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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Derivados de Dolicol en losDerivados de Dolicol en losinsectosinsectos
Quesada Allué, Luis Alberto
1979
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Quesada Allué, Luis Alberto. (1979). Derivados de Dolicol en los insectos. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1653_QuesadaAllue.pdf
Cita tipo Chicago:Quesada Allué, Luis Alberto. "Derivados de Dolicol en los insectos". Tesis de Doctor. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1979.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1653_QuesadaAllue.pdf
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
" DERIVADOS DE DOLICOL EN LOS INSECTOS "
AUTOR : Luis Alberto Quesada Allue
DIRECTOR : Luis Federico Leloír
LUGAR DE TRABAJO : Instituto de Investigaciones Bioquímicas
" Fundación Campomor "
TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TITULO DE
DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICAS
M53_'Ïal
V
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Luis Federico Leloir,cuyo constante estimulo y afectuosa guia encarrilaron
mi esfuerzo ; sus profundos conseios abrieron en cada discusión horizontes decisivos
en la concreción de esta tesis.
AI Dr. Carlos E. Cardini,Conse¡ero de estudios,por su valioso apoyo.
A los miembrosdel que llamamos afectuosamente "Conseio de Ancianos" :Docto
res Israel D.Algranati ,Carlos E.Cardini,Héctor Carminatti,Marce|o Dankert,Luis F.
Leloir,José M . Olavarria y Porrüa y Héctor N.Torres por haberme permitido rea
lizar este trabaio en el Instituto de Investigaciones Bioquímicas .
A los Doctores Enrique Belocopitow y Luis R.Marécha|,con quienes me inicié a
la investigación bioquímica y realicé una parte de los estudios de esta tesis.
AI Dr.Héctor N. Torres ,por su apoyo y enseñanzas.
A los Doctores Mirta M.Flawió,Norberto Judewicz,Armando J.Parodi y Maria
Teresa Téllez-Iñón por su ayuda constante,conseíos y enseñanzas.
A todos los colegas y amigos del l. |.B. que desde distintos ángulos me han brin
dado cooperación y han contribuido,con sus estimulantes discusiones y criticas,a la
realización de este trabaío.
A la Sra.Mary B.de Iozzolino , a Ia Srta.Margarita Mazzardi,a| Sr.Francisco
Irusta y a la Sra.Soledad Gimenez ; quienes,con el resto del personal de apoyo
de este instituto,co|-aboraron con dedicación y eficiencia.
A Maria José Bottaro Méndez quien dactilografió esta tesis con esmero y
responsabí lidad .
¿ Nonos seria posible,por medio de experimentos,adquirirla certeza de cómoes ? ” Galileo Galilei
” An organic being is a microc05m - a little universe,formedof a host of self propagating organisms,inconceivably minuteand numerous as the stars in heaven “ Charles Darwin
” Todoconsiste en despertar el espiritu de curiosidad cientifica,....,y de inocular con el ejemplo el fuego sagrado dela indagación personal “ Santiago Ramóny Cajal
“No trascendent ability is required in order to make usefuldíscoveries in science; the edifice of science needs itsmaSOns,bricklayers,and commonlabourers as well as ¡ts foremen,master-builders, and architects.“ Bertrand Russell
“Quandle fait qu'on rencontre .... est en oppositíon avec unethéorie régnante,il faut accepter le fait et abandoner la théorielors memeque celle-ci,soutenue par de grands noms,est généralement adoptée. “ Claude Bernard
“ .... pero el resorte príncipal,....,consisti6 - ¡quién lo dijera! - en haber aplicado a la resolución del problema .... los digtados del mas vulgar sentido común. “ Santiago Ramóny Cajal
“ Cet enthousiasme que vous avez eu dés la premiére heure,gardezle,....mais donnez-lui pour compagnoninséparable un sévérecontr61e.N'avancez rien quí ne puisse etre prouvé d' une faconsimple et decisive .Ayez le culte de l'esprit critique.Reduit 5lui seul il n'est ni un eveilleur d'idées,ni un stimulant de grandes choses. Sans lui, tout est caduc .ll a toujours le derniermot. “ Louis Pasteur
“ In science the man of real genius is the man who invents a newmethod.The notable discoveries are often made by his successors,who can apply the methodwith fresh vigour,....;but the mentalcalibre of the thought required for their work,however brilliant,ís not so great as that required by the first inventor of themethod.“ Bertrand Russell
“Research has manyaspects which make it an attractíve venture.Oneof them is the intellectual pleasure of discovering previously unknownfacts. There are also the humanaspects..... Someofthe most pleasant periods ín my career were those in which l couldwork with people that were enthusiastic and clever and had a goodsense of humour. The discussion of research problems with thesepeople has always been a most stimulating experienceU.Luís F.Leloír
“L'hommese découvre quand il se mesure avec l'obstacle”Antoine de Saint-Exupéry“Saber es importante. Pero lo mas importante del saberes saber pensar.“ Luis A.Quesada Cerbán“Nuncaos jactéis ....,porque es poco lo que se puede aprender sin el auxilioajeno.No olvidéis,sin embargo,que este poco es importante y que además nadieos lo puede enseñar .” Antonio Machado
A B R E V l A T l} R A S
ADP S'Adenosína dífosfatoAMP S'Adenosina monofosfatoAra ArabínosaASN AsparragínaASP Acido AspárticoATP S'Adenosína trifosfato
BHA 2(3)-tert-butíI-h-hidroxi-anísol
BHT 2,6-ditert-butíl-cresol
CDP S'Cítídina dífosfatoCMP S'Cítídína monofosfatoCon A Concanavalina “A”CTP S'Cítídína trifosfato
DEAE Dietil-amínoetílDOC DeoxícolatoDol DolícolDol-P Doliquil fosfatoDol-P- Doliquil fosfato derivado (-G|c,-Man,etc )Dol-P-P- Doliquil pírofosfato derivado (-GlcNAc,-GaINAc,-ol¡gosacarido,etc)
EA Aceptor endógenoEA-Glc Aceptor endógeno glucosílado (definido en(1h3) )
EDTA Etílen diamíno tetraacetato
Fic FícaprenolFic-P Ficapreníl fosfatoFic-P- Fícapreni] fosfato
Gal GalactosaGal-I-P Galactosa-l-fosfatoGDP 5uGuanosína dífosfatoGDP- S'Guanosína dífosfato derivado (-Man,-Fuc,-Glc,etc)Glc GlucosaGIc-I-P Glucosa-1-fosfatoGlc-6-P Glucosa-6-fosfatoGlcN GlucosamínaGlcNAc Acetíl-glucosaminaGlcUA Acido GlucurónícoGMP S'Gunnosína monofosfatoGTP S'Guanosina trifosfato
hDol-P Doliquil fosfato de hígado de mamíferoHEPES Acido N-Z-hídroxí-etíl-píperazína-N'-2-etanosulfónícoHYL HidroxílisínaHYP Hidroxíprolína
íDol-PIIB
ManMan-l-PMan-Z-PMan-6-P
NANA
PAS
(P)Pi_p__p_p_
Rha
SDSSER
TCATDPTDP-RhaTLCTRIS
UDPUDP
UMP
UTPUV
Doliquil fosfato de insectoInstituto de Investigaciones Bíoquimícas,Fundacíón Campomar
ManosaManosa-l-fosfatoManosa-Z-fosfatoManosa-ó-fosfato
Acido síálico (Acido N-acetíl-neuramïnico)
Reactivo (o reacción ) del acido peryódico de Schiff(Píro)fosfato inorgánicofosfatopírofosfato
Relación de la movilidad de la sustancia con el frente delsolventeRhamnosa o Ramanosa
Dodecíl (lauril) sulfato de sodioSerina
Acido tricloroacéticoS'TimidínaS'Timidina-RhamnosaCromatografía en capa fina2-amino-2(h¡droxímetil)-l,3-propandíol
S'Uridina difosfatoS'Uridina difosfato derivado (-Glc,-Gal,-GlcUA,-GlcNAc,-GalNAc,-Xil,-Ara,etc..S'Urídína monofosfatoS'Urídina trifosfatoluz ultravioleta
Xilosa
INDICE
i. INTRODUCCION
1.1.
1.3.
Generalidades
1.1.1. Transferencia de sacóridos mediada por intermediarios Iipidicos en
procariotes
1.1.2. Caracteristicas de los poliprenoles
Derivados de dolicol en eucariotes
Esteres de dolicol. Dolicol fosfato.1.2. i . Dolicol libre.
i. 2.2. Dolicol monosacórídos.
1.2.3. Dolicol-olígosacóridos conteniendo glucosa.
1.2.4. DoliquiI-difosfato disacóridos.
1.2.5. DolicoI-oligosacóridos conteniendo manosa.
Biosintesis de glicoproteïnas
i .3. i . Generalidades
1.3.2. Uniónpéptido-carbohidrato.
1.3.3. Proteinas glicosiladas por dolicol derivados.
1.3.4. Tunicamicina y otros antibióticos.
Glicoproteinas de insecto
1.4.1. Mucopolisacóridos unidos a proteinas.
1.4.2. Homopolisacóridosunidos a proteina.
1.4.3. Vitelogeninas.
1.4.4. Calliforina.
i .4.5. Manoproteinas solubles.
1.4.6. Fibroinas de la seda.
VI
PAG.
2]
23
25
28
28
32
36
39
4]
4]
42
45
46
46
47
1.5.
¡.4. 7. Otras glicoproteinas de insectos.
1.4.8. Circulación y reconocimiento de glicoproteinas en insectos.
Obíetivos del presente trabaio de Tesis.
M ATERIALES Y METODOS
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
2.6.
2.7.
2.8.
2.14.
Organismos utilizados
Sustratos
Enzimas auxiliares
Experimentos in vivo
Cultivo de teíido
Aislamiento de dolicol de insecto
Extracción de dolicol Fosfato de insecto
Preparación del Iipido aceptor de insecto. Extracción analítica.
Preparación de dolicol y doliquil derivados de higado.
Preparación de enzimas
Mezclas para incubaciones in vitro
Procesamiento de los incubados
Degradación quimica y enzimática
2. T3. l . Tratamientos con óc ido
2.13.2. Tratamientoscon ólcali
2.13.3. Tratamientos mixtos
2.13.4. Degradaciones enzimáticas
Métodos analíticos
PAG.T848
50
52
53
54
54
56
57
óO
óO
ó |
ó I
64
66
69
69
7|
73
74
75
2.15.
2.14.1. Análisis espectrofotométrico
2. 14.2. Cromatografía y electroforesis
2.14.3. Identificación en cromatografía y electroforesis
Nota sobre los materiales y métodos utilizados.
3. RESULTADOS
3.1. Existencia en insectos de dolicol libre y de dolicol fosfato
3.3.
3.4.
3. i . i .
comportó como doliquíl Fosfato
3.1.2. Propiedades del lipido de insecto aceptor de monosacóridos
Dolicol libre de insectos
Biosintesis in vivo " de polipreníl-azücares
3.2.1. Inyección de precursor en hemolinfa
3.2.2. Marcación en cultivo de teiido
Biosintesis de dolicol monosacóridos
3.3.]. Dol¡col-pirofostato-acet ilglucosamina
3.3.2. Propiedades de la enzima transferente de manosa
3.3.3. Dolicol fosfato glucosa en insecto
3.3.4. Evidencias sobre formación de otros dolicol monosacóridos
3.3.5. Dolicol monosacóridos en otros organismos
Biosintesis de dolicol-oligosacóridos conteniendo manosa
3.4. i. Estimulaciónde la sintesis por extractos de Ceratitís capitata
3.4.7.. Estudio del oligosacórido unido al lipido: Dolicol trisacórido
3.4.3. Losdolicol-oligosacóridos de mayor tamaño
Evidencias de que el lipido de insecto aceptor de monosacóridos se
VIII
PAG.75
76
85
90
91
92
92
3.5.
3.7.
3.8.
3.9.
3.10.
3.4.4. Caracteristicas de la transferencia de manosasPAG.l 74
3.4.5. Origen de los residuos de manosa incorporados a los Iipo-oligosacóridosl 7 9
Formación de dolicol-oligosacóridos conteniendo acetilglucosamina
3.5. l . DoliquiI-P-P- ( GlcNAc )2
3.5.2. Doliquil-P-P- ( GlcNAc )2 - Man
Formación de dolicol-oligosacóridos conteniendo glucosa
3.6. l . Identidad del material lipofilico
DolicoI-oligosacóridos en Artemia sp ( crustácea )
Biosintesis de glicoproteinas
3.8.1. Glicosilación a partir de nucleótido-azücares
3.8.2. Glicosilación de proteinas a partir de dolicol derivados
Biosintesis de derivados de dolicol en relación al ciclo de vida
3.9.1. Insectos: Ceratitis
3.9.2. Crustóceos:AM1 sali
Fosforilacíón de dolicol por enzimas de insecto
3.10.1. Evidencias indirectas
3.10.2. Formación de sustancias radiomarcadas con 32P
3.10.3. Hidróliuisácida
3. l0.4. Hídrólísisalcalina
3.10.5. Adición de dolicol fosfato
3. l0.ó. Adición de dolicol
4. DISCUSION
5. CONCLUSIONES
182
¡82
187
190
202
202
205
207
208
209
212214
215218
233
i. INTRODUCCION
1.1. GENERALIDADES
A fines de agosto de |949, el grupo de Leloir envió a Nature ( I ) la caracterización y la
fórmula propuesta para el factor termoestable responsable de la interconversión enzimática
de Gal-l-P en Glc-l-P ( 2 ): se trataba del descubrimiento del primer nucleótido-azücar, el
URIDIN difosfato glucosa. A partir de este hito fundamental en la quimica de carbohidratos, se
han descripto durante los 20 años subsiguientes más de 100 nucleótidos mücares y se ha conocido
en detalle la participación de éstos en la biosintesis de los principales hidratos de carbono,
glicolïpidos y proteinas glicosiladas ( 3 ) .
Ultimamente se han ido debilitando los esquemas demasiado simples con respecto a la
estructura, composición y biosi'ntesis de polisacóridos y glicoproteinas ( 4, 5 ) . Esto ha sido
posible gracias al empleo de nuevas técnicas y al meioramiento de las preexistentes. Entre las
primeras, han sido de decisiva importancia el uso de glicosidasas altamente especificas asi como
el empleo de la cromatografía de afinidad y de las lectinas. El meioramiento de la tecnologia
ha sido notorio en las diferentes técnicas cromatogróficas, en el instrumental para los distintos
tipos de espectroscopia, en el análisis por difracción, etc. (4 ) .
En muchos polisacóridos antes clasificados como homogéneos (homopolisacóridos y hetero
sacóridos con unidades repetitivas) se han encontrado ahora pequeños porcentaies de unidades
sacan'dicas diferentes de la principal. Por otra parte se sabe ahora que muchos de ellos estén
covalentemente unidos a cadenas peptidicas (a Ia par que se conoce que muchas proteinas son,
en verdad, glicoproteinas de muy boio contenido sacarl'dico) .
En cuanto a la biosintesis, tanto la de los denominados homopolisacóridos ( glucógeno,
almidón, celulosa, quitina, etc. )como en la de carbohidratos compleios,se sabe hace tiempo
que, además del nucleótido azúcar dador de glicosilos, se necesita un aceptor pre-formado.
Este está habitualmente constituido por una cadena del mismopolimero, de peso molecular
relativamente baio. Generalmente, no se sabe cua'l es el menor tamaño de aceptor capaz de
ser reconocido por las enzimas sintetizantes. Enalgunos casos, como en el glucógeno, la
porción de cadena que es elongada para dar la macromolécula ( el "primer", en las publica
ciones inglesas ) podria estar unido a una proteina (4,316) .
En Io que respecta a las glicoproteinas se acepta que Ia mayor parte de la cadena polisa
caridica se forma por sucesivas transferencias de monosacóridos desde los respectivos nucleótidos
azúcar a un oligosacárido primario unido a la cadena polipeptidica que constituye la parte inter_
na de la molécula de hidrato de carbono.
El interés de muchos investigadores se centro precisamente en aclarar la biosintesis de esa
parte interna ya que, hasta hace poco, resultaba dificil entender el fenómeno de adición de
las primeras unidades saoaridicas, mediada por derivados de nucleótidos, en ambientes fuerte
mente hidrofóbicos como las membranas.
El renovado énfasis en este tipo de estudios arranca del descubrimiento de los poliprenil
fosfato-azúcares de bacterias y de eucariotes y adquirió gran impulso cuando - pioneros otra
vez, veinte años más tarde - Leloir y su grupo identificaron al lipido intermediario en la
glicosilación de proteinas de mamiferoscomo doliquil-fosfato (ó) .
l. l . l . Transferencia de sacóridos mediada por intermediarios lipidicos en procaríotes
En 1964, Rothfield y Horecker ( 7 ) descubrieron un lipido que actuaba como activador
en la sintesis de lipopolisacóridos de Salmonella . Interpretaron errdneamente que el activador
formaba un compleio con el lipopolisacórido.
Durante |965 varios laboratorios publicaron casi simultáneamente que en la biosintesis
de ciertos polisacóridos de bacterias participaban sustancias con caracteristicas lipofilicas
que contenían Fosfato y residuos oligosacarïdicos. Strominger y col. ( 8 ) vieron que un
glicolipido, sintetizado por enzimas de Staphxlococus aureus o de Micrococus lysodeikticus,
era intermediario en la formación del peptidoglucano de la pared. El glicoli'pdo pentapépti
do se formaba a partir de un lipido endógeno y de nucleótido-azücar pentapéptido.
Poco después, Horecker y col. ( 9 ) y Robbins y col. ( IO) , describieron un Iïpido
intermediario en la biosintesis del antigeno 0 de Salmonella. Se formaba aqui un lipido fos_
tato mono, di o trisacórido.
Otra vez, simultáneamente el grupo de Robbins (l 1) y el de Strominger ( l2 ) identifi_
caron el lipido intermediario como un undecaprenol unido por un puente ditosfato al residuo
hidrofilico. Estudiossubsiguientes permitieron postular que el poliprenol fosfato participaba
de un ciclo al término del cual volvia a estar disponible ( ¡3 ) . Como puede apreciarse en
la Figura l,el poliprenol fosfato acepta Galactosa-fostato a partir del UDP-Gal y el glico
lipido formado se elonga por adición de rhamnosa y manosa a partir de sus respectivos nucle€_>
tido-derivados ( 14 ) . El paso siguiente consiste en la polimerización de la unidad trisaca
rr'dica. La elongación y modificación del antigeno 0 ha sido intensamente estudiada en di
ferentes especies de Salmonella , tanto en cepas salvaíes como mutadas ( ¡4 - 18 ) .
FIGURA] Biosintesis del antígeno "0" de Salmonella newington ( Tomado deHemming, F. W. (14)
llDi‘Gnl l'MP TDI’Rhn TDP GDI'M.m (iDP
’\_f K“j K j' \r",N /’f\ I
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|wpcnlcnnl-P-l’ ( i H) Rha|
" MflllI-Mnn-Rll:I-(i:ll-l.--LÍPOPOLÍbACIÍRtOO V |
(¡ull
Rhn. . 1 . |
'LIPOPousnchRIDO Man .4
i. i .2. Caracteristicas d_el_o_spoliprenoles
Los prenoles son alcoholes primarios con una cadena constituida por n unidades iso
prénicas cuyas dobles ligaduras pueden estar en posición cis ( la mayoria ) o trans y estar
ocasionalmente saturadas ( Figura 2 ) ( ver Figura siguiente ). El número de unidades de iso
preno es variable Se los ha encontrado en procariotes y eucariotes y se les ha
dado nombres vulgares que aluden a la fuente natural de donde se obtuvieron y al tamaño de
FIGURA 2 : Fónnda quimica de los poliprenoles
CH:3 -OH = POLIPRENOLl
H CH - C = CH - CH ) - R O( 2 2 n R |
-O -P -OH = POLIPRENILNO SATURADO | FOSFATO
OH
CH3 CHI | 3
H(CH2-C=CH-CH2)n_]-CH2—CH-CH2-CH2-R
o< - SATURADO
la cadena ( 20 ) . En la Tabla l se ve que, en general, los poliprenoles de bacterias y
plantas ( alilicos ) tienen cadena relativamente corta, mientras que en hongos y animales
( Tabla 2 ) predominan las cadenas largas ( 80 a HO átomos de carbono ) . Estas Últimas
se las agrupa ba ¡o el nombre de dolicoles ( Dolíkos : largo ) y la unidad ol -isoprénica
está saturada. Losdolicoles de levaduras son algo menores ( 65 a 90 átomos de carbono ).
