Upload
dinhkien
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1 vod
Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole
2.1 M
jednotka se bude vnovat podrobn
Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen
technologie vzniku,
Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu
Tak si v
2 Princip
DNA mikroip je
imobilizovanch rovnomrn
(obvykle v
Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se
mikroipu a tm dochz k
oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s
kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl
kvantifikuj.
Nejastji se
Men zmn v
pomoc
Detekci strukturnch zmn genomu
jednonukleotidov polymorfizmy
D
D
neznmch
Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v
vod
Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole
Mikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov
jednotka se bude vnovat podrobn
Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen
technologie vzniku,
Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu
Tak si v tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.
Princip a rozdlen
DNA mikroip je
imobilizovanch rovnomrn
(obvykle ve form
Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se
mikroipu a tm dochz k
oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s
kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl
kvantifikuj.
ejastji se pouv k
Men zmn v
pomoc cDNA)
Detekci strukturnch zmn genomu
jednonukleotidov polymorfizmy
Detekci vazebnch mst protein na DNA
Detekci alternati
neznmch
Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v
Obrzek
Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole
ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov
jednotka se bude vnovat podrobn
Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen
technologie vzniku, jak probh kvantifikace men a
Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu
tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.
a rozdlen
DNA mikroip je mikroip sloen z
imobilizovanch rovnomrn
cDNA) ve
Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se
mikroipu a tm dochz k jejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm
oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s
kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl
pouv k
Men zmn v hladinch genov exprese
cDNA) expresnDetekci strukturnch zmn genomu
jednonukleotidov polymorfizmy
azebnch mst protein na DNA
alternativnho
neznmch nebo nepredikovanch transkript
Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v
Obrzek 1 Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.
Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole
ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov
jednotka se bude vnovat podrobnji jejich
Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen
jak probh kvantifikace men a
Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu
tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.
a rozdlen DNA mikroip
mikroip sloen z
imobilizovanch rovnomrn na pevn
vzorku (Obr. 1)
Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se
jejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm
oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s
kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl
hladinch genov exprese
expresn mikroipyDetekci strukturnch zmn genomu
jednonukleotidov polymorfizmy)
azebnch mst protein na DNA
ho sestihu (exon junction nepredikovanch transkript
Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v
Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.
1
Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole
ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov
jejich nejrozenj skupin
Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen
jak probh kvantifikace men a
Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu
tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.
DNA mikroip
mikroip sloen z krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)
pevn podklad,
(Obr. 1).
Fragmenty DNA/cDNA ze vzorku se pruj sjejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm
oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s
kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl
hladinch genov exprese (gene
mikroipy Detekci strukturnch zmn genomu (zmny v
) arrayCGH, SNP azebnch mst protein na DNA ChIP
exon junction nepredikovanch transkript
Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v
Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.
Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole
ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov
nejrozenj skupin
Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen
jak probh kvantifikace men a jak vznik
Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu
tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.
DNA mikroip
krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)
podklad, pouvan
pruj s komplementrnmijejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm
oznaeny fluorescennm barvivem se pak daj detekovat s pomoc UV skeneru jako signl,
kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl
gene expression profiling
pot kopi gen, nebo
arrayCGH, SNP arraysChIP-on-chip
exon junction arrays) nebo pesnounepredikovanch transkript (tiling arrays
Jednotliv kroky mikroipovho experimentu si popeme v nsledujc kapitole.
Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.
Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole
ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov
nejrozenj skupin DNA mikroipKrom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen
vznik zkladn datov matice
Kad technologie m svoje specifika, kter se odr ve zpsobu analzy jejich dat.
tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.
krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)
pouvan k detekci DNA n
komplementrnmijejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm
pomoc UV skeneru jako signl,
kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl
expression profiling
pot kopi gen, nebo
arrays chip
nebo pesnou
tiling arrays)
nsledujc kapitole.
Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.
Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole
ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov
mikroip. Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen
zkladn datov matice
analzy jejich dat.
tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.
krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)
detekci DNA nebo RNA
komplementrnmi etzci sond na jejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm
pomoc UV skeneru jako signl,
kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl
expression profiling, detekce RNA
pot kopi gen, nebo
nebo pesnou detekci
nsledujc kapitole.
Vizualizace rozdlen spot a sond u cDNA mikroipovho sklka.
Ve vukov jednotce Souasn vzvy a technologie genomiky a proteomiky, kapitole
ikroipy jsme si vysvtlili zkladn princip technologie mikroip. Tato vukov
Krom definice si ble vysvtlme princip tchto mikroip, jejich dal rozdlen podle
zkladn datov matice.
tto sti vysvtlme nkter obecn, e aplikovateln teoretick principy.
krtkch DNA sekvenc (oligonukleotid)
ebo RNA
etzci sond na
jejich imobilizaci. Takto imobilizovan molekuly cDNA, pedtm
pomoc UV skeneru jako signl,
kter vytvo obraz, kter se nsledn analyzuje specilnmi programy, kter signl
RNA
2.1 Zkladn kroky DNA mikroipovho experimentu
Pro sprvnou analzu dat DNA mikroip je nutn znt kroky, kter vedou k vytvoen
finln datov matice.
1. Vroba mikroipovho sklka Zpsob vroby a tedy typ samotnho mikroipu pmo ovlivuje zpsob analzy jeho
dat.
2. Pprava vzorku Nejprve se ze vzorku, kter m bt analyzovn, vyizoluj molekuly, kter chceme
studovat (DNA nebo mRNA). Molekula mRNA je pepsna do cDNA a amplifikovna
pouitm RT-PCR. DNA je amplifikovna pomoc PCR. Amplifikovan DNA (nebo
cDNA) je pak oznaena fluorescennm barvivem (nejastji Cy3 nebo Cy5), a to bu
pmo, nebo nepmo. U nepmho znaen je nejprve do cDNA vlenna reagujc
skupina (obvykle primrn amin), a pak je v oddlen reakci pipojeno k tto skupin
fluorescenn barvivo.
