구투여 후 일이 경과한 후에1 2 6 2 40 mg/kg

을 경구 투여하여 항생제를 투여하지 않고 을 투여한 정hesperitin hesperitin

상군과 비교하였다.

장내미생물에 의한 내인성장내미생물에 의한 내인성장내미생물에 의한 내인성장내미생물에 의한 내인성3)3)3)3) 대사체대사체대사체대사체 변화검출을 위한변화검출을 위한변화검출을 위한변화검출을 위한 global metabolic profilingglobal metabolic profilingglobal metabolic profilingglobal metabolic profiling

연구연구연구연구

항생제처리한 모델 뇨시료에서- u 로 여과하고ltrafree-MC filter

로 범위에서 분석 비교하여 다변량분석과UPLC-TOF-MS m/z 50-1200

검색으로 내인성 대사체를 추정data 하였다.

4)4)4)4) 및 의 에서의 독성 평가및 의 에서의 독성 평가및 의 에서의 독성 평가및 의 에서의 독성 평가Geniposide Genipin precision-cut small intestine sliceGeniposide Genipin precision-cut small intestine sliceGeniposide Genipin precision-cut small intestine sliceGeniposide Genipin precision-cut small intestine slice

방법의 확립방법의 확립방법의 확립방법의 확립

의 소장을 적출하여 기법을- SD rat precision-cut small intestine slices

활용하여 소장의 절편을 배지에서 배양하여 와William E geniposide

을 노출시킨 후genipin alkaline phosphatase, Na+/K+-ATPase, lactate

의 활성을 측정하여 독성효과를 측정dehydrogenase 하였다.

배지에서 와 의 분석법을 개발- William E geniposide genipin HPLC 하였다.

차년도차년도차년도차년도(2) 2(2) 2(2) 2(2) 2

항생제 투여에 의한항생제 투여에 의한항생제 투여에 의한항생제 투여에 의한1)1)1)1) pseudopseudopseudopseudo 의 대사변화를 위한 대사체의 대사변화를 위한 대사체의 대사변화를 위한 대사체의 대사변화를 위한 대사체germ-free rat modelgerm-free rat modelgerm-free rat modelgerm-free rat model

연구연구연구연구

- 내인성 대사체 변화 연구 항생제 조성을 변경하여 확립한 새로운: pseudo

에 대하여germ-free rat model global metabolic 방법을 사용한profiling

장내미생물의 존재 여부에 따른 대사체 변화를 관찰하기 위하여

에 의한 대사체 분석을 위한 시료의 전처리 법 개발 및UPLC/QTOF-MS

세부과제2-1 8888////82828282


에 의한 대사체 분석LC/MS 하였다.

및 담즙산의 정량분석 장내미생물에 의한 담즙산 농도 변화를- Oxysterol :

뇨시료를 효소가수반응하고 로 추출하여 로 분석MTBE GC/MS 하였다

2)2)2)2) Pseudo germ-free ratPseudo germ-free ratPseudo germ-free ratPseudo germ-free rat 에서에서에서에서modelmodelmodelmodel 아세트아미노펜아세트아미노펜아세트아미노펜아세트아미노펜의 대사변화 연구의 대사변화 연구의 대사변화 연구의 대사변화 연구

- Pseudo germ---- 에 혈장 시료를 받아 체내동태연구를 하기free rat model

위하여 아세트아미노펜의 대사체를 로 분석하여 체내동태파라미터를LC/MS

구하여 두 군에서 비교하였다.

에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구3) Germ-free mouse3) Germ-free mouse3) Germ-free mouse3) Germ-free mouse

대조군 정착동물 무균동뮬 군으로- (SPF), (Gnotobiota), (Germ free) 3

나누어 아세트아미노펜 을 경구 투여하여 채혈하고 시료전처리200 mg/kg

과정 후 분석하여 혈중농도를 비교하였다.

장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향4) ginsenoside4) ginsenoside4) ginsenoside4) ginsenoside

및 관련 대사체의 분석법을 로 확립하였다- Ginsenoside Re LC/MS

일반 및 에 을 경구투여하고- germ free mouse ginsenosie Re 50 mg/kg

혈액시료에서 모약물 및 대사체를 정량 분석하였다.

항생제 처리 에 를 경구투여 투여 후 혈중농도 프로파일- rat 50 mg/kg Re

을 분석하였다.

장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구5) baicalin5) baicalin5) baicalin5) baicalin

을 항생제 처리군과 대조군에 투여 후 혈장시료를 분석- Baicalin 50 mg/kg

하고 체내동태 연구를 하였다.

세부과제2-1 9999////82828282


차년도차년도차년도차년도(3) 3(3) 3(3) 3(3) 3

및 의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화및 의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화및 의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화및 의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화1) Esculetin Esculin1) Esculetin Esculin1) Esculetin Esculin1) Esculetin Esculin

가 항생제 처리 모델가 항생제 처리 모델가 항생제 처리 모델가 항생제 처리 모델....

실험용 쥐 주령 에(8 ) cefadroxil (100 mg/kg), erythromycin (300 mg/kg),

인oxytetracycline (300 mg/kg) 항생제 혼합액을 일간 경구 투여하여3

모델을 만든 후 마지막 투여 일 후에 과Pseudo germ-free 2 Esculetin

을 투여Esculin (40 mg/kg) 하였다.

나 수술 방법 및 혈액 채취나 수술 방법 및 혈액 채취나 수술 방법 및 혈액 채취나 수술 방법 및 혈액 채취....

실험동물을 마취한 후 경동맥을 분리하여 헤파린으로 채워진 튜브(1) PE-50

를 심장 방향으로 삽입한 후 봉합하였다.

하루 동안 회복시킨 후 및 을 투여 한 후(2) Esculetin Esculin 0, 2, 5, 10,

분 시간에20, 30 , 1, 2, 3, 4, 6 500 lμ 을 채취하였다.

채취 한 혈액은 에서 분간 원심분리하여 를(3) 10000 rpm 10 plasma 100 lμ

취한 후 분석 전 까지 에서 보관70℃ 하였다.

다 시료의 전처리다 시료의 전처리다 시료의 전처리다 시료의 전처리....

(1) Plasma 100 lμ 에 내부표준물질 이 포함된 을(levafloxacine) acetonitrile

100 lμ 와 를0.2 % ascorbic acid 10 lμ 가하여 혼합한 후 을 충vortexing

분히 하여 혈장단백질을 제거하였다.

에서 분간 원심 분리하여 상층액을(2) 12000 rpm 5 100 lμ 취한 후 2 lμ 를

에 주입LC-MS/MS 하였다.

라 기기분석조건라 기기분석조건라 기기분석조건라 기기분석조건....

세부과제2-1 10101010////82828282


분석장비는(1) Finnigan TSQ Quantum Ultra mass spectrometer

와(Thermo, San Jose, USA) UFLC-20AD XR binary pump

을 사용하여 모든 시료를 분석하였다system(Shimadzu, Toko, Japan) .

사용한(2) C 은olumn Kinetex C18 (2.0 × 100 mm, 2.6 um,

이며 는 이고Phenomenex, Torrance, USA) , flow rate 0.5 ml/min ,

은Injection volume 2 lμ 로 분석하였다.

이동상 조건은(3) A (0.1% formic acid in water) and B (0.1% formic

으로 을 사용하였다acid in acetonitrile) gradient elution program .

장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구2) geniposide2) geniposide2) geniposide2) geniposide

가 를 이용한 및 의 대사체 분석기법 개발가 를 이용한 및 의 대사체 분석기법 개발가 를 이용한 및 의 대사체 분석기법 개발가 를 이용한 및 의 대사체 분석기법 개발. LC/MS/MS genipin geniposide. LC/MS/MS genipin geniposide. LC/MS/MS genipin geniposide. LC/MS/MS genipin geniposide

및 의 혈중 농도 측정을 위하여 를 이용(1) Genipin geniposide LC-MS/MS

하여 분석 조건을 확립하였다 는. LC-MS Agirent 6460 Triple Quad

를 사용하였다LC-MS .

와 은 에서(2) Geniposide genipin negative ion mode ESI (electrospray

를 이용하여 분석ionization) source MRM(multiple reaction monitoring)

조건을 확립하였다 은 는. Genipin m/z 225.2 101.2, geniposide 433.4

내부표준물질인 은 은225.1, luteolin m/z 285.2 133.1, digoxin m/z

의 로 검출하였다825.2 779.2 MRM mode .

분석용 컬럼으로는(3) BDS hypersil C18 column (2.1 mm * 50 mm, 5 μ

을 사용하고 이동상으로는 와l) 0.1% formic acid (solvent A) 90%

를 사용하였고 유속을 로 하여서acetonitrile (solvent B) 0.25 ml/min

에서 분석하였다 조건은 표 에 나타냈다gradient system . Gradient 1 .

(4) P 에서 검량선을 작성하기 위하여lasma blank rat plasma 90 lμ 에

은 농도가 가genipin 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ng/ml

되도록 씩 각각 첨가하고 과 똑같이 전처리한 후 로10 L sample LC-MSμ

분석하였다 검량선은 내부표준물질의 면적에 대한 의 면적비. peak genipin

세부과제2-1 11111111////82828282


와 농도에 대해서 작성genipin 하였다. 도Geniposide blank rat plasma 90

lμ 에 농도가 가 되도록5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ng/ml

10 lμ 씩 각각 첨가하고 과 똑같이 전처리한 후 로 분석하였sample LC-MS

다 검량선은 내부표준물질의 면적에 대한 의 면적비와. peak geniposide

농도에 대해서 작성geniposide 하였다.

에서 검량선을 작성하기 위하여(5) Feces blank rat feces 450 lμ 에

는 농도가 가 되도록geniposide 5, 10, 20, 100, 200, 5000, 10000 ng/ml

50 lμ 씩 첨가하고 은 농도가genipin 20, 100, 200, 500, 1000, 2000,

가 되도록5000 ng/ml 50 lμ 씩 첨가하고 과 똑같이 전처리한 후sample

로 분석LC-MS 하였다 검량선은 내부표준물질의 면적에 대한 약물의. peak

면적비와 농도에 대해서 작성하였다.

나 치자 색소 원료 중 의 함량 측정나 치자 색소 원료 중 의 함량 측정나 치자 색소 원료 중 의 함량 측정나 치자 색소 원료 중 의 함량 측정. geniposide. geniposide. geniposide. geniposide

확립된 분석법을 이용하여 치자 색소 원료 중의(1) LC-MS/MS geniposide

의 함량을 측정하였다.

측정된 함량을 기준으로 실험동물에서의 투여량을 산정(2) 하였다.

다 항생제 처리 모델에서의 치자 색소 원료 투여 실험다 항생제 처리 모델에서의 치자 색소 원료 투여 실험다 항생제 처리 모델에서의 치자 색소 원료 투여 실험다 항생제 처리 모델에서의 치자 색소 원료 투여 실험. (geniposide). (geniposide). (geniposide). (geniposide)

실험용 쥐 주령 에 항생제 혼합액(1) (8 ) cefadroxyl (100 mg/kg),

및 을 일간 일terramycin (300 mg/kg) erythromycin (300 mg/kg) 3 1

회 투여하여 항생제 처리 모델을 확립1 하였다.

항생제 투여 일후에 용량으로 원료를 실험용 쥐(2) 2 300 mg/kg geniposide

에 경구 투여하였다.

혈장은 경동맥에 를 하여 를 통해 채취(3) PE-50 tube cannulation tube 하였

다.

세부과제2-1 12121212////82828282


대조군과 항생제 처리군에서 약동력학 프로파일을 비교하여 장내 미생물이(4)

약물 대사에 미치는 영향을 연구하였다.

는 장내에서 직접 흡수되지 않다고 알려졌고 미생물에 의해(5) Geniposide

으로 대사된 후 흡수되며 체내에서 대부분 대사되어genipin genipin

로 존재한다고genipin-sulfate 알려져 있다. 따라서 혈장 중의 을 분genipin

석하고자 아래와 같은 전처리를 하였다 에. Plasma sample 100 Lμ

sulfatase 50 lμ 넣은후 에서, ascrobic acid (125 mg/mL) 20 L 37°Cμ

분 반응30 시켰다. 분후 내부표준물질30 (2 g/ml, luteolin) 10μ lμ 넣고

넣은 후 진행한 후 에서 분ethyl acetate 0.5 ml vortexing 13000 rpm 5

간 원심분리 시키고 상층액을 N2 를 이용하여 휘발gas 시켰다. 남은 잔사에

50% methanol 100 lμ 을 가하여 용해한 후 LC-MS를 이용하여 5 lμ 를

주입하여 분석하였다.

를 분석하기위하여 에 내부표준물질(6) Geniposide plasma sample 50 l (1μ

을 넣고 를 진행하고g/ml digoxin) 5 l solid phase exetration (SPE)μ μ

용매를 에서50°C N2 로 증발시킨후 남은 잔사에gas 50% MeOH 100 lμ

넣고 을 진행한 후 에서 분간 원심분리 시키고 상층액vortexing 13000rpm 5

을 을 이용하여 를 주입하여 분석하였다LC-MS 5 l .μ

에서 약물을 분석하기 위하여 에 내부표준물질(7) Feces feces 500 l (10μ

을 넣고 를 진행하고ug/ml digoxin) 20 l solid phase exetration (SPE)μ

용매를 에서50°C N2 로 증발시킨 후 남은 잔사에gas 50% MeOH 100 μ

넣고 을 진행한 후 에서 분간 원심분리 시키고 상l vortexing 13000 rpm 5

층액을 을 이용하여 를 주입하여 분석하였다LC-MS 5 l .μ

표 1. LC gradient program

세부과제2-1 13131313////82828282


Time (min) A(%) B(%) Flow rate (ml/min)

0 90 10 0.25

1.0 10 90 0.25

4.0 10 90 0.25

4.1 90 10 0.25

8.0 90 10 0.25

의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구3) Pseudo germ-free rat model3) Pseudo germ-free rat model3) Pseudo germ-free rat model3) Pseudo germ-free rat model

가 를 이용한 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법 개발가 를 이용한 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법 개발가 를 이용한 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법 개발가 를 이용한 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법 개발. LC-MS/MS. LC-MS/MS. LC-MS/MS. LC-MS/MS

표준 물질표준 물질표준 물질표준 물질(1)(1)(1)(1)

acetaminophen (APAP), 3-cysteinylacetaminophen (APAP-Cys),

3-methoxy acetaminophen (APAP-OMe), 3-methoxy acetaminophen

(APAP-OMe), acetaminophen glutathione (APAP-Glth),

4-acetamidophenyl-beta-D-glucuronide (APAP-Glc),

4-acetaminophen sulfate (APAP-Sul),

등이며3-(N-acetyl-L-cystein-S-yl) acetaminophen (APAP-NAC)

내부표준물질로 acetaminophen-d4 (APAP-d4),

4-acetamidophenyl-beta-D-glucuronide-d3 (APAP-Glc-d3 등을 사)

용하였다. 표준물질은 농도가 이 되도록 메탄올에 용해하여1000 g, Lμ

을 만들고 이 용액을 적정 농도로 희석하여 정량 분석하는데stock solution ,

사용하였다.

기기분석조건기기분석조건기기분석조건기기분석조건(2)(2)(2)(2)

모든 은samples API 3200™ 을 이용하여 로 분석하system LC-MS/MS

고 이때 사용한, 컬럼은 Capcell Pak C18 MG II (2.0 × 150 mm, 5 um,

이며Shiseido, Japan) , 유속은 300 μ 이었고 주입량은L/mL , 5 μ 로 분L

석하였다. 이동상 조건은 A (0.1% formic acid in 5% acetonitrile) and

으로B (0.1% formic acid in 95% acetonitrile) 0-8 까지 를min A

에서100% 20 로 시키고% gradient 9 까지min A 20 로 유지 시킨 후%

세부과제2-1 14141414////82828282


9.5 까지 로 바꾼 뒤 다음 시료를 찍기 전에min A 100% 6.5 간 유지min

시켰다.