Losundecaprenoles de plantas son similares a los de bacterias, con la particularidad de es
tar siempre acompañados por ísoprenoles de cadena més corta y/o más larga ( 21, 24, 26,
27 ). En los invertebrados marinos se encontraron dihydropoliprenoles ( Tabla 2 ) ( 25 ) .
(Se ha detectado químicamente dolicol en Arum maculatum (ll2) lo que refuerza los datos
que indican ( 58,62 ) que éste es el aceptor de glicosilos en plantas.
IABIA | :
OH .le HGM“
Pau,0m im
Puliprmmlm du hr. ¡Nim y pluma!
!.!9.'!‘."5‘..C.F‘_’-LL.’F.! Nu BCHTINSÉ
M_.ly_u_n!5¡'»_l_u¿u_s Undecoprenol ll
Qfldfinlfilïg Boc'opunol Il
5.oureu'. ¡dem I l
5.newing|_.¿I-\ Undrcoprenol H
Mi!Abedul (nílgliqj) Bn-Duluprcnol 6 a 9
Ïoboco ( Enlauumie ) '5')|ancso| 9
Cas'oño ( Sgyonn aa ) Casloprcml 9 o IJ
Gometo ( Ficus ¿e ) Ficuprenol IO o l?
Hrvcokrusilícnsis (árboldel couc o Hevenprenol IO o ¡3
Aalooncmo robelini Agloprenol 10 o ¡3
Tvícosonu-sBling Undecoprenol Il
Pinus ¡xlvts'ris Pinoprenoles ¡2 o 17
Pinus slrobus ¡dc-rn ¡8
A_biïol_bo ¡dem ll o IB
Picea abia ídem ¡2 o IB
Elipcws Egrfmufnjl Junípcmpmnolc‘. H o 2]
59.1":Eogulglyuq Dolitol I9
TABLA2: Dollcolen D) Mamíferon.
ORGANISMO ORGANO l°ISOPRLNOS CITAS
Cerdo Hígado 17 a 22 24,31Riflón 17 B 20 24
Baza 17 a 21 24
Páncreas 17 n 21 24
Vacunou Cerebro 19 n 21 30Inteutino 30
Hato Cerebro 13 a 21 30
"Igudp 17 n 21 29
Carnero Cerebro 30
ConaJo Higudo )hlflón )
lnLontino ) Jo
Mónnuln uuquolntlno )
Hu! ¡mon ¿món ) y)HIrn-lfl )
9m
293
294
294
294
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¡JBLA 2 : .-o¡\(-c‘.n| l. ) “¿gang r _;¿¿¡\:'_I\¡*ï_1;¡=_t_=_'¿r.{
u¡.-n;,\.u:;_:.t¿) ¿{Ey-¿jj me; CITAS
llonnoo
EESEXEJEFÏESH_RB{ 14 o 18 20
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Colenterudoa
Ietridium urnile 18 a 21 33,24.Anélidon
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EEEÉÁEE22212 )
Equinodurmoa
¿uterina Ighgng )onhioqgglgg E}¿ru ) 25ggpmmcchinuumillnrie )
Artrópodoc (Insectos)Cnllighqlg erxthroccnhnlu 17 a 19 2U
Cerntitis cugltqigTriatom i f‘st-—2 ¿‘ü ) muTESISHalloghoru ruficauün
Artrópodos (Crustáccoo)Cnrcinug mnenns 2'
EUEBBETUSpornhnrdus 25
La biosintesis de los poliprenoles pirofosfato alilicos implica la sintesis del isopentenil
pirofosfato a partir del ócído mevalónico y su isomerización dando el compuesto alilico
dimetil alíl pirofosfato ( Figura 3 ) que se condensa entonces con otro isopentenil pirofos
foto para dar geranil ( o neril ) pirofosfato ( Figura 4 ) ( 19, 20, 22 ) . Estos se elongan
para dar sustancias de diferente largo de cadena por sucesivas adiciones de isopentenil piro
fosfato ( 19, 22 ) ( Figura 5 ) . Para la biosintesis de dolicoles ( 3] ) se supone también
un mecanismo parecido ( 22 ) . Se necesitaria también una enzima capaz de saturar la
unidad Ok - isoprénica .
FIGURA 3 : Biosintesis de iso pentenil pirofosfato
Mc (‘Il,-('|I,()ll Mc (‘Il,-('H,-()l'\ / A”. \ /í. -> (‘\ \
IK) ('lI,-('(),Il Al)!‘ nu ('u,-('(),||
Mi: ('ll,-('Il,'()l’l’ Mc\ / ._-.._. L \u - n ) ’
Mc ('Il_.-('ll,-()I' ML. (¡nah-(mp (‘ . .__.- ( =-'(IH ll_.-()l|\ / A... \ / II l('\ -——-m» ('\ CH, Mc
H" CHAU," Al)!‘ IIU ('It,-(‘(),|lISOPENTENIL 3.3"DlHETIL-ALIL
Mc ('ll,-('lt.-()I'P PIROFOSFATO(IPP) PIROFOSFATO (DPP)M. ('Il_.-('H_.()I‘I' \‘/ '
' AII' (
(\ - - > Il_
HU (IL-(“Jl -\|)|' o l'. ,\ +COll Il 2
FIGURA 4 : Biosintesís de geranii pirofosfafo
Mc (Il'l’)
Mc mr], (' ¡(I'll-(‘llyhl’l' nir(' ('H (ln, II Mc gn: (* (Il-('Il,()|‘|'
Mi! Corr . > ( ('IH'iI.( mw) ¡{h Mi."
GERANIL PIROFOSFATO (GPP)
FIGURA 5 : Mecanismo de biosintesis de poliprenoles
Se produce una reacción de condensación entre el isopenfeníl pirofosfafo y el poliprenol(en la Figura, el geranil pirofosfafo ) para dar el miembro siguiente de la serie ferpénica.( en la Figura, el farnesil pirofosfato
I P P
Mcl
l -_—(‘:=('--('ll-(‘IlyOI'l’¡-z/ k I
Mc isïc H\ _ ., . . ,('-"('||'('Il,-( H,-( '-( ¡H Hifi," "
M" ¡(wm
|’|‘I 4
MC MU McI . I l
\(' (II'('H_.'('I|_.-(’(||'('||_.'(||,'(' (H'(I|,'()I’i'/MC
FARNES | L PIROFOSFATO (FPP)
AI margen del mecanismo principal , en las bacterias se ha descripto ( 32 ) Ia existen
cia de una poliprenil quinasa que podria significar una segunda via biosinféfica, quizás
suíeta a regulación. No se ha encontrado una enzima similar en plantas o en mamiferos.
En el presente trabaio se presentan evidencias de su existencia en eucariotes ( Ver 3.|0
página 207 ) .
1.2. DERIVADOS DE DOLICOL EN EUCARIOTES
El descubrimiento de los derivados de poliprenoles como intermediarios en la transferen
cia de azúcares)en bacterias,hízo que en los estudios con eucariotes se tuviera en cuenta Ia
posibilidad de existencia de mecanismos similares. Poco después de los hallazgos en proca
riotes aparecieron evidencias de la existencia - en animales y plantas superiores - de
sustancias que se comportaban en forma similar a glicolipidos de cadena isoprenoide
( 33 al 37 ) .
Behrens y Leloir demostraron en 1970 ( ó ) que en el higado de mamifero existia una
enzima capaz de transferir la glucosa del UDP-Glc a un glicolipido inestable en medio
ácido. El aceptor endógeno se comportaba como un poliprenol °( - saturado.
A partir de este trabaio se ha originado un enorme interés en los poliprenil derivados
de eucariotes/Io que se ha puesto de manifiesto en la gran cantidad de publicaciones ( Figu
ra ó ) .
No se sabe con certeza si la glicosilacíón de la Vitamina A ( 38 ) y de la Vitamina K
( 39 ) se debe a lo inespecifico de las doliquíl transferasas o a que estos li'pidos desempeñan
un papel propio como intermediarios lípidicos.
A la fecha de redacción de la presente Tesis se han publicado sucesivas revisiones del
tema de doliquil derivados ( 14, 40 a 46 ) . Por lo tanto solamente se reseñarón aqui
aquellos estudios en eucariotes de mayor interés para el desarrollo y posterior interpretación
de los trabaios en insectos.
FIGURA ó : Evolución del número de frabaios científicos relativos a derivados de dolícoldesde el comienzo del tema hasta fines de 1977.
A ¿Identificacióndel DoI-P
¿,0í (Behrens y Leloir)
50
/. Total mundial
.x/20’ .
DETRABAJOS
(.4 O
Pplí'íicaciones del° L . .2 10 ,/ p l.l.B'.
.\./ '__.O---.o\ o o,"e“? L .“oma. . . =:1969 ’71 72 73 74 75 76 77 78
A Ñ o
1.2.1. Dolicol libre. Esferesde dolicol. Dolícol fosfato.
Dolícol
En 1926 Channon y Marrïan aíslaron de la fracción ¡nsaponífícable de hígado de cerdo
una sustancia parecida al escualeno (47, 48 ) . Se la encontró en hígado de otros anima
les y se Ia llamó Hepene ( 49 ) , consideróndola un hidrocarburo ínsaturado ( no se habra
detectado oxígeno en la molécula . Esta sustancia nunca volvió a ser caracterizada y cuan
do, en ¡969, el grupo de Bioquímica de Ia Universidad de Liverpool intentó aislarlo en
riñón humano (50 ) y luego en hígado ( 3], 51 ), encontraron en su lugar una sustancia
de similares características, hidroxilada, de tipo poliisoprenólico y que llamaron dolicol
debido a lo largo de su cadena ( 3} ) .
Se demostró su síntesis a partir de mevalonoto en mamíferos primero ( 52 ) y en inverte
brados después 75 ) . En este Último, Walton y Pennock encontraron biosíntesis de dolicol
en diferente s especies de poríferos, celentemdos, anélidos, moluscos, equinodermos y crus
táceos ( Tabla 2 A ) . Quedó en evidencia que todos los invertebrados marinos investigados
convertían el mevalonoto en dolicol y que en general el isoprenol más abundante era el
C95 o C100, siendo asimismo el sintetizado en mayor cantidad. Losdatos indican que prc_>
bablemente el dolicol es un terpenoíde esencial para los eucariotes a diferencia de los este
roles que pueden ser obtenidos abundantemente en la dieta ( 53 ) .
La mayor parte del dolicol se encuentra como alcohol libre o en forma esterificada.
Existe también una unión, aparentemente específica (54 ), a lipoproteínas de baía densidad,
en plasma de mamíferos ( 55 ) .
Dolicol fosfato
El dolicol fosfato natural fue aislado primero por el grupo de Leloir ( ó ), que también
Io preparó sintéticamente ( ó ) . Dallner y col. estudiaron la distribución subcelular en el
hígado de mamífero ( 56 ) . Se lo halló en levaduras ( 57 ) y en plantas ( 58 ) , y luego,
en el marco del presente trabaío de tesis, en insectos ( Ver Resultados ) . En la Tabla 3
se resumen los principales trabaios referentes a detección de dolicol fosfato.
291%-: 092an _\|.<221 ¿al .1“..°_=11_¿.°_e__-v_u1:ifat_°q
911912115229 2:11. “.0 0. cm s
Cerdo Hígado 1970 6
Hutu "laudo 1972 56
Levndux'a — 1973 57
Humano Linfocitoo 19'14 59
Inacctoa - 3975 ESTATESIS (60)
San/ArVejn Brotes 1975 58Arveju - 1977 61Soju/Arveja - 1977 62
Conejo Hígado 1977 63Pollo llfaudo 1977 63(:nu'mu Oviducto 19'17 64
1.2.2. Dolicol monosacóridos
Losprimeros trabajos en que se detectó en eucariotes un glico(fosfo)l|'pido con carac
teristicas de poliprenil derivado fueron los de Tanner ( 33 ), Caccam y col. ( 37) ,
Villemez y Clark ( 34 ) , y Zatz y Barondes ( 36 ) . Estos grupos hallaron que las membrg
El ll'pidonas animales sintetizaban glicolipidos sensibles al ácido diluido (pH : 2.0 ) .
aceptor, sin embargo, no fue identificado.
El ya mencionado trabaio de Behrens y Leloir ( 6 ) aportó evidencias de Ia naturaleza
del lipido, al obtener creciente biosintesis de lïpido-glucosa por añadido de dolicol fosfato
natural, extraido del hígado de cerdo, o preparado sintéticamente. Estosautores utilizaron32
como dador UDP-Glucosa radiomarcado con p y demostraron que sólo se transfen'a
el azúcar al lipido. Sugirieron tambieñ que la glucosa estaba unida al fosforil dolicol en
posición /3 . Se puede representar Ia formación de los poliprenil monosacóridos con la
ecuación de tipo general :
XDP'Z+D°'-P —-—> Dol-P—Z+XDP
donde X es un nucleósido genérico , y Z un monosacórido.
Se han realizado numerososanálisis del manosil derivado de dolicol que, en general,
puede obtenerse con mucha facilidad y buen rendimiento en la mayoria de los sistemas y teii
dos. Evans y Hemming ( 65, 67 ) y Baynes y col ( 66 ) determinaron la estructura del mano
Iipido mediante espectrofotografr'a de masa. El primer grupo también utilizó en los análisis
espectrofotografi'a infrarroja y resonancia magnética nuclear. El grupo de Hemming fabricó
el manolipido radiomarcado en la manosa y en el dolicol simultáneamente (l ll) . Finalmer_i_
te se ha demostrado la configuración en la unión de la manosa al fosfolipido ( 68, 69 ) .
Warren y Jeanloz sintetizaron quimicamente el mannopiranosil doliquil monofosfato ( 70 a
72) y el Dol-P-P-GlcNAc (73).
En general la identidad de los monoglicosíl derivados se infiere a partir de los datos de
comportamiento en diferentes sistemas cromatogróficos ( columna,pape| , capa fina/adsorción,
partición, intercambio iónico, filtración molecular ) .
Laspropieadades que habitualmente se someten a evaluación son:
a) Solubilidad en solventes orgánicos ( y cromatografia de Partición )
b) Labilidad a los ácidos diluidos y subsiguiente liberación de monosacóridos
c) Estabilidad al tratamiento alcalino suave, en condiciones de saponificación de los gli
cerofosfótidos
d) Liberación de monosacóridos fosfato por tratamiento alcalina fuerte
e) Existencia de carga, puesta en evidencia por intercambio iónico en cromatografía en
columna o papel impregnado con resina de intercambio
f) Polaridad del glicolïpido (en columnas de adsorción )
g) Estimulación de la biosintesis por agregado de poliprenol fosfato exógeno
h) Inhibición de la biosintesis por agregado de EDTAen la mezcla de incubación
Por otra parte en varios trabaios se demostró la reversibilidad de las reacciones, obte
niéndose nucleótidos azúcar radiomarcados a partir del respectivo glicofosfolipido radioactivo.
Lossistemas enzimáticos glicosilantes de dolicol son sumamente inespecificos con res
pecto al aceptor lipidico pudiendo ser éste de cadena menor o mayor, saturado o insaturado,
del mismoo diferente organismo.
TABLQ_1¿L}nta de loa grincioales trabajos sobreBioaínteeigflgg_23;-P-Mun en hongos.
ASCOMIC¡11'55 ¿EQ CITAS
.Levadurua (Snccharomxcea s E.) 1959 331971 74.751972 76
1973 77 a 79
1974 80.81
1975 B2
1976 83
1977 54
.Egggggnorn crqggg 1976 85
BASIDZ M C5755
o¿inauguran 1972 861973 87
1974 88
1977 89-90
.’\I‘:I’.ZÍIM "ni
. plctyoskellgr gp. 1977 01
TABLA6 = Listo de los princlsnleo trabajos sacra
biosíntesis ce 301-P-ggg_gg¿ïgïgggggigg¿
‘2 11:25; . ¡No L {TAS¿wo 194,9 36 Hice-JJ; 1969 .n’ "
1971 104 ¿g¡u luu
1973 105 ¿EYL 104.1101974 106 1972 111
1976 107 1973 112 u 114
1977 108 1974 115
I‘únc'ngg 1974 121,122 1975 116197.). 68.123 1€)I6 117.118
1977 119.1202}roiggg 1973 124
1975 125 EXLÉEEEE 1969 37
1976 126 1913 1241975 130.13L
gggglggg 1973 127¿2539 1975 128
lg;ggí¿gg 1974 115 - 1976 129
Linfggjtos 1974 59.122 fi¿g¿u¿¡mncg¿¿1915 127
Cólulua de mieloma1969" 37 —""1"—“ 1977 132
Algun
Hongog
Pluntna
Protqzoon
¿magma
m1978
19731976
1977
19731975
1976
1977
19731975
(ESTA TESIS )
(ESTA WrüIS )1976
137 mmm138 '9252k52139
14 o
101 ¿im-‘1358
10062
141 ¿ingrata
133 -JHJ:L
-ïL!EHDl“üLQQ
.19;L.!.(;'.I."0_".'..l-.0_=1
1 3')’ 253212121511:
._Ï 1:. Í1fil'.l_1.\‘.::
TABLAu : Principales trnbu ou sobre bioaíntusia de Dol-P-Glc
m1971
1972
1973
19701971
1972
1975
1977
1971
19771977
1977
3074
21.118
104
142
105
b
104.143142 u 146
147
148
104
149
150151
7/ "A 7 2 .eín‘lels :e :cl-P-ïxn enInvertcï'mos .
AÍlO cum)
PHOT07,005
- Tsll;v.‘l.'-1E<Ln.-'\..ni.r.i.term; 1975 133
EJU INUiJmC-ÉO'J
. Arbncin_gn¿ 1976 134
AHTRCFODOS ( ¿STA T5315)a 1976 l 35
. Insectos y crustáceos 1977 136
TABLA__9__í
mDol-P-Ayl 1974Dol-P-Gal 1975
1977
Dal-P-GICUA 1977( 4.? )
Princiinlea traba os srbreotros derivudou de dolicol.
CITA152
153
154
0v1ducta
HígadoCélulas
en cultivo
155 Fibrosurcgme
2| . L'n'azr Yen"
ALGAS
- Sod_ív'".'29¿k
Protulhcca se.
PLANÏAS VASCULARES
. _P_l'2'._calu1sc. (parola )
Glzcine se. (mia)
Piaumsn. (arveia)
Ru¡”ces de ton-note
. Fibras dc algodón
Células de sicornoro
¡1. .l, t ¡- - s.ut¡.‘..'. r v ,
r“ algas y pIC"vo\ unan lam
l973
¡9/8
1969
197D
|97|
¡973
¡976
l977
¡975
|977
|975
1976
¡977
-- Dal-F1 Mon
¿LA?
¡23
k’ s UUI
98
58
62
IOI
102
103
En las Tablas 4 a 7 se han recopilado los principales trabaios n vitro" sobre biosin
tesis de Dolicol-P-Man en diferentes organismos y órganos. En la Tabla 8 se detallan los
trabaios sobre biosintesis del Dol-P-Glc y en la Tabla 9 la de los restantes monoglícosíl
derivados ( Dol-P-Xyl, DoI-P-Gal, Dol-P-GIcUA ) .