3. Hybridizace Dvouetzcov molekula DNA (cDNA) je denaturovna teplotou okolo 100C. Pi
tto teplot vodkov vazby, kter dr komplementrn pry bz a tud helixov etzce
pohromad, jsou perueny a roubovice se velmi rychle oddluje do dvou samostatnch
etzc. Za specifickch podmnek je denaturace DNA reverzibiln (vratn). U mikroipu
se tedy nastol podmnky Fluorescenn oznaen jednoetzcov DNA m tendenci vzat
se s komplementrnmi etzci sondy na mikroipu, vytv tak samostatn dvouetzcov
hybrid (duplex). Tento proces se nazv hybridizace.
4. Skenovn a kvantifikace 5. Normalizace
Tento posledn krok m za cl odstranit z dat zdroje nedoucho umu a
systematickch odchylek a sjednotit rozdlen expres u vech mikroip.
Nsledujc videa znzoruj proces DNA mikroipovho experimentu: MAXANIM
YOUTUBE animace
Nsledujc video ukazuje princip rznch typ mikroip (vetn proteinovch ip)
YOUTUBE rozdly mezi ipy
2.2 Vroba DNA mikroipovho sklka
Mikroipov sklka jsou vyrbna bu komern nebo na zakzku v jednotlivch
laboratoch. Vhodou komernch DNA mikroip je jejich vysok kvalita. Vtina
spolenost nabz celogenomov DNA mikroipy navren pro nejvce studovan organismy,
jako jsou lovk, my, krysa, nebo kvasinky. Mnoho spolenost tak nabz specializovan
ipy, kter jsou vhodn ke konkrtnjm vzkumm (ipy rakoviny tlustho steva, ipy
rakoviny prsu,).
Na druh stran, zakzkov vroba mikroip umouje specifick design i vrobu v malch
serich. To ovem vyaduje laborato, kter m mikroipovou tiskrnu nebo spotovac
zazen k vrob ipu.
Existuje nkolik technik, kter se pouvaj k vrob mikroip, snad nejvce pouvan je
spotovn a in-situ syntza. Dal je technika BeadArray
Spotovn - Sondy (oligonukleotidy, cDNA klony) o velikosti 500-5000 pr bz jsou syntetizovny jet dve, ne jsou naneseny na povrch ipu, a pak jsou umstny do spot na
povrch mikroipu. Tato procedura je vykonvna robotickou rukou s jemnmi jehlami.
Bhem procesu potisku jsou jehly vnoeny do ndob obsahujcch sondy (jedna jehla na jednu
sondu), kter jsou pak peneseny a natisknuty do uren oblasti na povrchu sklka. Jeliko
lze sondy a tiskov msta jednodue pizpsobovat, je tato technika celosvtov pouvna k
vrob zakzkovch mikroip vzkumnmi tmy ve vlastnch laboratoch.
Nsledujc video ukazuje spotujcho mikroipovho robota v akci:
http://www.youtube.com/watch?v=Pjr1Oyc0KrY&feature=related
Speciln pstup je technika BeadArray od firmy Illumina, kter sondy neumstuje na spoty
pmo na sklko, nbr na mikroskopick kuliky. Ty jsou pak nhodn umstny na povrch
mikroipu s malmi prohlubnmi.
In situ syntza - Tato metoda syntetizuje krtk sekvence sond (oligonukleotidy) pmo na sklku a je zaloena na fotolitografick syntze. Pi tto metod se pouv svtlo a
svtlocitliv ltky, kter maskuj nukleotid. V kadm kroku dochz k navzn jednoho typu
nukleotidu pouze na ty sondy, kter byli svtlem odmaskovny za pomoci selektivn mky
(Pease et al., 1994). Po navzn nukleotidu se opt vechny zamaskuj pomoc svtlocitliv
ltky a cel proces se opakuje a km vechny sondy nedoshnou svou konenou dlku.
Hezkou demonstraci celho procesu lze vidt na tomto videu:
http://www.youtube.com/watch?v=ui4BOtwJEXs&feature=related
2.3 Rozdlen mikroip
Mikroipy meme dlit podle
typu vrobn technologie (Affymetrix, Illumina, Agilent) dlky sond na mikroipu (cDNA mikroipy a oligonukleotidov mikroipy) potu vzork, kter jsou na jeden mikroip hybridizovny (jednokanlov vs
dvoukanlov, nebo i vcekanlov)
typu organismu, pro kter je mikroip navren
Rozdlen podle dlky sond a potu kanl odr zpsob jejich vroby a zrove pmo
ovlivuje zpsob odhadu umu a metody prav zkladnch datovch matic.
cDNA mikroipy sondami jsou 500-5000 pr bz dlouh cDNA klony vybranho
genu nebo znm sekvence. Obvykle jsou syntetizovny jet pedtm, ne jsou pouitm
spotovacho robota imobilizovny na pevn povrch metodou spotovn. Vhodou tchto
dlouhch sond je, e jejich specificita k jednotlivm clovm genm a v ppad spn
hybridizace s clovou vzorkovou DNA meme tm jist pedpokldat, e se opravdu jedn
o danou sekvenci. Nevhodou u tchto mikroip je, e nen znm pesn poet sond na
kadm spotu, a proto signl jednotlivch sond nen porovnatel jak mezi jednotlivmi spoty
v rmci mikroipu, tak mezi mikroipy rznch vzork. Z tohoto dvodu se na cDNA
mikroipy obvykle hybridizuj dva vzorky narz, odlien fluorescennm barvivem (dvoukanlov experiment). V jednom kanlu hybridizujeme vzorku, kterou studujeme, ve
druhm pak referenn DNA, kter by mla bt stejn pro vechny vzorky v studii. Ppadn
signl nespecifick sond se odhaduje
Tento typ ip produkuje komern napklad firma
Oligonukleotidov mikroipy
krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ
(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.
mohou bt
zaruuje stejn
referennho vzorku
pli krtk
(nejastji 11)
otevenho techo rmce
probeset
sekvenci.
