Upload
-
View
53
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
genetika
Citation preview
MODEL SISTEMI U MOLEKULARNOJ BIOLOGIJI
Model sistemi• Živi organizmi nad
kojima se vrše eksperimenti
• Izbor model sistema prevashodno zavisi od predmeta i ciljeva istraživanja ali i od karakteristika samih model sistema
• Razne prirodne nauke razni model sistemi
Model sistemi• Model sistem – čovek
• Sa etičkog, socijalnog i moralnog aspekta
POTPUNO NEPRIHVATLJIVO
Model sistemi u molekularnoj biologiji
• Laka eksperimentalna manipulacija i broj• Bakteriofagi• E. coli• Kvasac• C. elegans• D. melanogaster• M. musculus
Bakteriofagi
Bakteriofagi - virusi• Jednostavan sistem za istraživanje bazičnih procesa
molekularne biologije• U periodu razvoja molekularne biologije, pored bakterija,
glavni model sistem• Genom je molekul DNK ili RNK koji svoje gene
eksprimiraju tek nakon infekcije ćelije domaćina – obligatni intracelularni paraziti
Bakteriofagi
• Bakteriofagi su virusi čija je simetrija kompleksna, a veličina im se kreće u granicama od 24 nm do 200 nm.
• Otkrio ih je 1915. godine Englez Frederik Tvort.
• Prvi elektronsko-mikroskopski snimak bakteriofaga načinio je Tom Aderson 1942. godine.
Bakteriofag• Glava• Vrat• Okovratnik• Rep• Bazna ploča• Fibrile• Repne bodlje
Bakteriofagi “gajenje” u bakterijskim kulturama
• Latentni period – od infekcije do umnožavanja virusne nk i formiranja novih kapsida
• Period eksplozije u broju formiranih faga• Formiraju plakove
Litički rast
Nekoliko hiljada kopija DNK virusa
Lizogeni rast
• Umereni fag• Profag
Bakteriofag• Dvolančana DNK• 45 kb do 200 kb • Jednolančana DNK• Dvolančana RNK• Jednolančana RNK• fag - poseduje dvolančani molekul DNK
dužine168.903 bp na kojoj se nalazi 300 gena • M13 - filamentozni bakteriofag sa jednolančanim
molekulom DNK
Bakteriofagi
MODEL SISTEM ZA ISTRAŽIVANJE
• DNK replikacije• Ekspresije gena• Rekombinacija DNK• Ko-infekcija – za analizu mutacija
Značaj u tehnologiji rekombinovane DNKFagna terapija
Bakterije• Homologa populacija ćelija – klon• Razmnožavanje prostom deobom• Ćelijski ciklus kratak – 20 minuta
Naslednost osobinaMutabilnost
Bakterije – model sistem• Escherichia coli – gram -• Vreme generacije 20 minuta • Prekonoćna kultura sadrži oko 2x109 ćel/ml• Haploidna ćelija• Bacillus subtilis - gram +
Bakterije u laboratorijskim uslovima
• Rastu u tečnom ili čvrstom (agaroznom) medijumu u petrijevoj šolji – laboratorija
• Golim okom vidljive kolonije• Eksponencijalan rast do stacionarne faze
Bakterijska ćelija• 0.2 – 60 μm • 70S ribozomi• citoplazmatske vezikule i inkluzije • Zid• Pili• Flagela
Bakterijska DNK• Deo bakterijske ćelije u kojoj se
nalazi DNK molekul - nukleoid• Jedan kružni molekul DNK • “Bakterijski hromozom”• Veličina prokariotskog genoma
proporcionalna broju gena• Mali nekodirajući segmenti DNK -
kod E. coli 11 %
• Nema introna*• Geni organizovani u operone• Plazmidi i transpozoni
Plazmidi• Ekstrahromozomski molekuli DNK koji
imaju sposobnost autonomne replikacije - autonomni replikoni.
• Veličina od 1 kb do 400 kb. • Sadrže gene čiji proteinski produkti
učestvuju u procesu autonomne replikacije plazmidne DNK.