La biosinresis del N-acetíl-glucosamínil derivado de dolicol merece considerarse aparte
ya que la unión entre el lipído y el azúcar es de tipo pirofosfato, lo que afecta las propieda_
des cromatogróficas y quimicos de dicha sustancia. Además, los sistemas glicosílantes
vitro" son de menor eficiencia y las transferasas sumamente lóbiles. La reacción de
"¡n
formación del Dol-P-P-GIcNAc se representa por la ecuación:
UDP- Glc NAc + Dol.P ———a-Dol-P-P-GlcNAc + UMP
En la Tabla IO se enumeran los frabaios sobre formación del acefíl glucosaminil derivado
IATA ¿9.1 13.11191:21:13: 95:49“.15139:12.05105.111.“..¿2221.-: :Ezüelïis
Mg 1975 140.157 Kama;1976 158 . fín-negrita. 1974 1711977 159 1978 172
1978 16°'161 . Oviducto 1975 130.131
Zluntns 1975 102 1976 173197G 97.162 1977 1'14
1977 62.163 _ Em 19.” los( 22mTESIS)“ 1974 106
1973 164 1977 175
1976 135 . T'iroidea 1976 126
MET-1‘12 . Eitrocifiq 1977 151.. «¿asiq 1971 16‘)
' 1972 166 . ¿Mm 1974 591973 1m . Fibrounïgnïg 1977 155
19'15' nou" . Mmm-¡EMS! 197., 1561976 169
1977 17o
a)Se ha identificudo,ndcmús un lípido-P-(P)-GalNAcb)En cute trabajo de describió,ndeuáa,un paliprenil pirofoufuto
N-ucetilmanusamlna
de Dol-P . Este parece ser el intermediario "soporte" en la bíosïnfesís de lípowolígosacórïdos
(Ver 1.2.3. ) . Todo indica que se elonga por sucesivas adiciones de GIcNAc y manosas,
a partir de los respectivos nucleófïdos azúcar ( Ver más adelante ) .
20
Se ha descripto también un poliprenil pirofosfato N-acetilmanosamina ( ¡68 ) .
Parece que los doliquil monosacórídos, pueden transferir directamente el azúcar a pro
teinas. Esel caso de la transferencia de manosa desde el Dol-P-Man a los grupos SER/THR
del manana de levadura ( 80 ) y en la manosilación de proteinas de higado de cerdo ( lll )
y cerebro embrional de pollo ( 106 ) . El papel principal, sin embargo, parece ser el armado
de los polipreniI-oligosacóridos que el traba ¡o de Parodi y col. ( l4ó ) demostró participan
en la sintesis de glicoproteinas.
Los estudios realizados In VIVO sobre doliquil monosacóridos, ( Tabla ll ) , son
conver entes con los datos "in vitroll . Además se ha lo rado realizar Ia sintesis uimica9 r
TABLA H : Biosl'ntesis " in vivo " de doliquil mnosacóridos : principo'es habeis:
AÑO CITAS
Dol-P-Man ¡974 ¡76¡976 |77 o |79
fJol-P-P-GlcNAc 1973 164l97ó lw¡977 ¡Ely (su TESIS
Dol - P - Glc ESTA TESIS
de diferentes poliprenil derivados, lo que ha resultado de gran utilidad para demostrar Ia
estructura anomérica y para su empleo como estándares. Esta linea ha sido desarrollada fun?
damentalmente por Warren y Jeanloz ( Tabla ¡2 ) .
2]
' \ |;' - ‘unrm quimiuu -I.-¡".lilunnll “num... .’..i.|.n (M¡.,.,.|¡...,.,, )
my (MDal - P - Man ¡973 ¡82
¡97.: 721973 7|
Dei-P-P—M-u- ¡975 ‘83
(‘ri - P - P - ClcNAc |91| 73
Fi-rm -P-P-C—|rNAc IHH HM
ti o." - P - h‘nn |9/Il ¡35
Fc' ¡mil - P —P - Col 1971/ ¡36
1.2.3. DolicoI-oligosacóridos conteniendo glucosa
Un hallazgo metodológico, consistente en la utilización de una mezcla de cloroformo,
metanol y agua en proporción 10:10:3 , permitió a Leloír y su grupo solubilizar una sustan
o b O D ' Í O O C ocra, prewamente estimada glicoprotema, y despues caracterizada corno pohprenII-oligosacó
rido ( 143 ) . Esta sustancia fue denominada aceptor endógeno de glucosa por ser éste el
azúcar que la radiomarcaba. La glucosilación del aceptar endógeno se obtenl'a a partir
tanto de UDP-Glc como de DoI-P-Glc. Losautores representaron la reacción con Ia
ecuación:
Dol-P-Glc + EA —«- EA-Glc + Dol -P
donde EA era el aceptar endógeno. El EA-Glc es insoluble en agua y en cloroforrno y en
mezclas de CH CI3 y CH3 OH que no sean la mencío nada.
22
Por tratamiento ácido del EA-Glc se liberó un oligosacórido de 13-16 azúcares ( 302
El comportamiento del EA-Glc en cromatografía de intercambio iónico indicó una unión
pirofosfoto entre la parte oligosacaridica y el Iipido.
El tratamiento alcalina del lipo-oligosacórido ( NH OH / 100° C ) liberó un oligosa4
córido cargado que se hizo neutro por tratamiento con fosfatasa alcalina. Tratando éste Últi
mo con ólcali mós fuerte ( 2 M KOH / 100°C ) el oligosacórido se convirtió en dos sustan
cias cargadas positivamente que, por N-acetilación volvieron a ser una sola y neutra. Se
interpretó de estos datos la presencia de dos grupos acetilhexosamina. Por otra parte se vió14
que la C Glc no estaba situada en el extremo reductor del oligosacórido y que la
parte lipidica parecia comportarse como dolicol cuando se formaba el correspondiente com
puesto de inclusión con deoxïcolato ( l43 ) y se filtraba por columna de Sephadex . En
base a estas propiedades y al Peso Molecular aparente del residuo hid'Ofi'Iicodel EA-Glc
( 3550 ) se estimó que debia tener alrededor de 20 monosacóridos ( 143, 188 ) . Posteriores
estudios evidenciaron que debia ser más corto ( 187 a 193 ) y que existian diferencias de
tamaño según los teíidos ( 192) y las especies (139-40). Debido al papel crucial que
desempeñan estos lipo-olígosacóridos, y a que parecen ser los "Últimos" intermediarios en
la glicosilación de proteinas, numerososgrupos se dedicaron a elucidar la estructura que a Ia
fecha de redacción de esta Tesis parece ser la que se muestra en la Figura 7 .
Losprincipales trabaios sobre biosintesis de poliprenil oligosacéridos contendiendo gluco_
sa se detallan en la Tabla |3 .
23
FIGURA 7 : Estrucfura actualmente aceptada para el olígosacórído del EA-Glc ( segúnLí ycol.
1.¿(Hu -1(Hu
TAELA_1}:Princioulos Lrabn os sobre bionínhenls de
¡J"Hu
(307)
Bhln
Dhn|
LH 'ñhul
(¡1.2
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ul.6‘\\
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¿1 n "1-"M
¿Shui,
/ul,:l
eligesucáridos contenivnio {IUC031.
TltrahynennLevndura
Plantea
Hígado
1.2.4. Dolíquíl dífosfato disocórídos
A12
1975
197_6
1917
1977
1973
1970
1971
1912
1973
1976
1977
CITAS
137
6
104.
144,14a
166,
189
187.ru
143
145.
¡90,
Tiroidee
Páncreae
Cerebro
Riñón
LinfacltosFibroblnaton
EritrocitosNoticulociton
¡1mm
A_Ro
1973
1976
1976
1977
1973
1977
1973
1976
1973
1977
1977
1977
’ (“FNAC - - (:l('.\:\t'
188
192 u 194
194
148,440133
19S;¿¡8135
194
168
149
151
150
Leloír y col. ( ¡67 ) describieron la formación en hígado de rafa del DoI-P-P-(GIcNAc)2
por clongoción del Dol-P-P-GlcNAc. Este hallazgo confirmó lo presunción de que la
24
"médula" sacaridica de muchas glicoproteinas, constituida por quitobiosa unida a la proteina
y ramas de manosas, podia ser sintetizado Via lipidos intermediarios. En numerosos trabaios
se estudiaron los oligosacóridos radiomarcados con [MC] GIcNAc ( Tabla 14 ) .
Lilith" lr! : I'IÍIV¡ru-luv.lrulmiu'.1:-'.rI-irÍu.ÍII|rs¡'n dl, Hui-2' -i'- ( GhHAc ).j
¿‘92 910.5.
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52.41127“? '975 '571978 ¡97
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¿nm ¡974 I96
FME ¡977 ¡5|
¿6293 1973 ¡72m3.93231. ¡976 97
gimnï ¡977 62
imei Im 164
(rsrA ÏESIS) ¡976 ¡90,185
En muchos de ellos, incluyendo lo realizado en la presente Tesis, se demostró la eionga
ción del Dal-P —P(GIcNAc )2 mediante el agregado de GDP-Man dando lipo-oligosacóridos
indistinguibles de los biosintetizados directamente a partir de GDP-Man (Ver próximo
párrafo ) .
Por otra parte, Turco y Heath ( ¡56 ) han descripto, en células transformadas, la tor
mación de un dolíquil pirofosfato-acetiIglucosamina-ócido glucurónico, posible precursor
25
de proteoglicanos como la heparina.
1.2.5. Dolicol-oligosacóridos conteniendo manosa
Behrens y col. ( 198 ) descubrieron la formación de poliprenil oligosacórídos conte
niendo manosa y después muchos grupos ( Tablas l5 a ló ) , especialmente los dirigidos por
Lennarz (124) y Heath (l99),han estudiado estos derivados. Losensayos revelaron propiedades
similares a las del EA-Glc y ello con independencia del órgano u organismo estudiados(45).
TABLA 15 : Principales Irabaio: sobre doliquilwligosacáridos que contienen manosa : plantasy grupos inferiores
AÑO CITASr AÑO cmsHongos l_
Soccharomxces cerevisiae ¡977 140 Soia ( Glycino ) 1977 62
Planlas Células de Sicarnoro(Cullívo) l976 l03
Algodón .l975 ¡021977 ¡63 Arlrópodos
Poroto ( Phoseolus ) I 1976 97, l62 lnsccrcs l977 l3ó1977 62
ESTA TESIS ¡973 203
Crustóceos ESTA TESiS
TABLA l_ó : Principales trobaios sobre Julia-” "_, ‘ " do -‘ L J que convienenmnosa
CITAS
Hfqadol975 204/20512l612l7 Tiroides 1973 -.¡9/7 2“ m ¡976 125,l92,l94
Aorla 1975 ¡23 l978 2l2
“’Zó 1‘? Mieloma ¡974 ¡99¡9,17 214 —— ¡97, 209
Oviduclo 1973 12/. '.—— ¡974 20] Refina l977 2l0
l97 l30,l3l,2W Parólida l975 .l27
2|? Eritrocitos ¡977 ISI, _ ‘ ' ' Rericulociros ¡977 150
Cuerpo luteo l9/5 2l5 _ ____— . _ Lml'ocnos l974 ¡96ggulasdeOVOflO2977 N/Póncrem ¡977 ¡48’ l lo Fllnol)astos ¡977 “9,?”
26
Desde el punto de vista estructural, y sin que ello implique necesariamente una interre
lación iisiológica, los lipo-oligosacóridos conteniendo manosa pertenecen a la mismafamilia
quimica que el EA-Glc . Su fórmula general seria
Dolicol - P - P - ( GIcNAc )2 - ( Man) n
donde n , habitualmente, es entre 1 y 9 . Las pruebas de Ia existencia de un grupo diacetil
quitobiosa en el extremo reductor son conclusivas. Se obtuvieron principalmente en los
derivados de oviducto de gallina ( 200 ) y de mieloma de ratón ( 199 ) .
Leloir y su grupo ( 200 ) lograron biosintetizar el trisacórido unido a lipido por elonga
ción del Doliquil-P-P- [14 C] -diaceti| quitobiosa con GDP-Manosa.
Utilizando Dolicol-P-P-(GlcNAc)2 sintético, Wedgwoody col. ( 196 ) ratificaron
que éste acepta un residuo manosa del GDP-Manasa ( pero no del DoI-P-Man ) para formar
el Iipído-trisacórido.
Otros trabaios similares ( 158, 173, 197, 202, esta Tesis ) , confirmaron Ia igualdad
entre los oligosacóridos radiomarcados con [14 C] Man y los marcados con
[14 Cl GIcNAc .
Losestudios 'ïn vivo " han contribuido también a aclarar la formación fisiológica de
estos polipreniI-oligosacóridos ( 176, 218, 22] ) .
El coniunto de datos quimicos y enzimológicos indica que los poliprenil oligosacóridos
se iormarian según la secuencia de reacciones postuladas en la Figura 8 .
27
É_I_G_U_tï\__8_:8ecucncinpostulnda para las reacciones de formación del EA-Glc
(Dol-P—P-GlcN/\c2-Man9-Glc3)y (le glícosílación de proteinas.(Según Behrens,cítado por Leloir(l38),y modificado según datosde Lí y col.(307) ).
GLICÜPRÜTEINAS
copy“ -— Dol-PPÏ‘GICNAC
UDP-Gal P AUDP'G'CNA" UDP-GIcNAc a o
DoI-PPGUWGCNAc
Dol'P
s GDP'ManGlc
9 s
Umec Dol-PPGIcNAcÉMani’
DoI-P-Man
Aceptar Doi'PP-GICNALZMan
(Proteinas) \Do|.pig|cDoiPPcicNAci Mari‘Man
En general, los polípreniI-oligosocóridos radíomarcados en manosa se obtienen con
facilidad y rendimiento aceptable. Espor ello que lo mayoria de ios autores ha preferido
partir de éstos en experimentos de giicosilcción de proteinas, que se discuten en el próximo
capitulo.
1.3. BIOSINTESIS D_EGLICOPROTEINAS
1.3. l . Generalidades
28
El Peso Molecular de las proteinas glicosilados va desde ¡0.000 hasta 1.500.000 , es
decir que por criterio de tamaño, no se agrupan en una clase especial de proteinas. Loque
es quizós más interesante tener en cuenta es Ia proporción de la parte carbohidrato en la
molécula ( Figura 9 ), el número de cadenas de carbohidrato por molécula de glicoproteinas
y/o el número de aminoácidos entre las mismas ( Tabla 17) (45, 222 ) .
ÏABLA ¡7 z Número y separación entre side cadenas de hidratos de carbono englicoprateinas ( dorm Iumdos de Spiro í 28' ) y otros )
N" DE CADENAS SEPARACION[mas GLICCPROÏEINASBE c.n.ï<íoñm_u1'ïo COL Nin DErl.dc C.
(N°de aa )
l ‘74
l 27.)
7 375
2 776
3 .IOOO
4 770
4 5|
6 60
8 ¡35
¡3 llJ
l? 796
¡7 ¡73
ll 70'}
500 Ü
UX) 6
Ribonuclcam B ( bovina )
Dcmniribonuclcaun
TransferrinaHuan
lnrmnoglobulim C Humana
Colégena Each-ritos Coneio
Cológcno Epidérnricrl Rclu
GI lcqwutcfno Ac¡du d¡ llull Sucio
t'ctuína del Sumo Fuml
Culégeno Epídruhi', Bovina
Huptogluhina Humana
Ïiloglohulina Bovina
Cnlüulmo do Cómra dr- Cuneio
Mu-CI-mlolnulinud? Ilmuunn
Hun'lnn ‘illb'lll‘i'fll Í‘mcinu
Mm un '¡UluIII/Illu Uvinu
29
FIGURA 9 : Proporción de carbohidratos en glicoproteinas
(Tomadode diferentes autores)\10°C
i. o rAcron AcLunNANrE DEHanonulo o ANnoENos DEcnuvo SANGUINEOL
’ O MUCINA SUBMAXILARCANINA
°° ’ O LEanA DEPAPA O MUClNAsuaMAquR OVINA
GLICOPROTEINA ACIDA o< (PLASMA HUMANO )40 '-
2 "E EXTENS'NA DEZANAHOR'A t GLICOPRorEINA BASICADEFARorIDA ( HUMANA )
ao - . ‘ GONADOTROFINACORIONICA HUMANAO OVOMUCOIDEQ FETUINA
zo v
9 AGLU'I’ININADE ul" Q HORMONA LUTEINIZANTEHUMANAl
C PEROXIDASADE RABANITO . GLUCOSA oxmASAMUCINA HIPOBRANOUIAL DE Buccinum
m . INMUNOGLOBULINAS 19 s
:i O LECÏINA DE POROTO Ó TIROGLOBULINAr
7 b O SUSTANCIA DEFEN' IVA DE Zr‘e b I h D ucus
5 ' Q LEanA DESOJA . R'BONUCLEASA9o VITELOGENINA DEBlorelln4L ' _O OVOALBUMINA
3 —
Q LECTINADEANANA 0 VI'I'ELONINA DE Philosamia cmthia
2 - O INMUNOGLOBULINAS 7 s
I
2 |si A CONCANAVALINA"A" (0%) O COLAGENO(0,6% )
Una de las clasificaciones másaceptadas ( 5 223) diferencia las glicoproteinas de
ios proteoglícanos, en base a las caracteristicas quimicas y proporciones relativas de las
cadenas de carbohidrato ( 224 ) . En las primeras, la proteina es, con frecuencia, el cons_
tituyente cuantitativamente más importante y las cadenas oligosacóridos son - en general
cortas, ramificadas y heterogéneas en cuanto a los azúcares presente ( los más comunes
GicNAc, GalNAc, Man, Xyl, Gal, Ara, NANA ) . Comorasgo general no se en
cuentran ácidos urónicos. Habitualmente no hay unidades heterosacaridicas repetitivas .
En los proteoglicanos, ricos en mucopoiisacóridos, la parte protéica es menos importante que
lo polisacaridica; ésta está formada habitualmente por unidades repetitivas, casi siempre
lineales ( 223, 224 ) . Es raro encontrar ácido siólico y muy comün los ácidos urónicos y
las hexosaminas. La esterificacíón con sulfato es frecuente. La unión tipica es entre una
serina y una D-xilosa.
Los investigadores europeos han adoptado Ia denominación de glicoconiugados para la
totalidad de glicoprotel'nas, proteoglicanos y glicolipidos ( 223 ) . En general no hay una
nomenclatura racional para ninguno de estos sub-grupos (4 ,223 ) . Las glicoprotel'nas de
vertebrados se clasifican frecuentemente por su función y/o teiído de orígen ( Tabla 18 ).
TABIA IB : r' "' "
. MUCOGLICOPROTEINAS.
. oucornomNAs DELPLASMA
INMUNOGLOBULINAS
GLICOPROTEINAS ba LA LECHE
. GLICOPROTEINAS URINARIAS
de glicoprotcina: por su origen y/o función
sub-mandibular“ y sublingualos (salivores)
parotïdeos y de los copasenameI
de grupos sanguíneos
gastrointestinales
del tracto respiratorio
del mucus cervical
fisiológicas
patológicos
GLICOPROTEINAS PROPIAS DEL SISTEMA NERVIOSO
ENZIMAS
HORMONAS
LECTINAS
Lasglicoproteinas de‘ínvertebrados han sido poco estudiadas. Quizás el grupo en que
han sido más es el de los Mollusca ( 225 ) .
A5,.‘.9:Tiposdeenlaceenglíc
ENLACEN-lïcosïdíca
.(sd-GlcNAc-ASN
ENLACEO-Glicosïdico
.ci-d-GaINAc-sm
0Ld-GclNAc-THR
.P-d-Xyl-SER
v——
eïnat
.-d-Ga|-SER
Glicaproveu'nasdelsuero Lectinasdeplantas Albúmínadehuevo.-d-Man-SER Mananadelevadura Sultavodequeratana,delacórnea
.-d-Gal-THR
-d-Man-THR
Mucínasub-rr. bovinayporcina
ar,ovina,
Mucínagástricahumana Mucinadecarcinoma
.(J-d-GaI-HYL
Gastrafcrrinahumana Glicoprotefnasdemembrana
-L-Ara-HYP
lnmunoglabulinos Feluína
-d-Gal-HYp
Glicoproteu'nasanticangelantes depezantértico CaseinaKdavaca Gonadotrafinacoríóníca humana
b)"Módulo"delmanana
Prateaglicanos(gl-Jcasamina glicanas),excluidaselhialuronatoyalsulfatodequeratana
a)DatostomadosdeReferencias: a)Cadenaslateralesdelrmnana
4,231a237
Paredcelulardeplantassuperiores:Extenslni‘ento:tatc,etc. Colégenodecutïculadeahead.» (lombrizdetierra). GlucosamílasadeAer¡llus Invertasadelevadura Mananodelevadura Colágenodecun’culadelombriz detícrra Cológcnacuticulardeanélidas Glicapéptídasfitotóxicosde hongos Cológenosymembranasbasaler decordudos Extensinadeparedcelulary glicoproteïnasdeplantasGlicoproteïnadeendosperma dotrigo
3|
32
1.3.2. Unión péptido-carbohidrato
La caracteristica esencial de las glicoproteinas es la unión covalente entre el carbohi
drato y la cadena peptidica. Las uniones que se conocen involucran sólo 5 aminoácidos,
dos de ellos raros - 4 hidroxy-lisina y 4-hidroxi-_L_prolina ytres (L ASN L SER y
L THR ) que son habituales en todas las proteinas.