분석물질 및 조건분석물질 및 조건분석물질 및 조건분석물질 및 조건(3) MS/MS(3) MS/MS(3) MS/MS(3) MS/MS

혈장 및 뇨 중 와 그 대사체들을 에APAP electrospray ionization LC/MS

서 분석하기 위하여 와 그 대사체들의 이온화를 위한 조건을 확립하APAP

고 을 규명함 이때 선정한 와 그때의MS/MS fragment pattern . compounds

조건은 다음의 표 에 나타내었으MRM (multiple reaction monitoring) 2

며 이 조건으로 모든 시료를 분석함 이때 몇몇 대사체들에 있어서, .

에서 감도가 월등히 높은 이유로 보다 한 분석을negative mode sensitive

위해 두 가지 모드로 분석을 진행함 분석을 위한 조건은 다음의 표. MS 3

에 나타내었다.

표 분석물질의 의 선택된 분자 이온의 정보2. LC/MS

Ionization modeIonization modeIonization modeIonization mode Parent ionParent ionParent ionParent ion Product ionProduct ionProduct ionProduct ion

APAPAPAPAPAPAPAP Pos 152.116 110.000

APAP-OMeAPAP-OMeAPAP-OMeAPAP-OMe Pos 182.136 108.100

APAP-d4 (IS)APAP-d4 (IS)APAP-d4 (IS)APAP-d4 (IS) Pos 156.151 114.100

APAP-GlcAPAP-GlcAPAP-GlcAPAP-Glc Neg 326.070 149.900

APAP-SulAPAP-SulAPAP-SulAPAP-Sul Neg 229.943 150.000

APAP-NACAPAP-NACAPAP-NACAPAP-NAC Neg 311.043 182.000

APAP-CysAPAP-CysAPAP-CysAPAP-Cys Neg 268.978 182.000

APAP-GlthAPAP-GlthAPAP-GlthAPAP-Glth Neg 455.091 182.000

APAP-Glc-d3 (IS)APAP-Glc-d3 (IS)APAP-Glc-d3 (IS)APAP-Glc-d3 (IS) Neg 329.058 152.900

세부과제2-1 15151515////82828282


그림 아세트아미노펜 및 대사체의 크로마토그램1. LC

표 아세트아미노펜 및 대사체 분석을 위한 조건3. MS

Ionization mode　 Positive mode Negative mode

Acquisition mode SRM

CUR (psi) 35

IS (V) 5000 -4500

TEM ( )℃ 500

GS1 (psi) 60

GS2 (psi) 60

CAD 5

세부과제2-1 16161616////82828282


나 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법나 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법나 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법나 아세트아미노펜 및 대사체 분석기법. validation. validation. validation. validation

(1) Linearity(1) Linearity(1) Linearity(1) Linearity

분석물질과 내부표준물질의 비율로 calibration 를 그리고 이때의curve

을squares linear regression weighting factor (1/x2 를 주어 를) linearity

구하였다.

(2) Precision and accuracy(2) Precision and accuracy(2) Precision and accuracy(2) Precision and accuracy

분석법의 정확성 및 정밀성을 평가하기 위해서 최저정량한계 및 저농도 중,

간농도 고농도를 대표하는 세 가지 퀄리티컨트를 샘플에 대해서 반복적으로,

분석하여 하루에 번 각기 다른 일간 의Intra-day( 5 ), Inter-day( 5 )

를 구하였다precision and accuracy .

회수율과회수율과회수율과회수율과(3) matrix effect(3) matrix effect(3) matrix effect(3) matrix effect

분석물질의 회수율을 평가하기 위해서 생체시료에 분석물질을 가한 후 추출

하여 얻어진 검출 값과 기지 농도의 순수 표준물질의 검출 값을 비교하였으

며 를 평가하기 위해서 생체시료에서의 분석물질의 검출 값과, matrix effect

에서의 분석물질의 검출값을 비교하였다neat solution .

안정성안정성안정성안정성(4)(4)(4)(4)

생체시료중의 약물의 안정성을 평가하기위해서 장기보관 설정된 보관온도(

에서 냉동 에서 주간보관 과 단기보관 실험대위 실온에서 시간, -80 4 ) ( , 6℃

보관 한 후 및 냉 해동 주기 에서 시간 보관 후 완전해동 를 거) · (-80 24 )℃

친 후의 안정성 및 의 안정성 실온에서 시간 보관 전처리stock solution ( 6 ),

후 안정성 에서 시간보관 에 대해서 샘플을 채취하고 취급하는 동안(4 24 )℃

분석물질의 안정성과 분석하는 동안 분석물질의 안정성에 대해 평가하였다.

다 항생제처리모델에서의 아세트아미노펜 투여 및 샘플처리다 항생제처리모델에서의 아세트아미노펜 투여 및 샘플처리다 항생제처리모델에서의 아세트아미노펜 투여 및 샘플처리다 항생제처리모델에서의 아세트아미노펜 투여 및 샘플처리....

실험 동물모델의 응용실험 동물모델의 응용실험 동물모델의 응용실험 동물모델의 응용(1)(1)(1)(1)

을 사용하여 실험기간동안 물과Sprague-Dawley(SD) rat (240±10 g) ,

세부과제2-1 17171717////82828282


사료는 자유로이 공급하고 사육실내의 온도는 습도는, 23±2 °C, 55 ±10

로 유지하였다 실험동물은 군으로 나누고 한 군은 정상 대조군으로 정하% . 2

여 증류수를 투여하고 대조군 은 정상 쥐에게( ), pseudo germ-free rats

bacitracin(200 mg/kg), neomycin(200 mg/kg), streptomycin(200

용량으로 증류수에 녹인 항생제 혼합액을 하루 두 번 총 일간 경mg/kg) , 5

구 투여하여 완성하였다 항생제 처리군. ( , pseudo germ-free group)

수술 도구 및 시약수술 도구 및 시약수술 도구 및 시약수술 도구 및 시약(2)(2)(2)(2)

수술 도구로는 수술용 가위 핀셋 포셉 수술용 봉합사 수술용 바늘, , , , ,

튜브 주사기SP-45 , autoclavable low profile button/tether assembly, ,

수술대 등을 사용함 시약은 생리 식염수 주사용 헤파린 용액 마취, . , 100 U ,

제 등을 사용하였다(zoletil:rompun (2:1) mix) .

수술 방법수술 방법수술 방법수술 방법(3)(3)(3)(3)

실험동물은 마취제를 복강 투여하여 마취한 후 수술대에 고정하고 좌측 쇄,

골 유첨근 위를 가량 절개하고 핀셋으로 경동맥을 분리하여 들어 올린1cm

후 위쪽과 아래쪽에 각각 봉합사를 걸쳐 놓았다 튜브는 주사. SP-45 1 ml

기와 연결한 후 헤파린을 채워 준비100 U/ml 하였다 바늘을 사용하. 25G

여 혈관에 구멍을 내고 준비된 튜브를 심장방향으로 삽입한 후 봉, SP-45

합사로 위쪽과 아래쪽을 걸쳐 둔 봉합사로 묶어서 고정하였다. 고정된

튜브는 튜브 유도관을 통해 등 뒤쪽까지 뽑아내고SP-45 autoclavable

에 연결하여 보호하였다low profile button/tether assembly .

아세트아미노펜의 체내동태 연구아세트아미노펜의 체내동태 연구아세트아미노펜의 체내동태 연구아세트아미노펜의 체내동태 연구(4)(4)(4)(4)

아세트아미노펜은 에 용해한 후 용량으로 경구 투여50% PEG 200 mg/kg

하였다 채혈은 경구 투여 후 분 시. 0, 5, 15, 30, 60, 90 , 2, 4, 8, 12, 24

간에 이상 취하고 에서 분간 원심 분리하여200 l , 14000 rpm 3 plasmaμ

를 를 취하였다 는 전까지 에서100 l . plasma sample preparation 80μ ℃

보관하였다 채뇨는 경구 투여 후 시간 간격으로. 0, 0-8, 8-24, 24-30

취하고 각 시간별 양을 기록하였다, .

시료의 전처리시료의 전처리시료의 전처리시료의 전처리(5)(5)(5)(5)

세부과제2-1 18181818////82828282


내부 표준물질은 APAP-d4 (acetaminophen-d4, 10 g/mlμ ),

APAP-Glc-d3 (acetaminophen -glucuronide-d3, 10 g/mlμ 의 혼합액)

을 사용하였다. 의 경우Plasma , 100 lμ 에 내부표준물질 혼합액을 20 lμ 씩

가하여 혼합한 후 을methanol 200 lμ 씩 가하고 을 충분히 하여vortexing

혈장단백질을 제거하였다 에서 분간 원심 분리하여 상층액을. 14000 rpm 10

200 lμ 취하여 질소가스 하에서 건조시키고 분석 전까지 20 ℃에서 보관

하였다. 분석을 실시하기 직전에 50% methanol 100 lμ 으로 재조정하였

다 뇨. 의 경우, 100 lμ 에 내부표준물질 혼합액을 20 lμ 씩 가하여 혼합한

후 을methanol 180 lμ 씩 가하고 을 충분히 하여 혈장단백질을vortexing

제거하였다. 에서 분간 원심 분리하여 상층액을14000 rpm 15 150 lμ 취하

여 기계에 적용하였다.

의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구4) Germ-free mouse model4) Germ-free mouse model4) Germ-free mouse model4) Germ-free mouse model

세부연구에서 정상대조군 무균동물군 정착동물군1-3 (SPF), (Germ-free),

군에 에 녹인 아세트아미노펜을 와(Gnotobiota) 50% PEG400 200 mg/kg

로 투여한 후 시간에 채혈하여 혈장을 분리하였고 혈300 mg/kg 1, 2, 6, 24 ,

장에 대한 분석은 에서의 아세트아미노‘(3) Pseudo germ-free rat model

펜의 대사변화 연구 에서 기술한 방법과 동일한 방법으로 진행하였다’ .

장내미생물에 의한 내인성 대사체 변화 연구장내미생물에 의한 내인성 대사체 변화 연구장내미생물에 의한 내인성 대사체 변화 연구장내미생물에 의한 내인성 대사체 변화 연구5)5)5)5)

가 장내 미생물에 의한 내인성 대사체 변화 검출을 위하가 장내 미생물에 의한 내인성 대사체 변화 검출을 위하가 장내 미생물에 의한 내인성 대사체 변화 검출을 위하가 장내 미생물에 의한 내인성 대사체 변화 검출을 위하. global metabolomic. global metabolomic. global metabolomic. global metabolomic

profilingprofilingprofilingprofiling

시료 전처리 방법시료 전처리 방법시료 전처리 방법시료 전처리 방법(1)(1)(1)(1)

채취한 뇨 시료를 원심 분리하여 불순물을 제거하였다 상등액 를 취하. 100 lμ

여 증류수 를 가하여 희석하였다 희석된 뇨 시료 를200 l . 5 l UPLC (ultraμ μ

performance liquic chromatography)-QTOF (Quotrople time of

세부과제2-1 19191919////82828282


에 주입하여 분석하였다flight)-MS (mass spectrometry) .

기기분석 조건기기분석 조건기기분석 조건기기분석 조건(2)(2)(2)(2)

분석기기는 에 로 연결된UPLC (Waters) direct interface Synapt G2

를 사용하였다 데이타 검출은 질량분석기의 와(Waters) . positive ionization

에서 각각 진행하였다 은negative ionization . Capillary voltage 3.2 kV

이었고 은(positive ionization), 2.5 kV (negative ionization) , cone voltage

이었으며 와 의 흐름은 각각 와40 V , desolvation gas cone gas 600 L/h 100

이었다 는 를 유지하였고L/h . Source temperature 120 , dissolution℃

는 로 하였다 을 로 사용하여temperature 350 . leucine enkephalin lockmass℃

검출된 질량 값을 보정하였다 질량 스펙트럼 데이터는 분리된 두 개의 채널에.

서 수집되었는데 한 채널에서는 낮은 을 사용하여, collision energy parent

의 질량 값이 수집되고 다른 한 채널에서는 높은 을 사용ion , collision energy

하여 조각이온의 질량 값이 수집되었다 두 채널은 빠른 시간동안 번갈라 가면.

서 질량 값을 수집하여 한 파크에 대해서 모이온과 조각이온의 질량 값을 동시

에 확인할 수 있었다 컬럼은. LC Acquity UPLC HSS T3 column

을 사용하였으며 컬럼 온도는 유속(2.1×100 : particle size :1.8 m) 40 ,μ ℃

은 으로 흘려주었다 이동상으로는 가 함유된400 l/min . 0.1% formic acidμ

아세토나이트릴 과 가 함유된 아세토나이트릴1% (A) 0.1% formic acid 99 %

을 사용하였으며 이동상 에서 로 분간 을 주어서 분석하였(B) A B 12 gradient

다.

다변량 분석 과 검색다변량 분석 과 검색다변량 분석 과 검색다변량 분석 과 검색(3) Multivariate analysis ( ) data base(3) Multivariate analysis ( ) data base(3) Multivariate analysis ( ) data base(3) Multivariate analysis ( ) data base

모든 시료표본에서 얻어진 질량분석 데이터를 데이터 분석 프로그램인

에 적용하여 시료표본의 모든MarkerLynx XS (version 4.1, Waters, USA)

피크는 머무름 시간 질량 대 전하 비율 로 표시하고 각 피크의 이온_ (RT_m/z) ,

강도는 면적 값으로 표시하였다 시료표본마다 프로파일링 된 모든 피크의 이.

온 강도의 합으로 개별 피크의 이온강도를 표준화하였다 장내 미생물이 아닌.

투여된 항생제 및 그 대사체가 및 가 영향을 미치는 것을 피하PLS-DA HCA

기 위하여 분자량 및 그 대사체인 분자량streptomycin ( : 581) sterptidine ( :

과 분자량 분자량 의 분자량에 해당262) neomycin ( : 614), bacitracin( : 1422)

세부과제2-1 20202020////82828282


하는 값을 다변량 분석을 진행하기 전에 제거하였다 각 시료의 피크값을m/z .

을 적용하여 직교부분최소EZinfo software (Umetrics Inc., ume, Sweden)

자승판별 분석(orthogonal partial square discrimination analysis;

을 진행하였다 에서OPLS-DA) . OPLS-DA VIP(variable importance plot)

차트는 모든 피크들을 관련성이 높은 순서대로 정렬하여 작성하고 는, S-plot

피크들이 각 그룹에서의 신뢰도와 기여도에 따라서 좌표평면에 표시하여 작성

하였다 유의한 값으로 인정되는 피크는 이상의 값을 갖으면서 각 그룹. 1.5 VIP

에서 신뢰도와 기여도가 높은 피크들로 선별하였다 선별된 피크들은 모이온의.

질량값을 이용하여 등 다Human metabolome database, lipidomap, KEGG,

양한 데이터 베이스((Human metabolome: www.metabolomics.ca, Chemical

Entities of Biological Interest: www.ebi.ac.uk/Databases/,

MassBlank.jp-High Resolution Mass Spectral Database

:www.massbank.jp/index.html), Scripps Center for Mass spectrometry:

massspec.scripps.edu/index.php, LIPID MAPS-LIPID Metabolites and

에서 해당 대사체들을 찾고 조각이온Pathways Strategy: www.lipidmap.org)

의 질량 값을 비교하여 대사체들을 확정하였다 이들 대사체들에 대해서 유의.

적 차이는 스튜던트 를 실시하여 검증하였다t-test .

나 분석시스템의 안정화와 분석법의 재현성 확인나 분석시스템의 안정화와 분석법의 재현성 확인나 분석시스템의 안정화와 분석법의 재현성 확인나 분석시스템의 안정화와 분석법의 재현성 확인....

표본의 제작표본의 제작표본의 제작표본의 제작(1) QC(1) QC(1) QC(1) QC

표본은 각각의 모든 뇨 시료에서 씩 취하여 혼합하여 제작하였다QC 100 l .μ

모든 시료의 정보를 담고 있으므로 분석 방법 확립과 안정성 재현성 확인에,

사용된다 표본의 전처리 방법은 뇨 시료와 같은 방법으로 진행하였다. QC .

