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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS
Purificación de LDH de músculo de Gallus gallus
LDH Gallus gallus
>sp|P00340|LDHA_CHICK L-lactate
dehydrogenase A chain OS=Gallus gallus
GN=LDHA PE=1 SV=3
MSLKDHLIHNVHKEEHAHAHNKISVVGVGA
VGMACAISILMKDLADELTLVDVVEDKLKGE
MLDLQHGSLFLKTPKIISGKDYSVTAHSKLVIVT
AGARQQEGESRLNLVQRNVNIFKFIIPNVVK
YSPDCKLIVSNPVDILTYVAWKISGFPKHRVIG
SGCNLDSARFRHLMGERLGIHPLSCHGWIVG
EHGDSSVPVWSGVNVAGVSLKALHPDMGTD
ADKEHWKEVHKQVVDSAYEVIKLKGYTSWAI
GLSVADLAETIMKNLRRVHPISTAVKGMHGIK
DDVFLSVPCVLGSSGITDVVKMILKPDEEEKIK
KSADTLWGIQKELQF
>sp|P00337|LDHB_CHICK L-lactate
dehydrogenase B chain OS=Gallus gallus
GN=LDHB PE=1 SV=3
MATLKEKLITPVAAGSTVPSNKITVVGVGQV
GMACAISILGKGLCDELALVDVLEDKLKGEM
MDLQHGSLFLQTHKIVADKDYAVTANSKIVV
VTAGVRQQEGESRLNLVQRNVNVFKFIIPQI
VKYSPNCTILVVSNPVDILTYVTWKLSGLPKHR
VIGSGCNLDTARFRYLMAERLGIHPTSCHGW
ILGEHGDSSVAVWSGVNVAGVSLQELNPAM
GTDKDSENWKEVHKQVVESAYEVIRLKGYTN
WAIGLSVAELCETMLKNLYRVHSVSTLVKGTY
GIENDVFLSLPCVLSASGL
LDHA LDHB
CICLO DE CORI
↑Demanda de ATP
↓O2
Piruvato NADH
Lactato deshidrogenasa
(LDH)
L-Lactato NAD+
Hígado
Sangre
Músculo
Glucosa Glucosa Glucógeno
L-Lactato L-Lactato
ATP + GTP
ADP + GDP + Pi
ADP + Pi
ATP
Glucogenolisis y
Glucólisis
Gluconeogénesis
2. PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA
LACTATO DESHIDROGENASA DE
MÚSCULO ESQUELÉTICO DE BOVINO
PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.
¿PARA QUÉ PURIFICAR UNA PROTEÍNA?
Lipasa
Hexosa oxidasa
Vacuna Hepatitis B
Insulina
Gelatina
Proteínas recombinantes
varias
Pectinoesterasas
•Suero fetal bovino
•Colorante de carne
•Proteína liofilizada
¿POR QUÉ QUEREMOS PURIFICAR UNA
PROTEÍNA?
Precisar secuencias de aminoácidos.
Establecer relaciones evolutivas.
Investigar la función bioquímica.
Establecer relaciones estructura-función.
Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas
GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
• Definir los objetivos.
Pureza, actividad y cantidad.
•Definir las propiedades de la proteína de interés e impurezas.
PM, pI, solubilidad, estabilidad. Componentes que puedan dañar
a las proteínas (ejm proteasas).
• Seleccionar la fuente de proteína.
Organismo, tejido, localización celular.
• Desarrollar una técnica de análisis.
Para una detección rápida de la actividad de la proteína.
GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
•Minimizar el manejo de la muestra.
Evitar procedimientos largos.
• Minimizar el uso de aditivos.
Usar lo mínimo necesario.
• Eliminar los contaminantes dañinos rápidamente.
Por ejemplo, las proteasas.
• Usar una técnica diferente en cada paso.
Con el fin de aprovechar al máximo las características de la muestra
en el proceso de separación.
GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
•Reducir el número de pasos.
Los pasos extra reducen el rendimiento e incrementan el tiempo de
purificación.
¿QUÉ PARÁMETROS DEBEMOS CONSIDERAR
PARA ELEGIR UNA TÉCNICA DE PURIFICACIÓN?
Resolución: Depende de la selectividad y eficiencia de la técnica de separación.
En general, una resolución elevada es más importante al final del proceso de
purificación.
Capacidad del método: Se refiere a que tanta muestra puede ser procesada por
el método. La cantidad de muestra así como el volumen, disminuyen a lo
largo del proceso.
Velocidad: Es más importante al inicio de la purificación, donde los
contaminantes como las proteasas deben ser removidas lo más rápido posible.
Rendimiento: Es muy importante porque incrementa el valor de la pureza del
producto. El rendimiento puede disminuir por procesos destructivos o por
condiciones desfavorables para la muestra durante la purificación.
DEFINIR LOS OBJETIVOS: FASES DE LA
PURIFICACIÓN
Las tres fases de purificación aseguran un método rápido, de buen
rendimiento y económico.
DEFINIR LOS OBJETIVOS: FASES DE LA
PURIFICACIÓN
1. Fase I ó fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y
estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los
contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la
proteína.
2. Fase II ó fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría de
las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos,
endotoxinas y virus.
3. Fase III ó fase de perfeccionamiento, la mayoría de las
impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están
muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran
en cantidades muy pequeñas. El objetivo es logar la mayor
pureza posible.
DEFINIR LAS PROPIEDADES DE LA PROTEÍNA DE
INTERÉS
•La información es útil para detectar la proteína a través
de SDS-PAGE, también es importante cuando
seleccionamos un método de filtración en gel.
Peso Molecular
•El conocer el valor del pI puede ser utilizado con
diferentes propósitos: pp isoeléctrica, selección de
columna de intercambio iónico, pH de trabajo.
pI
•Afectada por temperatura, pH, fuerza iónica. Esto debe ser
considerado para evitar la agregación y precipitación de la
proteína. También útil para separación.
Solubilidad
•Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para
elegir una columna de interacción hidrofóbica. Polaridad
•Ligandos útiles para separar la proteína. Unión Específica
•En términos de actividad, agregación y composición de
subunidades. Las características físicas y químicas de la
proteína son importantes a lo largo del proceso.
Estabilidad
SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA
La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en
criterios tales como:
a) la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del
que se aísla la proteína,
b) la cantidad de la proteína de interés en el tejido y
c) cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida, que
ayudará en su estabilización y su aislamiento.
RUPTURA DE LA CÉLULA
¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE?
ESTABILIDAD
Las proteínas se desnaturalizan fácilmente por temperaturas elevadas,
aunque algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las
proteínas debe llevarse a cabo a 0°C ó temperaturas cercanas.
•Suaves:
Lisis celular (choque osmótico)
Digestión enzimática (lisozima)
Lisis química (detergentes)
Homogenización manual
Molienda
Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína,
pero no aseguran su liberación celular.
MÉTODOS
RUPTURA DE LA CÉLULA
¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE?
ESTABILIDAD
•Moderados:
Homogenización con cuchillas
Molienda abrasiva
Congelamiento
•Vigorosos:
Ultrasonicación
Homogenizador Manton-Gaulin
Prensa francesa
Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.
MÉTODOS
SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA
Buffer de Lisis
Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e
incluso mejorar la estabilidad de la proteína.
pH
Debe ser al menos una
unidad arriba o abajo del
pI de la proteína. Ésta
diferencia previene la pp
isoeléctrica, por el
mantenimiento de cargas
positivas o negativas en
la proteína.
Fuerza Iónica
Incrementar la fuerza
iónica del medio puede
reducir las interacciones
iónicas entre las proteínas
y las pérdidas por pp.
Aditivos
Son componentes que
previenen la degradación
y mejoran la estabilidad.