En la Tabla 19 ( ver página anterior ) se indican los tipos de uniones de los glicoprotej
nas divididas según sea el enlace N-glicosidico u O-glicosidico.
Unión ASN-GlcNAc
En las glicoproteinas con enlace N-glicosidico ( Figura lO ) éste se establece entre
FIGURA lO : Estructura del N-acetilglucosamínil-asparragina
( 2-acetamido-l-L- (5 -aspartamido-l,2-di-deoxí- (5 -D-Glucosa )
0 NHzNH‘C'CHZ'CH
COZH
33
una N-acetilglucosamino y una Asparragina. Cabria esperar una participación importante de
los lipidos oligosacóridos intermediarios en su biosfntesis ya que todos ellos poséen GlcNAc
en el extremo reductor del oligosacórido ( ver mósadelante El enlace ASN-GlcNAc
es lóbil al ólcali (0.2 M NaOH / 100° C,- tiempo medio de hidrólisis: lOOmín. ). La
vida media en HCI 2 M/ 100° C es de l7 min.
En la Tabla 20 se indican los principales glicoproteinas que poseen esta unión; en lo
Figura ll se representan algunos de los principales tipos de glicopéptídos obtenidos por
degradación de glicoproteinas ricas en manosa ( 222 a 226 Existe microheterogenidad en
casi todos los glicopéptidos que se aislan por degradación enzimática de glicoproteinas,
como la ovoalbümina ( 227 ) .
G licoproteinas con enlace
GlcNAc - ASI:
Aglutinina de mia
Avidina de pollo
RNA“: porcina
DNAsa A bovina
Pigmeulo visual bovino
Su”an de keiolano
Membrana basal glonvcrular bovina
Siuloglicoproteino de rmmbranahu mona
Mncruglnbulinwd-Z humana
Glü opmloíuu (¡ci-ind-l humano
(lnnrkluhnflinu llumnnu rnriúnico
lan y lg Í liumumn
GlcNAc-AS N (Tomado,en parte,de (4) y (222) )
(bl-4 (sI-4Man ——— G'CNAL GlcNAc - ASN
Unión proteina - rumano cn levadura
0‘ - omilosode AE ¡Ilus
Ovoalbómina
Ovamucoide
l'iroglobulina porcina
RNAsa B bovina
Fetuim bovina
lgG bovino
IgG rnurim
IgG, IgA e lgE hunnnns
luctolancu ¡nahumana
FIGURA H : Glícopépfídos ricos en monosos ( tomado de 222 )
l- - - l- - (A) n_,6 n.'_6,H_'..6.H___6..n_'.".clcu;.c_'_"..c|cua;_..nsn
1m Im rw twn H n
f"! ÍznH n
f3“H
I- l-’ -I —I.(a) n___.i,. n_____‘l__n.--.'__'-alcxnc;..ulcNAc—.AsN
ípl ¡4| l
H M - . —
,2“ (c; n ¡6 n '6 H¿Lauren 'h,n|cnnc _..,\s\'
1 I JU I 7Mn
n n
1 ícln
.|— ' 1- _(o) H._6_.H_6..H;L(GlcNAc GlcNAc)—-+ASH
1 3+! t suH H H
l
Ï 241n
(c) n_.2 n ¡"6.n_."" cIcNAc_..'-l‘ GII.N/\c——ASN
(h) l-..-'.¡ u-nlu [Iluld‘illd y manana dr levadura 3“
(¡1) (.lí(n;-r..llnlu du l.) «(uunilísn (lr ly,_¡¡cru¡.íl_|_u¿
(CI O'Iualhún-nna dv qallinn
(D) (vllfl)lll::1lilllj I dr lp II," humana
H) Iirliún nulrrna dc- vnvins lnmunnq|uhulinas.
(k ¡ndth uur uuu un'unrrs v.|r|.|h|n-s)
Enlaces O-glícosïdicos
Los enlaces GalNAc-SER, GolNAc-THR y XyI-SER (Figura 12 ) son sumamente
lóbíles ol ólcoli, suictosa (5 -E|¡minoción (0.05 a 0.1“ NoOH/ 25° C/ 24 hs) (ver
Métodos ) . Losenlaces Gol-Hyl y Ara-Hyp son muy estables al ólccli (estable a
2 M NaOH /9o-105° C/ 16-20 hs y también a 0.05 M SO4H2/100° C/ 28 hs (Figu
35
ra 12 ) . Losenlaces Man-SER o Man-THR son también lóbiles al ólcalí.
FIGURA 12 : Enlaces O-glícosïdícos
01,0"I
o--———cH2R H2N-CH- C00"¿H H0 o“
HzN-¿H-COOHNHAc 0"
l ll
EnIaces O-Glícosïdicos a serína ( R= H )o a threonína ( R = CH3 ) .(l )En|ace a GlcNAc, de tipo d .( || ) Enlace a xílosa, de tipo © .
COOMl
H¡NCHI
CH20M 9"?
o “o FH:. c H _ ‘Enlace 0- Gllcosïdlco Gal-HYL ° (¡HCH —NH
OH z z
l
OH
HN—‘;\COOHEnlace O-Glícasïdíco Ara-HYP /y\/( arbitrariamente díbuiado en forma , "
. . ---opor no conocerse la real confuguracnón ) ml) o/'
OH
36
1.3.3. Proteinasglicosiladaspï dolicol derivados
Aunque ya habia sido postulado ( ó, 109 ) , Ia participación de los poliprenil-oligosa
córídos en la glicosilación de una proteina eucariote no quedó firmemente establecida hasta
el trabaio de Parodi y col. (146 ) . En el mismo se demostró que el EA- C14 C) Glc ,
incubado con microsomasde higado de rata era transferido a una glicoproteina ( insoluble
en TCA caliente ) . Lucas y col. ( 13 ) usaron precursores doblemente marcados con14 3
C C) Manosa y C H) GlcNAc - es decir en ambos extremos de Ia molécula oligosa
caridica - y vieron que en la incorporación a glicoproteina la relación de marcas se man
tenia constante. Ello indica que el oligosacórido se transfirió en bloque a la proteina.
Dado que en muchas glicoproteinas con enlace N-glicosidico la secuencia de los azú
cares más próximos a la proteina es idéntica a la encontrada en los poliprenil oligosacóridos
( ( GlcNAc )2 Man ) , se ha propuesto que la parte interna oligosacaridica de las
glicoproteinas con unión ASN-GlcNAc se estructuraria via lipidos intermediarios y que
el resto de la cadena Io haria via nucleótidos azúcar. A pesar de esta generalización no
existen todavia suficientes datos sobre la identidad de la mayoria de las proteinas glicosila
das por los polipreniI-azücares ( 230, 45 ) .
Losdatos publicados sobre la glicosilación,via ll'pidos,de proteinas de oviducto indican
que sólo un lO % de las mismas reaccionaron con el suero antiovoalbümina, a pesar de
ser ésta la principal glicoproteina biosintetizada ( 13] ) y lo mismosucedió con las cadenas
de inmunoglobulina de mieloma de ratón ( 199 ) . Estas tienen una estructura, en la médula
del oligosacórido, similar a las de varias glicoproteinas plasmáticas ( 223 ) . (Fig,]],póg.34),
También se ha demostrado la participación de dolicol-derivados en la unión a serína o
(.3 \'
threonina ( enlace O-glicosïdico ) .
EI caso más ilustrativo para ambos tipos de transferencia es el de manano de levadura
que contiene dos tipos de cadenas hidrocarbonadas ( 288 y 289 ) z unas cortas, ( 1 a 4
manosas ) unidas a SER o THR y otras largas y ramificadas unidas por ( GlcNAc )2 a
ASN con una parte interna de hasta 20 manosas y una periferia de hasta 150 manosas ( 289 ).
El DoI-P-Man es el precursor de las manosas unidas a SER/ THR ( 81 ) mientras que la
parte interna de las cadenas largas se sintetiza aparentemente a partir de DoI-P-P
- ( GIcNAc )2 Man (97, 157, 158 ) y/o de polipreniI-oligosacóridos más largos ( 291 )
( Figura 13 ).
FlGURA 13 : Esquema de la parte interna del manano unido a proteina en levadura( sobre Ia base de ( 222 ) , con modificaciones )
1-6 1-6 1-6 1-6 1 6 1-6 1-6 1-6 1-6 1-4 1-4M—-M—-M--M->M —hM-"M—"'M—*'M-" M—""GNAC'-"GNAC—-Asn
1 2-11 2-112-112-1 n 12-1|3-1 12-1 13-1M M M M vo— M M M M
12-112-112-1 fl 13-112-1M M M M M M L
13-1 13-1 13-1 13-1 yM M M M
4z
CADENA EXTERNA PARTE ¡"TERHR M
1-2M—-- M
, 1-2 1-2 .y Ser ( Thr)ouaosncnmoossensíuss M__ M__,. M_RLA'Laní ¡_3 ¡_2 ¡_2
M—-—M——4-M—--M
38
Además, Parodi (29] ) logró demostrar que el oligosacórido liberado del dolicol
pirofosfato por hidrólisis ócido débil fue capaz de elongarse ¡n vitro dando un polímero
con las caracteristicas tipicas de la porción periférica de las cadenas largas del manana.
Simultáneamente a la redacción de esta Tesis han aparecido varios trabaíos referentes a
la glicosilación de glicoproteinas virales del tipo ASN: Li y col. ( 307) han confirmado
que el oligosacórido unido a lipido ( el EA-Glc del grupo de Leloir ) se tronsFiere en bloque
al polípéptido naciente. Tras lo cual,enzimas posiblemente especificas eliminan las glucosas
y parte de las manosas. Robbinsy col. (319) y Hunt y col. (318) han obtenido resul
tados parecidos con glicoproteinas virales y el modo de procesamiento parece muy general,
a ¡uzgar por los trabaios de Staneloni y Leloir en tiroides ( 212 ) y Ugalde y col. (32] )
en higado. En este Último trabaío se describe una glucosidasa que actuaria Únicamente sobre
estructuras como la del EA-Glc ( ver Figura 7 , página 23) . Este procesamiento especif_í
co de los glicopéptidos nacientes, a nivel de reticulo endoplasmótico ( 32] ) puede consti
tuir una etapa crucial en la regulación del destino de la glicoproteina terminada.
En las Tablas 13 a ló se citaron algunos de los trabaios esenciales sobre transferencia de
azúcares de lipidos a proteinas. En la Tabla 2] se indican los trabaios más recientes, que
eventualmente remiten a los anteriores.
39
TABLA 2] : Principales trabaios recientes sobre glicosilación de proteinas mediada porpoliprenil azúcares.
ORGANISMO 21155 ORGANISMO CITAS
.Aigas 32h .Vertebrados
.Levadura Ih0,158 a 160 *Cerebro 195
.Arvejas 137 *Retina 132
.Vírus 320,322,325 *Hïgado 19]*Tiroides 192 a 19h,
212
*0viducto 208*0vario 2077'=F¡brobiastos lb9,2|i*Míelomas 209,320
Se puede, por tanto, postular que en ambientes intracelulares hidrofóbicos la parte
oligosacari'dica de ciertas glicoprotei'nas se arma a través de lípidos intermediarios. Eso
seria válido para glicoproteinas de membrana y también para glicoproteinas de exportación
que se glícosilen en forma previa, simultánea o inmediatamente posterior a la penetración
del péptido naciente en lo cisterna del reticulo endoplcïsmico ( 228, 229 ) .
1.3.4. Tunicamicina[otros antibióticos
Takatsuki y col. ( 326 ) aislaron del hongo Streptomyces Iysosuperificus un antibió
tico activo contra virus, bacterias Gram positivas y hongos. Lo llamaron Tunicamicina y
40
encontraron que contenïa glucosamina. Kuo y Lampen ( 327 ) demostraron que en la leva
dura, la tunicamicina actuaba como inhibidor de la sintesis de glicoprotei'nas. Los mismos
grupos observaron ( 328, 329 ) que el antibiótico interten'a con la sintesis del
Dol-P-P-GlcNAc . Esta inhibición, de tipo competitivo se producia solamente sobre la
unión de la primera GlcNAc al doliquil y no sobre la incorporación de la segunda
( 337 ) . Otros grupos han confirmado este efecto ( Tabla 22 ) y, actualmente, Ia TC se
utiliza como una valiosisima herramienta para esclarecer la participación de Iipidos interme
diarios en la biosintesis de diferentes glicoproteinas ( 330, 33] ) .
TABLA 22 : Acción de la tunicamicina sobre la biosintesis de Dol-P-P-GlcNAc y deglicoproteinas: Principales trabaios.
AÑO CITAS AÑO CITAS
1971 326, 335 1976 337o 339, 345
1972 336 1977 175, 219, 330
1974 327 343, 346
1975 328, 329 1978 331, 342, 344, 349
Kang y col. ( 332 ) han descripto la capacidad de la anfomicina, que es un antibiótico
polipeptidico, para inhibir la biosintesis del Dol-P-P-GlcNAc y la de Dol-P-Man. Por
otra parte, Reuversy col. ( 333 ) encontraron que un antibiótico similar, la bacitracina,
inhibió la formación del DoI-P-P- ( GlcNAc )2 . Ambos antibióticos también inhiben la
formación de derivados de undecaprenol en bacterias ( 332, 334 ) .
41
1.4. GLICOPROTEINAS _D_EINSECTOS
A pesar de que los artrópodos constituyen el phy Ium animal con mayor número de
especies, su bioquímica está poco desarrollada. Gran parte de las falencias en los estudios
realizados con artrópodos se deben a que han sido desarrollados por biólogos carentes de for
t, f O I O D ' O Imacuontecnica para el traba¡o a nivel molecular. Losbloqwmlcos, por su parte, prefieren
frecuentemente trabaiar con mamíferos, plantas u hongos. En los invertebrados, en general,
los compleios de proteinas-hidratos de carbono sólo se han estudiado bien recientemente ya
que gran parte de los trabaios de más de 15 años utilizaban técnicas de detección histoqui
micas ( 225 ) .
1.4. l . Mucopolisacóridos unidos g proteinas
La identificación histoquimica . de proteinas asociadas a ácidos hialurónicos no se puede
tomar como evidencia de una unión estable ( 225 ) . Sin embargo, se han identificado varios
aminoácidos en los hidrolizados del hialurónico constituyente de la membrana perítrófica de
gusano de seda ( 231, 232 ) . En secreciones de glándulas salivares de dipteros se ha des
cripto también una proteina aparentemente unida a hialurónico ( 234, 274 ) . Estosdatos
se contradicen con lo encontrado en mamíferos, donde el hialurónico parece simplemente
interaccionar especificamente con proteoglicanos, sin que medien uniones covalentes
( 4 y 5 ) .
Por otra parte, existe una secreción polisacari'dica en los tubos de Malpighi de varios ¡n
sectos homópteros rica en ácido glucurónico, glucosa, Rhamnosay glucosamina (¿NAcet í l 3.
42
En Cosmocarta abdominalis el polisacórido ácido de malpighi parece estar asociado con pro
teina y es sensible a hyaluronidasa testicular ( 235, 236 ) . Aqui también podria tratarse de
un caso de unión no covalente.
1.4.2. Homopolisacóridosunidos (¿proteina
Quitina
La quitina es el polisacórido más abundante del reino animal. Esun polisacórido lineal
de residuos GlcNAc unidos en forma {b ( 1-) 4 ). La estructura y propiedades son muy
similares a las de la celulosa ( Figura 14 ) . Probablemente la quitina de invertebrados, en
FIGURA 14 : Estructura de celulosa y de quitina
CH,0Ho
0‘ OH o
OH
CE LULOSA
CH,0H CH,0H_\ --o o0‘
0' OH °
NHCOCHI NHCOCHl
3
QUITINA
43
su estado natural, debe estar unida a proteina ( 308 ); sin embargo, debido al tipo de
extracciones sumamente drásticas, se consideró durante mucho tiempo que se trataba de un
" homopolisacórido “ sin unión a otras sustancias.
Existen evidencias de que hasta un 10 % de azúcares de la cadena podrian estar desa
cetiladas ( 237, 308 ) . Además, dependiendo del teíido de donde se extrae Ia quitina,
habria pequeñas cantidades de otros azúcares neutros ( 309, 312 ) . Laquítina del exo
y endoesqueleto cuticu lar parece estar tan compleiamente unida a proteina y otras moléculas
( Figura 15 ) que más propio parece referirse al compleio como una glicoproteina de
FIGURA 15 : Modelo de estructura de cuticula( tomado de L ipke and Geoghegan (310 ) )
grü,. hÜfifllfik I “p-Ljüücon
VIloNo
nm HM ) (U,
Ü-L {'Ïi Ü ‘51]-{_.}-Ü-WlÜ-{ 1-Malí-13‘60“-->h
O : N-acetilglucosaminil /_\: lndolil [j : Aminoócido (Ar = aromático )O : Polifenol . Lasóreas rayadas indican interacciones no covalentes (a ) Puntos sensibles a Ia
oxidación con N-Bromo-succinimida. ( b ) Puntos sensibles a enzimas proteoliticas. ( y ) indicearbitrario que representa la polímerización de Ia quitína. ( z ) idem polimerización de la melanina.
44
cuticula (225, 308, 310 al 313,233)
Losdatos de cristalografia de Rayos X apuntan fuertemente en ese sentido ( 225, 314,
315 ) . Se ha postulado que la artropadina, principal proteina de cuticula, ínteracciona con
Ia quitina (debido a su configuración g) ) ( 238 ) pero probablemente se trate de ín
teracciones débiles. Hackman ( 239, 240 ) eliminó el grueso de la proteina e identificó
los aminoácidos más próximos a la matriz oligosacari'dica como bistidina y ócido aspórtico,
lo que sugerin'a la existencia de un enlace entre el grupo amino de la hexosamina y el grupo
.-carboxilo del ácido aspórtico. Sin embargo otros autores han cuestionado estos resulta
dos (241, 312).
En la epicuticula del arócnido Polamnaeus swammerdami se ha detectado principalmen
te ócido glutómíco en los glicopéptidos de quitina ( 242 ) .
Glucógeno
El glucógeno es un poli'mero d ( 14-4 ) de glucosa, con cadenas ramificadas unidas
por puentes o( ( 1-!- ó ) . Se lo ha encontrado soluble en ócido tricloroacético ( lio
glucógeno ) e insoluble ( desmoglucógeno ) . Se ha postulado que este Último está covalen
temente unido a proteina ( 316 ) .
En el cestode Moniezia expansa el desmoglucógeno forma un compleio con proteina y
se lo puede dividir electroforéticamente en dos fracciones que contienen un 40 % ( "Baerina")
y 90 % ( " Moniezina " ) respectivamente de proteina ( 243 ) . Se ha encontrado la
" baerina en Taenia saginata ( 244 ) y otros organismos ( 245, 246 ) .
En la pupa de mosca Calliphora erxthocephala existen cuatro fracciones de glucógeno
que sólo difierenen su contenido peptidico y en el grado de ramificación ( 247 ) .
45
Reynolds ( 317) ha sugerido que - al menosen cuticula - muchas interacciones entre
hidratos de carbono ( fundamentalmente quitina ) y proteina pueden establecerse por medio
de bases de Schiff.
1.4.3. Vitelogeninas
Losprecursores de proteinas de vítelo, presentes en hemolinfa de hembras de algunos
insectos, han sido llamadas vitelogenínas ( 248 ) . Tras modificaciones en Ia molécula,
TABLA 23 : Porcentaíe de azúcares en glicoprotel'nas de vítelo
Insecto Tipo de glicoproteinas % H. de C. Cita
Vitelogenina Vitelinina
Blatella germanica + 4,5 154
Blatella germanica + 8,0 154
Leucophaea maderae + + 8,6 252,255 al257
Locusta migratoria + + 13.3 250
Locusta migratoria + 11.0 258
Locusta migratoria + l4.0 25]
Hyalophora cecropia + + l.0 253, 259
2.5 249,260,261Philosamia cynthía + +
46
pasan al vítelo y se las denomina viteloninos ( 249) . Ambos tipos de molécula son lipo
glicoproteinos y los azúcares predominantes son(¿NAc?) glucosamina y manosa ( 249,
250, 252 ) . En lo vitelonina de langosta se aisló un glicopéptido donde la manosa parece
unida a Asparragina ( 251 ) . En la Tabla 23 ( ver página anterior ) se han resumido los
estudios sobre estas sustancias.