• Kod mnogih plazmida registrovano je prisustvo gena čiji su proteinski produkti odgovorni za razvoj otpornosti (rezistencije) bakterijske ćelije na određene antibiotike.
Bakterijski genom 105 – 107 bp
• Procesi koji mogu imati efekta na veličinu bakterijskog genoma:• Mutacije po tipu delecija i inverzija.• Transpozicija (aktivnost mobilnih genetičkih elemenata u okviru
genoma).• Horizontalni transfer gena - proces prenosa genetičkog
materijala - segmenta DNK molekula iz jedne bakterijske ćelije u drugu
Prenos genetičkog materijala
Donatorska ćelija
Recipijentna ćelija
Fragment DNK
a. inkorporiran u hromozom recipijentne ćelijeb. opstaje u ekstrahromozomskom obliku - plazmid
• HORIZONTALNI GENSKI TRANSFER• Transformacija• Transdukcija• Konjugacija
Transformacija• Prihvatanje slobodne DNK iz spoljašnje sredine i transport
u unutrašnjost ćelije.• Otkriće fenomena transformacije bio je prvi naučni korak u
dokazivanju nosioca naslednih osobina (Frederick Griffith).
Litički Lizogen
Transdukcija• Određeni umereni bakteriofagi kod prelaska iz lizogenog
u litički ciklus imaju mogućnost da “upakuju” fragment bakterijske DNK u kapsid. Takvi fagi nazivaju se transdukujući fagi.
• Transdukujući fagi prenose fragmente bakterijske DNK iz jedne u drugu bakterijsku ćeliju – GENERALIZOVANA TRANSDUKCIJA.
Transdukcija• Ako transdukujući fag (koji sadrži i deo DNK bakterijskog
hromozoma) nanovo pređe iz litičkog u lizogeni ciklus (u novoj bakterijskoj ćeliji) inkorporira bakterijski segment DNK u bakrerijsku DNK nove ćelije domaćina. Ovaj proces naziva se restriktivna transdukcija.
• MehanizamREKOMBINACIJA
Konjugacija• Prenos DNK koji se odvija direktnim kontaktom dve bakterije
• Plazmidi
Konjugacija• F faktor• Prvootkriveni plazmid• Konjugativni plazmidSadrži gene neophodne zaodigravanje konjugacijePROCESa. Kontakt 2 ćelije (preko pila)b. Replikacija plazmidac. Transfer plazmidapreko citoplazmatskogmostića
Mycoplasma genitalium • Klasa: Mollicutes• Bakterije bez ćelijskog zida• Veličina 0.2-0.3 μm • Izolovan iz uretralnog brisa
bolesnika sa uretritisom • Parazit respiratornog i
genitalnog trakta primata• Najmanji poznati genom
580,070 bp• 470 protein kodirajućih gena,
3 rRNK gena, 33 tRNK gena
E. coli
• Domaćin i čovek• 1997. godine “očitan” genom• 4,639,221 bp• 4.288 proteina • Najpoznatiji plazmid – F- faktor
BakterijePrvi prozor molekularne genetike
• Model sistem na kome su otkriveni i/ili dokazani fundamentalni molekularno - biološki procesi: Semikonzeravativan način replikacije molekula DNK, osnovi postulati regulacije procesa transkripcije, mutacije i reper sistemi....
• Tehnologija rekombinovane DNK i ostali metodološki pristupi
Saccharomyces cerevisiae
• Pivski kvasac veličine od 5 m• Jednoćelijski eukariot• Tipičan i najintezivnije istraživan eukariot• Laka eksperimentalna manipulacija• 90 minuta dovoljno da dođe do deobe
Saccharomyces cerevisiae• Haploidne forme a i α (jedna
kopija svakog hromozoma)• Haploidne ćelije opstaju
samo ako su delecijom ili nekom drugom mutacijom pogođeni neesencijalni geni
• Dipolidna forma (dve kopije svakog hromozoma) nastaje fuzijom dve haploidne ćelije kvasca
• Mejozom diploidne ćelije kvasca nastaju 4 produkta tzv. tetrade
• Sporulacija
Saccharomyces cerevisiae
• Najmanji eukariotski genom• 1996. godine “očitan”
genom• 16 hromozoma• 13.000.000 bp (13 Mb)• 6.275 gena (funkcionalno
5.885 gen) • U 231 genu detektovano
prisustvo introna
Saccharomyces cerevisiae
• Regulacija ekspresije gena eukariota• Rekombinacija molekula DNK• Replikacija molekula DNK• Translacija• Obrada primarnog transkripta• Prvi model sistem funkcionalne genomike• Kvaščev veštački hromozom – YAC – eukariotski vektor
Caenorhabditis elegans
• Phylum Nematoda • Model sistem u molekularnoj
biologiji i biologiji razvića od 1965. godine
• Prvi je u eksperimentalnom radu upotrebio Sydney Brenner (Nobelova nagrada 2002).