GeneChip
2.4 Design dvoukanlovch cDNA experiment
3 Skenovn amatice
Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch
skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu
mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv
emitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze
vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,
kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.
signl nespecifick sond se odhaduje
Tento typ ip produkuje komern napklad firma
Oligonukleotidov mikroipy
krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ
(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.
mohou bt spotovny nap i
zaruuje stejn mnostv
referennho vzorku
krtk, aby byly
(nejastji 11) odpovdalo rznm
otevenho techo rmce
probeset) jsou pak
sekvenci. Nejbnj ipy v
GeneChip-->), obvykle zvan
Design dvoukanlovch cDNA experiment
Skenovn amatice
Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch
skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu
mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv
mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze
vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,
kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.
signl nespecifick sond se odhaduje
Tento typ ip produkuje komern napklad firma
Oligonukleotidov mikroipy
krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ
(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.
spotovny nap i
mnostv sondy v
referennho vzorku. Tyto mikroipy jsou proto
byly specifick,
odpovdalo rznm
otevenho techo rmce (obr. 2)
pak v dal analze
Nejbnj ipy v tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,
>), obvykle zvan
Obrzek 2
Design dvoukanlovch cDNA experiment
Skenovn a kvantifikace signlu
Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch
skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu
mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv
mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze
vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,
kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.
signl nespecifick sond se odhaduje rznmi
Tento typ ip produkuje komern napklad firma
Oligonukleotidov mikroipy - zde jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ
(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.
spotovny nap ipem ve vy hustot
sondy v kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace
Tyto mikroipy jsou proto
specifick, proto je cel systm navren tak,
odpovdalo rznm stem sekvence znmho nebo pedpokldanho
(obr. 2). Men
dal analze sumarizovny
tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,
>), obvykle zvan Affymetrix
2 Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu
Design dvoukanlovch cDNA experiment
kvantifikace signlu
Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch
skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu
mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv
mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze
vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,
kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.
rznmi algoritmy
Tento typ ip produkuje komern napklad firma Agilent
de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi
krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ
(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch.
pem ve vy hustot
kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace
Tyto mikroipy jsou proto pouze
je cel systm navren tak,
stem sekvence znmho nebo pedpokldanho
Men vech sond odpovdajc jedn sekvenci
sumarizovny do jednoho sla pedstavujcho danou
tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,
Affymetrix ipy. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.
Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu
Design dvoukanlovch cDNA experiment
kvantifikace signlu
Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch
skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu
mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv
mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze
vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,
kter tak vytv obrzek mikroipovho sklka.
algoritmy z pozad
Tento typ ip produkuje komern napklad firma Agilent.
de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi
krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ
(nejastji), nebo obvyklou nslednou imobilizac na povrch. Vhodou tchto sond je, e
a pomrn pesn. In
kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace
pouze jednokanlov.
je cel systm navren tak,
stem sekvence znmho nebo pedpokldanho
vech sond odpovdajc jedn sekvenci
do jednoho sla pedstavujcho danou
tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,
. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.
Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu
Design dvoukanlovch cDNA experiment
kvantifikace signlu, vytvoen zkladn datov
Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch
skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu
mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv
mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze
vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,
pozad prostoru
de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi
krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ
Vhodou tchto sond je, e
a pomrn pesn. In-situ syntza
kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace
jednokanlov. Tyto
je cel systm navren tak, aby vce tchto sond
stem sekvence znmho nebo pedpokldanho
vech sond odpovdajc jedn sekvenci
do jednoho sla pedstavujcho danou
tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,
. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.
Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu
, vytvoen zkladn datov
Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch
skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu
mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv
mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze
vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,
prostoru v okol spotu.
de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi
krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ
Vhodou tchto sond je, e
situ syntza
kadm ze spot, a proto nen nutn hybridizace
Tyto sondy jsou ov
vce tchto sond
stem sekvence znmho nebo pedpokldanho
vech sond odpovdajc jedn sekvenci (anglicky
do jednoho sla pedstavujcho danou
tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,
. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.
Design sond oligonukleotidovho DNA mikroipu.
, vytvoen zkladn datov
Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch
skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu
mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv
mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze
vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,
spotu.
de jsou sondy reprezentovny oligonukleotidy, velmi
krtkmi sekvencemi (obvykle ne vce ne 25 pr bz). Jsou syntetizovny bu in situ
Vhodou tchto sond je, e
situ syntza
sondy jsou ovem
vce tchto sond
(anglicky
do jednoho sla pedstavujcho danou
tto kategorii jsou GenChip ipy (vrobce: Affymetrix Inc.,
. Stejnou technologii vyuv firma ALMAC.
, vytvoen zkladn datov
Vlastnosti fluorescennch barviv umouj detekci hybrid DNA za pouit laserovch
skener. Laser jist vlnov dlky excituje fluorescenn barvivo ptomn v kadm spotu
mikroipu a barvivo emituje zen, kter je zachycovno fotonsobiem. Mnostv
mitovanho signlu je pmo mrn mnostv barviva a tedy mnostv zachycen DNA ze
vzorku na spotu mikroipu. Tyto hodnoty jsou zskny a kvantitativn vyjdeny na skeneru,
3.1 cDNA mikroipy
Kad fl
umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u
dvoukanlovch
fluoresc
fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na
mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi
sekvencem
dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.