1.4.4. Calliforina
Las larvas de Callíphora erythrocephala contienen particulas de lO nan ometros de
diámetro constituidas por una glicoproteina llamada calliforina ( 262 ) . EI contenido de
carbohidrato es baio ( 0,5 % ) ( 263 ) .
Se han encontrado también proteinas que dan inmunoreacción cruzada con Ia Callifo
rina en Bomb ( 264 ) y en Drosophila ( 265 al 267) pero no se ha detectado
carbohidrato.
1.4 .5. Manoproteinas solubles
La muda en la cucaracha parece estar acompañada por cambios en los carbohidratos de
glicoproteinos plasmáticas ( 269 ) . Utilizando técnicas electroforétícas se han aislado dos
glicoproteinas del plasma de la cucaracha Períplaneta americana ( 270, 271 ) , que con
tienen 2-amino-2 deoxy-D-Glucosa, 2 amino-2 deoxy- D- Galactosa, manosa, galactosa,
arabínosa y xílosa. En el dia previo a la muda aparece una tercera glicoproteina en el
plasma (271 ). ( Ver también ( 198) ).
El principal azúcar neutro en estas glicoproteinas parece ser la manosa.
En la secreción de las glándulas salivares de Drosophila víridis hay una glicoproteina
47
conteniendo glucosa, golactosa, manosa y 2-amino-2-deoxiglucosa ( 272 ) . Este último
azúcar ha sido hallado también en secreciones de la glándula solívor de la prepupo de
Drosophíla melanogaster ( 273 ) . Otras glicoproteïnas similares han sido detectadas en
secreciones salivares de larvas de mosquito quironómido ( 274 ) .
En la secreción salivar de Rhynchosciara americana se han detectado ( 295 ) por lo
menos 9 posibles glicoproteinas. Aparentemente la función principal del fluido solívor en
las larvas seria la secreción de las proteinas usadas en la construcción del Cocón. Utilizan
do este insecto, Santelli y col. ( 296 ) han descripto una alta actividad biosintética de
nucleótidos azúcares, posibles precursores de glicoproteinas.
1.4.6. Fibroinas de la seda
Estudios recientes de Sinohara ( 347 ) han descripto que las fibroinas constituyentes de
la seda de diferentes especies de mariposas Bombycidae y Satuniidae contienen hasta tres
unidades de hidrato de carbono cada 100 mg de proteinas ( Tabla 24 ) .FTABLA 24 : Cantidad de carbohidratos ( p moles/ 100 mg ) en varias fibroinas
de sedas de diferentes mariposas ( tomado de Sinohara ( 347 ) )
TOl’AL
Iun\lu\- hu“ ' ¡um A quu .. .Ln um\\|I N\.i'll\l
209l , y 3. 0.66¡H n... ¡un un nll J L'I‘llu. ¡u un ¿.90l'l-I-n I I|| |||l¡ IIIII IIII| IIII'1......,.
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48
Lo unión del hidroto de carbono o lo proteina serio del tipo ASN-GlcNAc ( 348 ).
1.4.7. Otras glicoproteinos cl_e_insectos
Loshuevos de Drosophilo contienen adhesivos ( 275, 276 ) aparentemente excretodos por
las glándulas accesorios de las hembras ( 277) y que contienen 2 omino-2-deoxy-D-Glucosa.
Losdel saltamontesAchaeto tambiéncontienenen sucáscaraunoespeciede
lubricante ( poro posor por los ductos genitales ) que es uno glicoproteino conteniendo hexosa_
minos lo cuol parece tener propiedades de inhibidor de tripsina ( 278 ) .
Anderson ( 279 ) describió una secreción de las glándulas occesorios de aporoto copulo
torio mosculino que parece ser uno glicoproteino asociado a un fosfolipido y cuya naturaleza
no pudo dilucidar debido a que usó técnicos histoquimicas.
Por otro porte Sissockion y Veinora ( 280 ) demostraron la presencia de un glicopéptido
ácido soluble conteniendo 4 % de orabinosa en el fluido celómico de pupos de gusono de
seda ( Bombzxm ),°hidrolizodos de una fracción de un precipitado ocetónico de dicho
Fluido redisuelto en oguo dieron presencia de glucosa y manosa además de lo orabinosa domi
nonte. Lo fracción insoluble en oguo parece ser una clase de nucleótido-gl icopéptido de
nuevo tipo.
Finalmente hoy una larga lista de citas sobre glicoproteinos solubles, detectadas en bose
o evidencias histológicos, que son dificiles de evoluor (225, 268 ) .
1.4.8. Circulación X reconocimiento d_eglicoproteinas <2 insectos
Varios grupos de investigadores han observado que ciertos prote inos espec iticos de insec
tos, circulontes enlhemolinfo, desaparecen de ésto por coptoción o nivel de cuerpos grasos
49
( 297 ) . Muchas de estas proteinas, como la Calliphorina , son PAS positivas y se las encuen_
tra también en células de cuerpos grasos, acumuladas en grónulos ( 298, 299 ) . El proceso
de captación parece altamente selectivo ( 299 ) lo que sugeriria, por analogia con el higado
de los vertebrados ( 300 ) , la posible existencia en células del cuerpo graso de lectinas
( o glicosiltransferasas ) capaces de reconocer los carbohidratos de las glicoproteinas circu
lantes. Si asi fuera, el proceso seria diferente de la desialización en los mamíferos ( 297 )
ya que no se ha detectado ácido siólico en proteinas solubles de insectos ( 30l ) .
50
1.5. OBJETIVOS EE. PRESENTETRABAJO QE TESIS
Como se ha expuesto en esta introducción, en el momento de iniciarse Ia presente Tesis,
diferentes investigadores habian caracterizado derivados de dolicol en mamiferos, aves y hongos.
Otros pocos trabaios habian extendido los estudios a las algas ( dos trabaíos ) , plantas
( un trabaio ) y a un protozoario, como único invertebrado ( un trabaio ) . En varios grupos
de trabaío, incluyendo el del Director de esta Tesis, se realizaban en ese tiempo, además de
los estudios con mamiferos, nuevos estudios en plantas.
Los insectos y otros invertebrados interesaban al autor por sus particularidades fisiológicas
y bioquimicas y su importancia económica y sanitaria. El punto de partida de la presente
Tesis - como ya se ha indicado - fue la detección por el autor, de un glicolipido, con
propiedades similares a las de los poliprenil-azücares, en Triatoma infestans primero y en
otros insectos después.
Losobietivos de la presente investigación han sido:
1°) Esclarecer la naturaleza y propiedades del poliprenil de insecto ( hasta ese entonces
desconocido ) y de sus derivados fostoriladasy glicosilados.
2° Estudiar las relaciones metabólicas de esos poliprenil-derivados entre si y el papel queV
cumplirian como intermediarios en la glicosilación de proteinas.
30 Buscar correspondencias entre los datos obtenidos "in vitro" e "in vivo" , tratando deV
correlacionar con el ciclo de vida y estudiando posibles puntos de regulación.
4oV Extender los conocimientos obtenidos en insectos a organismos filogeneticamente cerca
nos ( crustáceos ) y establecer analogias con los resultados obtenidos por otros autores
en eucariotes.
5|
La presente Tesis contiene los trabaios realizados exclusivamente por el autor, baio
supervisión del Director. Tanbién contiene aquellos experimentos, de los trabaios realizados
en colaboración, en que la participación del autor ha sido relevante y se omiten aquellos en
que no ha tenido participación directa.
52
2. MATERIALES Y METODOS
2.1. ORGANISMOS UTILIZADOS
El grueso de los experimentos descriptos en eI presente trabaío de Tesis se realizó conestadios larvales y adultos de " mosca de la fruta " , Ceratitis capitata, y de Ia " vinchuca 'LTriatoma infestans
Se los seleccionó utilizando tres criterios principales:
a) Posibilidad de conseguir suficientes cantidades de material;
b) Posibilidad de determinar el momentodel ciclo de vida y, en Io posible, poder manipularéste, y
c) Detección de poliprenil transferasas.
Se han utilizado también, para experimentos especiales otros artrópodos que cumplieronalguna de estas premisas:
Tenebrio molitor ( Escarabaio de panaderia ) ( b, c )
Palendus dermestoides ( Escarabaio de semillas ) ( a, b, c)
Camponotus M ( pupas ) ( Hormiga corredora ) ( b y c )
Periplareta americana ( Cucaracha ) ( b y c )
Aeschna bonaerensis ( LibéIuIa del Delta ) ( a en forma estacional )
Mallophora rUFicauda ( Moscardón de los colmenares ) ( a en forma estacionaI y c )
Ms m_eI_I_i_fe_ra(Abeia doméstica) (a y b )
Porcellio sp ( Crustacea ) ( Bicho bolita ) (a y c )
5m sgliï (Crustacea) (a, b, c)
Con el obieto de establecer paralaies con organismosfilogenéticamente distantes de losinsectos, pero con analogías metabólicas, se realizaron estudios en:
NeurosEro crassa ( Hongo ascomycete )
Phycomxces blakesleanus ( Hongo zygomycete )
Euglena viridis ( Zooflagelado fotosíntético )
En la obtención rutinaria de enzimas y/o sustratos se han utilizado preparaciones de teiidos de mamifero ( higado de rata, de cerdo, etc. ) y de aves ( oviducto de gallina ) .
2.2. SUSTRATOS
A Io largo del presente trabaío se utilizaron diferentes lotes de cada droga radiomarcada.
Se utilizaron los siguientes nucleótidos-azücares, preparados en el Instituto de Investigaciones Bioquimicas, Fundación Campomar, de acuerdo al método de Wright y Robbins ( 303 )con las necesarias modificaciones:
3 . [14 ] . .- UDP'[ H "Glc de 3.46 Cl/lTlOl y UDP C Glc entre CI/mol y 268 CI/mol
- GDPÏ[]4C]-Man de la) Ci/mol
- UDP-[I4C17Gal de 268 Ci/mol
- UDP-['4c]- GlcUA de 268 Ci/mol
De fuentes comerciales se utilizaron:
-. [MC] -G|ucoso entre 260 y 268 Ci/mol de New England Nuclear14
- i C] -Manosa entre 50 y 100 Ci/mol de New England Nuclear
[MC] ' Glucosamina 200 Ci/mol de Amersham
- GDP [MC] Man entre 208 y 40 Ci/mol de New England Nuclear
- UDP [MC] - NAcetiIglucosamina entre 45 y 60 G/M de New England Nuclear o Ama.sham
- UDP [MC] - NAcetílgalactosamina 47.0 Ci/mol de New England Nuclear14
- UDP l C.l Arabinosa 183 Ci/mol de Amersham
54
lll- UDP l C] Xilosa ¡00 Ci/mol de New England Nuclear
14 El -32P] ATP se preparó según el método de Glynn y Chappell (304 ) . LaC Tre alosa de 25 Ci/mol se preparó por sintesis enzimática mediada por Trehalosa fosforilasa según el método de Belocopitow y Maréchal ( 30 ) . Se Ia obtuvo también por biosintesis, en cultivo de cuerpos grasos de Triatoma con Í C] Glucosa.
Lospoliprenil derivados radiomarcados se obtuvieron de acuerdo a las técnicas expuestasen la presente Tesis.
Todas las demós drogas son de origen comercial. Lossolventes orgánicos fueron generalmente destilados antes del uso, especialmente cloroformq,metano| y piridina.
2.3. ENZlMAS AUXILIARES
- Proteasa de Streptom ces griseus o Proteinasas de estreptococos ( Pronasa ) ( Ec.3.4.22.10 ) Sigma y CalEiocFem respectivamente )
Quitinasa de Streptomyces griseus . Se purificó por el método de Cobib y Bowers(306)
Emulsina y lísozima, de clara de huevo ( Nutritional Biochemical Corp. )
Celulosa de Aspergillus niger y (b -glucosidasa de almendras ( Sigma )
El ¡ugo de hepatopóncreas de caracol terrestre se preparó de acuerdo al método deMyers y Northcote ( 350 )
Glucosa oxidasa de Aspergillus niger ( Sigma )
Glucosa-ó-fosfato deshidrogenasa de levadura ( Sigma )
Hexoquinasa de levadura ( Sigma )
Peroxidasa de rabanito ( Sigma )
Fosfatasa alcalina bovino (Sigma )
2.4. EXPERIMENTOS " IN VIVO "
Para los mismos, se utilizaron, principalmente, diferentes estadios larvales de Triatoma
55
infestans y de Periplaneta americana. Enexperimentos preliminares se determinó que, paraTriatomo , la máximo incorporación de radioactividod a componentes cuticulares y a glicolïpidos lóEiIes ol ácido se verificaba en eiemplares recién mudados a adulto, durante el periodoen que la cuticula todavia es translücida. Despuésde anestesiar con frio o con C02, elprecursor radioactivo se inyectó en hemolinfa con una microieringa Hamilton. Con la aguíase perforó la pared abdominal flexible, entre dos piezas esternales previamente esterilizadascon etanol 96 % . La perforación se obturó con parafina caliente y, en caso de pérdida dehemolinfa, éstcI se tomó con papel de filtro y se contó en centelleador para conocer la cantidad real de radiomarca inyectado. El animal se mantuvo a temperatura ambiente por eltiempo de marcación. Comovehiculo se utilizaron soluciones fisiológicas de Hoyle o de
(Tabla 25 ) .Chen
TABLA 25 : Medios do cultivo y soluciones Ringer de insecto
Medio Semi-Cambre
Acetato Mg . 4 HZO
Acido c( xctogluréríco
Acido mleico
Acido lumnrica
Frucroso
Sacarorc
Aibümina bovina V
Lcc'clbümina
L-Glutamïna
Hi'Jrclizario laclulbümina
Agua destilada exp
l'enícilira G sódico Squibb
Eslrrp'omícina Squibb
ü
l CO
300
340
205
5600
320
490
500ml
Medio Minimo
NaCl
KCl
CaCl . 2H202
504Mg . 7|120
PO H Na . H O "4 2 2
COatha
Sacoroso
HZO bidutil. csp
Rige-r de Hazle (393 )
NaCI
KCI
MgCI2 . 6 HZO
CuCI2 . 2 H20
NoHCO3
Nall2P04
Agua csp
finger de Chen (399)
NaCl
KCI
CaCl2
H20 esp
500 ml
Para analizar la marca incorporada se disecaron los eiemplares sobre placa de parafinacuidando eliminar cabeza, hemolinfa y sistema digestivo y el resto se procesó para extraccióncon solventes.
2.5. CULTIVO EE TEJIDOS
Se utilizaron larvas de 5° estadio de Tríatoma infestansy adultos recién mudados, preferiblemente en la etapa en que Ia cuticula aún es trans Úcida ( son visibles las insectorubinasde la epidermis ) .
Se disecaron los animales esterilizados externamente con etanol, anestesiados por frio ydecapitados, separóndose los cuerpos grasos, las alas rnembranosasy las paredes tergales yesternales del abdomen ( los tubos de Malpighi se separaron por flotación en solución fisiológica ) . Todo el manipuleo se realizó en la forma lo mósestéril posible, baio campana defluio frontal. Como medio de cultivo completo se utilizó bemolinfa de langosta de mardiluido al 25 % con una parte de Tris HCI pH 7.4 lOmM y dos partes de medio minimo osemi-completo ( Tabla 25 ) ( ver página anterior ) .
Se añadió ( 14C ) Glc, ( 14C )Man o ( 14C )Trehalosa, según los casos,y despuésde la incubación se lavó abundantemente con medio de cultivo nuevo tras lo cual se disgregaron las muestras en homogeneizador Potter/Eveliheim con émbolo de Teflón, accionadoa motor.
Loshomogenatos se extraíeron con cloroformo/metanol 3: 2, calculando el volumende las muestras como un 50 % de agua y completando para la partición con MgC|2 4mM.
Diseño de una solución fisiológica y un medio de cultivo (Tabla 25 )
El medio minimo se preparó de acuerdo a los siguientes criterios: sustituir parte delNaCI de la solución fisiológica de Chen ( 399 ) por Na C03H y No PO4H2 comorecomiendan Hoyle ( 398 ) y Madrell ( 400 ); además se añadió 504 Mg . Se añadiósacarosa como estabilizante para disminuir roturas de células en cultivo .
El medio semi-completo (a completar con hemolinfa de langosta ) se diseñó sobre labase de los requerimientos estudiados por Grace ( 401 ), sustituyendo los aminoácidos porhidrolízado de lactalbumina, suprimiendo las vitaminas, y estableciendo las proporciones desales inorgánicos de acuerdo a los criterios generales para soluciones fisiológicas, concuidado de evitar la formación de precipitados.
57
2.6. AlSLAMlENTO QE DOLICOL DE INSECTO
- Método A:
Se homogeneizaron 250 g de pupas de Ceratitis en una licuadora Sorvall Omnimixerdurante 3 min a velocidad móxima. El tampón de Bomogeinización contenia: Tris-HCIpH 7,35 50 mM; EDTA l mM; 2-mercaptoetanol 1 mM y 2,6-ditert-butil cresol ( BHT)0,1 g/litro como antioxidante. Se centrifugó a 13.200 x g en centrifuga refrigerada durante10 min ( el sobrenadante se puede utilizar como fuente de fracción microsomal ) . El precipitado se resuspendió en l litro de agua: acetato de etilo ( 100: 8 ) y se transfirió a unbalón de 5 lt. Se añadieron 2 It de metanol destilado conteniendo 150 g de KOH 85 % y40 g de ócido pirogólico. Se reemplazó el aire del balón por N2 y se deió agitando por2 hs a 37° C , después de lo cual se calentó a refluio durante 4,5 hs a 70° C. Se deíóuna noche a 20° C baío atmósfera de N2 y se extra ¡o con eter etilico una primera vez con2,5 lt y una segunda vez con 1,5 It. La Fracción etérica se Iavó con agua repetidamente( l vez 2 It y 6 veces de 1 lt ) y se añadió al balón sulfato de sodio anhidro en exceso paraeliminar el agua residual. AI extracto asi obtenido se lo denominó : extracto saponificado.Se esquematiza Ia marcha de la extracción en la Figura ló . A partir de este extracto se
FIGURA|62Extracción de dolicol de insectos=Método A.0btencíón de Extractosaponificado libre de esteroles.
Preparación deHOMOGENATO ;<:SOBRENADANTE enzima microsg
13.200 x g malPRECIPITADO
KOH
Acido pírogálícoi Incubación 37°C
-Saponifícación- Reflujo 70°C: Repaso 20°C
Extracción conEter,lavados ,separación,deíhidratación,etc. FRACCIONACUOSA
EXTRACTO SAPONIFICADO
ESTI'ROLESe '15 c-Dcslilncíón
Etcr de Pclrólco-20”C
L‘tTlROLL'S4-EXTRACTOSIN ESTEROLES _fidsorción en alümina(Fig.l7)
_Adsorcíón en columna(Fíg.18)_
58
ÍlCrU‘Hl__l_7_rut lllLJciñu ru ..lúrll.|J¡Lla_r.1__ll3__:(uluvm.l(rmunlnnrailcu de olñminn
[XlRÁCÏOSIN ls‘lïfills"" _"""_"'—"""' rnAcílouls2 o 3
1‘¡lámina Gr.l| A|Gmínalvplcr ¡zl
I
[tor de P.30’65'rmgclon l
pridos adlsorbidos _.. rnccuficg o 7,I I
'Elcr ¡(.101 en [.dv P.lavados
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--— LRJ'EC_É!91‘._É
(a)Coln.n:na de ¡.3 x 20,0 ("1.1.15 cluciunesse re'nlíIJron con lbbcc dc cada solución.