• Danas se C. elegans, kao model sistem, koristi u stotinama laboratorija širom sveta
Caenorhabditis elegans
• Valjkasti crvi široko rasprostranjeni u prirodi • 1 mm• Bilateralna simetrija• Hermafrodit • 959 ćelija u adultnom hermafroditu• 1031 ćelija u adultnom mužjaku
Caenorhabditis elegans• Embrionalni razvoj 12 sati• 131 ćelija hermafrodita
odnosno 111 ćelija mužjaka tokom embriogeneze umire procesom apoptoze
• Četiri larvena stadijuma (L1-L4),
• Dauer – forma larve rezistentna na sredinske faktore
• Juvenilni oblici i adult• Kompletan životni ciklus 3
dana
Caenorhabditis elegans• 1983. g. John Sulston – mapu ćelija C. elegans• 1986. g. Joch White – EM-snimci svih ćelija
• Mutacije u ćelijama vulve hemafrodita (22 epidermalne ćelije) dovodi do razvoja embriona unutar organizma.
• Detektovano na stotine mutacija koje uzrokuju promene na vulvi
• Neke od tih mutacija “pogađaju” gene čiji su proteinski produkti uključeni u procese prenosa signala i u kontroli ćelijske proliferacije
• Mnogi sisarski analozi ovih gena su onkogeni ili tumor supresorni geni
Caenorhabditis elegans
- Genom sekvenciran 2002. godine- 5 para autozoma i 2 polna hromozoma X- Jedinske sa dva polna hromozoma su
hermafroditi- Nondisjunkcijom, retko, gubi se jedan X
hromozom i takvi crvi postaju mužjaci sposobni da fertilišu jaja hermafrodita
- 100,258,171 bp duga DNK- 19.000 – 20,000 - protein-kodirajućih gena- Prosečno pet egzona po genu
2002. godine - Nobelova nagrada za fiziologiju ili medicinu
• Za oktriće procesa regulacije razvića organizma i programirane ćelijske smrti kod Caenorhabditis elegans
• Sydney Brenner, H. Robert Horvitz, John E. Sulston
2006. godine - Nobelova nagrada za fiziologiju ili medicinu
• Andrew Zachary Fire • Craig Cameron Mello• 1998. godine• RNK interferencija
Drosophila melanogaster
• Jedan og prvih i glavnih model sistema u biologiji
• 1908.g. Morgan – Columbia University• Istraživanje “naslednosti” • Boje očiju voćnih mušica• Dostupne i lake za laboratorijsku manipulaciju
Drosophila melanogaster
• Veličina vinske mušice do 3 mm• Ženke krupnije od mužjaka• Životni vek kratak i žive oko 2 nedelje
Drosophila melanogaster
• Ženka polaže 400 jaja• Embriogeneza 1 dan• Metamorfoza larvi duga je 5 dana• Adultni oblici nastaju sazrevanjem pupe.
• Larve karakteriše prisustvo imaginalnih diskova, tkiva nastalih invaginacijom epidermisa embriona.
• Svaki od njih ima oko 100 ćelija u embrionu i narasta u formaciju od preko 10.000 ćelija u larvi.
• Od ovih parnih formacija razvijaju se organi adultnih vinskih mušica kao što su oči, antene, genitalije, itd...
• Eksperimentalna manipulacija imaginalnim diskovima predstavlja jedan od najpoznatijih načina istraživanja metamorfoze i embrionalnog razvoja uopšte.