테스트믹스의 제작테스트믹스의 제작테스트믹스의 제작테스트믹스의 제작(2)(2)(2)(2)

테스트믹스는 모드에서는 표본에 아세트아미노펜 카positive ionization QC ,

페인 등을 가하여 제작하였고 모드에서는, reserpine , negative ionization

등을 가하여 제작하였다hippuric acid, glycocholic acid, adipic acid, .

세부과제2-1 21212121////82828282


분석 방법의 재현성과 안정성 확보분석 방법의 재현성과 안정성 확보분석 방법의 재현성과 안정성 확보분석 방법의 재현성과 안정성 확보(3)(3)(3)(3)

시료 분석 전에 또한 표본에 대해 회 분석을 진행하여 분석 시스템을QC 10

안정화하였다 시료 분석에서는 표본을 개의 시료마다 분석을 진행하였. QC 10

고 테스트믹스는 시료분석 시작 중간 끝 세 번 분석을 진행하였다 모든, , , , . QC

표본과 시료들에서 얻은 피크 변동값에 대해서 주성분 분석(principal

을 실시하여 도출된 에서 모든 표component analysis; PCA) score plot QC

본의 위치를 확인하였다 주성분 분석의 에서 가까이 위치할수록 개. score plot

체가 갖는 변동값이 유사함을 나타내기 때문에 주성분 분석의 에서, score plot

모든 표본의 위치를 확인하여 분석방법의 재현성을 확인하였다QC .

연구개발 결과연구개발 결과연구개발 결과연구개발 결과4.4.4.4.

차년도차년도차년도차년도(1) 1(1) 1(1) 1(1) 1

최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인최신분석기법을 활용 약물대사체 분석법 개발 및 대사체 구조 확인1)1)1)1)

을 을 사용하여 배양 후 생성된 대사체는- Hesperitin rat liver microsome

각각 과 대사체로 추정되는 대사체demethyltion hydroxylation 를 확인하였

다. MSn의 분석 결과 이 대사체는 이2-methoxyphenol group

된 대사체 생성되었다demethylation .

분석법 에서 이온을 생- Amaranth : ESI-MS positive ion mode m/z 539

성 을 규명하기 위해. CID fragmentation pattern MSn의 분석결과 m/z 521

의 과 가 탈락된 과 이온이 생성되었다dehydroxylation sulfate m/z 457 375 .

항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구항생제처리 동물모델에서 대사체 및 프로파일링 연구2)2)2)2)

항생체 처리 모델에서의 총 의 체내동태파라미터는 대조군의- hesperetin

가 항생제 처리군보다 약 배가량 높았다 는 정상군에서는AUC 3 . Cmax 578

세부과제2-1 22222222////82828282


ng/ml, 항생제 처리군에서는 로 정상군에서 더 높게 나타났다198 ng/ml .

혈청시료 중 의 분석법을 확립하였다 내부표준물질을- hesperetin .

으로 하고 에서 양호한 직선성을 나타내었다terfenadine 2-1000 ng/ml .

장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 연구장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 연구장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 연구장내 미생물에 의한 내인성 변화검출을 위한 연구3) global metabolic profiling3) global metabolic profiling3) global metabolic profiling3) global metabolic profiling

항생제 처리 전 후의 뇨를 로 분석하여 의- rat UPLC-TOF-MS PLS-DA 3

차원 을 분석한 결과 뚜렷한 두 군의 이 구별되어 두score plot clustering

군 사이에 대사의 변화가 관찰되었다 그림( 2) 이 의 분석결과 각. data base

값에 해당하는 물질로 추정되는 대사체를 검출할 수 있었다m/z .

결과로부터 좀 더 신뢰성 있는 대사체 검출을 위하여 값을- PLS-DA VIP

고찰하였을 때 그 값이 이상인 값을 분석하여 를 수행하고 추정 대, 1.3 HCA

사체를 확인한 결과 그림( 3) 량이 항생제 전, amino acid, sterol, steroid

후에 감소하거나 증가하여 이 대사체들이 영향을 받는 대사체 군임을 확인하

였다 표( 4).

세부과제2-1 23232323////82828282


그림 항생제 처리 전후의 뇨 중 대사체 중 농도 변화가 관찰된3. peaks

에 대한peaks HCA

세부과제2-1 24242424////82828282


표 항생제 투여 후 뇨에서 농도 변화가 예측되는 대사체 후보들4.

뇨 중 농도 증가가 예측되는 대사체 후보들a.

M+H Compound Category

118 Valine Amino acids

162 Aminoadipic acid Amino acids

271 Estrone Steroids

273 17 -estradiol (17 -E2)β β Steroids

11 -OH-etiocholanoloneβ

11 -OH-androsteroneβ

7 -OH-Androstenediolα

307 4 -OH-DHEAα Steroids

11 -OH-Androstenediolβ

16 -OH-Androstenediolβ

16 -OH-Androstenediolα

315 16-Dehydropregnenolone Steroids

Progesterone

361 Cortisone Steroids

5 -cholanic acidα Bile acid

Ursocholic acid Bile acid

　 Lithocholic acid Bile acid

377 18-Oxocortisol Steroids

3 -Hydroxy-5 -cholan-24-oicα β

AcidBile acid

　 Murocholic acid 　

5 -Cholanic acid-3b,12 -diolβ α

393 Chenodeoxycholic acid Bile acid

Deoxycholic acid

Ursodeoxycholic acid

401 7-keto-cholestanol Sterol

　 7 -Hydroxycholest-4-en-3-oneα Bile acid

세부과제2-1 25252525////82828282


뇨 중 농도 감소가 예측되는 대사체 후보들b.

M+H Compounds Category

133

Ureidopropionic acid

Amino acidL-Asparagine

Ornithine

1703-Methylhistidine

Amino acid2-Furoylglycine

271 Estrone Steroids

365Tetrahydrocortisone

SteroidsDihydrocortisol

419

5-Cholesten-3 ,17 ,20 -triolβ α α Steroids

Dihydroxycholesterol Sterol

cholestan-6-oxo-3,5-diol Sterol

412 6 -hydroxycholestanolα Sterol

및 의 에서의 독성 평가및 의 에서의 독성 평가및 의 에서의 독성 평가및 의 에서의 독성 평가4) Geniposide Genipin precision-cut small intestine slice4) Geniposide Genipin precision-cut small intestine slice4) Geniposide Genipin precision-cut small intestine slice4) Geniposide Genipin precision-cut small intestine slice

방법의 확립 연구방법의 확립 연구방법의 확립 연구방법의 확립 연구

을 이용한 독성평가 방법의 확립하기 위하여- Percision-cut small intestine

소장을 의 로 만들어 배지에서 배양하였다rat 250 um slice William E .

배양시간에 따른- Na+/K+ ATPase, NADPH oxidase, alkakine

의 활성을 비교하여 에서 와 의phosphatase 2 hr, 6 hr geniposide genipin

영향을 비교하였다.

는 에서 농도에서- Geniposide 6 hr 10-100 uM Na+/K+ ATPase, alkakine

의 활성이 감소됨이 관찰되어 독성을 나타내는 것으로 확인하였phosphatase

다 이에 비해 은 에서 현저한 활성을 나타내지 않았다. genipin 6 hr .

과 의 분석법을 개발하였다 내부표준물질은- Genipin geniposide HLPC .

으로 하고 는 로 은methyl paraben geniposide n-butanol , genipin ethyl

로 추출하여 정량분석 하였다acetate .

세부과제2-1 26262626////82828282


차년도차년도차년도차년도(1) 2(1) 2(1) 2(1) 2

항생제 투여에 의한 의 대사변화를 위한 대사체 연구항생제 투여에 의한 의 대사변화를 위한 대사체 연구항생제 투여에 의한 의 대사변화를 위한 대사체 연구항생제 투여에 의한 의 대사변화를 위한 대사체 연구1) germ free rat model1) germ free rat model1) germ free rat model1) germ free rat model

으로 내인성대사체의 변화확인- Global metabolic profiling

항생제 처리로 변화가 예상되는 대사체의 표준품에 대해 UPLC-TOF-MS

의 상에서 과 를 확인하고 그림chromatogram retention time peak ( 4 이),

를 뇨 중 대사체 과 비교하여 항생제 처리에 의해 감소하는 대사체profile 2

가지 과 를 확정하였다 장내미생(5 -dihydrocortisol 3-methylhistidine) .β

물이 존재하지 않았을 때의 뇨에서 의 농도가 감소함을5 -dihydrocortisolβ

확인함으로써 에 관여하는 농도가 감소하였음을glucogenesis glucocorticoid

예측할 수 있었다 또한 의 뇨 중 농도 감소를 확인함으로. 3-methylhistidine

써 질소의 장간 내 순환이 영향을 받아 근육단백질의 분해가 감소하였을 것

으로 예상할 수 있었다.

그림 뇨 시료 중 대사체 와 표준품 와의 비교4. peak peak

세부과제2-1 27272727////82828282


정량분석에 의한 항생제 처리 전후의 뇨 중 과 담즙산의 농도 비교- oxysterol

시료 중 과 담즙산의 농도는 각 물질의 와oxysterol integrated peak area

주입한 internal standards (5 -cholestane, dα 4 의-cholic acid)

와 비교하여 정량화하였고 그 결과는 표 에 정리하였integrated peak area 5

다.

표 항생제 처리 전 후의 담즙산과 의 뇨 중 농도5. oxysterol

(ng/mg of creatinine)

CompoundsNormal control Antibiotic treated

Mean± SD Mean± SD

7 -OH-cholesterolα 53.56±22.18 63.40±36.47

7 -OH-4-cholesten-3oneα 120.46±67.83 166.69±140.41

7-keto-cholesterol 13.76±2.94 18.70±9.73

22(R)-OH-cholesterol 7386.15±2360.235661.41±1606.1

0

24S-OH-cholesterol N/D N/D

25-OH-cholesterol 106.73±34.92 70.62±33.82*

Cholesterol 4008.03±1592.702866.83±1271.6

7*

Deoxycholic acid (DCA) 46.27±18.30 29.84±14.35*

-Muricholic acid ( -MCA)α α 118.11±30.75 139.63±63.87

Chenodeoxycholic acid (CDCA) 94.96±20.28 158.98±111.33*

Cholic acid (CA) 55.10±17.04 79.66±57.85

Ursodeoxycholic acid (UDCA) 67.37±12.00 75.01±45.29

Lithocholic acid (LCA) N/D N/D

-Muricholic acid ( -MCA)β β 53.91±13.58 74.43±43.61

5 -cholestane 3 ,7 ,12β α α α

-triol47.58±10.16 77.73±51.49*

*: 0.05 between normal control and antibiotic treated group≤

N/D : not detected

세부과제2-1 28282828////82828282


에서 아세트아미노펜의 대사변화 연구에서 아세트아미노펜의 대사변화 연구에서 아세트아미노펜의 대사변화 연구에서 아세트아미노펜의 대사변화 연구2) Pseudo germ-free rat model2) Pseudo germ-free rat model2) Pseudo germ-free rat model2) Pseudo germ-free rat model

혈장 및 뇨 중 아세트아미노펜과 그 대사체들 그림 를( 5) electrospray

에서 분석하기 위하여 와 그 대사체들의 이온화를 위ionization LC/MS APAP

한 조건을 확립하고 을 규명하였다MS/MS fragment pattern .

NH

HO

O

NH

O

OHO3S

NH

O

O

O

OH

OHHO

COOH

O N

O

NH

HO

O

S

HN

OHOOC

NH2HN

HOOC

O

NH

HO

O

S

H2N

HOO

NH

HO

O

HS

NH

HO

O

S

HN

HOO

O

NH

HO

O

HO

NH

HO

O

H3CO

APAP-sulfate

APAP-glucuronide

NAPQI

APAP-glutathione

3-CH3O-APAP

APAP-Cys

3-Mercaptoacetaminophen

3-OH-APAP

APAP

APAP-NAC

그림 아세트아미노펜의 체내대사과정5.

이때 선정한 와 그때의 조compounds MRM (multiple reaction monitoring)

건은 다음의 표 에 나타내었으며 이 조건으로 모든 시료를 분석하였다 이2 , .

때 몇몇 대사체들에 있어서 에서 감도가 월등히 높은 이유로negative mode

보다 한 분석을 위해 두 가지 모드로 분석을 진행하였다sensitive .

군에서 모약물인 와 를 제외한 대사Pseudo germ-free APAP , APAP-Sul

체 모두에서 반감기AUC, (T1/2 가 증가하고 와 분포용적) clearance (Cl/F)

은 감소하는 경향을 보여 약효가 오래 지속될 수 있음이 관찰되었다(Vd/F) .

의 경우 실험한 두 군에서의 반감기APAP-Sul (T1/2 는 거의 비슷하였으나)

는 다른 대사체의 경우와 같이 항생제 처리군에서 증가하였으며AUC

도 감소하였다 그러나 통계적으로 유의적인 차이는 확인할clearance (Cl/F) .

수 없었으며 개체 간 차이가 크게 남을 확인하였다, .

세부과제2-1 29292929////82828282


에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구에서의 아세트아미노팬의 대사변화 연구3) Germ-free mouse3) Germ-free mouse3) Germ-free mouse3) Germ-free mouse

정착동물 무균동물 에서 대조군에 비하여(Gnotobiota), (Germ-free) APAP

및 의 농도가 증가하는 경향을 보였으나 에서는 약물APAP-OMe APAP-Cys

투여 초기에는 그 농도가 정착동물 무균동물 에서(Gnotobiota), (Germ-free)

감소하다 투여 후 시간 이후에는 증가하여 일관된 결과를 보이지APAP 10

않았으며 의 경우 약물 투여 초기에만 그 농도가 검출되었고APAP

이외의 다른 대사체는 분석 감도에 도달하지 못하였APAP-OMe, APAP-Cys

다. 따라서 분석 감도를 증가시키는 분석 방법을 재확립하고 각 그룹의 개체수

를 증가하여 실험을 재 진행하였다.

장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향장내미생물 대사가 의 체내동태에 미치는 영향4) ginsenoside4) ginsenoside4) ginsenoside4) ginsenoside

모든 에서 인 가 검출되었고 일- mouse parent compound ginsenoside Re ,

부 에서 그 대사체인 과 가 검출되mouse ginsenoside Rg1 ginsenoside Rg2

었지만 그 외의 대사체는 검출 되지 않았다 용량으로 투여 시. Re 50 mg/kg

최고 혈중 농도는 평균 33 ng/ml, 는AUC 69.9 ng·hr/ml로 나타났다 반면.

에서는 최고 혈중농도 평균germ-free mouse 139 ng/ml, 202 ng·hr/ml

로 더 증가되어 의 흡수가 에서보다ginsenoside Re conventional mouse

에서 더 잘된 것으로 나타났다 그러나 두 그룹에서의germ-free mouse . ,

pharmacokinetic 에서 통계적인 유의성은 검증할 수 없었다parameter .

모델을 이용한 시험에서 의 를 투여하였을 때- Germ free rat 50 mg/kg Re

혈중농도나 대사 프로파일에서 정상군과의 특별한 차이를 보이지 않았다.

장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구장내미생물 대사가 의 대사에 미치는 영향연구5) baicalin5) baicalin5) baicalin5) baicalin

항생제 처리군과 대조군에 각각 을 용량으로 경구투여- baicalin 50 mg/kg

하고 혈장 내의 의 농도를 측정한 결과 는 대조군이 항생제 처리baicalin AUC

군보다 배 높았고 도 유의성 있게 차이가 보였다1.4 Tmax .