(“La relación lípidos/al-ivzinJ (n pesoapróximaderi'le de ¡:60.
fraccionaron las clases de lípidos según el método de Burgosy col. ( 31 ) con leves modiFícaciones. Para ello se deió una noche a -5° C el extracto saponificado, al cabo de lacual precipitaron esteroles que se descartaron. Se destiló el extracto hasta volumen reducido( 150 ml ) , se le añadieron 2 vol de éter de petróleo 30-65 ° C y se llevó a -20° C en congeladora. Losesteroles precipitados se eliminaron por Filtración en Buchner en ambientetrio y se lavaron con éter de petróleo trio repetidamente. Losfiltrados combinados se volvieron a llevar a -20° C durante una noche y después de eliminar los esteroles remanentes sereduio el volumen de los extractos a 100 cc ba ¡o vacio. Este extracto se fraccionó por adsorción sobre 40 g de alümina grado ll ( SERVA) en vaso de precipitado según el esquema dela Figura l7. Las Fracciones 2 y 3 se mezclaron asi como las 4 y 5, fraccionóndose nuevamente por cromatogratias en columnas de alümina grado Il ( SERVA) . Los lipidos adsorbídosse eluyeron de la columna según el e squema de la Figura 18 y se analizaron por cromatografía
5‘)
de capa fina.
- Método B :
Enun método alternativo de obtención de dolícol se utilizó la fracción acetónica delmétodo de obtención de dolícol fosfato (ver mósadelante ) . Después de eliminar losesteroles por repetidas precipitaciones a -20° C al extracto acetóníco se le añadieron lasfracciones neutras de la columna de DEAE-Celulosa del método de obtención de Dolicol-P.El extracto se reduio en volumen volviéndose a eliminar los esteroles por congelación y Filtración y se lo purificó o bien por el método A o bien por sucesivas cromatografias del material en capa fina preparativa ( 0.7 mm de espesor ) . La obtención se esquematiza en laFigura 19.
Figura 19: rurifícacíón de Dolicol de lnsecto(Método 0) y de Dollquíl fostato
Hx‘"OGLNFAT0
Acciona
\___-ranccuw ACETONICA_.csuauus
t____ lAVA30í__JClorofn'no/Futuna!2:| __—_
l \‘RïcílDN L/H 2:| l
l
Sapoul'icamlófl Suponilinacíón
V.n(i(i6n lrulthi I\—--—----—-o- II:,‘L(I0!I AcuofiA
L'lnirlQ_ÉÜPÜ"ILJIÉP°
.
V(0|.DÍÁI'CrluI-¡So
.- FRACCION HEUÏRAIv
L___—Pcrcoladul
. V .Gradueule 'U'ml0l0.N"L ïlc.prcoarativaI
i
Ocasionalmente, se utilizó el método de extracción de Walton y Pennock ( 25 ) comoalternativa al método A , obteniéndose resultados similares.
2.7. EXTRACClON[É DOLICOL FOSFATO E INSECTO
Se utilizaron 30 g de pupas de Ceratitis ( en el momento en que comienza la pigmentación de los oíos ) o larvas de 5° estadio de Triatoma infestans . Se homogeneizaron en cincovolúmenes de acetona y se filtraron, El residuo seco se volvió a extraer dos veces con3 volúmenes de cloroformo/metanol 2: l y se filtró. Losextractos clorotormo-metanólicosse llevaron a 0.] N de NaOH y se incubaron por 15 min a 37° C. Después de neutralizarcon HCl y de llevarse a partición según el método de Folch y col. (355 ) , la fase orgánicase lavó de acuerdo al mismométodo repetidas veces con cloroformo/metanol/agua 1:16:16.
El extracto se hizo pasar por una columna de intercambio aniónico de DEAE-Celulosa( forma acetato ) de 1,0 x 20,0 cm preparada en metanol 99 % y luego equilibrada conclorotormo/mctanol 2: l . Despuésde reciclar el material lipidico de insecto, se siguiólavando con cloroformo/metanol 2: l, para eliminar los lípidos neutros remanentes. Para laelución de la columna se utilizaron o bien un gradiente de concentración de formiato deamonio 0-200 mM en cloroformo/metanol 2: l o bien un gradiente discontinuo de 10,20,50, 100 y 200 mM de la misma sal en idéntico solvente. En ambos casos se recogieron fracciones de 2-3 ml a las cuales se les eliminaron las sales por el método de Folch y col. (355 ).En preparaciones masivas se cambiaron las proporciones de la columna de acuerdo a una relación empirica de 10 g de resina seca por cada 0,5 g de lipidos totales del extracto. Eldolicol fosfato se detectó en la columna mediante el ensayo de glucosilación, utilizando enzimas de higado de rata o de insecto.
2.8. PREPARACION D_ELLIPIDO ACEPTOR E INSECTO. EXTRACCION ANALITICA.
Treinta gramos de pupas o larvas de Triatoma se lavaron superficialmente con abundantesolución Ringer de insecto ( ver Tabla 23 lhelada, se congelaron con nitrógeno liquido oen congeladora a -70° C. Se reduio a polvo el material congelado y se liofilízó hasta pesoconstante. El polvo IioFilizado se extraio con 2 volúmenes de acetona durante 24 hs a 30° C.Se eliminó la acetona por filtración y se secó el residuo en corriente de aire. ( El extractoacetónico puede utilizarse para preparar dolicol ) . El residuo seco se extraio dos veces de12 hs con 3 volúmenes de cloroformo/metanol 2: l y se filtró . ( El Filtrado cloroformo/metanólico puede servir como fuente de dolicol fosfato y de dolicol monofosfato azúcares ).
El residuo se secó y se extrajo con cloroformo/metanol/agua ¡0:10:3. EI extracto sellevó a seco, se resuspendió en solvente y se pasó por una columna de intercambio iónico de
ó]
DEAE-Celulosa ( forma acetato ) equilibrada con el mismosolvente. Después de reciclarla muestra se lavó la columna con 200 ml de cloroformo/metanol/agua 10: lO: 3 . En esascondiciones los dolicol pírofostato derivados quedan unidos a Ia resina ( |4 3 ) . La columnase eluyó en etapas con 20, 100 y 200 mM Formiato de amonio en el mismo solvente ( 100,150 y 150 ml respectivamente ) . Las fracciones conteniendo sales se lavaron por particiónsegún Folch y col ( 355 ) y se dosó la capacidad de las mismas para estimular la biosintesis de poliprenil oligosacóridos. El lipido estímulador eluyó en la fracción de 100 mMdeformiato de amonio.
Extracciones en gran escala
Con obieto de obtener cantidades de lipido aceptor suficientes para numerososexperimentosse partió de 300 a 500 g de insectos y los extractos se fraccionaron en columna de DEAEde5.0 x 60-70 cm de DEAE-Celulosa. En esos casos se eluyó la columna con un gradienteentre 0 y 200 mMde formiato de amonio en cloroformo/metanoI/agua 10:10:3 (5 litros ) .La fracción que eluyó a 60 mM de concentración salina ( 1.150 ml) resultó rica en el Iipidoaceptor de insecto. ( Enestas extracciones el autor de esta Tesis solamente realizó los dosa¡es enzimáticos ) . _
2.9. PREPARACION _D_EDOLICOL X DOLIQUIL DERIVADOS D_EHIGADO
Se preparó el dolícol de higado de cerdo de acuerdo al método de Burgosy col (51 ).El doliquil fosfato de higado de cerdo se purifícó siguiendo el método de Behrens y Leloir( ó ) .
Para las preparaciones de aceptores de higado ( mezcla de doliquil pirofosfato sacóridos )se siguió el método de Parodi y col. ( 145 ) .
Se sintetizó doliquil fosfato a partir de dolícol de higado de cerdo siguiendo la técnicade Popiack y col. (351 ) aan las modificaciones de Behrens y Leloir ( ó ) y Tóbora (187).
2.10.PREPARACION DE ENZIMAS
Homogenatos de higado
Siguiendo la técnica de Moulé y col. ( 352 ) con algunas modificaciones , se prepararon microsomas de higado de rata. A los animales ayunados 20-24 hs se les inyectó intraper_í_toncalmente insulina ( ¡5-30 unidades ) y se los deíó reposar 45-60 min. Se los sacrificópor decapitación y los higados se cortaron a tiíera y se homogeneizaron en un homogeneizador
62
Potter-Elvelíeim.
El tampón helado utilizado contenía: Tris-Maleato pH 7.7 0.] M; sacarosa 0.8 My EDTA-Na 3 mM . Se eliminaron los desechos celulares por centrifugación a 7500 x gdurante iO mín y el sobrenadante se centrifugó a 105.000 x g durante 90-120 mín. El precipitado rico en microsomasfue resuspendido en: Tris-Maleato a pH 7.7 0.] M; EDTA-Na0,3 mM; 2-mercaptoetanol I mM hasta una concentración final de proteina de 120-160 mg/ml. Se subdividíó en tubos de 0,5 cc y se conservaron parte a -70 ° C ( para usar l solavez ) y parte a -20° C ( para usar varias veces ) .
Homogenatos de insectos
Se han utilizado diferentes tipos de preparación enzimática, dependiendo de las necesidades. En las preparaciones de insectos grandes (Triatoma, Periplaneta ) se realizarondisecciones para eliminar las Fuentesde enzimas degradativas ( cabeza, tórax, gónadas,sistema digestivo, Malpighi, etc. ) . Después de lo cual en algunos casos se los congelómediante N2 liquido o congeladora y en otros solamente se los enfrió a 1-4 ° C .
En el primer caso el material se molió en mortero de cerámica congelado (con o sinalúmina ) o se lo rompió por impacto en una prensa ad hoc, mientras que en el Último casofueron disgregados en mini-licuadora Sorvall Omnímixer. Ambas preparaciones se homogeneizaron en homogeinizador de Potter-Evelíheim con émbolo de Teflon accionado a motor. _
En la preparación de homogenatos de Ceratitis se utilizó el animal completo. En el casode larvas se las lavó superficialmente con Ringer de insecto y se las homogeneizó e n homo
geneizador con émbolo de Teflon. Cuando se las congeló con N2 liquido, primero se reduíoa polvo en mortero.
FIGURA 20 : Ciclo de vida de Ceratitis capitata
PIGMENÏACIÜN
UMAÏIDIAS EMERBENCIAV_ v¡ADULÏD FARAIJÜ IMAGÜ
(PU PA)
HUEVO
’3pous¡s'
l|ll
I
l
l
I
l
lr
r
l
ln
14lllleLL'IÁAJILLLA AILIIIAAAA1234567891012141618 20 DIAS
63
La determinación de edad de las larvas se basó en el calendario de eventos del ciclo dedesarrollo ( Figura 20 ) ( ver pógina antericr) y por observación baio lupa binocular. Paradeterminar el desarrollo de las pupas fue necesario eliminar la teca oscura y observar baiolupa ya que en este periodo la variabilidad es mayor y muy dependiente de la temperatura yhumedad ambiental { 210 ) . En la mayoria de los experimentos se obtuvieron meioresactividades enzimóticas con adultos farados sacrificados en el momento en que aparece lapigmentación en las ommatidias. Una vez determinada la edad, se siguieron dos procedimientos alternativos: para pequeñas cantidades de insectos se los lavó exhaustivamente con Ringery se los congeló con N liquido, se eliminaron las tecas con fluio de aire y los insectos sereduieron a polvo en mortero o por impacto y se homogeneizaron en homogeneizador de PotterEvelíheim. Para grandes cantidades, se lavaron las pupas con MgCI2 4 mM en H20 destilada( en vez de solución fisiológica ) y después de secarlas entre papeles de filtro, se las procesóen el Omnimixer durante 40 sec. a móximavelocidad. En general, se las re-homogeneizó enhomogeneizador de Potter. Lostampones de homogeneización mós usuales se detallan en laTabla 26. Enexperimentos en que la posible contaminación externa podia interferir, las
TABLA26: Soluciones tampón para homogenizaciones de insectos
Hl = TRIS-HCI (pH entre 7.6 y 7.8) #0-50 mMMgCl2 (optativo) h- S mMEDTA.Na l mM
Z-mercaptoetanol 3- h mM
H2 = Los anteriores mas:Sacarosa 250 mM
H3 Igual a H2,pero se utilizó Tris-Maleato pH 7,hen lugar del Trís-HCI
S han utilizado pequeñas variantes de éstas soluciones (Ver pág.57).
En gran número de experimentos se han adicionado pequeñas cantidadesde sustancias anti-oxidantes ( drtocoferol,BHT,etc).
(D
pupas se trataron con hipoclorito de Na al 0,] - l % . En todos los casos se incorporó altampón un antioxidante, generalmente BHA: ( 2 ( 3 ) Tert-butil-4-hidroxi-anisol, mezclade isómeros ) . Se utilizó a veces 0L -tocofero| como antioxidante, con excelente resultado; lamentablemente el vehiculo ( aceite de oliva ) produio inhibición en algunasglicosil transferasas.
Fraccionamiento
El método de preparación de fracciones ricas en vesiculas microsomales se basó en eldescripto por Porter y Jaworski ( 353 ) , con modificaciones. Todas las operaciones sellevaron a cabo en frio ( 1-4 ° C ). Loshomogenatos se centrifugaron durante lO min a2000 x g en centrífuga refrigerada. EI precipitado volvió a resuspenderse en el tampón dehomogeneización y se repitió la centrifugación. Estosprecipitados contienen fundamentalmente Ias células intactas y las membranas plasmáticas. Se ¡untaron los sobrenadantes, y selos centrifugó a 10000 x g por ¡5 min. En esta fracción se obtienen los núcleos y mitocondrías con algunos microsomas. El sobrenadante fue separado del tapón lipidico, y centrífugado a 140.000 x g durante 90 min.
La fracción precipitado contiene habitualmente restos de mitocondrías, casi todos losmicrosomas rugosos y lisos y el compleio de Golgi.
Esta fracción enriquecida en microsomasno puede asimilarse a una preparación "purificada" de microsomas, según los métodos de centrifugaciones en gradiente ( 354 ), perotiene la ventaía de la rapidez y la poca manipulación. A Io largo del trabaio se la denomina"extracto ( o preparación ) microsomal".
Se la resuspendió en el tampón de homogeneización, generalmente sin sacarosa/a unaconcentración de proteina entre 120 y 200 mg/ml, y se guardó en fracciones de 0,5 ml encongeladora a —70°C .
2.11. MEZCLAS PARA INCUBACIONES " IN VITRO "
Se han utilizado muydiferentes condiciones de incubación dependiendo de la actividadenzimática que se deseaba detectar. Comoregla general, las enzimas presentes en preparaciones microsomales necesitan Ia adición de detergentes cuando son suplementadas con lipidosexógenos. Lasenzimas que transfieren monosacóridos del nucleótido derivada al poliprenilnecesitan cationes divalentes y son inhibidas por EDTA. Laspoliprenil-oligosacórido transterasas pueden o no precisar cationes.
En general, el trazador radioactivo ¡unto con las sales y los Iipidos exógenos se llevarona seco con fluio de N? en el tubo de reacción y después se añadieron los restantes componen
8‘.
tes. Las incubaciones, a 25° C generalmente, se iniciaron con el añadido de la preparaciónmicrasomal. AI inicia y a la mitad de la incubación se agitó fuertemente para homogeneizarla mezcla. Al término de la incubación, generalmente entre 20 y 60 min, se la interrumpiópor desnaturalizacíón de la proteina con l ml de cloraformo/metanol 3:2 .
En la Tabla 27 se indican las mezclas de incubación mósutilizadas.
TABLA 27 : Principales mezclas de incubación utilizadas
a ) Biosintesis de dolíquil monosacóridos
Tris-HCI pH= 7,8 0,1 M2 - mercaptoetanol 80 mM
MgCl2 20 mMEDTA - Na 3 mM
Deoxicolato-Na 0,5 % o Tritón X-lOO 0,25 %DoI-P lO - 30 nanomoles/ 50 ul en P lóbilUDP-GIcNAc 40)uM (¡05 cpm) 6UDP-Glc 6-10 p M (0.8 - 1.2x 105 cpm)
IPara Ia Formacrón de Dol-P-Man se Ul’lllZOIa misma mezcla
b ) Formación de lipido-oligosacórído-( glucosa )
Tris-Maleata pH= 8.0 0.1M2 - mercaptoetanol 60 mMMgAcetato 20 mMEDTA-Na 4 mM
UDP-Glc ó-lOp M (80 - 120.000 cpm)
c ) Formación de lipido-oligosacórido—( manosa )
Tris-HCI pH = 7.4 82 mM2 - mercaptoetanol 80 mMTritón x -100 3,3 %MgCI 8,2 mMEDTAzNa 3,2 mMGDP-Man ó.ópM (105 cpm)aceptores de insecto
Otras mezclas de incubación se indicarán en Ia figura o tabla respectiva.
2.12. PROCESAMIENTO D_ELO_SINCUBADOS
Una vez interrumpida la reacción con la mezcla cloroformo/metanólica, se procesaronlos incubados de acuerdo al método general de Folch y col. ( 355 ) de reparto en solventes,con algunas modificaciones introducidas en el Instituto de Investigaciones Bioquímicas . Seseparó el material ¡nsoluble del liposoluble por centrífugación y se lo re-extraío con cloroformo/metanol 3:2 ( i ml ) . Se volvió a separar el material ínsoluble y se ¡untaron los sobrenadantes cloroformo/metanólicos de ambas extracciones ( N 2.0 mI ). Se añadieron0.4 mI de MgCI2 4 mM con obíeto de particionar en dos fases, la superior acuosa y Ia inferior orgónica. ( Cuando Ia mezcla de incubación ya estaba excedido en sales, Ia particiónse provocó con agua ) ( Figura 2] A ) .
FIGURA 21 : Lavados de la fase inferior de una partición realizada según elmétodo de Folch y col. ( 355 )
A B C D
ELiHinAciáN
oe FASEsonaron
+ FASEsurem‘oa/6051 áMmm PRU‘CÍOHADA LAVADO sin cenrairuoha'o'fl
E F G
mii-1251??Q
+ me sumion 'g-Ïzf. MEICLAR CEÑTWUW‘
M(7/ ï2/1
LAVADO CoN cenmiruonao'n
67
Para la aislación y lavados se siguió la técnica de Leloir (comunicación personal ) :
1° ) Después de centrifugar para separar las fases, se descartó la superior por succión, deianun menisco para evitar turbulencias y pérdida de Fase inferior ( Figura 2l , B ) .
2°) Se añade lentamente fase superior teórica ( cloroformo/metanol/agua 3:48:47 ) hasta40 % del volumen Final, con obíeto de diluir las sustancias acuosolubles remanentes enel menisco (Figura 2l, C).
3°) Sin centrifugar, se elimina nuevamente la fase superior ( Figura 2] , D ) .
4°) Se repite el lavado sin centrifugar ( pasos C - D ) .
5° ) Se añade nuevamente fase superior teórica, manteniendo la proporción de 40 % delvolumen Final. Se agita vigorosamente y se centrífuga para separar las fases ( Figura2] , E a G ) .
6°) Se repiten el lavado sin centriFugacíón ( 2 veces ) ( B - D ) .
7°) Se realiza una vez mós el ciclo completo de lavados ( E a G y luego B - D 2 veces ) .
Se obtuvo asi una "Fase inferior" limpia en la que habitualmente se encuentran glicolipidos y fosfolipidos de hasta mediana polaridad. Con esta Fracción se extraieron los poliprenil-fosfato-monosacóridos y los poliprenil-oligosacóridos de hasta 6-8 azúcares. En loslavados se arrastró menos del 5 % de estas Últimas sustancias.
La proteina parcialmente deslipidificada se lavó exhaustivamente con la Fase superiorteórica, luego con metanol anhidro para secar, se evaporó ligeramente el metanol hasta casisequedad, y se extraío la proteina con el solvente de Leloir ( 143 ), cloroformo/metanol/agua lO:lO:3 . Este solvente pose'e la propiedad de solubilizar materiales muy polares ycargados como los poliprenil piroFosFatooligosacóridos ( 146 ) . Su empleo ha significadoun importante avance técnico en lo relativo a la detección de dichas sustancias.
Como Lucas y Waechter ( 43 ) han hecho notar, es de presumir que en muchos estudiosprevios sobre bíosintesis de glicoprote inas, en los cuales éstas no han sido debidamente caracterizadas, se hayan cometido errores de interpretación en los datos. Enefecto, los polipreniloligosacóridos permanecen unidos a las porciones membranosasdespués de las extracciones"tipicas" con cloroformo/metanol y los tratamientos con TCA.‘
Los residuos radiomarcados insolubles en el solvente de Leloir se procesaron por variosmétodos, según las sustancias que se deseaban medir.
Losprincipales tratamientos se detallan en la Tabla 28 .