Se deben agregar solo si
es necesario.
SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA
Aditivos
FRACCIONAMIENTO CELULAR:
CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
La centrifugación es una técnica
utilizada para eliminar contaminantes
o clarificar la muestra e implica la
separación de los componentes con
base en las diferencias en densidad,
tamaño y forma. Como resultado, el
efecto de la gravedad para cada
proteína es diferente.
De manera general, partículas más
grandes y pesadas migran a lo largo
del medio más rápido y se sedimentan
en el fondo del tubo de centrífuga en
menor tiempo.
LA FUERZA CENTRÍFUGA RELATIVA (RCF)
De esta depende qué componentes se sedimentarán y
cuáles se quedarán en suspensión. Se calcula con la
siguiente ecuación:
Donde RPM son las revoluciones por minuto de un
rotor con una distancia r (expresada en mm). El radio
usado es la distancia del centro del eje del rotor a la
posición intermedia del tubo.
2
1000
RPM1.12rRFC
FR
AC
CIO
NA
MIEN
TO
C
ELU
LA
R:
CEN
TR
IFU
GA
CIÓ
N D
IFER
EN
CIA
L
Diagrama
para la
obtención de
diferentes
fracciones
celulares
Homogenización
del tejido
Baja velocidad de centrifugación
(1 000 g, 10’)
Baja velocidad de centrifugación
(1 000 g, 10’)
Sobrenadante sujeto a velocidad de
centrifugación media
(20 000 g, 20’)
Sobrenadante sujeto a velocidad de
centrifugación alta
(80 000 g, 1 h)
Sobrenadante sujeto
a velocidad de
centrifugación
muy alta
(150 000 g, 3 h)
Sobrenadante
contiene
proteínas
solubles
Tejido
homogenado
Pellet,
contiene
células
completas,
núcleos,
membranas
plasmáticas
Pellet,
contiene
mitocondrias,
lisosomas,
peroxisomas
Pellet, contiene
microsomas
(fragmentos de
RE), vesículas
pequeñas
Pellet, contiene ribosomas,
macromoléculas grandes
FRACCIONAMIENTO CELULAR: GRADIENTE DE
DENSIDAD
Las partículas pueden separarse con base
en su densidad. En los oganelos, las
diferencias de densidad están dadas por
diferencias en la composición lipídica y
protéica.
Un gradiente de densidad se establece
colocando cristales de sacarosa al fondo
de un tubo de ensaye. La sacarosa se
disuelve en la solución y difunde
lentamente a lo largo del tubo hasta la
parte superior.
Si la densidad de la partícula es mayor
que la de la solución periférica, ésta
migrará hasta la zona de la solución
donde la densidad sea la misma que la de
partícula.
FR
AC
CIO
NA
MIEN
TO
C
ELU
LA
R: G
RA
DIEN
TE D
E
DEN
SID
AD
Otros
compuestos
utilizados para
formar el
gradiente:
detergentes no
iónicos, Ficoll,
Percoll,
Nycodenz y
Optiprep.
Centrifugación
Muestra
Gradiente
de Sacarosa
Componentes
menos densos
Componentes
más densos
Fraccionamiento
REMOVER CONTAMINANTES Y/O CONCENTRAR
LA MUESTRA
Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el
siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes
métodos:
Ultrafiltración
Liofilización
Precipitación
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD
La solubilidad de una proteína es sensible a la
temperatura, el pH, la fuerza iónica.
Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir
o incrementar la solubilidad de la proteína.
El método más comúnmente empleado es la
precipitación por salado con (NH4)2SO
4.
¡Y es el que vamos a hacer en la práctica!
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD
Fuerza Iónica
Lo
g (S/S’)
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD
Los iones adicionales
proporcionados por la sal,
protegen a los radicales
cargados de las proteínas,
evitando que interactúen entre
sí. Los iones salinos, además,
tienen la capacidad de formar
redes de hidratación y
provocan un aumento de la
cantidad de agua retenida por
la proteína.