세부과제2-1 30303030////82828282


차년도차년도차년도차년도(3) 3(3) 3(3) 3(3) 3

1)1)1)1) 및 의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화및 의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화및 의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화및 의 투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화Esculetin EsculinEsculetin EsculinEsculetin EsculinEsculetin Esculin

의 머무름 시간은 이고 의 머무름 시간은- Esculetin 3.75 min , Esculin 3.28

이며 내부표준물질로 사용된 의 머무름 시간은 으min levafloxacin 3.98 min

로 검출되었다 과 의 투여 후 에서는 검출이. Esculin Esculetin blank plasma

되지 않은 이 검출되었는데 머무름 시peak 간은 투여 후 검출된Esculetin

은 투여 후 검출된 은 이었다 그림peak 3.30 min, Esculin peak 3.35 min ( 6)

과 의 검량선은 좋은 직선성을 나타내며 정량한계는- Esculetin Esculin 20

이었다 그림 표ng/ml ( 7, 6)

과 의 투여 후 에서는 검출되지 않았던- Esculetin Esculin blank plasma peak

이 검출되었다 그림( 8).

의 투여 후 에서 유의성 있는 차이는 보이지 않았으나- Esculetin AUC Esculin

의 투여 후 과 의 에서는 대조군과 항생제 처리군이 유Esculin Esculetin AUC

의성 있는 차이를 보였다 그림 표( 9, 7, 8).

투여 후 에서는- Esculetin pharmacokinetics parameter k(hr-¹), t1/2(hr)

이 대조군과 항생제 처리군에서 유의성 있는 차이를 보였고 투여 후Esculin

AUCINF, AUClast 에서 유의성 있는 차이를 보였다, CL/F .

의 투여 후 항생제 처리군에서 가 높았고 는 감소하였다 대- Esculin AUC CL/F .

사되어 나타난 에서 역시 가 항생제 처리군에서 더 높았다Esuletin AUC .

대조군과 항생제 처리군의 에서 차이를 나타내- pharmacokinetics parameter

는 것으로 보아 체내동태 영향을 주는 것으로 고려된다.

그림 6. MS spectrum of esculetin, esculin and levafloxacin

세부과제2-1 31313131////82828282


그림 에서7. SRM Chromatogram. (A)Blank plasma SRM Chromatogram

검량선의 에서의 의(B) 200 ng/ml Escelin, Esculetin SRM Chromatogram

의 경구 투여 후 분에서의(C) Esculetin 2 SRM Chromatogram (D) Esculin

의 경구 투여 후 분에서의2 SRM Chromatogram

세부과제2-1 32323232////82828282


그림 과 의 검량선8. Esculetin Esculin

표 과 의 과6. Esculetin Esculin Accuracy C.V.

Esculetin

(ng/mL)

Accuracy

(%)C.V.(%)

10 76.17 11.9820 89.22 7.7150 103.49 3.69100 109.83 1.93200 110.10 1.28500 107.80 1.131000 107.48 0.982000 101.83 4.773000 94.08 1.02

Esculin

(ng/mL)

Accuracy

(%)C.V.(%)

10 84.03 12.9820 92.24 4.9850 104.92 2.77100 107.97 1.99200 104.86 2.17500 103.32 1.321000 104.42 1.402000 102.17 6.763000 95.96 1.03

세부과제2-1 33333333////82828282


그림 의 경구 투여 후 의9. Esculetin Esculetin Time-Concentration curve

및 의metabolite ratios curve

표 의 투여 후 의7. Esculetin Esculetin Pharmacokinetic parameter

**P<0.005, *P<0.05

Esculetin Control Rat (n=5)Pseudo Germ-Free Rats

(n=5)

AUCINF(ng·hr/ml) 345.67±139.02 724.10±363.46

AUClast(ng·hr/ml) 339.68±136.72 692.66±384.66

Cmax(ng/ml) 1717.12±849.72 5715.90±3831.51

k(hr-¹) 2.60±1.17 5.52±0.92**

t1/2(hr) 0.31±0.13 0.13±0.02*

Tmax(hr) 0.07±0.06 0.053±0.03

세부과제2-1 34343434////82828282


그림 의 경구 투여 후 과 의10. Esculin Esculin(A) Esculetin(B)

및 의Time-Concentration curve metabolite ratios curve(C).

표 의 투여 후 의8. Esculin Esculin Pharmacokinetics parameter

**P<0.005, *P<0.05

Esculin Control Rat (n=5)Pseudo Germ-Free Rats

(n=5)

AUCINF(ng·hr/ml) 829.06±43.30 1061.41±50.90**

AUClast(ng·hr/ml) 820.75±41.11 1052.58±47.85**

Cmax(ng/ml) 1668.20±237.28 2402.68±747.18

k(hr-¹) 2.65±0.13 3.39±1.28

t1/2(hr) 0.26±0.01 0.23±0.08

Tmax(hr) 0.25±0.10 0.21±0.08

세부과제2-1 35353535////82828282


표 의 투여 후 의9. Esculin Esculetin Pharmacokinetics parameter

**P<0.005, *P<0.05

장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구2) geniposide2) geniposide2) geniposide2) geniposide

가 를 이용한 혈장시료 중가 를 이용한 혈장시료 중가 를 이용한 혈장시료 중가 를 이용한 혈장시료 중. LC/MS/MS. LC/MS/MS. LC/MS/MS. LC/MS/MS 와와와와geniposidegeniposidegeniposidegeniposide 의 정량분석법 개발의 정량분석법 개발의 정량분석법 개발의 정량분석법 개발genipingenipingenipingenipin

혈장 중Rat 와geniposide 을 분석하기 위하여genipin triple-quadrupole

를 이용한 분석법을 개발LC/MS/MS 하였다. 는 분자량이 로Geniposide 388.14

에서 가 검출되었으며negative ion mode molecular ion m/z 433.4 MS/MS

에서는 이 주요 으로 검출되었고product ion spectrum m/z225.1 fragment ion

은 가 검출되었으며genipin molecular ion m/z 225.2 MS/MS product ion

에서는 가 주요 으로 검출되었다 따라서spectrum m/z 101.2 fragment ion .

는 은 내부표geniposide m/z 433.4 225.1, genipin m/z 225.2 101.2,

준물질인 은 은luteolin m/z 285.2 133.1, digoxin 825.2 779.2

을 이용한 방법으로 를 검출하였다 그림transition MRM peak . ( 11, 12).

과 들은 각각의 머무름 시간Geiposide, Genipin internal standard 2.36, 2.54,

분 부근에서 검출되었고 위에서 기술한 검출조건에서 타 물질에 의2.79, 2.77

한 영향은 없었으며 우수한 를 나타냈다 그림selectivity ( 13, 14).

Esculetin Control Rat (n=5)Pseudo Germ-Free Rats

(n=5)

AUCINF(ng·hr/ml) 130.01±57.33 331.99±119.28*

AUClast(ng·hr/ml) 98.94±37.76 314.50±117.53*

k(hr-¹) 4.77±2.08 9.61±2.90*

t1/2(hr) 0.17±0.08 0.08±0.02

Tmax(hr) 0.23±0.12 0.21±0.08

세부과제2-1 36363636////82828282


나 치자 색소 원료 중 의 함량 측정나 치자 색소 원료 중 의 함량 측정나 치자 색소 원료 중 의 함량 측정나 치자 색소 원료 중 의 함량 측정. geniposdie. geniposdie. geniposdie. geniposdie

표준품 을 이용하여 치자 색소 원료 중Geniposide (Wako, Japan)

및 의 함량을 측정geniposide genipin 하였다 분석 결과. LC/MS/MS ,

의 함량은 은 로 측정geniposide 47%, genipin 3.1% 되었다 그림( 15).

다 항생제 처리 쥐에서의 의 약동력학 연구다 항생제 처리 쥐에서의 의 약동력학 연구다 항생제 처리 쥐에서의 의 약동력학 연구다 항생제 처리 쥐에서의 의 약동력학 연구. geniposide. geniposide. geniposide. geniposide

정상 쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 치자 색소 원료- (300 mg/kg

를 경구 투여한 후 혈장 중의 과 농도를 측geniposide) genipin geniposide

정하였다 를 경구투여 후 항생제 처리군과 대조군의 혈. Geniposide genipin

중농도는 그림 에 나타내었고 은 표 에 나16 pharmacokinetic parameter 8

타냈다 와. AUC Cmax는 대조군과 항생제 처리군이 비슷한 값을 보였다.

혈중농도는 그림 에 나타내었고Geniposide 17 pharmacokinetic parmeter

은 표 에 나타냈다 와9 . AUC Cmax는 그래프상에서 군이antibiotics-treated

높은 수치로 보이지만 유의성 있는 차이는 없었다.

정상 쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 치자 색소 원료- (300 mg/kg

를 경구 투여한후 시간까지 를 수집하여 중의geniposide) 24 feces feces

와 양을 측정하였다 양은 그림 과 표 에 나geniposide genipin . Feces 18 10

타냈다 는 항생제 처리 쥐에서 정상 쥐보다 배정도 높았으면. Geniposide 29

유의성 있는 차이가 나타났다.

라 에서 의 약동력학 연구라 에서 의 약동력학 연구라 에서 의 약동력학 연구라 에서 의 약동력학 연구. Germ-free, gnotobiotic mouse geniposide. Germ-free, gnotobiotic mouse geniposide. Germ-free, gnotobiotic mouse geniposide. Germ-free, gnotobiotic mouse geniposide

정상 그리고 에서- mouse, germ-free mouse gnotobiotic mouse

를 각각 경구 투여한 후 혈장 중 의 농도를 측정하였다geniposide genipin .

결과는 그림 과 표 에 나타냈다 의 농도는 시간에서19 11 . Genipin 0.5, 1, 4

모두 정상 그리고 순으로mouse, germ-free mouse gnotobiotic mouse

농도가 높은 것으로 나타났다.

세부과제2-1 37373737////82828282


그림 11 Product ion mass spectra of genipin (A) and geniposide (B)

세부과제2-1 38383838////82828282


그림 12. Product ion mass spectra of digoxin (A) and luteolin (B)

세부과제2-1 39393939////82828282


그림 13. Multiple reaction monitoring chromatograms of (A) genipin and

luteolin standard (1000 ng/ml), (B) plasma spiked with genipin(1000

ng/ml) and luteolin (200 ng/ml), (C) plasma taken 4h after oral

administration of geniposide and luteolin (200 ng/ml)

세부과제2-1 40404040////82828282


그림 14. Multiple reaction monitoring chromatograms of (A) geniposide

(1000ng.ml) and digoxin standard (100 ng/ml), (B) plasma spiked with

geniposide(1000 ng/ml) and digoxin (100 ng/ml), (C) plasma taken

0.5h after oral administration of geniposide and digoxin (100 ng/ml)

세부과제2-1 41414141////82828282


그림 15. Multiple reaction monitoring chromatograms of (A) genipin and

(B) geniposide in the raw dye material from gardenia fruits

Time (h r)

0 5 10 15 20 250

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

N orma lAntib iotics-treated

그림 16. Plasma concentration of genipin after oral administration of

the raw dye material from gardenia fruits (300 mg/kg as geniposide)

to rats (n=5)

세부과제2-1 42424242////82828282


표 10. Pharmacokinetic parameters for genipin

ParameterParameterParameterParameter NormalNormalNormalNormal Antibiotics-treatedAntibiotics-treatedAntibiotics-treatedAntibiotics-treated

AUC ( g·hr/mL)μ 15.4 ± 5.3 17.9 ± 4.3

T 1/2λ (hr) 3.2 ± 0.4 6.3 ± 1.1

Tmax (hr) 4.0 ± 2.4 3.7 ± 2.4

Cmax (ng/mL) 1513 ± 366 1534 ± 291

Time (hr)

0 5 10 15 20 250

200

400

600

800

1000

1200

Normal Antibiotics-treated

그림 17. Plasma concentration of geniposide after oral administration of

the raw dye material from gardenia fruits (300 mg/kg as geniposide)

to rats (n=5)

세부과제2-1 43434343////82828282


표 11. Pharmacokinetic parameters for geniposide

ParameterParameterParameterParameter NormalNormalNormalNormal Antibiotics-treatedAntibiotics-treatedAntibiotics-treatedAntibiotics-treated

AUC ( g·hr/mL)μ 9.5 ± 3.6 11.9 ± 2.1

T 1/2λ (hr) 3.5 ± 1.1 3.3 ± 0.2

Tmax (hr) 2.1 ± 1.4 3.1 ± 2.4

Cmax (ng/mL) 993.4 ± 215.8 1009.8 ± 41.7

그림 18. Total quantity of geniposide and genipin in feces after oral

administration of the raw dye material from gardenia fruits (300 mg/kg

as geniposide) to rats (n=5)

Normal Germ-free0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

Geniposide Genipin

세부과제2-1 44444444////82828282


표 12. Total quantity of geniposide and genipin in feces

NormalNormalNormalNormal Antibiotics-treatedAntibiotics-treatedAntibiotics-treatedAntibiotics-treated

Geniposide (µg) 509.6 ± 876.7 14798.0 ± 3290.8

Genipin (µg) 1601.6 ± 1467.8 397.5 ± 216.1

그림 19. Plasma concentration of geniposide after oral administration of

geniposide to mouse (n=5)

Time (hr)

0.5 1 4 120

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Normal Germ-free Gnotobiotic

세부과제2-1 45454545////82828282


표 13. Pharmacokinetic parameters for genipin

a P< 0.05, Compared to nomal mouse.

3) Pseudo g3) Pseudo g3) Pseudo g3) Pseudo germ-free rat modelerm-free rat modelerm-free rat modelerm-free rat model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구

가 결과가 결과가 결과가 결과. Validation. Validation. Validation. Validation

1) Linearity1) Linearity1) Linearity1) Linearity

표 아세트아미노펜 및 대사체의14. linearity

CompoundCompoundCompoundCompoundConcentrationConcentrationConcentrationConcentration

range (µg/mL)range (µg/mL)range (µg/mL)range (µg/mL)SlopeSlopeSlopeSlope Y-interceptY-interceptY-interceptY-intercept

LinearityLinearityLinearityLinearity

(r)(r)(r)(r)

APAP 0.1-100 0.4700 0.0220 0.9973

APAP-Glc 0.1-100 0.1050 0.00365 0.9998

APAP-Sul 0.1-100 1.2200 0.02290 0.9982

APAP-NAC 0.01-5.0 0.6080 -0.00019 0.9996

APAP-Cys 0.01-5.0 0.0877 -0.00038 0.9967

APAP-Glth 0.01-2.5 0.0395 -0.00004 0.9974

APAP-OMe 0.01-1.0 1.3700 -0.00057 0.9998

세부과제2-1 46464646////82828282


(2) Precision and accuracy(2) Precision and accuracy(2) Precision and accuracy(2) Precision and accuracy

표 15. 아세트아미노펜 및 대사체의 및Intra- and Inter-day precision

accuracy

CompoundConc.

(µg/mL)

Intra-day (n=5) Inter-day (n=5)

Measured

conc. (µg/mL)

Accuracy

(%)

Precision

(C.V.%)

Measured

conc.