3.1.2 Kvantifikace signluPo skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak
vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.
obrazu je obvykle v
Kvantifikac
1. Lokalizace
2. Segment
3. Kvantifika
Lokalizace center spot
(anglicky
jejich prmru.
jakou sekvenci (sondu
cDNA mikroipy
Kad fluorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost
umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u
dvoukanlovch cDNA mikroip
fluorescennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm
fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na
mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi
sekvencemi. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a
dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.
Obrzek
vantifikace signluPo skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak
vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.
obrazu je obvykle v
fikaci signlu
Lokalizace
Segmentace
Kvantifikace signlu
Lokalizace center spot
(anglicky grid) je
jejich prmru. Normln jej
jakou sekvenci (sondu
cDNA mikroipy
uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost
umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u
DNA mikroip
ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm
fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na
mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi
i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a
dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.
Obrzek 3 Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip
vantifikace signlu Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak
vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.
obrazu je obvykle v softvrovej vbave skeneru.
signlu pedchz dva kroky
center spot
ace - nalezen
ce signlu
Lokalizace center spot se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka
speciln datov soubor,
Normln jej
jakou sekvenci (sondu) kad spot obsahuje.
uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost
umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u
DNA mikroip (Obr. 3)
ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm
fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na
mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi
i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a
dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.
Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip
Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak
vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.
softvrovej vbave skeneru.
pedchz dva kroky
er spot
nalezen spot, odlen intensity
na spotu i na pozad
se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka
speciln datov soubor,
Normln jej dodv vrobce cDNA mikroipu, spolu s
) kad spot obsahuje.
uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost
umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u
(Obr. 3). Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm
ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm
fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na
mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi
i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a
dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.
Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip
Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak
vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.
softvrovej vbave skeneru.
pedchz dva kroky, kter slou k
spot, odlen intensity
na spotu i na pozad
se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka
speciln datov soubor, kter obsahue informace o
v vrobce cDNA mikroipu, spolu s
) kad spot obsahuje.
uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost
umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u
. Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm
ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm
fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na
mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi
i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a
dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.
Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip
Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak
vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl.
slou k identifikaci
spot, odlen intensity spot od
se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka
kter obsahue informace o
v vrobce cDNA mikroipu, spolu s
uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost
umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u
. Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm
ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm
fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na
mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi
i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a
dva obrzky jsou pozdji v procesu analzy obrazu sloueny dohromady.
Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip
Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak
vstupuje do programu pro analzu obrazu, kter kvantifikuje signl. Program pro analzu
identifikaci spot a pozad:
od pozad
se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka
kter obsahue informace o rozmstnn spot a
v vrobce cDNA mikroipu, spolu s
uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost
umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u
. Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm
ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm
fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na
mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi
i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a
Princip dvoukanlov fluorescence vyuvn u cDNA mikroip.
Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak
Program pro analzu
spot a pozad:
se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka
rozmstnn spot a
v vrobce cDNA mikroipu, spolu s informac o tom,
uorescenn barvivo je excitovno podle odlinch UV vlnovch dlek, tato vlastnost
umouje porovnvat dva vzorky na stejnm mikroipovm sklku. Toho se vyuv u
. Zde je DNA jednoho vzorku oznaena jednm
ennm barvivem (nap. Cy3, zelen barva), DNA druhho vzorku je oznaena jinm
fluorescennm barvivem (nap. Cy5, erven barva). Oba vzorky jsou pak hybridizovny na
mikroipovm sklku, kde se kompetitivn vou na sondch s komplementrnmi
i. Skener zachyt obrzek pro kad kanl (fluorescenn barvivo) individuln a
Po skenovan sa obrzky obou kanl microarray sklka ulo ve formt .tiff, kter pak
Program pro analzu
se provede poloautomaticky, pomoc nasazen mky. Mka
rozmstnn spot a
informac o tom,
Tyto informace pak slou
Existuje
Pevnze sky o
postup je nevhodn v
Adaptivn kruhzvl. Problematick v
Adpaptivn tvar spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn
intenzity pixel v
Adaptivn histogramspotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit
bimodln rozdlen
histogramu) a spotu (prmr cca
Po segmentaci nsleduje
intensity pixel)
Pipomeme si, e
sond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.
rozliujeme pojem
spotu. Protoe ale v
1) k referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako
hodnot intenzit pixel ve spotu. Medin
chybm v
Kvantifikacezahrnuje tak signl nespecifick hybr
pedstavujc nedouc um.
Tyto informace pak slou
Existuje vce algoritm
Pevn kruhze sky o
postup je nevhodn v
Adaptivn kruhzvl. Problematick v
Adpaptivn tvar spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn
intenzity pixel v
Adaptivn histogramspotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit
bimodln rozdlen
histogramu) a spotu (prmr cca
Po segmentaci nsleduje
intensity pixel) na pozad i ve spotu
Pipomeme si, e
sond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.
rozliujeme pojem
Protoe ale v
referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako
odnot intenzit pixel ve spotu. Medin
chybm v segmentaci
Kvantifikace intenzity zahrnuje tak signl nespecifick hybr
pedstavujc nedouc um.
Tyto informace pak slou jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.
algoritm segmentace, nejastj
kruh (anglicky ze sky o pozici a prmru
postup je nevhodn v ppad spot odlinho prmru (celkem bn).
Adaptivn kruh (anglicky zvl. Problematick v
Adpaptivn tvar (adaptive shapespot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn
intenzity pixel v okol.