Competencia entre los iones
adicionales y los radicales
cargados de las proteínas por
las moléculas de solvatación,
haciendo insuficiente el
volumen de disolvente. Las
interacciones soluto-soluto se
vuelven más fuertes que las
interacciones soluto-disolvente,
entonces los solutos pp.
Salting in Salting out
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD
Solubilidad
Capa de
Hidratación Salting in
Salting out
Concentración de sal
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD
¿CÓMO VAMOS A
PURIFICAR A LA
LACTATO
DESHIDROGENASA DE
MÚSCULO DE POLLO?
¿CÓMO CALCULAR LA CONCENTRACIÓN DE
SULFATO DE AMONIO A UTILIZAR?
EXISTEN TABLAS QUE NOS INDICAN CUANTO
AÑADIR DE SULFATO DE AMONIO
Y TAMBIÉN EN INTERNET
http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl
Conocer:
1. Sulfato de amonio sólido
2. Conocer el volumen de la solución
3. Y la concentración final de la sal
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es importante?
SOLUBILIDAD
Otros métodos…
Pp con polietilenmina (PEI).
Pp con solventes orgánicos: EtOH y Acetona, a
temperaturas bajas para evitar desnaturalización de
proteína.
Pp isoeléctrica. Al pI de la proteína con baja fuerza
iónica.
Pp térmica. Para proteínas termoestables, las proteínas se
calientan, desnaturalizan y pp, la proteína de interés es
estable y se mantiene soluble.
Pp con PEG.
DESALAR
¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE?
FORMA Y TAMAÑO
Una vez que se obtiene el pp de una mezcla proteína hay que
eliminar la sal o medio utilizado para la precipitación.
La sal puede interferir en los posteriores pasos de purificación
La sal puede alterar las propiedades biológicas de la proteína
FILTRACIÓN. A través de una membrana porosa
DIÁLISIS. Es un método de separación basado en el tamaño de las
moléculas en solución por la difusión selectiva a través de una
membrana permeable.
FILTRACIÓN EN GEL.
DESALAR
¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE?
FORMA Y TAMAÑO
También llamada exclusión molecular, las moléculas se separan
de acuerdo a su forma y tamaño.
Fase sólida estacionaria . Consiste en una matriz de moléculas
de gel que contienen cavidades de un tamaño molecular
determinado.
Fase móvil. Acarreará a la mezcla de proteína.
DESALAR
¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE?
FORMA Y TAMAÑO
Las proteínas más grandes no serán capaces de entrar en las cavidades de
las moléculas de gel, entonces tomarán un “camino más corto” y pasarán
a través de la columna más rápido. Las proteínas pequeñas, serán capaces
de entrar a las cavidades, recorrerán un “camino más largo” y pasarán a
través de la columna lentamente.
A280
Equilibrio
Volumen de
inyección de
muestra
Volúmenes de Columna (CV)
Peso
molecular
alto
Peso molecular
intermedio
Peso
molecular
bajo
DESALAR
¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE?
FORMA Y TAMAÑO
ENSAYO ANALÍTICO
Cuantificar proteína:
Bradford o Lowry los
más usados.
Determinar actividad.
SDS-PAGE.
Piruvato NADH
Lactato deshidrogenasa
(LDH)
L-Lactato NAD+
Propiedades de LDH de Gallus gallus
LDH A LDH B
Numero de aminoácidos 332 333
Peso molecular (Da) 36514.4 36318.0
Punto isoeléctrico 7.75 7.07
Promedio general de hidropaticidad (GRAVY) -0.004 0.087
Localización celular Citoplasma Citoplasma
Forma activa Homotetrámero Homotetrámero
Superfamilia LDH/MDH LDH/MDH
Tipo de enzima Oxidoreductasa Oxidoreductasa
Cofactor NAD+
NAD+