TABLA 28
68
Medición de radioactividad en precipitados
A)
BV
Radioactividad en material "TCA insoluble"
Se pasó el material insoluble en cloroformo/metanol/agua lO:lO:3, secado ligeramente con N y resuspendido en TCA lO °/o frio, por filtro de papel de vidrio( Whatman /C ). La evaporación por lo menos del cloroformo del solvente " lO:10:3 " es esencial para evitar que, con el ácido, se disuelva casi todo la proteina.
Se lavó con TCA 5 % frio y con agua abundante.
Se secaron los Filtros baio lámpara.
Se contó la radioactividad usando 4 % de Omnifluor en tolueno como liquido centelleador.
Radioactividad en material "TCAcaliente insoluble" ( según Parodi, comunicaciónpersonal )
- Se resuspendió el material insoluble en solventes orgánicos, después de evaporar lastrazas de éstos, en TCA lO % ( l ml ) .
- Se calentó 3-5 min a 100° C en baño de agua con obíeto de hidrolizar los posiblespoliprenil derivados ( especialmente oligosocóridos )contaminantes ( 145 ) . Además)los eventuales remanentes de nucleótído-azücar o azúcar-P lóbil también se hidrolizan.
- Se eliminó el material soluble en TCA caliente y se lavó el insoluble con l cc deTCA lO % Frio (2 veces).
Se lavó con l cc de éter etilico.
- Se lavó con l cc de metanol.
Se añadieron 200pl de protosol o soluol y se calentó l a 3 min a ¡00° C (hasta clarificación de la suspensión ) .
Se añadió mezcla de Broy ( 356 ) como centelleador, neutralizanda con 5)Jl deácido acético concentrado para evitar la activación por el ólcoli .
En caso de quererse preservar la muestra, después de los lavados con metanol, se Filtróa través de filtro de Millipore o papel de vidrio y se contaron los filtros secos enOmnifluor 4 % en tolueno. Después se lavó el filtro varias veces con tolueno y sesecó, pudiéndose recuperar la proteina.
69
C) Rodíooctivídad en glucógeno o en quifína
).- Para medir radíoactívídad en glucógeno se siguió el método de Krísman ( 372
- La radíoacfivïdcd en quitína se midió por el método de Keller y Cobíb ( 357) utilizando precipitados resuspendídos en etanol óó % . Como métodos alternativos seutilizaron los de Porter y Joworskí ( 353 ) y de McMurrough y Bartníckí-Gorcr'o( 358 ).
2.13. DEGRADACION QUIMICA Y_ENZ|MAT|CA
2.13.1. Tratamientoscon ácido
D I I I, 0 I O Oo) Suave: Pora reconocer pollpreml - monofosfcto-azucares se los somero o una hldl’OllSlS
o pH : 2.0 que clíva el enlace entre el FosFatoproximal al azúcar y éste. Es una sensi
70
bilidad al ócido tipica, no conociéndosc otros glicolipidos con esa labilidad. Si existeun enlace pirofosfato, el enlace entre cl fosfato y el primer azúcar también se rompe.
Procedimiento: Se llevó a seco la muestra de glicoll'pido, en un tubo de l cm de diómetro,baío fluío de nitrógeno a presión. Se añadieron 5pl de Timol azul como indicador y 5p|de butanol saturado de agua como emulsionante y se agitó intensamente en vibrador de tipo"vortex" con HCl 0,0] N, en un volumen final de 200pl. ( La sonicación no meioró lastasas de hidrólisis ) .
Se tomó el "rosado incipiente" del indicador como control del pH correcto ( pH 2.0 +0.2 ) . El tubo se tapó con bolita de vidrio, se calentó a 99 ¡li l° C en baño de agua porel tiempo deseado y se interrumpió pasando a agua helada. Se añadió l ml de cloroformo/metanol 3:2 y se formó la partición de Folch ( 355 ) . La fase superior contiene losproductos hidrosolubles de la hidrólisis y la inferior el glicoll'pído remanente y los prductos liposolubles.
Otros tratamientos alternativos z metanólisis con HCI O. Ol N en metanol 99 % o enmetanol 50 °/o .
Se puede también hacer una hidrólisis con HCl l N en propanol 50 % durante 15 min a50 °C pues es aproximadamente equivalente al tratamiento a pH 2 descripto arriba paraderivados monofosfato azúcar.
b) Intermedia: Igual procedimiento que el anterior pero a pH ¡.0 con HCI 0.] M. La mayoria de los glicolfpidos es resistente a este tratamiento por tiempos cortos. El dolicol fosfato también lo resiste.
c-e) Fuerte: Para la liberación de azúcares neutros y para romper oligosacóridos se usó:
c) l M SO H , ó horas, lOO° C (en ampolla sellada) (liberación de GIcN de quitinaprotegida en la cutI'cula )
d) 4 M HCI , l2 horas, 100 ° C (en ampolla sellada ) ( liberación de monosacórídos deoligosacóridos y glicoprotel'nas )
Para hidrolizar esteril-glicósidos y otros glicósidos:c) 3 N HCI , 3,5 horas , 100 °C (ampolla sellada)
f) Hidrólisis con fenol de poliprenil-azúcares: Se utilizó el procedimiento de Garcia y col.(359 Se secó la muestra baio chorro de N2 y se la resuspendíó con fuerte agitaciónen 200pl de fenol destilada al 50 % . Se calentó a 68 i l ° C agitando ocasionalmente. Al término de la incubación se centrifugó para separar la fase fenólica de laacuosa y se lavó la primera con agua que se mezcló con la fase acuosa. Los restos de fenol
71
se eliminaron con éter etilico.
g) Metanólisis de azúcares: Se colocó la muestra en tubos de vidrio y se secó en desecadorbaio KOH y P205 durante una noche. Se añadió HCI i M en metanol . Se sellaron lostubos baio llama ( cuando se sustituyó el aire por N2 se utilizaron ampollas de vidrio,más fáciles de cerrar ) . Se incubó en estufa a 100° C durante ó hs. Se abrieron después de deiar 10 min a 0° C y se evaporó el metanoI-HCI baío nitrógeno seco. Se resuspendió en metanol y se repitió 2-3 veces.
2.13.2. Tratamientoscon ólcali
a) Suave: ( (5- eliminación ): Se utilizó el tratamiento con 0.05 a 0.| M de NaOH atemperatura ambiente y por 18-24 hs. para clivar uniones péptido-carbohidrato en glicoproteinas de enlace O-glicosidico a serina o threonina ( ver póg.35
. lasEl mecanismo se puede representar po/reaccnones de Ia Figura 22 .
FIGURA22 : P-eliminación.
// 40 .___-.R'HN-CH-C Ñ R'HN-C-C\RII fi 'q. \RI| H
RCH RCH. ""0HX 'o.
X
_ ¡,0-—¡' X + R' HN - C - Cd———- \Rll
RCH
X puede ser Ga|NAc o Xyl, R es H en la serina o CH3 en Ia threonina y R' y R'l son losaminoácidos vecinos de la cadena peptidica.
7?
Para este tipo de reacción la notación {5 corresponde al carbono que usualmente es0< en la nomenclatura de aminoácidos y viceversa.
b) Suave: ( Saponificación de lipidos acompañantes y deacetilación de ésteres ( NO paratratamiento de poliprenil azúcares ) )
- Se disolvieron los lipidos en 1 cc de cloroformo/ metanol 1:4.
- Se añadió 0.1 cc de NaOH 1 M.
- Se incubó 10 min a 37 ° C y se neutralizó con formiato de etilo o ácido acético.
- Se añadió cloroformo/metanol 9:1 , 2 cc y agua, 2 cc separando las camsacuosa yOl'anICG
c-e) Tratamientoalcalina de poliprenil-azúcares
c) 0,1 M NaOH en cloroformo/metanol/agua 6:4:1 por 10 min a 37° C . Lospoliprenilmonosacóridos son resistentes a este tratamiento.
d) 0,1 M KOH en n-propanol por 30 min, a 64°C (Método de Parodi y col. ( 145 ) ).
e) 0.1 M NaOH en 50 % n-propanol por 90 min a 68 ° C . Los poliprenil monosacóridosse clivan a nivel del enlace ester entre fosfato y lipido. Se deacetilan parcialmentelos glícolipidos que contienen NAcetil glucosamina.
f-h) Tratamiento de glicoproteinas
f)0.2 M NaOH a 100°C 2-4 hs.
g) 1 M NaBH + 1 M NaOH 100 °C 4-6 hs. Con estos tratamientos se rompen uniones del tipo ASN-GlcNAc. El NaBH se añade ¡unto con el ólcali para prevenir,que, una vez rota la unión ASN-GlcNAc por acción del alcali, prosiga la degradacióndel oligosacórido por el extremo reductor susceptible al ólcali. El borohidruro reduce
a alcohol estable (340 ) .
h)2 M NaOH 100°C , 12-18 hs. Este tratamiento permite detectar uniones que lo resisten,del tipo HYL-Gal, etc.
í) Tratamiento alcalino de oligosacórídos : Se reduio el oligosacórido con borohidruro desodio ( 15 mg/ml ) durante 1 hr a 21° C , para proteger el extremo reductor, llevando
73
a alcohol estable (ver arriba , g) ). Se paró la reacción añadiendo resina de intercambio catiónico Dowex X-50 ( Forma H + ) para eliminar el borohidruro en exceso. Elresto de los cationes se eliminaron pasando la muestra por una columna de 0.6 x 1.0 cm dela misma resina. Se llevó a seco baío chorro de nitrógeno, se añadió metanol para eliminar el ócido bórico por evaporación, repitiéndose dos veces. —
El material reducido se calentó a 100° C en 2 M KOH. La de-acetilación completa delas acetilhexosaminas se alcanzó a los 120-150 min.
2.13.3. Tratamientos mixtos
1) Desproteinización de cuticula (generalmente para experimentos "in vivo" )
Las condiciones son similares a las de numerosos autores. El ócido fórmico elimina pigmentos y otras sustancias que hacen la quitina más accesible a quitinasa.
Se trató la muestra con NaOH 10% a 70° C durante 18 hs.
- Se lavó con agua destilada.
Se resuspendió en ócido Fórmico al 80% durante 1 hr.
- Se lavó con ócido tórmico 10% y se deió 12 hs en el mismo.
El residuo rico en quitina se lavó con etanol 95%.
Se deshidrató con etanol absoluto.
Se extrajo con eter etilico y se evaporó éste a sequedad.
El residuo se consideró era la " uitina" habitualmente ace tada en la biblio ratio.q p 9
2) Desproteinización suave de cuticula ( según Lipke y col. ( 271 )con variantes )
- Se suspendió la muestra en ClNa 1% un dia y se lavó.
- Se hirvió el residuo en etanol durante 10 min.
- El residuo resultante se extraio con cloroformo/metanol 3:2.
- lÍl residuo se lavó con Triton X-IOO 1% y luego intensamente con agua.
2.
74
- Se hirvió en agua durante 20 min.
- Se trató el residuo con NaOH 0.] N, 24 hs a 4°C.
- Se eliminó el NaOH y se resuspendió en ócido fórmico 20% durante ¡2 hs a temperaturaambiente.
- Se dializó contra agua y se liofilizó el residuo.
13.4. Degradaciones enzimóticas
Pronasa o proteasa de Streptom ces griseus : las muestras se íncubaron en 0,15 ml de TampónTris-maleato 100 mM a pH 7.5 y CaCI 8 mM; se añadió a las O, 24, 48 hs 50p| desolución enzimática de 20 mg/ml en un tampón Tris-maleato 100 mM a pH 7. 7. En el casode la pronasa debe pre-incubarse ésta para eliminar otras enzimas contaminantes ( especídmente glicosidasas ) . Las incubaciones se llevaron a cabo en atmósfera de tolueno.
La quitinasa comercial de Streptomzces se utilizó después de purificarla por el método deCabíb y Bowers ( 306 ) . A pesar de ello no estuvo enteramente libre de quitobiasa.Se utilizaron también quitinasas de caracol terrestre y de otras Fuentes, con abundantequítobiqsa. En todos lo casos la mezcla de incubación estuvo constituida por un tampóncitrato 0.83 M/ Fosfato disódico 0.66 M a un pH 5.3 y EDTA0.8 mM en un volumenfinal de lOOpl, durante 48 hs a 21° C con agitación, baio atmósfera de tolueno.
2.14. METODOS ANALITICOS
2.14. l. Anólisis espectrofotométrico
Se realizaron en Coleman 2000 para mediciones de macromuestras de tipo rutinario y endiferentes modelos Gilford, con monocromador Beckman DU 2, para micromuestras.
- Fósforo : Para mediciones de fosfato ( inorgónico y orgánico ) se siguió el método deFiske-Subbarrow ( 360 ) con ligeras modificaciones. Para requerimientos de mayor sensibilidad, se midieron fosfatos por el método de Chen y col. ( 361 ) . En ambos métodosse mide la reducción del compleío fosfomolfbdíco a óxido molibdoso ( azul de molibdeno )( 660 mM ) .
Para mediciones del orden del nanomol de fosfato se siguió el método de verde de malaquita de Chalvardíian y Rudnicki ( 362 ) modificado por Tóbora ( 187 ) ., con variantes:a 350pl de la muestra se le añadieron 50,ul de molibdato de amonio al 2,5 % y 50,ul deácido sulfúrico 5 M. Se agitó fuertemente y se añadieron 50.1Jlde Tween-20 al 1,5 %agitando suavemente y 50,ul de verde de malaquita al 0,15 °/o. Se incubó 30 min atemperatura ambiente y se leyó la absorbancia a 660 n metros. El fosfato total se dosócalentando a la llama la muestra seca con 70pl de ácido sulfúrico 5 N : ócido perclórico 70 % (5:2 ) hasta eliminación del perclórico. Se añadieron 300p| de agua y secalentó a 100° C durante lO min y luego se siguió como arriba.
- Proteinas : Se estimó proteina en forma no destructiva por el método de Warburg y Christian(363 ( midiendo la extinción a 260 nrn y 280 nm y calculando el cociente para obtener el factor de corrección de la lectura a 2m nm ) .
- Proteinas : Se dosaron proteinas en forma destructiva por el método de Lowry y col. ( 364 ).La coloración se origina en la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau por la tirosinay tríptofano sumado a la formación del compleio entre las sales de cobre y los N de launión peptidica en medio alcalino (500 nm ) . Engeneral se utilizó albúmina bovinacomo patrón aunque en el caso de proteinas de insectos, la relación densidad óptica a pesoseco de proteina es variable. Se observó que aumentó la coloración en muestras conteniendo fenoles ( cuticula, hemolinfa, etc. ) . El Tampón Tris-HCl, en cambio disminuyó laabsorbencía.
- Azúcares reductores : Se utilizó el método de Somogyi-Nelson ( 365 ) con ligeras modificaciones. Losazúcares reductores, en medio alcalino, reducen las sales de Cu a hidróxido de Cu el cual reduce el reactivo arseno-molibdico dando azul de molibdeno ( 660 nmSe dosó también poder reductor por el método de Orcinol ( 366 ) ( condensación deorcinol con el hidroxi-metil furfural ( narania 540 n m).
2.
furano-derívados en medio ácido ( Método de fenol-sulfúrico)
76
Azúcares totales : Se midieron por el método de Dubois y col. ( 367 ) de formación de( amarillo-narania
485nm).
Amino azúcares y NAcetil amino azúcares : Para aminoazúcares se siguió el método deElson Morgan ( 368 ) . Para acetilliexosaminas el método de Morgan y Elson ( 378 )modificado por Reissig y Leloir ( 369 ) y Reissig y col. ( 370 ). Estos trabaios meioraronuna modificación anterior de Aminoft y col. ( 384 ) . En medio alcalino se forma unintermediario cromógenoque reacciona con el p-diametil-amíno-benzald ehido en medioácido dando un color malva (585 nm ) .
Pentosas : Se midieron por el método de Orcinol ( 37] ) ( compleios Orcinol-Furfural,verde azulado 670 nm ) .
Glucógeno : Se midió con el reactivo de iodo, de acuerdo a Krisman ( 372 ) ( amarillopardo, 460 nm ).
14.2. Cromatografia y electroforesis
l) Cromatografía en papel
- Generalmente descendente, en papeles Whatman N° l o Schleicher y SchÜll 2043 a .
Los solventes más utilizados Fueron:
A) l-ButanoI/piridina/agua (6:4:3 ) (383)
B) Los mismos, en proporción (4:3:4 ) (384 )
C) idem ( 10:3:3 ) ( también ascendente ) (385 )
D) 2-Propanol/6cído acético glacial/ agua (27:4:9 ) (386 )
E) Etanol 95%/ tampón acetato amonio pH 3.8 ( 7,5:3 ) ( 387 )
F) Etanol 95% / amoniaco conc. ( 7,5:3 ) ( 388 )
G) Agua/nitrometano/i-Propanol ( 3:2:5 ) (4l3)
H) Agua/n¡trometano/2-Propanol ( 3:2:5 )
l) l—Butanol/píridina/6cido acético conc. (6:4:3 ) ( 389 )
77
J) CIOFOFOFmO/memml/GQUG ( 104013 ) (usado también con papeles impregnados).
PCII'Oseparar GlC de Gal o cualquiera de ellos de ( GlCNACy GalNAc de GIcNAc se impregnó Whatman l con tetraborato de Na y se cromatografió con el solvente A (390, 39] ). Para separar GlcN de GIcNAc se impregnó elpapel en 0.] n ZnSO y se cromatografió con el solvente A ( ló7 ) . AI parecerel ión sulfato es el responsable de la separación ( Leloír y Parodi, datos no publicados ).
- Para cromatografía de sustancias lipofilicas se usaron papeles impregnados con ócidosilicico (Whatman SG 8] ) tratados con EDTA (392 ) y el desarrollo se realizó enforma ascendente.
Los solventes mas usados fueron :
K) Cloroformo/metanol/agua (óO:35:6) (393)
L) Dí-¡sobutil-cetona/ócido acético/agua ( 20:15 :2 ) ( 393 )
2) Electroforesis con alto voltaie en papel
- Generalmente en Whatman Nos. l o 3, con enfriamiento por inmersión en tetraclorurode carbono ( 394 ) . Las diferencias de potencial utilizadas fueron de 1000 a¡500 volt. , obteniéndose un campo promedio de 20 a 30 volt/cm en el papel.
Los tampones mós utilizados fueron :
I) Acetato de piridina ¡.4 mM a pH 6.5ll) Acido fórmico al 5%III) Barato de sodio 0.03 M
3) Cromatografia en capa delgada
- Gel de silice : Se utilizaron varios tipos de placas:
a) Para cromatografias de rutina y para fines preparativos y de purificación se confeccionaron cromatoplacas de diferentes tamaños de Silica gel tipo 60 y Silica gel H,ambas de Merck, sobre base de vidrio (0.5 - 0.7 mmde espesor ) .
b) Comoplacas analíticas para sustancias radiomarcadas, se utilizaron placas deSilica gel en base de plástico ( Eastman 606] o Schleicher y SchÜll 355100 )( 0.25 mm de espesor ) .
78
c) Cuando el revelado de las placas analíticas requirió el empleo de ácidos fuertes seutilizaron placas de Silica gel sobre vidrio, comerciales (Merck 5721/0025 ) de0.25 mmde espesor.
d) Para microanólisis en capa fina, en bandas de 2 cm de ancho, se utilizaron, comosustituto de las placas confeccionadas manualmente con portaobietos de microscopio(0.5 mmde espesor ), placas con soporte de aluminio ( 0.25 mmde espesor )( Merck 5554/0025 - Kieselgel F 254 ) . Estas placas llevan incorporado unamplificador de fluorescencia.
Tierra de infusorios : ( Kieselgur - Merck ) : Se utilizó para propósitos especiales, comocromatografia en fase reversa o para mezclas con el gel de Silice. Las cromatoplacasse confeccionaron poco antes de su uso .
Preparación de placas de silice : Se utilizó el método general de Kates ( 395 ) . Lasplacas de vidrio entre 1 y 2 mmde espesor, se lavaron con detergente y se secaron porescurrimiento. En el momento del uso se limpió la superficie con cloroformo.Lasproporciones utilizadas de polvo a agua fueron : 33/67 o 20/45 o 40/86 g/ml.Antes de cargar el aplicador de Gel ( Desaga de Brinkman Instruments Inc.) se agitala mezcla fuertemente y se deia reposar l min.Lasplacas confeccionadas se secaron al aire y se cromatogrofiaron en metanol/ócidoclorh idrico concentrado 9:] para eliminar el hierro y otros metales pesados. Sesecaron hasta eliminación del HCl.Para activarlas se las mantuvo entre i hs y 12 hs a 110-120°C.