Adaptivn histogramspotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit
bimodln rozdlen
histogramu) a spotu (prmr cca
Po segmentaci nsleduje samotn
na pozad i ve spotu
Pipomeme si, e celkov fluorescence
sond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.
rozliujeme pojem intenzita spotu
Protoe ale v dalch analzch potme s
referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako
odnot intenzit pixel ve spotu. Medin
segmentaci, nebo k
Obrzek
intenzity pozadzahrnuje tak signl nespecifick hybr
pedstavujc nedouc um.
jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.
segmentace, nejastj
(anglicky fixed circle
pozici a prmru spotu
ppad spot odlinho prmru (celkem bn).
(anglicky adaptive circle
zvl. Problematick v ppad spo
adaptive shape
spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn
okol. Doke pesn uri
Adaptivn histogram (adaptive hspotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit
bimodln rozdlen identifikuje
histogramu) a spotu (prmr cca v
samotn kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne
na pozad i ve spotu.
fluorescence spotusond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.
intenzita spotu, kter je definovn jako souet intenzit pixel v
dalch analzch potme s
referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako
odnot intenzit pixel ve spotu. Medin je
nepravidelnm tvarm
Obrzek 4 Vliv kvality spotu na statistiky intenzity signlu.
pozad je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu zahrnuje tak signl nespecifick hybridizace, ppadn jinch zlouenin na sklku
jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.
segmentace, nejastj jsou
fixed circle) jednodue
spotu, vechny spoty
ppad spot odlinho prmru (celkem bn).
adaptive circle)
ppad spot nekruhovho tvaru.
adaptive shape) po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje
spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn
Doke pesn urit i spoty nepravidelnho tva
adaptive histogram)
spotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit
identifikuje pixely pozad (prmr
v 80 percentil
kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne
spotu je proporcionsond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku.
, kter je definovn jako souet intenzit pixel v
dalch analzch potme s po
referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako
je vhodnj, protoe je robustnj k
nepravidelnm tvarm
Vliv kvality spotu na statistiky intenzity signlu.
je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu
idizace, ppadn jinch zlouenin na sklku
jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.
jednodue fixn ur spoty
, vechny spoty tak maj stejnou
ppad spot odlinho prmru (celkem bn).
prmr
t nekruhovho tvaru.
po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje
spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn
t i spoty nepravidelnho tva
) ur tvercov region kolem centra
spotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit
pixely pozad (prmr
80 percentilu histogramu).
kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne
je proporcionln mnostv hybridizovanch
sond na spotu a tedy mnostv sledovan sekvence ve vzorku. U kvantifikace proto
, kter je definovn jako souet intenzit pixel v
pomry intenzit studovanho vzorku (kanl
referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako
vhodnj, protoe je robustnj k
nepravidelnm tvarm spot (obr. 4).
Vliv kvality spotu na statistiky intenzity signlu.
je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu
idizace, ppadn jinch zlouenin na sklku
jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.
ur spoty na zklad inform
tak maj stejnou
ppad spot odlinho prmru (celkem bn).
prmr je odhadovn pro kad spot
t nekruhovho tvaru.
po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje
spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn
t i spoty nepravidelnho tva
ur tvercov region kolem centra
spotu, kter je vt ne spot. Pak na zklad histogramu intenzit
pixely pozad (prmr v
histogramu).
kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne
ln mnostv hybridizovanch
U kvantifikace proto
, kter je definovn jako souet intenzit pixel v
mry intenzit studovanho vzorku (kanl
referennmu vzorku (kanl 2), sta nm vyjdit intenzitu jako prmrvhodnj, protoe je robustnj k
(obr. 4).
Vliv kvality spotu na statistiky intenzity signlu.
je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu
idizace, ppadn jinch zlouenin na sklku
jako vstupn informace pro algoritmus segmentace.
na zklad inform
tak maj stejnou velikost
ppad spot odlinho prmru (celkem bn).
je odhadovn pro kad spot
po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje
spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn
t i spoty nepravidelnho tvaru.
ur tvercov region kolem centra
kde se pedpokld
v 5-20 percentil
kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne
ln mnostv hybridizovanch
U kvantifikace proto
, kter je definovn jako souet intenzit pixel v regionu
mry intenzit studovanho vzorku (kanl
prmr, nebo medinvhodnj, protoe je robustnj k ppadnm
je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu
idizace, ppadn jinch zlouenin na sklku ve
na zklad informac
velikost. Tento
je odhadovn pro kad spot
po stanoven stedu spotu algoritmus roziuje
spot pidvnm novch pixel na zklad porovnn jejich intenzity a prmrn
ur tvercov region kolem centra
kde se pedpokld
20 percentilu
kvantifikace intenzity fluorescennho zen (a tedy vlastne
ln mnostv hybridizovanch
regionu
mry intenzit studovanho vzorku (kanl
medin ppadnm
je motivovna pedpokladem, e namen intenzita spotu
ve
Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence
region spot. V
signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit
finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.
Existuj rzn metody kvantifikace pozad
Obrzek
Vtina program pro analzu obrazu vyuv
principem je odhad intenzity
zobrazuje
pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm
segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic
Metoda
spot, ze kterch pak
sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v
tohoto novho obrazu.
(robustnj vi
Obrzek
Ve zmnn metody
studie naznauj, e intenzita signl
Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence
region spot. V analze se pak kvantifikovna hodnota pozad
signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit
finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.
Existuj rzn metody kvantifikace pozad
Lokln metoda
Morfologick oteven (
Konstantn/globln
Obrzek 5 Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu
Vtina program pro analzu obrazu vyuv
principem je odhad intenzity
zobrazuje regiony, kter
pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm
segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic
Metoda morfologickspot, ze kterch pak
sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v
tohoto novho obrazu.
(robustnj vi ppadnm loklnm extrmm
Obrzek 6 Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA
Ve zmnn metody
studie naznauj, e intenzita signl
Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence
analze se pak kvantifikovna hodnota pozad
signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit
finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.