(µg/mL)

Accuracy

(%)

Precision

(C.V.%)

APAP

0.1 0.091±0.004 91.3 4.2 0.093±0.004 93.0 3.8

0.6 0.620±0.039 103 6.3 0.646±0.026 107.6 4.0

6 5.798±0.379 96.6 6.5 5.940±0.195 99.0 3.3

60 58.84±3.840 98.1 6.5 56.62±1.398 94.4 2.5

APAP-Glc

0.1 0.099±0.009 98.9 8.7 0.100±0.004 100.1 4.4

0.6 0.645±0.036 108 5.6 0.655±0.033 109.2 5.1

6 6.082±0.279 101 4.6 6.252±0.172 104.2 2.7

60 61.80±2.035 103 3.3 60.20±1.529 100.3 2.5

APAP-Sul

0.1 0.106±0.012 106 11.6 0.100±0.007 100.1 6.6

0.3 0.319±0.024 106 7.6 0.302±0.035 100.8 11.5

6 5.942±0.545 99.0 9.2 5.831±0.374 97.2 6.4

60 57.53±4.387 95.9 7.6 56.12±2.484 93.5 4.4

APAP-Glth

0.01 0.010±0.002 100 16.5 0.011±0.001 112.4 5.5

0.03 0.032±0.003 106 9.4 0.033±0.001 108.8 2.4

0.15 0.161±0.013 107 8.0 0.153±0.004 102.3 2.3

0.6 0.601±0.032 100 5.3 0.641±0.028 106.8 4.3

APAP-NAC

0.01 0.011±0.001 105 6.3 0.009±0.001 95.0 11.1

0.03 0.032±0.002 105 5.4 0.031±0.002 102.8 6.1

0.15 0.150±0.002 100 1.2 0.154±0.007 102.5 4.5

0.60 0.578±0.041 96.4 7.1 0.625±0.023 104.1 3.7

APAP-Cys

0.01 0.011±0.001 107 11.2 0.010±0.001 96.5 11.1

0.03 0.028±0.001 93.7 3.0 0.030±0.001 98.7 4.7

0.15 0.148±0.012 98.7 8.1 0.149±0.005 99.1 3.0

0.60 0.575±0.043 95.9 7.4 0.618±0.048 103.0 7.8

APAP-OMe

0.01 0.009±0.001 90.7 9.0 0.009±0.000 92.3 4.0

0.03 0.028±0.001 94.0 4.0 0.028±0.002 92.0 5.6

0.15 0.140±0.005 93.2 3.4 0.140±0.004 93.0 2.6

0.60 0.611±0.026 102 4.3 0.606±0.043 101.0 7.0

세부과제2-1 47474747////82828282


회수율과회수율과회수율과회수율과(3) matrix effect(3) matrix effect(3) matrix effect(3) matrix effect

표 16. 아세트아미노펜 및 대사체의 회수율과 matric effect

CompoundCompoundCompoundCompoundConcentrationConcentrationConcentrationConcentration

(µg/mL)(µg/mL)(µg/mL)(µg/mL)Recovery (%)Recovery (%)Recovery (%)Recovery (%) Matrix effect (%)Matrix effect (%)Matrix effect (%)Matrix effect (%)

APAPAPAPAPAPAPAP

0.6 97.86 97.75

6 101.23 96.26

60 104.91 105.50

APAP-GlcAPAP-GlcAPAP-GlcAPAP-Glc

0.6 99.57 99.35

6 98.94 98.69

60 97.91 104.51

APAP-SulAPAP-SulAPAP-SulAPAP-Sul

0.3 95.69 131.66

6 97.73 114.79

60 94.74 103.02

APAP-GlthAPAP-GlthAPAP-GlthAPAP-Glth

0.03 98.41 89.83

0.15 73.92 92.84

0.60 74.13 98.57

APAP-NACAPAP-NACAPAP-NACAPAP-NAC

0.03 83.50 98.88

0.15 90.27 102.42

0.60 92.64 103.18

APAP-CysAPAP-CysAPAP-CysAPAP-Cys

0.03 80.00 85.02

0.15 72.34 85.18

0.60 83.43 87.26

APAP-OMeAPAP-OMeAPAP-OMeAPAP-OMe

0.03 87.19 89.65

0.15 93.08 88.21

0.60 97.96 89.15

세부과제2-1 48484848////82828282


안정성안정성안정성안정성(4)(4)(4)(4)

표 17. 아세트아미노펜 및 대사체의 안정성평가 결과

표 18. 아세트아미노펜과 대사체 및 내부표준물질의 표준원액 안정성

CompoundConc.

(µg/mL)

Short-ter

m (RT)

Post-prepa

rative

Freeze

&Thaw

( 3cycle )

Freeze

&Thaw

( 1cycle )

Long-term

(-80 )℃

Accuracy(

%)

Accuracy(

%)

Accuracy(

%)

Accuracy(

%)

Accuracy(

%)

APAP

0.6 106.6 103.6 95.10 102.0 110.6

6 100.9 104.5 91.75 103.8 108.8

60 102.4 106.4 98.83 108.4 110.8

APAP-Glc

0.6 102.0 100.0 94.35 101.6 100.0

6 99.07 102.5 91.24 99.8 100.4

60 99.59 104.3 99.47 107.1 103.2

APAP-Sul

0.3 98.14 109.4 90.00 100.6 87.19

6 96.27 104.1 90.63 110.7 99.46

60 100.9 99.79 94.42 110.3 106.7

APAP-Glth

0.03 93.00 92.54 26.36 98.71 104.7

0.15 93.30 93.52 15.38 104.2 113.1

0.6 101.7 95.85 29.65 86.09 107.9

APAP-NAC

0.03 106.0 104.7 23.32 99.56 94.34

0.15 97.12 103.1 13.56 102.6 112.6

0.6 99.01 106.7 13.32 103.8 106.6

APAP-Cys

0.03 107.8 104.9 24.09 91.96 103.2

0.15 106.0 98.47 20.04 102.6 107.5

0.6 115.2 102.9 12.92 94.03 105.1

APAP-OMe

0.03 98.93 98.35 74.70 86.45 97.67

0.15 96.99 98.12 68.97 88.52 104.4

0.6 99.14 98.95 75.42 93.56 94.23

CompoundCompoundCompoundCompound Accuracy (%)Accuracy (%)Accuracy (%)Accuracy (%)

APAP

APAP-Glc

APAP-Sul

APAP-OH

APAP-Glth

105.0

101.7

105.0

101.1

104.3

세부과제2-1 49494949////82828282


나 과 에서의 아세트아미노펜 및 대사체 변화나 과 에서의 아세트아미노펜 및 대사체 변화나 과 에서의 아세트아미노펜 및 대사체 변화나 과 에서의 아세트아미노펜 및 대사체 변화. Pseudo germ-free rat control rat. Pseudo germ-free rat control rat. Pseudo germ-free rat control rat. Pseudo germ-free rat control rat

아세트아미노펜 및 대사체의 혈중 농도아세트아미노펜 및 대사체의 혈중 농도아세트아미노펜 및 대사체의 혈중 농도아세트아미노펜 및 대사체의 혈중 농도(1)(1)(1)(1)

그림 에 과 에서 모약물인 아세트아미20 pseudo germ-free rat control rat

노펜과 그 대사체들의 시간에 따른 농도 변화를 로 나타semi-log scale 냈다.

그림 20. 아세트아미노펜 및 대사체의 혈중농도 profile

APAP-NAC

APAP-Cys

APAP-OMe

APAP-d4

APAP-Glc-d3

101.5

102.7

102.8

101.2

97.18

세부과제2-1 50505050////82828282


과 에서 모약물인 아세트아미노펜과 그 대Control rat pseudo germ-free rat

사체의 를 비교하였을 때 대조군에 비해 군에서AUC , pseudo germ-free

를 제외한 가지 대사체들과 모약물인 아세트아미노펜의 가APAP-Sul 5 AUC

증가되는 경향이 보였으나 통계적으로 유의적인 차이를 나타낸 것은 와APAP

이었다APAP-Glth .

(2) PK parameter(2) PK parameter(2) PK parameter(2) PK parameter

시간에 따른 혈중농도 를 을 이용하여 처리하여data Winnonlin program PK

를 구하여 표parameter 19에 나타냈다. 표 19에서 으로 체크한 부분은*

를 통해 값이 이하를 나타내는 경우T-test p-value 0.05 이다.

표 19. 와 에서의Pseudo germ-free control rat PK parameter

(A) APAP

ControlControlControlControlPseudoPseudoPseudoPseudo

germ-freegerm-freegerm-freegerm-free

p-valup-valup-valup-valu

eeee

T1/2(hour) 3.41±0.38 3.88±0.51 0.052

Tmax(hour) 0.23±0.19 0.44±0.34 0.363

Cmax( g/ml)μ 48.55±26.69 76.80±12.52 0.242

AUClast(h× g/ml)μ 211.40±90.67 384.38±73.32 0.035 *

AUCINF_obs(h× g/μ

ml)216.58±86.90 391.28±72.97 0.028 *

Vd/F(ml/kg) 4.96±1.78 2.95±0.26 0.191

Cl/F (ml/h/kg ) 1.03±0.39 0.52±0.09 0.105

세부과제2-1 51515151////82828282


(B) APAP-Glc


germ-freegerm-freegerm-freegerm-freep-valuep-valuep-valuep-value

TTTT1/21/21/21/2(h)(h)(h)(h) 2.82±0.34 2.82±0.64 0.978

TTTTmaxmaxmaxmax(h)(h)(h)(h) 1.60±0.49 1.25±0.42 0.277

CCCCmaxmaxmaxmax( g/ml)( g/ml)( g/ml)( g/ml)μμμμ 31.58±13.71 37.28±13.50 0.535

AUCAUCAUCAUC0-t0-t0-t0-t(h× g/ml)(h× g/ml)(h× g/ml)(h× g/ml)μμμμ 162.32±68.38 225.99±94.06 0.247

AUCAUCAUCAUC0-0-0-0-∞∞∞∞(h×(h×(h×(h×μμμμ

g/ml)g/ml)g/ml)g/ml)163.76±76.11 227.35±95.34 0.250

VVVVdddd/F(ml/kg)/F(ml/kg)/F(ml/kg)/F(ml/kg) 5.88±2.41 4.04±1.69 0.229

Cl/F (ml/h/kg )Cl/F (ml/h/kg )Cl/F (ml/h/kg )Cl/F (ml/h/kg ) 1.47±0.63 1.00±0.36 0.229

(C) APAP-Sul



TTTT1/21/21/21/2(h)(h)(h)(h) 7.22±2.39 8.65±7.08 0.664





g/ml)g/ml)g/ml)g/ml)297.79±77.01 226.26±154.98 0.351



세부과제2-1 52525252////82828282


(D) APAP-Glth



TTTT1/21/21/21/2(h)(h)(h)(h) 3.64±0.77 3.35±1.00 0.621



AUCAUCAUCAUC0-t0-t0-t0-t(h× g/ml)(h× g/ml)(h× g/ml)(h× g/ml)μμμμ 3.56±1.54 6.53±2.35 0.039 *


g/ml)g/ml)g/ml)g/ml)3.64±1.68 6.59±2.33 0.038 *



가. (E) APAP-Cys



TTTT1/21/21/21/2(h)(h)(h)(h) 3.46±0.67 3.50±0.74 0.934





g/ml)g/ml)g/ml)g/ml)8.06±4.72 11.44±2.81 0.208



세부과제2-1 53535353////82828282


(F) APAP-NAC



TTTT1/21/21/21/2(h)(h)(h)(h) 4.05±0.63 4.52±0.93 0.363





g/ml)g/ml)g/ml)g/ml)4.82±2.53 7.67±2.26 0.086



(G) APAP-OMe



TTTT1/21/21/21/2(h)(h)(h)(h) 5.57±1.49 5.21±1.58 0.728





g/ml)g/ml)g/ml)g/ml)0.16±0.08 0.32±0.18 0.081

VVVVdddd/F(ml/kg)/F(ml/kg)/F(ml/kg)/F(ml/kg) 11595±3811 6722.6±5735.1 0.141


T1/2: eliminationhalf-life

Tmax: time required to reach Cmax

Cmax: maximum plasma concentration

AUC0-t:area under the plasma concentration-time curve from 0 to time t

AUC0-∞∞∞∞: area under the plasma concentration-time curve from 0 to time

infinity

Vd/F: apparent volume of distribution

세부과제2-1 54545454////82828282


Cl/F: oral clearance.

The values shown are the mean ± SD.

Significantly different from control group *(p < 0.05)

과 에서 모약물인 아세트아미노펜과 그 대Control rat pseudo germ-free rat

사체의 를 비롯한 를 비교하였을 때AUC PK parameter , pseudo germ-free

군과 대조군에서의 수치적 차이를 보였으나 과 의 값, APAP APAP-Glth AUC

에서만 유의적인 차이를 확인할 수 있었다 두 물질 모두. pseudo germ-free

군에서 대조군에 비해 약 배정도 높은 값을 가지는 것을 확인할 수 있었2 AUC

다.

대사율에 변화를 알아보기 위해서 각 대사체별로, AUC0-t대사체를 AUC0-t전

구체로 나눈 값을 표 에 나타내었다 표 에서 로 체크한 것은20 . 20 **

이하로 유의성이 있음을 나타낸다p-value < 0.01 .

표 대조군과 군에서 각 대사체별20. pseudo germ-free AUC0-t대사체

/AUC0-t 비율APAP

　 ControlPseudo

germ-freep-value

APAP-Glc

/APAP

0.

66

1

± 0.107

0.

57

7

± 0.185 0.378

APAP-Sul

/APAP

1.

09

6

± 0.295

0.

50

2

± 0.284 0.009**

APAP-Glt

h/APAP

0.

01

5

± 0.005

0.

01

7

± 0.004 0.427

APAP-Cy

s/APAP

0.

03

1

± 0.009

0.

03

0

± 0.009 0.908

APAP

0.

01

8

± 0.005

0.

02

0

± 0.006 0.751

APAP-OMe/APAP 0.001 ± 0.000 0.001 ± 0.000 0.308

세부과제2-1 55555555////82828282


(3) Urine data(3) Urine data(3) Urine data(3) Urine data

의 경우 시간별로 취한 을 각각 분석한 뒤에서 시간동안의urine , urine 0-30

를 취합하여 나타내었으며 각 뇨 량으로 보정하였다data 표( 21).

표 21. 아세트아미노펜 및 대사체의 뇨 중 배설량

　　 ControlPseudo

germ-freeP-valu

e　　 Mean S.D. Mean S.D.

APAP-Glc (mg) 27.7 23.6 32.2 9.02 0.74

APAP-Sul (mg) 58.1 15.4 35.6 5.67 0.06

APAP-NAC (mg) 6.23 4.03 7.38 2.06 0.62

APAP-Cys (mg) 0.08 0.06 0.11 0.04 0.47

APAP (mg) 5.3 0.5 3.24 1.14 0.01**

APAP-Glth (mg) - - - - -

APAP-OMe (µg) 8.97 3.36 7.19 3.56 0.45

대조군에 비해 군에서 의 뇨 배설량은 유의적 차이pseudo germ-free APAP

를 보이며 감소하였고 를 제외한 포합 대사체들의 뇨 중 배설량은, APAP-Sul

증가하는 경향을 보였으며 의 뇨 중 배설량은 감소하는 경향을 보, APAP-Sul

였다.

세부과제2-1 56565656////82828282


4)4)4)4) Germ-free mouse modelGerm-free mouse modelGerm-free mouse modelGerm-free mouse model의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구의 아세트아미노펜의 대사변화 연구

아세트아미노펜 및 대사체에 대한 혈 중 농도 정량아세트아미노펜 및 대사체에 대한 혈 중 농도 정량아세트아미노펜 및 대사체에 대한 혈 중 농도 정량아세트아미노펜 및 대사체에 대한 혈 중 농도 정량(1)(1)(1)(1)

용량 투여시의 시간에 따른 아세트아미노펜 및 대사체의 혈 중 농200 mg/kg

도는 그림 에 나타내었다21. .

그림 시간에 따른 아세트아미노펜 및 대사체의 혈 중 농도 곡선21. (200

용량 투여시mg/kg )

용량 투여시의 시간에 따른 아세트아미노펜 및 대사체의 혈 중300 mg/kg

농도는 그림 에 나타내었다22. .

그림 시간에 따른 아세트아미노펜 및 대사체의 혈 중 농도22. (300 mg/kg

용량 투여시)

세부과제2-1 57575757////82828282


아세트아미노펜 및 대사체에 대한아세트아미노펜 및 대사체에 대한아세트아미노펜 및 대사체에 대한아세트아미노펜 및 대사체에 대한(2) pharmacokinetic parameter(2) pharmacokinetic parameter(2) pharmacokinetic parameter(2) pharmacokinetic parameter

아세트아미노펜 및 대사체에 대한 혈 중 농도 데이터에 대해 프로Winnonlin

그램을 이용하여 반감기PK parameter ( (T1/2), Cmax, Tmax 및 분포용적, AUC

(Vd 과 를 구하였다 표 표 그림 표 와 를 기반으) Clearance ( 20, 21, 23). 22 23

로 유의성 있는 결과에 한해 그림 에 도식화 하였다 표 와 에서 같이23 . 22 23

가 주대사체였던 의 결과와는 달리 에서는 가APAP-Sul rat mouse APAP-Glc

주 대사체여서 종간 차이를 확인할 수 있었다 투여 군. 300mg/kg germ-free

에서 와 의 이 대조군과 유의적 차이를 보APAP APAP-Glc, APAP-Sul AUC

였는데 와 의 는 증가하였고 의 는 감, APAP APAP-Sul AUC , APAP-Glc AUC

소하였다 투여 군에서는 의 가 대조. 200mg/kg germ-free APAP-Glth AUC

군과 유의적인 차이를 보이며 감소하였다 의 경우 와는 반대. Clearance , AUC

의 경향을 보였다.