Drosophila melanogaster
• 4 para hromozoma: jedan (X ili Y) polni i tri autozomna obeležena kao 2,3 i 4.
• 1998.g. sekvenciran genom• 122.653.977 bp DNK• 13. 379 gena
Drosophila melanogaster
• 50% proteina D. melanogaster ima svoje sisarske homologe
• Model sistem za istraživanje - neurodegenerativnih bolesti - malignih bolesti - dijabetesa
Genetička sličnost sa H. sapiens
Mus musculus• Najčešći model sistem u molekularnoj biologiji i
medicini
• 14 – 28 g• do 20 cm• do 2 godine
• Najmarkantnija razlika između polova je ta štomužjaci nemaju bradavice
Embriogeneza
13 ICM ćelijaStem ćelije
Kultivacijom sa odgovarajućim faktorima rasta može se indukovati rast svih adultnih tipova ćelija miša
Placenta
Mus musculus
Bazični principiotkriveni kod
C. elegans i
D. Melanogaster
Bolesti čoveka
link
Mus musculus
• Genom “očitan” 2002. godine• 40 hromozoma• 2.267.775.209 bp • do 23.000 gena
“mini čovek”
Transgeni miševi i miševi sa izbačenim genom
Nezaobilazan eksperimentalan model u istraživanjima• Razvoja čoveka• Biologije ponašanje čoveka• Patogeneze bolesti čoveka
neoR TK
Transgeni miševi• Mikroinjekciona metoda• Muški pronukleusi izolovani iz
oplođene jajne ćelije• Gen od interesa inkorporiran u
vektor• Po principu slučajnosti klonirani
gen se raspoređuje po genomu• Jajna ćelija prenosi se u jajovod
“lažno” trudnih ženki• Embrioni sa kopijama
rekombinantne DNK - transgen
Invertni mikroskop ( 400x) i specijalna mikromanipulatorna
injekciona pipeta kojim se fragmenti molekula DNK insertuju u pronukleuse
Transgeni miševi• Transgeni se ugrađuju i u
somatske i u polne ćelije te se prenose i na potomstvo
• Proizvodnja linija transgenih miševa
• Model sistemi za istraživanje različitih aspekata funkcije gena i njihovih produkata
“Knockout” miš Miševi sa izbačenim genom
• Za razliku od transgenih miševa kod kojih je ugrađen novi genski materijal, mogu se “proizvesti” i životinje kod kojih neki gen nedostaje ili je nefunkcionalan.
• Proizvodnja takvih životinja zasniva se na postupku kojim se normalni gen in vitro “zamenjuje” mutiranim genom.
• Vrlo koristan model sistem – daju odgovore na pitanja kako nedostatak nekog gena utiče na različite funkcije u ćeliji, tkivu.... Organizmu.
“Knockout” miš• Kultivacija embrionalnih stem
ćelija• Homolognom rekombinacijom
“dobija se” mutirana / inaktivna kopija željenog gena
• Selektovane embrionalne matične ćelije koje sadrže promenjeni gen prenose se u novu blastocistu a ona se unosi u matericu “lažno” trudne ženke
Miševi sa izbačenim genom• Homolognom rekombinacijom se u ciljnu sekvencu
inkorporira gen za rezistenciju na lek npr. antibiotik neomicin.
• Fragmente sa normalnim alelima, kod kojih se nije odigrala rekombinacija, ubija neomicin
• Marker nehemologe rekombinacije je gen za timidin kinazu čiji proteinski produkt fosforiliše ganciklovir.
• Fragmenti koji su rezultat nehomologne rekombinacija “poseduje” i gen za timidin kinazu.
• Ovi fragmenti se “anuliraju” rastom u medijumu sa ganciklovirom.
• Fosforilisani ganciklovir je nukleotidni analog. Njegovo inkorporiranje u DNK, tokom sinteze DNK, dovodi do smrti ćelije.
“Knockout” miš
• Preživljavaju samo DNK fragmenti koji su rezultat rekombinacije sa genom za rezistentnost na neomycin i bez gena za timidin kinazu