Existuj rzn metody kvantifikace pozad
metoda (local background
Morfologick oteven (
Konstantn/globln metoda
Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu
Vtina program pro analzu obrazu vyuv
principem je odhad intenzity jako medin pixel
, kter pouvaj
pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm
segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic
orfologickho otevenspot, ze kterch pak spoty odstran
sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v
tohoto novho obrazu. Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln
ppadnm loklnm extrmm
Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA
Ve zmnn metody operuj s odhadem
studie naznauj, e intenzita signl
Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence
analze se pak kvantifikovna hodnota pozad
signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit
finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.
Existuj rzn metody kvantifikace pozad
local background
Morfologick oteven (morphological opening
metoda (constant/global background
Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu cDNA mikroipu.
Vtina program pro analzu obrazu vyuv
jako medin pixel
pouvaj ti rzn metody.
pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm
segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic
oteven (obr. 6spoty odstran a vytvo
sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v
Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln
ppadnm loklnm extrmm
Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA
operuj s odhadem
studie naznauj, e intenzita signlu na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy
Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence
analze se pak kvantifikovna hodnota pozad
signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit
finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.
Existuj rzn metody kvantifikace pozad:
local background)
morphological opening
constant/global background
Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu cDNA mikroipu.
Vtina program pro analzu obrazu vyuv lokln metodu odhadu pozad. jako medin pixel z malch region v
rzn metody.
pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm
segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranic
(obr. 6) pouv tvercov
vytvo nov
sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v
Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln
ppadnm loklnm extrmm).
Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA mikroipu.
operuj s odhadem signlu pozad v
u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy
Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence
analze se pak kvantifikovna hodnota pozad
signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit
finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.
morphological opening)
constant/global background
Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu cDNA mikroipu.
lokln metodu odhadu pozad. malch region v
rzn metody. GenePix a QuantArray neberou v vahu
pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm
segmentanho algoritmu, kter me patn odhadnout hranici spotu.
v tvercov element
nov obraz, kter je odhadem pozad celho
sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v
Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln
Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA
pozad v okol spotu. Nicmn, nkter
u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy
Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence
analze se pak kvantifikovna hodnota pozad obvykle odet
signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit
finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.
constant/global background)
Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu
lokln metodu odhadu pozad. malch region v okol spotu.
GenePix a QuantArray neberou v vahu
pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm
i spotu.
elementy o rozmrech nkolika
kter je odhadem pozad celho
sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v
Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln
Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA
okol spotu. Nicmn, nkter
u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy
Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence
obvykle odet od hodnot
signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit
finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.
Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu
lokln metodu odhadu pozad. Jejm spotu. Obrzek
GenePix a QuantArray neberou v vahu
pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm
o rozmrech nkolika
kter je odhadem pozad celho
sklka. Pro jednotliv spoty se pozad pak odhaduje jako hodnota signlu v centru spotu
Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln
Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA
okol spotu. Nicmn, nkter
u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy
Fluorescence region, kter nejsou okupovny DNA by se mla tedy liit od fluorescence
od hodnot
signlu (ne vdy, ja si ukeme pozdji). Protoe intenzita pozad me takto vrazn ovlivnit
finln hodnotu signlu (po odeten), je dleit, aby byla kvantifikace pozad robustn.
Vizualizace oblast loklnho odhadu intensity pozad u t rznch metod analzy obrazu
Jejm
Obrzek 5
GenePix a QuantArray neberou v vahu
pixely pozad v zk blzkosti samotnho spotu, a proto jsou mn citliv k vsledkm
o rozmrech nkolika
kter je odhadem pozad celho
centru spotu
Signl pozad odhadnut touto metodou je ni a mn variabiln
Schematick znzornn metody morfologickho oteven pro odhad signlu pozad cDNA
okol spotu. Nicmn, nkter
u na spotu u negativnch kontrol (tedy tam, kde jsou sondy
pro mRNA jinho organismu, ne pro kter je sklko ureno a kde by tedy nemlo vbec
dochzet k hybridizaci se vzorkem) bv ni ne v okol spot. Proto by hodnota pozad
mla bt spe odhadnuta jako konstanta pro vechny spoty (konstantn/globln metoda), nejlpe jako prmr intenzit spot negativn kontroly. V ppad, e tyto kontroly na sklku
nejsou, doporuuje se signl pozad odhadnout jako tet percentil rozdlen signl vech
spot.
Ne vichni se ale shoduj na tom, zda je nutno odetn pozad vbec provdt. Obecn se
uznv i postup, pi kterm se signl pozad vbec neodet.
Lokln a globln metoda odetn pozad m vt vliv na spoty s nzkou expres (a tedy
nzkm signlem), v porovnn s metodou morfologickho oteven nebo bez odetn, take
u tchto spot je obtn rozliit mezi opravdovm signlem a umem.
3.1.2 Parametry kontroly kvality
V idelnm ppad maj spoty stejnou velikost, jsou opravdu rovnomrn rozloeny, mra
hybridizace (ppadn nastaven skeneru) nevystila v saturaci pixel na spotech a segmentace
probhla bezchybn. Ve skutenosti to vak tak nen, a proto program analzy obrazu
generuje informaci o kvalit jednotlivch spot a jejich men.
Tyto informace jsou pak soust vstupn zkladn datov matice, a slou k vytvoen
promnn Flags, kter obsahuje kategorie kvality ve form kvalitativn promnn kdovan
obvykle celoselnmi hodnotami. Kategorie kvality jsou ureny na zklad pravidel bu
defaultn nastavench programem, nebo manuln uivatelem.