표 로 아세트아미노펜 투여 시22. 200mg/kg pharmacokinetic parameter

(A) APAP

　 Control Germ-free Gnotobiota

　 Mean SD Mean SD Mean SD

T1/2(hour) 0.81 0.16 1.620.

591.51 0.27

Tmax(hour) 1.00 0.00 1.200.

451.00 0.00

Cmax( g/ml)μ 13.61 4.29 16.044.

8117.98 4.22

AUClast(h× g/mlμ

)29.64 13.82 32.55

11

.5

1

29.96 4.26

AUCINF_ob

s(h× g/ml)μ29.88 13.79 30.69

11

.4

3

32.73 4.19

Vd/F(ml/kg)9487.4

04699.92

15546.7

3

26

44

.4

1

13523.86 2964.57

Cl/F (ml/h/kg )8021.6

43764.70 7285.93

27

65

.7

8

6197.64 857.52

세부과제2-1 58585858////82828282


(B) APAP-Glc


　

M

ea

n

SD

M

ea

n

SD Mean SD

T1/2(hour) 2.27 0.19 2.68 0.41 2.32 0.17

Tmax(hour) 1.20 0.45 1.40 0.55 1.00 0.00

Cmax( g/ml)μ 130.86 37.07 48.32 5.33 55.64 6.77AUClast(h× g/mμ

l)383.08 170.67 213.09 32.11 280.29 29.12

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ383.30 170.60 213.67 32.43 280.48 29.15

Vd/F(ml/kg) 2002.47 889.97 3667.09 585.18 2402.06 272.63

Cl/F(ml/h/kg ) 598.78 229.89 954.49 153.05 719.04 72.05

(C) APAP-Sul



T1/2(hour)1.

090.40

1.

950.85

2.

49

0.

29

Tmax(hour)1.

200.45

1.

200.45

1.

00

0.

00

Cmax( g/ml)μ4.

072.33

2.

860.57

3.

50

0.

90AU

Clast

(h×

g/μ

ml)

9.

685.14

6.

981.60

7.

77

1.

49

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ

8.

714.98

8.

221.72

10

.0

8

1.

57

Vd/F(ml/kg)

43

18

5.

03

22379.4

5

70

13

1.

94

28129.4

4

73

44

8.

72

19

25

3.

81Cl/F

(ml/h/

kg )

27353.5

2

10406.0

5

25184.3

75429.45

20227.8

13199.39

세부과제2-1 59595959////82828282


(D) APAP-Glth



T1/2(hour) 2.72 0.522.

480.36

2.

23

0.

33

Tmax(hour) 1.00 0.001.

200.45

1.

00

0.

00

Cmax( g/ml)μ 5.31 3.101.

580.55

2.

68

0.

60

AUClast(h× g/mμ

l)12.85 5.40

5.

491.08

8.

19

1.

99

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ12.88 5.39

5.

501.08

8.

19

1.

99

Vd/F(ml/kg)80861.5

8

67041.0

4

13

52

95

38775.2

1

81

11

5.

48

17

19

3.

00

Cl/F(ml/h/kg )19119.5

6

11518.2

4

37752.1

78751.53

25865.9

67657.96

(E) APAP-Cys



T1/2(hour)2.

110.13

2.

320.50

2.

16

0.

22

Tmax(hour)1.

200.45

1.

200.45

1.

00

0.

00

Cmax( g/ml)μ

26

.4

4

6.16

24

.0

4

8.04

26

.3

4

9.

33

AUClast(h× g/mμ

l)

93

.3

8

31.24

83

.1

3

29.54

91

.0

9

26

.1

0

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ

93

.4

1

31.23

83

.2

6

29.51

91

.1

2

26

.1

1

Vd/F(ml/kg)

72

73

.4

6

2851.67

91

93

.2

8

4369.51

75

95

.4

0

34

80

.5

3

Cl/F (ml/h/kg ) 2358.47 825.13 2720.20 1192.99 2385.22 852.19

세부과제2-1 60606060////82828282


(F) APAP-NAC



T1/2(hour)2.

250.25

2.

490.69

2.

12

0.

39

Tmax(hour)1.

200.45

1.

200.45

1.

20

0.

45

Cmax( g/ml)μ

10

.1

7

3.136.

191.20

7.

52

0.

70

AUClast(h× g/mlμ

)

38

.6

3

15.93

28

.2

3

3.89

39

.3

3

14

.0

3

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ

38

.6

5

15.92

28

.3

2

3.88

40

.5

7

11

.4

7

Vd/F(ml/kg)

19

93

9.

65

9766.74

25

79

1.

74

7812.13

17

35

2.

35

10

81

5.

12

Cl/F (ml/h/kg ) 5995.09 2605.55 7170.21 990.54 5401.31 2125.52

세부과제2-1 61616161////82828282


표 로 아세트아미노펜 투여 시23. 300mg/kg pharmacokinetic parameter

(A) APAP


　

M

ea

n

SD

M

ea

n

SD Mean SD

T1/2(hour) 3.09 1.02 2.45 0.40 2.98 1.07

Tmax(hour) 1.00 0.00 1.00 0.00 1.00 0.00

Cmax( g/ml)μ 23.76 3.62 30.38 4.63 30.18 13.47

AUClast(h× g/mlμ

)58.51 12.63 84.25 12.06 100.77 30.23

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ59.27 13.42 84.39 11.99 101.81 30.76

Vd/F(ml/kg)22649.5

65817.71

12857.1

73427.04

13090.4

23852.29

Cl/F(ml/h/kg ) 5261.06 1104.17 3611.30 497.01 3205.97 1123.80

(B) APAP-Glc


Mean SD Mean SD Mean SD

T1/2(hour)3.

971.63

3.

380.68

3.

32

0.

55

Tmax(hour)1.

400.55

2.

000.00

1.

60

0.

55

Cmax( g/ml)μ

12

6.

48

45.14

77

.5

6

13.66

70

.3

6

13

.9

9

AUClast(h× g/mlμ

)

47

6.

04

61.95

37

1.

29

34.82

42

9.

43

10

4.

64

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ

49

1.

06

75.24

37

4.

69

33.85

46

8.

42

82

.2

2

Vd/F(ml/kg)

34

29

.5

6

1000.66

39

40

.2

0

938.32

30

84

.7

1

28

8.

50

Cl/F(ml/h/kg ) 624.00 107.76 805.82 71.59 656.45 122.18

세부과제2-1 62626262////82828282


(C) APAP-Sul


　

M

ea

n

SD

M

ea

n

SD Mean SD

T1/2(hour) 3.61 0.81 3.48 0.39 3.34 0.27

Tmax(hour) 1.20 0.45 1.40 0.55 1.00 0.00

Cmax( g/ml)μ 4.15 1.29 5.53 0.93 3.63 1.42

AUClast(h× g/mlμ

)13.65 3.12 23.83 3.16 15.76 3.52

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ13.91 3.38 24.04 3.17 16.87 2.46

Vd/F(ml/kg) 113353 10017.4163349.6

39905.50

86692.8

1

10694.6

3

Cl/F(ml/h/kg )22688.7

65884.19

12670.1

31836.11

18059.5

02427.85

(D) APAP-Glth

　 ControlGerm-fr

eeGnotobiota


T1/2(hour)5.

36

2.

50

3.

49

0.

893.41 0.81

Tmax(hour)1.

60

0.

55

2.

00

0.

001.40 0.55

Cmax( g/ml)μ6.

26

1.

72

7.

04

1.

694.50 2.03

AUClast(h× g/mlμ

)

25

.7

3

6.

49

26

.9

9

3.

9220.39 8.27

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ

27

.6

7

8.

48

27

.3

3

4.

2121.87 9.33

Vd/F(ml/kg)

82

80

8.

88

28

48

6.

47

55

01

1.

46

90

54

.6

1

73525.3

026583.81

Cl/F(ml/h/kg )11700.0

73698.18

11180.9

61653.93

15539.5

35961.14

세부과제2-1 63636363////82828282


(E) APAP-Cys

　 ControlGerm-fre

eGnotobiota


T1/2(hour) 5.682.

405.10 1.16

4.

62

0.

26

Tmax(hour) 1.200.

452.00 0.00

2.

40

2.

07

Cmax( g/ml)μ 14.023.

5816.70 4.15

8.

73

1.

90

AUClast(h× g/mlμ

)68.33

22

.6

4

96.92 32.53

62

.3

9

21

.7

0

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ76.46

32

.6

8

101.36 33.27

67

.9

5

23

.4

0

Vd/F(ml/kg)32444.4

3

74

95

.7

7

24396.7

812046.19

31

84

0.

84

10

17

6.

76

Cl/F(ml/h/kg ) 4388.45 1389.99 3235.49 1067.80 4753.74 1338.81

(F) APAP-NAC

　 ControlGerm-fr

eeGnotobiota


T1/2(hour)4.

18

1.

33

4.

14

0.

673.50 0.54

Tmax(hour)1.

40

0.

55

2.

00

0.

001.60 0.55

Cmax( g/ml)μ9.

50

1.

83

6.

99

0.

416.13 0.53

AUClast(h× g/mlμ

)

51

.4

4

9.

87

42

.5

6

5.

8941.92 17.73

AUCINF_obs

(h× g/ml)μ

52

.8

1

11

.2

9

43

.4

2

5.

7947.20 16.07

Vd/F(ml/kg)

33

80

6.

10

61

45

.1

3

42

10

9.

37

99

31

.3

1

36476.6

517763.66

Cl/F(ml/h/kg ) 5861.26 1064.81 7011.23 962.44 7056.85 2837.79

세부과제2-1 64646464////82828282


그림 아세트아미노펜 투여 후 와23. AUC Cl/F ; (A) APAP, (B)

APAP-Glc, (C) APAP-Sul, (D) APAP-Glth.

세부과제2-1 65656565////82828282


아세트아미노펜와 그 대사체들의 비율 변화의 의의아세트아미노펜와 그 대사체들의 비율 변화의 의의아세트아미노펜와 그 대사체들의 비율 변화의 의의아세트아미노펜와 그 대사체들의 비율 변화의 의의(3)(3)(3)(3)

대부분의 약물은 체내에서 여러 가지 대사효소에 의해 다양한 대사체를 생성

한다 정상 상태에서는 체내 모약물 대비 약물 대사체들이 일정한 비율로 생성.

되지만 체내 대사 활성이 변화 등과 같은 생리적 변화에 의해서는 체내 모약,

물 대비 약물 대사체들의 비율이 변화된다 아세트아미노펜의 경우 독성 유발. ,

대사체를 갖고 있기 때문에 아세트아미노펜에 대한 대사체 생성 비율은 중요한

의의를 갖을 것으로 생각된다 따라서 모약물 대비 대사체들의 생성 비율을 확.

인하였다 그림( 24).

그림 장내 미생물에 의한 아세트아미노펜 투여 후의 대사체 모약물 비율의24. /

변화

세부과제2-1 66666666////82828282


그림 에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 군에서 를24 germ-free APAP-Sul

제외한 포합대사율이 감소하는 경향을 확인할 수 있었다 에서 아세트아. Mouse

미노펜의 주대사체인 포합체의 생성율이 두 용량 투여 모두에서glucuronide

감소함을 확인하였으며 이로인해 혈중 아세트아미노펜의 혈 중 의 증가에, AUC

기여할 것으로 사료된다 또한 정착동물군 에서의 포합대사체 생성. (Gnotobiota)

비율은 군과 정상대조군의 중간정도로 관찰되어 완전하지는 않지germ-free

만 대사율이 어느 정도 회복되는 것을 확인할 수 있었다 이와 같은 대사효율.

회복은 생성율 변화에서 유의적인 차이를 보이며 뚜렷이 관찰되APAP-Glth

었다.

장내미생물에 의한 내인서 대사체 변화 연구장내미생물에 의한 내인서 대사체 변화 연구장내미생물에 의한 내인서 대사체 변화 연구장내미생물에 의한 내인서 대사체 변화 연구5)5)5)5)

분석법의 재현성 확인분석법의 재현성 확인분석법의 재현성 확인분석법의 재현성 확인(1) global metabolomic profiling(1) global metabolomic profiling(1) global metabolomic profiling(1) global metabolomic profiling

기기분석에 얻은 모든 표본과 시료들의 피크 변동값에 대해서 주성분 분석QC

을 실시하여 도출된 에서 모(principal component analysis; PCA) score plot

든 표본의 위치를 확인하였다 그림 주성분 분석의 에서QC ( 25). score plot

가까이 위치할수록 개체가 갖는 변동값이 유사함을 시사하기 때문에 주성분,

분석의 에서 모든 표본이 가까이 위피함을 확인하여 시료 분석score plot QC

방법의 재현성을 확인하였다.

그림 모든 표본과 시료들의 피크 변동값에 대해서 주성분 분석25. QC

를 실시하여 작성한 이다(principal component analysis; PCA) score plot . a

은 포지티브 이온화 모드의 결과이며 은 네가티브이온화 모드의 결과이다, b .

표본은 초록색으로 표시되었다QC .

세부과제2-1 67676767////82828282


표 테스트믹스에서 얻은 크로마토그램으로부터 특정한 추출 이온24.

크로마토그램

Standardchemical

in testmixture

RT Ion intensity

Average SD CV% Average SD CV%

Positive modePositive modePositive modePositive mode

Acetaminophen 4.25 0.00 0.00 5959.00 732.50 12.29

Caffeine 5.00 0.01 0.23 28916.00

3289.07 11.37

Reserpine 7.98 0.00 0.00 2835.00 367.02 12.95

Negative modeNegative modeNegative modeNegative mode

Adipic acid 4.34 0.00 0.00 636.67 27.01 4.24

Hippuric acid 5.11 0.00 0.00 8511.00 305.18 3.59

Glycocholicacid 8.25 0.00 0.00 19612.0

0985.29 5.02

머무름 시간 이온 강도a. , b.

세부과제2-1 68686868////82828282


표 표본에서 얻은 크로마토그램으로부터 특정한 추출25. QC

이온 크로마토그램

XIC from QCsamples RTa Ion intensityb

RT m/z Average SD CV% Average SD CV%

Positive modePositive modePositive modePositive mode

1.45 166.08 1.47 0.00 0.00 76.00 1.61 2.12

2.12 271.15 2.14 0.01 0.54 21.66 0.59 2.74

3.87 568.27 3.91 0.00 0.00 2.21 0.29 12.89

4.12 384.12 4.13 0.00 0.00 47.80 2.34 4.89

5.71 221.12 5.73 0.01 0.20 157.25 1.97 1.26

7.13 410.18 7.15 0.00 0.00 152.29 4.99 3.28

12.11 300.30 12.13 0.00 0.00 0.86 0.07 8.24

Negative modeNegative modeNegative modeNegative mode

1.58 231.10 1.57 0.00 0.00 19.28 0.74 3.84

3.00 215.10 3.01 0.00 0.00 28.62 0.23 0.81

4.73 188.04 4.75 0.01 0.12 19.23 1.95 10.14

5.46 429.08 5.46 0.00 0.00 36.25 1.67 4.60

8.75 141.13 8.75 0.00 0.00 7.20 0.63 8.72

3.76 388.14 3.77 0.01 0.31 3.75 0.04 1.14

10.88 221.15 10.89 0.00 0.00 1.83 0.09 4.94

머무름 시간 이온 강도a. , b.

표본과 테스트믹스에서 얻은 크로마토그램으로부터 특정한 추출 이온 크로QC

마토그램 을 얻었고 이들의 이온 강도와(extracted ion chromatogram;XIC)

머무름 시간을 비교했다 표 에서 알 수 있듯이 확인된 모든 의 이. 24, 25 XIC

온 강도와 머무름 시간이 변동계수 가 이내로 유의적인 차이가% (%CV) 15%

없음을 확인하여 분석방법의 안정성과 재현성을 확인하였다.

세부과제2-1 69696969////82828282


장내 미생물에 의한 뇨 중 내인성 대사체 변화 검출을 위한장내 미생물에 의한 뇨 중 내인성 대사체 변화 검출을 위한장내 미생물에 의한 뇨 중 내인성 대사체 변화 검출을 위한장내 미생물에 의한 뇨 중 내인성 대사체 변화 검출을 위한(2) global metabolomic(2) global metabolomic(2) global metabolomic(2) global metabolomic

profilingprofilingprofilingprofiling

시료들의 피크 변 동값에 대해서 을 실시한 결과 대조군과OPLS-DA pseudo

군이 뚜렷이 구분됨을 확인되었다 그림 따라서 두 그룹 간germ-free ( 26).

뇨 중 대사체 프로파일이 다름을 알 수 있었다.

그림 시료들의 피크 변동값에 대해서 를 실시하여 작성한26. OPLS-DA

은 의 결과이며 은 의score plot. A positive ionization , b negative ionization

결과이다 빨간색 삼각형은 군을 검정색 원은 대조군을 나. pseudo germ-free

타낸다.

유의한 값으로 인정되는 피크들에 대해 데이터베이스 비교와 high resolution

분석에 의한 와 조각이온 분석을 실시하여 장내미생물에 의mass exact mass

해서 영향을 받는 대사체들은 표 26과 같다.

표 26 장내미생물에 의해서 영향을 받는 대사체들.

RT_m/z(Formula) Fragmentation Identified metabolite

Foldchange

a

p-value

Amino acid metabolismAmino acid metabolismAmino acid metabolismAmino acid metabolism

3.19_205.07[M+H] C9H8N(-C2H5NO2) Tryptophane 1.40 0.003

3

(C11H12N2O2) C11H13N2O(-O)

세부과제2-1 70707070////82828282


4.95_162.06[M+H] C8H6N(-CH2O2)

Indole-3-carboxylicacid 0.23 0.000

1

(C9H7NO2) C9H6NO(-H2O)

C9H8NO(-O)

5.25_164.08[M+H] C8H10O(-CNO) 3-Methyldixoyindole 0.00b 0.000

2

(C9H9NO2) C9H8NO(-H2O)

C6H7(-C3H3NO2)

4.46_162.06[M+H] C10H10N(-H2O) Tryptophanol 0.12 0.005

1

(C10H11NO) C9H8N(-CH4O)

5.48_212.00[M-H] C8H6NO(-O3S) Indoxyl sulfate 0.62 0.043

4

(C8H7NO4S) O3S(-C8H6NO)

5.46_194.09[M+H] C7H7(-C3H5NO3) Phenylacetylglycine 0.27 0.000

3

(C10H11NO3) C9H10NO(-CH2O2)

C9H12NO(-CO2)

5.65_283.08[M-H] C6H10O5(-C7H5O2) p-Cresol glucuronide 0.07 0.000

6

(C13H16O7) C7H7O(-C6H8O6)

C5H8O4(-C8H7O3)

5.10_180.07[M+H] C7H5O(-C2H5NO2) Hippuric acid 0.28 0.002

5

(C9H9NO3) C6H5(-C3H5NO3)

C8H10N(-CO3)

1.17_314.13[M+H] C8H9O(-C6H11NO6 Tyramine glucuronide 10.25 0.002

3

(C14H19NO7) C5H4O2(-C9H16NO5)

5.55_239.9976[M-H]

C3H8OS2(-C3H2

NO4)

3-Mercaptolactate-c

ysteine disulfide

0.0

47

0.

00

01

(C6H11NO5S2)C2H5NS2(-C4H5

O5)0.85_153.07

[M+H] C3H2NO (-H6O3S) Cysteine sulfinic acid 3.89 0.029

(C3H6NO4S)

4.30_356.14[M+H] C5H11S(-C9H15N6O3)

S-Adenosylmethioninamine 5.77 0.002

5

(C14H25N6O3S)C11H17N5OS(-C3H9N

O2)

4.71_427.12[M+H]

C9H15N3O4(-C4H8NO4S2)

Cysteineglutathionedisulfide 1.86 0.001

7

(C13H22N4O8S2)C4H8N2O2(-C9H15N2

O6S2)

C5H9N2O3(-C8H14N2O5S2)

4.41_336.07[M-H]

C6H13N2OS(-C5

H5NO6)0.01

0 .

0 0

세부과제2-1 71717171////82828282


04

(C11H19N3O7S)C8H9N3O3(-C3H9

O4S)

Isoflavonoids and riboflavinIsoflavonoids and riboflavinIsoflavonoids and riboflavinIsoflavonoids and riboflavin

5.22_377.15[M+H]

C12H11N4O2(-C5

H10O4)Riboflavin 1.72 0.005

8

(C17H20N4O6)C10H10N3(-C7H11

NO6)

C11H8N3O(-C6H1

3NO5)

6.44_327.11[M-H]

C9H9N4O5(-C3H6

O5)7-Hydroxy-6-methyl-8

-ribityl lumazine 0.13 0.0000

(C12H16N4O7)C7H4N4O(-C5H11

O6

6.01_445.08[M-H]

C15H9O5(-C7H12

O5)Glycitin 5.87 0.000

0

(C22H22O10)C5H5O3(-C17H16

O7)

5.54_285.08[M+H] C15H10O5(-CH3) Glycitein 5.92 0.000

1

(C16H12O5) C6H6O3(-C10H7O2)

3.65_433.17[M+H] C6H6O2(-C15H15O8) Genistin 4.24 0.000

6

(C21H20O10) C8H9O2(-C13H12O8)

5.47_255.07[M+H] C5H5O2(-C16H16O8)

(C15H10O4) C8H7O(-C7H4O3) Daidzein 3.15 0.0003

6.29_243.11[M+H] C7H7O2(-C8H4O2) 2.96 0.000

1

(C15H14O3) C9H9O(-C6H6O2) Equol 0.01 0.0006

OthersOthersOthersOthers

3.17_335.08[M+H] C6H5O4 (-C3H15O7P)

1-(sn-Glycero-3-phospho)-1D-myo-inositol 7.49 0.002

3

(C9H19O11P)

1.31_250.05[M+H] C8H12NO (-HO5P) Pyridoxine 5'-phosphate 0.58

0 .

0 0

05

(C8H12NO6P)

5.40_349.10[M-H] C17H17O2 (-CH3O3S) Pyridoxine 5'-phosphate 3.59 0.003

7

(C18H22O5S)

3.69_580.26[M+H]

C20H30O4S(-C6H16NO5S)

Taurochenodeoxychol

ate-7-0.47 0.001

7

세부과제2-1 72727272////82828282


대조군과 비교하였을 때 군의 뇨 대사체의 변화률a. , pseudo germ-free

군의 뇨에서 검출되지 않은 대사체b. pseudo germ-free

이 결과 차 년도의 에서 표준품의 머무름시간으로2 global metabolic profiling

확인한 는 관찰되지 않았으며 장내미생물에 의해 변화되는 내인성 대사steroid

체들은 등과 같은 아미노산 대사체들과 이소플라보노tryptophan, methionine

이드나 리보플라빈과 같은 영양소 대사체들만이 검출되었다 그러나 담즙산과.

그 전구체인 은 장내미생물이 직접적으로 관련된 대사과정인 포합과oxysterol

정에 중요한 역할을 하므로 좀 더 선택적이고 감도가 높을 정량분석GC-MS

방법을 이용하여 장내 미생물에 의해 영향을 받는지를 평가하고자 하였다 그.

방법과 결과를 다음에 나타내었다.

의 뇨 중 담즙산과 의 농도 변화 연구의 뇨 중 담즙산과 의 농도 변화 연구의 뇨 중 담즙산과 의 농도 변화 연구의 뇨 중 담즙산과 의 농도 변화 연구(3) Pseudo germ-free model oxysterols(3) Pseudo germ-free model oxysterols(3) Pseudo germ-free model oxysterols(3) Pseudo germ-free model oxysterols

뇨 시료 중 과 담즙산에 대하여 분석을 실시하여 정량화oxysterol GC-MS

하였다 각 물질의 와 주입한. integrated peak area internal standards (5α

의 와 비교하여 정량화-cholestane, d4-cholicacid) integrated peak area

하였고 그 결과는 표 에 정리하였다27 .

sulfate

(C26H45NO9S2)

4.71_425.10[M-H]

C5H2NO3

(-C10H23NO9_2.63

0 .

0 0

16

(C15H26N2O12) C6H5O4 (-C3H15O7P)

5.23_340.11[M+H] C14H13NO3(-CH5O5)

6-Hydroxy-5-methoxyindole glucuronide 0.01 0.000

2

(C15H17NO8) C9H10NO2(-C6H8O6)

C5H5O2(-C10H13NO6)

세부과제2-1 73737373////82828282


표 에서의 담즙산과 의 뇨 중 농27. Psuedo germ-free rat model oxysterol

도 (ng/mg of creatinine)

CompoundsCompoundsCompoundsCompoundsNormal controlNormal controlNormal controlNormal control Pseudo-germ-freePseudo-germ-freePseudo-germ-freePseudo-germ-free

Mean± SDMean± SDMean± SDMean± SD Mean± SDMean± SDMean± SDMean± SD

7 -OH-cholesterolα 13.66±6.94 10.58±10.43

7 -OH-4-cholesten-3oneα 17.51±31.50 57.24±48.57

7-keto- cholesterol 0.92±0.52 2.94±3.63

22(R)-OH- cholesterol 622.67±378.39 4178.44±3866.48*

24S-OH- cholesterol ND ND

25-OH- cholesterol 27.03±15.82 15.26±14.36

Cholesterol 8145.48±3588.55 4657.67±3049.36*

5 -cholestane 3 ,7 ,12β α α α

-triol3.68±4.36 6.69±9.84

Deoxycholic acid (DCA) 9.97±14.05 8.33±12.31

-Muricholic acid ( -MCA)α α 8.18±6.53 56.09±36.29**

Chenodeoxycholic acid (CDCA) 2.02±1.28 4.02±2.98

Cholic acid (CA) 35.30±29.10 250.52±188.08**

Ursodeoxycholic acid (UDCA) 3.30±3.15 6.53±4.83

Lithocholic acid (LCA) 30.96±18.44 49.19±72.87

-Muricholic acid ( -MCA) β α 20.51±19.33 124.57±80.89**

*: P 0.05 between normal control and pseudo germ-free rats,≤

**: P 0.01 between normal control and pseudo germ-free rats, ND:≤

not detected

군에서 및 과 같은Pseudo germ-free cholesterol, 22(R)-OH- cholesterol

의 농도는 감소하였으나oxysterols cholic acid, -muricholic acid,α β

와 같은 담즙산의 농도는 증가하였다 따라서 담즙산에 의한-muricholic acid .

간독성 유발 가능성이 있음을 확인하였다.

세부과제2-1 74747474////82828282


연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론연구결과 고찰 및 결론5.5.5.5.

이 연구의 목적은 또는 에 항생제를 처리한rat mouse pseudo-germ free

에서 천연물 또는 약물을 투여하고 대사체 및 체내동태 연구를 수행하model

여 장내대사 및 체내동태에 미치는 장내미생물의 영향을 연구하고 대사체,

연구를 통하여 장내미생물 대사가 독성에 미치는 영향을 연구하는 것이다.

장내미생물이 내인성 대사에 미치는 영향에 대한 연구장내미생물이 내인성 대사에 미치는 영향에 대한 연구장내미생물이 내인성 대사에 미치는 영향에 대한 연구장내미생물이 내인성 대사에 미치는 영향에 대한 연구

○ 가지 항생제 혼합액 과 처리 전 후의 뇨를2 (neomycin streptomycin) rat

로 대사체를 분석한 후 로 통계 처리한 결과 서UPLC-TOF-MS PLS-DA ,

로 다른 의 양이 항생제 투여 전 후에 감소하거amino acid, steroid, sterol

나 증가하여 이 대사체들이 항생제 투여 전후에 영향을 받을 수 있음을 관

찰하였다 이를 확인하기 위하여 각각의 대사체 표준품과 비교하여.

과 를 확인하고 이를 뇨 중 대사체 과 비교하여retention time peak , profile

항생제 처리에 의해 감소하는 대사체는 과5 -dihydrocortisolβ

임을 확인하였다 장내미생물이 존재하지 않았을 때의3-methylhistidine .

뇨에서 의 농도가 감소함을 확인함으로서5 -dihydrocortisolβ

에 관여하는 농도가 감소하였음을 예측할 수glucogenesis glucocorticoid

있었다 또한 의 뇨 중 농도 감소를 확인함으로서 질소의. 3-methylhistidine

장간내 순환이 영향을 받아 근육단백질의 분해가 감소하였을 것으로 예상할

수 있었다.

○ 가지항생제 혼합액 을 투여하여 유3 (neomycin, streptomycin, bacitracin)

도된 의 뇨 중 대사체 프로파일 변화를 확인pseudo germ-free rat model

한 결과 가지항새제 혼합액을 처리하여 유도한, 2 pseudo germ-free rat

의 뇨 중 대사체 변화보다 많은 대사체들의 변화를 관찰하였다 아미model .

노산 대사와 관련해서는 및 등의 대사체들tryptophan, tyrosine, cysteine

의 변화가 뚜렷이 관찰되었으며 식이유래 대사체들로 이소플라보노이드 리, ,

보플라빈 등의 대사체 농도 변화가 관찰되었다 또한 담즙산과 스테로이드.

대사체들 중 일부의 농도 변화도 관찰되었다 과 은. tryptophan tyrosine

세부과제2-1 75757575////82828282


아미노산으로 분류되며 기를 가지고 있다 장내 미생물들이armatic , indole .

기를 갖는 화합물의 분해에 역할을 함은 이미 알려진 사실이다 따라indole .

서 뇨 중 이들 아이노산 대사체들의 농도 변화는 장내미생물의 활성 변화에

서 기인한다고 생각할 수 있다 또한 이들 아미노산은 체구성성분 신경 전. ,

달물질의 전구체 역할을 함으로 이들의 대사경로 변화는 체내 생리활성에

영향을 줄 것으로 생각된다 이소플라보노이드와 리보플라빈은 체내 전자전.

달계의 구성요소이므로 이들 대사변화로 체내 활성에 영향을 줄 것으로 예

상된다 이와 같이 뇨 중 대사체 농도 변화을 관찰함으로서 는 장내 미생물.

의 활성에 의해 체내 다양한 생리활성이 변화되었음을 예측할 수 있었다.

○ 가지 항생제 혼합액 과 처리 전 후의 뇨 시료2 (neomycin streptomycin) rat

에서 담즙산과 그 대사체 대사 관련 효소 활성을 비교하여 합성 전구체 중, ,

과 의 농도가 현저히 감소하였고 담즙산cholesterol 25-OH-cholesterol ,

중 의 농도도 감소하였다 반면 담즙산 대사체인deoxycholic acid . 5β

와 간 독성을 유발한다고 알려진-cholestane 3 ,7 ,12 -triolα α α

의 농도 증가가 뚜렷이 확인되었다 이와 관련하여chenodeoxycholic acid .

cholesterol 7 -hydroxylase (cholesterol ⟶ 7α α

의 활성은 증가하였고-hydroxycholesterol) , 7 -dehydroxylase (cholicα

와acid ⟶ deoxycholic acid) 7 -dehydrogenaseα

의 활성은 감소하였(chenodeoxycholic acid ⟶ lithocholic acid)

음을 확인하였다 그러므로 항생물질 투여로 장내미생물이 없는 상태에서는.

대사경로에 있는 대사과정에 변화가 생길 수 있음이 관찰되었으cholesterol

며 과 같은 간 독성을 유발 할 수 있는 내인성 물질chenodeoxycholic acid

의 농도가 증가함으로서 간독성이 나타날 수 있음을 암시하였다.