Parametry kvality nejastji zahrnuj:
Cirkularitu spotu
Poet pixel ve spotu
Prmr spotu (v pixelech)
Poet/procento saturovanch pixel
Pomr intenzity signlu a umu (pozad) anglicky signal to noise ratio
b-hodnotu: podl pixel pozad s intensitou men ne je medin intensity spotu
p-skre: jak velice se odliuje centrum spotu od skou pedepsan pozice
Program pro analzu obrazu obvykle nechv uivateli monost vizuln inspekce vsledku
segmentace a manulnho oznaen nekvalitnch spot. Pklady nekvalitnch a kvalitnch
spot ukazuje obrzek 7.
Obrzek
3.1.3 Zkladn datov matice
Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako
specifickm formtem, v zvislosti
jedna zkladn datov matice.
Napklad data z GenePix
pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo
tabulkovm editorem.
Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl
experimentu a
spolen
reprezentuj rzn promnn.
identifikan slo
dal identifikace
pozice spotu na mikroipu
obvykl)
informace o
intens
medin, smrodatn odchylka)
intensita
medin, smrodatn odchylka)
dal odvozen charakteristiky
dvma kanly, )
Z dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn
signl spotu mezi kvantifikaci hodnot
rozmez
analzy proto tyto hodnoty
nuly se ped logaritmovanm
dvou kanl
Obrzek 7 A) Saturovan spot, B) Koblihov spot,
Zkladn datov matice
Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako
specifickm formtem, v zvislosti
jedna zkladn datov matice.
Napklad data z GenePix
pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo
tabulkovm editorem.
Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl
experimentu a softvru
spolen pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce
reprezentuj rzn promnn.
identifikan slo
dal identifikace
pozice spotu na mikroipu
obvykl)
informace o
intensita signlu spotu
medin, smrodatn odchylka)
intensita signlu pozad
medin, smrodatn odchylka)
dal odvozen charakteristiky
dvma kanly, )
dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn
signl spotu mezi kvantifikaci hodnot
rozmez 0 a 65 536
analzy proto tyto hodnoty
nuly se ped logaritmovanm
dvou kanl je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do
A) Saturovan spot, B) Koblihov spot,
Zkladn datov matice
Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako
specifickm formtem, v zvislosti
jedna zkladn datov matice.
Napklad data z GenePix softvru
pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo
tabulkovm editorem.
Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl
softvru pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace
pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce
reprezentuj rzn promnn.
identifikan slo sondy na spotu
dal identifikace (pozice na chromozomu, symbol genu, ..)
pozice spotu na mikroipu
informace o kvalit spotu
ita signlu spotu
medin, smrodatn odchylka)
signlu pozad
medin, smrodatn odchylka)
dal odvozen charakteristiky
dvma kanly, )
dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn
signl spotu mezi dvma kanly.kvantifikaci hodnot svtlosti
65 536. Rozloen tchto hodnot je tedy
analzy proto tyto hodnoty transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva
nuly se ped logaritmovanm nahrazuje nula slem jedna
je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do
A) Saturovan spot, B) Koblihov spot, kruhovho tvaru
Zkladn datov matice
Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako
specifickm formtem, v zvislosti od typu pouitho softwaru
jedna zkladn datov matice.
softvru pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix
pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo
Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl
pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace
pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce
Pro cDNA ipy to jsou zpravi
sondy na spotu
(pozice na chromozomu, symbol genu, ..)
pozice spotu na mikroipu (bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je
spotu (viz 3.1.2
ita signlu spotu (pro vechny
medin, smrodatn odchylka)
signlu pozad (pro vechny
medin, smrodatn odchylka)
dal odvozen charakteristiky (logaritmus intenzit, logaritmus podlu
dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn
dvma kanly. Vzhledem ksvtlosti pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat
Rozloen tchto hodnot je tedy
transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva
nahrazuje nula slem jedna
je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do
A) Saturovan spot, B) Koblihov spot, C) Spot nekruhovho tvaru, D) kruhovho tvaru
Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako
typu pouitho softwaru
pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix
pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo
Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podl
pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace
pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce
Pro cDNA ipy to jsou zpravi
(vlastn kad mikroipov platform
(pozice na chromozomu, symbol genu, ..)
(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je
viz 3.1.2 parametry kontroly kvality
vechny kanly) a odvozen
pro vechny kanly) a odvozen
(logaritmus intenzit, logaritmus podlu
dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn
Vzhledem k tomu, e
pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat
Rozloen tchto hodnot je tedy
transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva
nahrazuje nula slem jedna
je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do
C) Spot nekruhovho tvaru, D) kruhovho tvaru
Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako
typu pouitho softwaru. Pro kad mikroip
pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix
pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo
Informace uloen v textovch souborech se mohou liit podle typu mikroipovho
pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace
pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce
Pro cDNA ipy to jsou zpravidla:
(vlastn kad mikroipov platform
(pozice na chromozomu, symbol genu, ..)
(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je
parametry kontroly kvality
kanly) a odvozen
kanly) a odvozen
(logaritmus intenzit, logaritmus podlu
dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn
tomu, e u mikroip dochz ke
pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat
Rozloen tchto hodnot je tedy siln zeikmen
transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva
nahrazuje nula slem jedna. Logaritmus pomru intensit spot
je finln hodnota transkriptu, kter vstupuje do dalch analz
C) Spot nekruhovho tvaru, D)
Z programu pro analzu obrazu se exportuje zkladn matice dat jako textov soubor
. Pro kad mikroip
pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix
pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo
e typu mikroipovho
pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace
pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce
dla:
(vlastn kad mikroipov platform
(pozice na chromozomu, symbol genu, ..)