○ 가지항생제 혼합액 을 투여하여 유3 (neomycin, streptomycin, bacitracin)

도된 의 뇨 중 담즙산과 그 대사체의 농도를pseudo germ-free rat model

비교하였을 때 군에서 및, pseudo germ-free cholesterol, 22(R)-OH-

과 같은 담즙산의 합성 전구체의 농도는 감소하였으나cholesterol cholic

와 같은 담즙산의 농도는 증acid, -muricholic acid, -muricholic acidα β

가하였다 가지 항생제 혼합액을 처리하여 유도한. 2 pseudo germ-free rat

의 뇨 중 담즙산의 농도변화와 유사한 양상을 관찰하였고 장내 미생model ,

물의 활성과 간독성과 밀접한 관련성이 있음을 확인하였다.

세부과제2-1 76767676////82828282


장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구hesperidinehesperidinehesperidinehesperidine

○ 을 으로 배양하여 분석기법으로 분Hesperidin rat liver microsome LC/MS

석하여 과 대사체를 확인하고 방법으demethylation hydroxylation MS/MS

로 군이 된 것을 확인하였다2-methoxyphenol demethylation .

○ 항생제 처리군과 대조군에 각각 을 용량으로 경구투여hesperidin 40 mg/kg

하고 혈장 내의 의total hesperetin (hesperetin+hesperetin glucuronide)

농도를 측정하였다 대조군에서 혈중농도가 항생제 처리군보다 유의성 있게.

높은 것을 확인할 수 있었고 와 는 대조군이 항생제 처리군보다AUC Cmax

각각 배 배 높았다 이 결과는 항생제 처리군에서 장내미생물이 감소2.7 , 2.9 .

하여 배당체 이 으로 대사되는 양이 감소함으로써hesperidin ( ) hesperetin

체내로의 흡수된 양이 감소되었다고 볼 수 있다.

장내미생물 대사가장내미생물 대사가장내미생물 대사가장내미생물 대사가 baicalin의 약동력학에 미치는 영향 연구의 약동력학에 미치는 영향 연구의 약동력학에 미치는 영향 연구의 약동력학에 미치는 영향 연구

○ 항생제 처리군과 대조군에 각각 을 용량으로 경구투여하baicalin 50 mg/kg

고 혈장 내의 의 농도를 측정하여 를baicalin pharmacokinetic parameter

비교한 결과 는 대조군이 항생제 처리군보다 배 높았고 도, AUC 1.4 Tmax

유의성 있게 차이가 보였다 이 결과는 항생제 처리군에서 장내미생물이 감.

소하여 이 으로 대사되는 양이 감소함으로써 체내로의 흡수baicalin baicalein

된 의 양이 감소되었고 따라서 체내의 의 양도 감소되었다baicalein baicalin

고 볼 수 있으므로 이 물질의 대사에 미생물이 영향을 미침을 확인할 수 있

었다.

장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구ginsenosideginsenosideginsenosideginsenoside

○ 및 의 에서 및 그Conventional germ-free mouse plasma ginsenoside Re

대사체를 분석 결과 모든 에서 인, mouse parent compound ginsenoside

가 검출되었고 일부 에서 그 대사체인 과Re , mouse ginsenoside Rg1

가 검출되었지만 그 외의 대사체는 검출되지 않았다ginsenoside Rg2 , .

의 혈중농도는 에서보다Ginsenoside Re conventional mouse germ-free

세부과제2-1 77777777////82828282


에서 더 높았으므로 의 흡수가mouse , ginsenoside Re conventional

에서보다 에서 더 잘된 것으로 나타났다 그러나mouse germ-free mouse . ,

두 그룹에서의 에서 통계적인 유의성은 검증할pharmacokinetic parameter

수 없었다 또한 순수한 를 단독 투여하였을 경우. ginsenoside Re

의 흡수가 매우 좋지 않아서 각 개체의 혈중 농도의 차이가ginsenoside Re

크게 나타난 것으로 보인다.

투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화투여 후 체내동태 및 장내미생물에 의한 대사체의 변화EsculetinEsculetinEsculetinEsculetin

○ 의 경구 투여 후 항생제 처리모델에서 대조군과 비교Esculetin (40 mg/kg)

하여 에 대한 의 유의성있는 차이가 없었으나Esculetin AUC ,

중pharmacokinetic parameter k(hr-¹), t1/2 은 대조군에 비해 항생(hr)

제 처리모델에서 통계처리상 유의성 있는 차이가 보였다. Esculetin을 투여

하였을 경우 은 혈액에서 검출되지 않았고 의 머무름 시간Esculin , Esculetin

앞쪽에서 에서는 검출 되지 않은 로 추정 이blank plasma peak (metabolite )

나타났으며 를 내부표준물질의 비로 계산한 결과 항생, unknown metabolite

제 처리군에서 더 높게 나타나 장내미생물이 의 체내동태에 영향Esculetin

을 주었다고 고려되었다.

○ 의 투여 후 대조군과 항생제처리군 모두에서 대사체인 이Esculin Esculetin

검출되었고 투Esculetin 여 후 대사체로 추정되었던 또한 검출되었다peak .

의 투여 후 항생제 처리 군에서 대조군에 비해 높은 를Esculin AUC 보였고

통계처리상 유의성 있는 차이가 나타났다 대사체로 검출된 의. Esculetin

에서도 유의성 있는 차이AUC 가 나타났으며 대사체로 추정되고 있는 peak

의 그래프 역시 항생제 처리 군에서 더 높은 경향을 보였다.

○ 투여 후 나타난Esculin Esculin pha 중rmacokinetic parameter AUCINF,

AUClast 에서 대조군과 비교하였을 때 통계처리상 유의성 있는 차이가, CL/F

나타났다 또한 대사되어 검출된 의. Esculetin pharmacokinetic parameter

중에서 AUCINF, AUClast 이 통계처리상 유의성 있는 차이가 보였, k(hr-¹)

다 이를 보아 장내 미생물이 의 체내동태에 영향을 주었다고 고려되. Escuin

었다.

세부과제2-1 78787878////82828282


장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구장내미생물 대사가 의 약동력학에 미치는 영향 연구geniposidegeniposidegeniposidegeniposide

○ 를 이용하여 혈장 중 분석법을 확립하였으며 본 분석법LC/MS/MS genipin

을 이용하여 에 대한 약동력학 연구를 수행하였다genipin .

○ 치자 색소 원료 중 의 함량을 분석한 결과 약 로 확인하였으geniposide 47%

며 이에 근거하여 로서 의 용량이 되도록 에 치자, geniposide 300 mg/kg rat

색소 원료를 투여하였다.

○ 정상쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 치자 색소 원료를 투여한 후 혈장 중

의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서 의genipin (genipin sulfate) genipin

및 는 유의적인plasma concentration profile pharmacokinetic parameter

차이를 보이지 않았다.

○ 정상군과 항생제 처리군의 분변시료를 분석한 결과 항생제 처리군에서

의 양이 대조군에 비하여 현저히 높게 나타남으로 미생물의 의한geniposide

에서 으로의 대사가 억제된 것으로 나타났다geniposide genipin .

○ 정상군과 항생제 처리군에서 혈중 가 검출되었으며 이는 장내에geniposide

서 의 형태로도 흡수가 되는 것을 나타났다 항생제 처리군의geniposide .

의 혈중 농도가 대조군에 비하여 높게 측정되었으나geniposide

에서 통계적인 유의성은 나타나지 않았다pharmacokinetic paramater .

○ 항생제 처리군에서는 미생물에 의한 생성이 거의 억제되었음에도 불genipin

구하고 정상군과 항생제 처리군에서의 프로파일이 유사하게 나타난genipin

것은 정상군의 경우 가 으로 대사된 후 이 위장관geniposide genipin genipin

에 존재하는 등과 반응하여 혈중으로 흡수되지 못한 것으로 사료되protein

었다.

아세트아미노펜과 그 대사체의 를 이용한 동시 정량분석방법의 개발아세트아미노펜과 그 대사체의 를 이용한 동시 정량분석방법의 개발아세트아미노펜과 그 대사체의 를 이용한 동시 정량분석방법의 개발아세트아미노펜과 그 대사체의 를 이용한 동시 정량분석방법의 개발LC-MS/MSLC-MS/MSLC-MS/MSLC-MS/MS

○ 를 이용하여 혈장 및 뇨 중 아세트아미노펜 및 가지 대사체에LC/MS/MS 6

대한 분석법을 확립하였으며 이때의 는 나, recovery APAP-Glth

를 제외한 나머지 물질들은 이상을 보였다 또한APAP-Cys 90% . matrix

대부분에서 수준을 나타내어 이 분석법이 아세트아미노펜effect 90-110%

및 대사체 분석에 적합함을 확인할 수 있었다.

세부과제2-1 79797979////82828282


○ 를 이용하여 아세트아미노펜 및 가지 대사체에 대한 분석법에LC/MS/MS 6

대하여 을 진행하였으며 모두 및 은 모든validation accuracy precision QC

에서 이내였으며 에서 를 만족하였다 그 외에도± 15% , LOQ ± 20% .

와 샘플을 저장 및 처리하는 조건하에 도 내에 기standard stability ± 15%

준에 만족하였다.

Pseudo germ-free rat modelPseudo germ-free rat modelPseudo germ-free rat modelPseudo germ-free rat model의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구

○ 개발된 분석법을 이용하여 아세트아미노펜과 그 대사체에 대한 에 대한 약

동력학 연구를 수행하였다.

○ 정상쥐와 항생제 처리 쥐에 각각 아세트아미노펜을 투여한 후 혈장 중 아

세트아미노펜 및 가지 대사체의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서 아세트6

아미노펜과 아세트아미노펜 글루타치온 포합체의 값이 유의적인 차AUC

이를 보였으며 항생제를 처리하여 만든 그룹에서 대, pseudo germ-free

조군에 비하여 두 가지물질이 더 높게 나타났다.

○ 항생제 처리군에서 를 제외한 대사체와 모약물인 모두APAP-Sul APAP

에서 반감기AUC, (T1/2 가 증가하고 와 분포용적) clearance (Cl/F)

(Vd 은 감소하는 경향을 보여 약효가 오래 지속될 수 있음이 관찰되었/F)

다 의 경우 실험한 두 군에서의 반감기. APAP-Sul (T1/2 는 거의 비슷하)

였으나 는 다른 대사체의 경우와 같이 항생제 처리군에서 감소하였으AUC

며 는 증가하였다 그러므로 이러한 결과로부터 장내미생clearance (Cl/F) .

물이 존재하지 않을 경우에는 약물의 약동력학 이 변(pharmaco kinetics)

화할 수 있다고 생각되었다.

○ 뇨 중 아세트아미노펜 및 가지 대사체의 농도를 분석한 결과 두 그룹에서6

모약물인 아세트아미노펜의 총 배설량에서 유의적인 차이를 보였으며 아세,

트아미노펜의 배설량이 그룹이 대조군에 비하여 감소하pseudo germ-free

였다.

○ 정상대조군에 비해 군에서 모약물인 아세트아미노펜의pseudo germ-free

혈중 는 증가하고 이로 인해 를 제외한 대사체들도 전체적AUC APAP-Sul

으로 값이 증가하는 경향을 보였다 특히나 의 경우AUC . APAP-Glth

가 증가됨에 있어서 유의성이 확인되었다AUC (p-value < 0.05).

세부과제2-1 80808080////82828282


는 에서 의 주대사체이므로 의 대사체 생APAP-Sul rat APAP APAP-Sul

성 저하는 의 혈중 증가에 기여했을 것으로 생각된다 장내미APAP AUC .

생물에 의해 아세트아미노펜의 포합대사경로가 영향을 받았을 것sulfate

으로 사료된다 모약물인 아세트아미노펜의 뇨 중 배설량이 감소는 장내.

미생물의 활성이 아세트아미노펜의 배설경로에도 영향을 준 것으로 사료된

다.

Germ free mouse modelGerm free mouse modelGerm free mouse modelGerm free mouse model의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구의 아세트아미노펜의 대사 및 약동력학 변화 연구

○ 세부와 연계하여 정상대조군 군 그리고 정착동물1-3 (SPF), germ-free

군 에서의 아세트아미노펜 및 대사체 분석을 진행하였으며 확(Gnotobiote) ,

립된 아세트아미노펜 및 그 대사체들의 분석방법을 이용하였다 의. Mouse

혈중 농도가 높기 때문에 에APAP-Glth, APAP-NAC, APAP-Cys , rat

서 확립한 방법을 적용하기 위해 혈액 시료를 희석하여 분석을 진행하였

고 이를 환산하여 정량하였다, .

○ 분석결과 가 주대사체였던 과는 달리 에서는APAP-Sul rat mouse

가 주 대사체로 확인되어 종간 차이를 관찰할 수 있었다APAP-Glc .

○ 용량으로 투여된 그룹에서 와 의 경우 대조300 mg/kg APAP APAP-Sul

군에 비해 군에서 가 유의적으로 증가되었으나germ-free AUC ,

의 경우 오히려 감소되는 것을 확인하였다APAP-Glc .

○ 로 투여된 그룹에서 의 경우는 대조군에 비해200mg/kg APAP-Glth

군에서 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다germ-free .

○ 군에서 대조군에 비해 를 제외한 대사체에서 모약Germ-free APAP-Sul ,

물이 대사체로 변화되는 비율이 감소되는 것을 확인할 수 있었고 정착동,

물군 에서 유의적인 차이는 없으나 대조군과 유사해지려는 경(Gnotobiota)

향성을 확인하였다.

○ 과 에서 아세트아미노펜에Pseudo germ-free rat germ-free mouse

대사가 완벽히 같은 방향성을 갖지는 않았지만 모두 각각에 대조군과 비교,

할 때 약동학적인 차이를 뚜렷이 확인할 수 있었다 이는 장내미생물이 아.

세트아미노펜에 대사에 중요한 영향을 미치고 있음을 시사한다.

세부과제2-1 81818181////82828282


참고문헌참고문헌참고문헌참고문헌6.6.6.6.

Douglas J. Fort et al., Evaluation of the developmental toxicities of

coumarin, 4-hydroxycoumarin, and 7-hydroxycoumarin using

FETAX. Drug and Chemical Toxicology, 21(1), 15-26 (1998).

Qiu Hong Chen et al., Determination of aesculin in rat plasma by high

performance liquid chromatography method and its application to

pharmacokinetics studies. Journal of Chromatography B, 858

(2007) 199-204.

S.L. Borna et al., Comparative metabolism and kinetics of coumarin in

mice and rats. Food and Chemical Toxicology 41 (2003) 247:258

Tung-Hu Tsai et al., Simultaneous blood and biliary sampling of

esculetin by microdialysis in the rat. Life Sciences, 65 (1999)

1647:1655

Chao Feng et al., Simultaneous Determination and Pharmacokinetics of

Four Coumarins in Rat Plasma after Oral Administration of

Traditional Chinese Medicine "YIGONG" Capsule by SPE-HPLC. J.

Braz. Chem. Soc.,21(2010): 2272-2277.

Feng Zuo et al., Pharmacokinetics of Berberine and Its Main

Metabolites in Conventional and Pseudo Germ-Free Rats

Determined by Liquid Chromatography/Ion Trap Mass

Spectrometry. Drug Metab Dispos, 34 (2006) 2064-2072.

Kinouchi T, Kataoka K, Miyanishi K, Akimoto S, Ohnishi Y. Biological

activities of the intestinal microflora in mice treated with

antibiotics or untreated and the effects of the microflora on

absorption and metabolic activation of orally administered

glutathione conjugates of K-region epoxides of 1-nitropyrene.

Carcinogenesis. 1993;14(5):869-74

Hewavitharana AK, Lee S, Dawson PA, Markovich D, Shaw PN.

Development of an HPLC-MS/MS method for the selective

determination of paracetamol metabolites in mouse urine. Anal

Biochem. 2008;374(1):106-11.

세부과제2-1 82828282////82828282


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2-1세부과제