(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je
parametry kontroly kvality)
kanly) a odvozen statistiky (stedn hodnota,
kanly) a odvozen statistiky
(logaritmus intenzit, logaritmus podlu
dalch odvozench charakteristik se zastavme u promnn logaritmus podlu intenzit u mikroip dochz ke
pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat
zeikmen zprava
transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva
Logaritmus pomru intensit spot
dalch analz
C) Spot nekruhovho tvaru, D) Kvalitn spot
textov soubor se
. Pro kad mikroip vznik
pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix
pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo
e typu mikroipovho
pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace
pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce
(vlastn kad mikroipov platform), ppadn i
(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je
(stedn hodnota,
(stedn hodnota,
(logaritmus intenzit, logaritmus podlu intenzit mezi
logaritmus podlu intenzit u mikroip dochz ke
pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat
zprava. Pro vechny
transformujeme logaritmem, nejastji o zklad dva. V ppad
Logaritmus pomru intensit spot
dalch analz. Oznauje
Kvalitn spot
se
vznik
pro analzu obrazu maj pponu .gpr, data z Affymetrix
pponu .CEL atd. Vechny tyto soubory jsou iteln jakmkoli klasickm textovm nebo
pouitho k analze obrazu; nicmn nejdleitj informace jsou
pro vechny z nich. Kad dek reprezentuje jeden spot na mikroipu a sloupce
ppadn i
(bu v pixelech, nebo souadnicch na mce, oboj je
(stedn hodnota,
(stedn hodnota,
mezi
logaritmus podlu intenzit
pixel obrazu, kvantifikovan hodnoty se mou pohybovat v
. Pro vechny
ppad
Logaritmus pomru intensit spot
. Oznauje se
, (1)
Kde R pedstavuje intensitu kanlu obsahujcho studovan vzorek (nejastji Cy5, tedy
erven) a G intensitu kanlu referennho vzorku (nejastji Cy3, tedy zelen).
Pklady zkladnch datovch soubor k nalezen zde:
GenePix [odkaz na soubor]
Agilent [odkaz na soubor]
3.2 Oligonukleotidov mikroipy
U jednokanlovch oligonukleotidovch mikroip je pouita pouze jedna vlnov dlka a
vytvoen je pomoc UV skeneru pouze jeden obraz. U Affymetrix mikroip je tento obraz ve
formtu DAT, a je zpracovn v softvru firmy Affymetrix.
3.2.1 Kvantifikace signlu
U tchto ip jsou vechny spoty tvercov a tesn plhaj, ke kontrole kvality
hybridizace (ve smyslu jej specificity) se proto pouv prov systm sond (na odhad pozad
jako u cDNA mikroip). Pro kad spot na ipu obsahujc sondu perfektn komplementarity
k clov sekvenci (anglicky perfect match probe, zkratka PM) existuje spot obsahujc stejnou
sondu, avak se zamnenm nekomplementrnm nukleotidem na 13 pozici (anglicky
mismatch probe, zkratka MM, obr. 2). Nekomplementrn sonda m intenzitu signlu
nespecifick hybridizace, kter v zvislosti od algoritmu kvantifikace me nebo nemus bt
zapotna do odhadu signlu sondy.
3.2.2 Parametry kontroly kvality Affymetrix softvr po analze obrazu svch GeneChip ip poskytuje nkolik parametr
kontroly kvality, a to
prmrn signl pozad variabilitu procento ptomnch sond (podle algoritmu Affymetrix) 3/5 pomr mra kvality RNA, vypotena jako pomr signlu sond kontrolnch
gen pro b-actin a GADPH
3.2.3 Zkladn datov matice
Kvantifikace intenzit probh pomoc specilnho Affymetrix softvru za vzniku zkladn
datov matice, kter se ukld do souboru s pponou .CEL. Tento soubor obsahuje
identifiktory a intenzity PM i MM spot (sond), spolu s dalmi informacemi o kvalit dat.
Tyto data obvykle doprovz soubor CDF, kter obsahuje dal informaci o sondch, a to
konkrtn, do kter sady sond pat a jestli je PM nebo MM.
Na rozdl od cDNA mikroip, spot (tedy sonda) reprezentuje pouze st clov sekvence,
proto pro dal analzy je potebn hodnoty sond ze kad sady sumarizovat. Podobn jako u
cDNA mikroip dochz k logaritmovn hodnot intenzit signl, avak pouze v jednom
kanlu. Hodnota M je potna specilnmi funkcemi s pomoc PM (a ppadn i MM). U
oligonukleotidovch mikroip tedy lze M definovat jako
,, (2)
Kde f pedstavuje funkci pslunou metodm MAS5, RMA nebo dChip, kter si popeme
ble ve vukov jednotce 3.
V nsledujc, tet vukov jednotce se budeme vnovat pravm zkladnch datovch matic,
od dalch kontrol kvality pes jejich normalizaci a po vytvoen finlnho datovho souboru.
Doporuen literatura
Yang, Y. H., Buckley, M. J., Dudoit, S. and Speed, T. P. (2001), Comparisons of methods for image analysis on cDNA microarray data. Technical report #584, Department of Statistics, University of
California, Berkeley.
Yang, Y. H., Buckley, M. J. and Speed, T. P. (2001), Analysis of cDNA microarray images. Briefings in bioinformatics, 2 (4), 341-349 [http://www.maths.usyd.edu.au/u/jeany/Papers/imagereviewBIB.pdf]
Draghici, S. (2001) Data Analysis Tools For DNA Microarrays. Chapman & Hall/CRC. Gentleman, R., Carey V.J., Huber, W., Irizarry, R.A., Dudoit, S. (2005). Bioinformatics and
Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. Springer.
McLachlan, G., Do, K., Ambroise, Ch. (2004). Analyzing microarray gene expression data. Wiley Series in Probability and Statistics. John Wiley & Sons, Inc.