Elución de Iipidos de cromatoplacas de silice :
Para Iipidos no polares y lipidos polares neutros se utilizaron extracciones sucesivascon cloroformo/metanoI/éter etïl ico ( 1:]:1 ) .
Para Iipidos polares neutros o ligeramente acidicos se utilizó cloroformo/metanol/agua ( i:2:0.8 ) , o la mezcla solvente J .
Para los Iipidos polares acidicos se utilizó cloroformo/metanol/ HC| 0.2 N acuoso(se neutralizó con amoniaco 0.2 N en metanol y se Iavó con el método de Folch) .
Preparación de placas para cromatografia en fase invertida : Se prepararon placas detierra de infusorios T Kieselgur ) de 0.3 a 0.4 mmde espesor y se impregnaron conparafina liquida al 5 % en éter de petrdeo ( 30-65 ° C ) según el método de Stoney col. ( 396 ) . Los solventes usados fueron:
M) Acetona/agua/parafina liquida (65:35:0,5 ) ( fase inferior )
N) 5 o 14 % agua en acetona, saturado con parafina.
79
— Principales solventes para cromatografía en sílice :
O) 2-Propanol/ agua ( 7:3 ) ( también l-Propanol )
P) Cloroformo/metanol/oguo ( 65:25:4 )
Q) idem (60:25:4 )
R) Eter isopropílico/éter de petróleo (30° - 65°) ( ¡:4 )
S) Cloroformo/metanol/ócido fórmico (70:lO:l )
T) Metanol/benceno ( l: 99 )
U) Hexano/éter etílico/ácido acético ( 65:35:] )
V) 2-Propanol/amoníaco/agua (6:3:1 )
— Celulosa y PEI-celulosa : Se utilizaron placas comerciales con base plástica, comoalternativa a'la cromatografía en papel de sustancias hidrosolubles ( placas: celulosa6064 de Eastman y PEIOFde Baker and Co. ) .El solvente usado fue:
Y) Acido isobutírico/amoníaco ( 5:3 )
- Diseño de un solvente para cromatografía de poliprenil azúcares
Uno de los problemas que se presentaron al comienzo de esta Tesis fue la ausencia en labibliografía de sistemas cómodos y rápidos de identificación y separación de poliprenilazücares con diferente largo en la cadena isoprenoide.Se partió de la premisa de que la rapidez se lograría con un sistema de cromatografíade adsorción/partición en capa fina de gel de sílice.Para el diseño del sdvente no se tuvieron en cuenta los ya existentes para fosfolípidosy glicolípidos, intentando modificarlos, prefiriéndose en cambio el diseño basado enla serie mixotrópica de solventes.
Losrequisitos que se buscó cumpliera el solvente beron:
a) Sustancias liposolubles :
l) que los poliprenil azúcares cromatografiaran en una zona "típica" y de ser posiblese separaron los derivados de bactoprenol de los derivados de dolicol .
2) que los lípidos neutros de cadena isoprenoide no migraran con el frente, conobíeto de poder identificar al dolicol y otros isoprenoides.
3) que Ia mayor parte de las sustancias liposolubles se separaron netamente de lashidrosolubles.
b) Sustancias hidrosolubles
l) que mígraran netamente separadas de los derivados de poliprenoles.
2) que se separaron entre si los monosocóridos y oligosocóridos como los moltooligosocóridos.
3) que los nucleótidos-azücor, azúcares fosfato, etc. permanecieron en el orígen
El solvente que cumplió esos requisitos fue :
X Clorotormo/2-PropanoI/Etanol/ócido acético l N (2:2:3zl)
En la Tabla 29 se encuentran las movilidodes relativas de muchas de los sustanciasanalizadas en esta Tesis. Loseiemplos corresponden o desarrollos en cubo de vidrio,totalmente saturada, a temperaturas entre 19° C y 22° C, en cromatoplacas de silicagel comercial de 20 x 20 (ver Materiales) con origen o 2,5 cm y frente a 3,5 cm delos bordes. Previamente lavados por cromotografia en metonol - HCI (9:1 )
8]
TABLA292Movilidad cromatográfica de diferentessustancias en el Solvente X y similares.
Rfs
Xa(EtOH 96%) Xb(Et0H abs) ( l ) ( 2 T
Colesterol .76p-sitosterol .7hEscualeno .83Dolícol .35Cerebrósidos .77 .66hDol-P-Glc .65 .79 .78 .71iDol-P-Glc .62 .75 .78 .70hDol-P-Man .5h .7]iDol-P-Man .Sü .70Fic-P-Glc .55 .76 .65Fic-P-Gal .50 .68 .75 .62
Dol-P-P-Oligosacáridos(3_h) .hhGlc .35 .3h .38 .2]Man .hZ .39GlcNAc .35GlcN .19 .22 .Zh .27Trehalosa .l7 .20Rafínosa .llMaltosa .l7 .20Maltotriosa .12 .13Maltotetraosa .07 .08GlcUA .05Hexosas fostato .00 .Ol .02Nucleotidos-azücares .02 .02 .07 .03
Variante (l): Cloroformo/2-propanol/Etanol absoluto/Agua=(l:2:2 l)(2): " / “ / " /Amonïaco(2fln5:3)
Las movilidades indicadas en la Tabla son el promedio de numerosas cromatografïas,para cada sustancia,en las mismascondiciones de trabajo.Por ello,en una cromatografía aislada,las relaciones de movilidad entre sustanciaspueden variar ligeramente. Por otra parte numerosos parámetros hacenvariar ,en forma independiente,las sustancias hidrofïlicas y las lipofïlicas = La falta de saturación de la cuba adelanta los lipidos;la temperatura aumenta la movilidad de todas las sustancias y varia las relaciones entrecllau.Muy ligeros aumentos del agua aumentan movilidad de azúcares. La presencia dc distintos tipos de “bínder”(yeso,etc) ocasiona variaciones.Etcétera.
82
4) Cromatografía de adsorción en ócido silicico
5)
Se utilizó unisil ( Clarkson Chem Co. ) 100-200 mes h que se activó cada vez a120°C durante las 12 hs previas a la cromatografia. Generalmente se utilizaron columnasde 1.0 x 12.0 cm que se armaron con el ácido silicico suspendido en cloroformo destilado. Después de colocar la muestra las columnas se eluyeron habitualmente con 10volúmenes de cloroformo, 5 de cloroformo/acetona ( 1: 1 ) , 10 de acetona y 15 decloroformo/metanol/agua ( 10:10:3 ).
Cromatografia de intercambio iónico en DEAE-celulosa
Se utilizó DEAE-celulosa comercial preparada para cromatografia de lipidos según elmétodo general descripto por Rousery col. ( 397 ) con pequeñas variaciones.Se supendió la resina en 1 N HCl y se filtró por embudo de Buchner utilizando tela dequeseria como filtro ( la succión se hace con bomba de agua ) . Se lavó hasta el pHdel agua destilada y se añadió sucesivamente:
. KOH 0.1 N
Agua destilada hasta alcanzar el pH de la misma ( pH : 5,5 )
Se repitieron los 2 fases anteriores 2 veces más.
. Se secó la resina al aire y se la resuspendió en ócido acético glacial durante una nochepara convertir la resina a la forma acetato.
Se lavó en embudo Buchner con metanol 99 % , hasta neutralidad y se guardó conabundante metanol 99 % en frasco color caramelo hasta el uso. En general las columnas se armaron con la DEAEsuspendida en metanol 99 % y luego se pasaron al solventedeseado.
Columnas microanaliticas: Se utilizaron columnitas de 0.6 x 1-3 cm de alto equilibradas con cloroformo/metanol 2:1 o cloroformo/metanol/agua 10:10:3. Este tipo decolumnas permiten rápidas purificaciones de poliprenil derivados (136,143) . En laTabla 30 se indica el comportamiento habitual de estas sustancias .
TABLA30 : Columnas microanaliticas de DEAE-celulosa ( Ver M3)
a) Columna microanalïtica equilibrada con cloroformo/metanol 2:1
- Percalado C/M 2:] ( lO vol de columna ) Colesterol, dolicol
- Gradiente escalonada de acetato de amonioen C/M 2:] ( lO vol de columna de c/u )lO - 30 mM
- 40 - 55 mM Pol¡preniI-P-MonosacóridosPolíprenil-P ( parte )
- 60 - 100 mM PolipreniI-P (parte)Poliprenil-P-P-GIcNAcPolipreni I-P-P-o| igosacórídos
- más de 100 mM Polipreníl-P-P-olïgosacóridosmuy polares
b) Columna microanalitica equilibrada con cloroformo/metanol/agua 10:1023
- Percolado C/M/H2O lO:lO:3 Poliprenil-P-Monosacóridosmós lavado con el mismo solvente (probablemente debido a sales( lO vol de columna ) residuales)
Formiato de amonio en C/M/H20 lO:lO:3(10 vol de columnac/u)
- 3 mM a 5 mM PolipreníI-P-Monosacórído ( restos)Polipreníl-P-P-GIcNAcPolipreniI-PPoliprenil-P-P-oligosacórído
- 12 mM Polipreníl-P-P-oligosacóridos ( restos )
Cuando Ia presencia de lípidos no cargados lo hizo necesario, se combinaron los dostipos de columna pasando a eluir las sustancias pegadas a la columna con cloroformo/metanol2:1 , con el mismosolvente en proporción l: l y luego pasando a cloroformo/metanoI/agualO: l0:3 .
- Columnasanaliticas:
. Columna de 1.2 x 40 cm con DEAE-celulosa equilibrada con metanol 99% y a lacual se aplicó un gradiente de concentración de acetato de amonio en metanol99% entre 0 y 200 o 400 mM. Habitualmente se tomaron Fracciones de 1,5 a 3,0cc.
Columnas de 1.0 x 30 cm que se armaron con DEAEen metanol 99% y luego seequilibraron con cloroformo/metanol 2:1 .Se pasaron : cloroformo/metanol 2:l lO volúmenes
idem l:l 5 volúmenescloroformo/metanol/agua lO:lO:3 lO volúmenes
En este punto se pasaron gradientes continuos o discontinuos de formíato ( o acetato )
de amonio en C/M/H20 lO:lO:3 desde 0 hasta 100-200 mM . Se tomaron fracciones de 1.0 a 1.5 cc.
- Columnas preparativos : Variaron según la disponibilidad de material. En general seusaron dos tipos: de 2,5 x 30 cm de alto y de 4,6 x 55-60 cr-1de alto. Se utilizóel mismodiseño de elución que en las analiticas y se verificó que para eluir los polipreníl derivados se precisó mayor concentración salina que en éstas.
ó) Electroforesis en geles de poliacrilamida
Se realizó en geles cilindricos según la técnica de Fairbanks ( 414 ) durante 8 hs,estableciéndose un campo eléctrico promedio de lO V/cm. El pH del tampón para elarmado fue de 8,3 y se desarrolló la electroforesis a un pH de 9,5 .
2.14.3. Identificación en cromatografia y electroforesis
—¡ V Reveladores generales
Sustancias reductoras, con el reactivo de nitrato de plata alcalino ( 379 ) y sus modificaciones ( 382 ) .
Fosfatos: En papel con el reactivo de molibdato ( 380 ) y en capa fina con el deverde de malaquita ( 362 ) , con las modificaciones de Tóbora ( l87) .
Aminoácidos y péptidos con ninhidrina ( 376 , 38l ) y proteinas con azulcoomassie ( 376 ) .
Nucleósidos y necleótidos se visualizaron baío luz ultravioleta .
2) Teñido de geles de poliacrilamida
Se utilizó azul de coomassie, según la técnica de Fairbanks ( 4l4 ) .
3) Radioactividad
4)
Las sustancias radiomarcadas se localizaron mediante un radiocromatógrato Packard,modelo 720i .
En otros casos se realizaron autoradiograti'as utilizando placas radiogróficas estandarreveladas según recomendaciones de los respectivos fabricantes y, eventualmente, serealizó la impresión de la imagen positiva en papel Fotográfico.
También se cortaron los cromatogramas ( papel o capa fina flexible ) o se eluyó lasustancia ( papel, silice, celulosa ) o se raspó el soporte ( silice ) y se contó la muestra en centelleador liquido.
Revelado de lipidos en capa delgadaj papel
a) Reveladores inespecificos
- lodo : La placa se sometió ( en un desecador o cuba de vidrio estancos ) a vaporesde iodo. Todo enlace insaturado fiia al iodo, por lo que el revelado es inespecitico.Los Iipidos saturados también disuleven iodo, pero la coloración es menos intensa.Para establecer la intensidad del teñido conviene mirar baío luz ultravioleta. Unprocedimiento que se usó tre cuentemente fue dirigir los vapores de ¡odo ( mediantecristales en una piseta con intermediario para soplar ) a zonas limitadas del cromatograma. Esto resultó de gran utilidad para revelar Únicamente estándares o revelarsuperficialmente placas con base plástica.
Rhodamina ó B : se utilizó preferentemente para revelar en papel. Se prepararonsoluciones entre l y lO °/oen agua / etanol lzl y se pulverizaron sobre el cromatograma. Se analizaron baio lámpara ultravioleta en moiado y en seco.
- Rhodamina ó G : Es mucho más sensible que la Rhodamina B. Se utilizó una soluciónStock de Rhodamina ó G al 0.12 % en agua destilada ( estable a la oscuridad ) .En el momento de usar se preparó una solución de 0.0012 a 0.0020 7/0diluyendocon agua/etanol 6:4.Se sumergió el papel durante 3 min moviendo.Se lavó con agua destilada para eliminar el exceso.Se miró baio luz ultravioleta; mientras está húmedoflos lipidos aparecen ligeramentefluorescentes. Loscolores que se obtienen ( variables según la pureza de la sustancia ) son :
Iipidos neutros amarillo y narania
ácido fosfatidicotosfatidil inositolfosfatidilserina
tosfatidil etanolamina
fosfatidil colina
dolicol
vitamina A
Cuando se utilizó capa delgadano se lavó .
87
azul violóceo
amaril lo
azul
azul púrpura
púrpura
se pulverizó con solución diluido (0.0012 % ) y
- Fluoresceina : Se utilizó una solución de 0.0] % P/V en etanol 66% . Lospoliprenoles se ven amarillo-verdoso fluorescentes baío lámpara de ultravioleta. Otros lipidos neutros son amarillos o narania muy claro.
- Vainillina : Se la usó para revelar sustancias lípidicas conocidas, por ser económico.Se prepararon soluciones entre 0,5 y 1.0% en ácido sulfúrico conc./etanol 4:l .
- Acido fosfomolibdico : Esun reactivo inespecifico pero que revela meior fosfolipidos.Se prepara en el momento una solución entre 4.5 y 20 % (P/V ) con la que se pulveriza la placa ( o sumerge el papel ) . (41])Losfosfolipidos y glicolipidos se tiñen en azul intenso sobre Fondo ligeramente amarillento cuando se calienta a 85 ° C . Llevandoa lOO-l 10° C aparecen otros lipidosteñidos pero aumenta el fondo.
Reveladores especificos
- O( -Naftol : Para revelar glicolipidos se utilizó una solución de CX - Naftol 0,5%en metanol7agua lzl . Se roció la placa hasta humectarla y se secó con aire frioforzado. Se pulverizó levemente ( desde suficiente distancia ) con ócido sulfúricoconcentrado/agua 95:5. Se desarrolló el color entre lOOy 120 ° C. (371)
I .cerebrOSIdos
fosfolipidos (P-Etanolamina,P-serina )
colesterolesterolesotros lipidos neutros
dolicol
azul purpúreo
amarillo
. . /f0|0 gI‘ISOCGO
pardo roiizo
88
—Revelador de orcinol: Por acción del ácido sulfúrico en caliente, las hexosas se deshidratan produciendo 0( -hidroxilmetilfurfural ( inestable ) que se condensa condensa con el 3,5-dihidrotolueno (orcinol ) dando color. Comorevelador especifico para glicoll'pidos, se utilizó el siguiente método:Se preparó una solución de 200 mg de orcinol en 100 ml de ócido sulfúrico conc./agua 3:1 ( puede mantenerse en heladera y frasco oscuro por 15 dias ) . Se rociósuavemente la placa y se calentó a 90-100° C cuidando no pasarse de revelado. Losglicolipidos dan un color diferencial pardo violóceo o violeta virando a malva.Se utilizaron otras variantes del método para medición de glicoproteinas solubles( 375 ) ( 0.1 % orcinol en sulfúrido 4 mM en etanol ) y de azúcares diversos( 376 ) .
—Revelador de p. anisaldehido : ( CH3 O C6H4CHO ) (4-Metoxi-Benzaldehido ) :Por acción del óc ido sulfúrico en caliente se obtienen coloraciones especificas paralos poliprenoles y poliprenil derivados ( 377, 24 ) . Tarrbién los colores para ciertos azúcares son caracteristicas .
Se preparó anisaldehido purisimo ( Fluka ) al 5% y SOAH2 para análisis (Merck )al 5% en etanol absoluto y se roció la cromatoplaca varias veces muy levemente. Secalentó a 110-130° en estufa.Para el reconocimiento de un lipido en el cromatograma se utilizaron siempre los siguientes parámetros, además de la posición:
1°) velocidad de revelado cuando se calentó la placa desde 80 a 120 ° C .2‘) color inicial del lipido revelado ( baío luz natural y ultravioleta ).3°) color revelado a 120°C .4°) color "de retorno" cuando se enfrio la placa ( luz natural y ultravioleta ).5°) color final cuando se quemó la placa a 130-140 ° C .
La observación permitió distinguir lipidos con revelados finales idénticos pero condiferencias en las etapas 1 a 4 .Loscolores variaron según la pureza de las sustancias y la velocidad de revelado.Fueron diferentes cuando la cromatoplaca fue previamente expuesta a vapores deiodo. Por ello, la identificación por color sólo es válida comparando en una misma
O I O I I '
placa y no de placa a placa. Las mdncacnonesde la bibliografia son escasas ( 377,376) y frecuentemente diferentes de lo que se obtiene con anisaldehido comercial.
A Io largo de Ia presente Tesis se logró estandarizar aceptablemente las coloraciones con anisaldehido . (Tabla 31 ) .
89
_TABlA31 : Eíemplo de coloraciones obtenidas en revelados estóndara con 0nïsoldehïd0/504H2
Sustancia Color inicialb Color finalC
nerolidol violeta verde grisóceo
Fitol violeta azul oscuro
fítosterol azul verde esmeralda
geraniol azul azul oscuro
geranil-geraniol rosa solterino violeta
citronelol roio violeta
escualeno pardo violeta
línalool granate pardo oscuro
dolicol de higado verde hoia verde oscuro
colesterol y esteroles verde azulado azul de prusia
cerebrósidos ( mezcla ) azul verdoso violóceo
ceramida-glucosa pardo pardo oscuro
ácido fosfatidico ocre pardo roíizo
ácidos grasos verde hoía verde hoía
glucosa verde verde
acetil glucosamina ocre claro pardo anaraniado
maltooligosacóridos verde verde
quito-oligosacóridos ocre claro ocre
glucosamina pardo verdoso pardo
90
dócído glucurónico narania verde
Í ’- ' l d Í l hacudo neuramlmco salmon borravmo a Violeta
a) Placas rociadas a 70 cm de distancia sin que lleguen a impregnarse totalmenteb) Color de aparición de la sustanciac) Color a l30-l40° Cd) Revelado sumamente especifico, muy Útil para distinguir ambos ácidos, de similar movili
dad en numerosos solventes.
2.15. Nota sobre los Materiales y Métodos utilizados
L a forma en que se desarrollan las actividades de investigación en el Instituto de Investigaciones Bioquimicas hace que exista entre sus miembrosun continuo intercambio de drogas ,preparaciones de todo tipo e información ( bibliografia , técnicas ) . Por ello seria largoparticularizar todo la ayuda recibida, que se agradeció globalmente en Ia sección correspondiente. Quiero destacar aqui, sin embargo, las repetidas donaciones recibidas de : N.H.Behrens, J.Martin-Barrientos y A.J. Parodi (dolicol y doliquil-fosfato ); E.T6bora y P.A.Romero ( Ficaprenol y ficaprenil-derivados ) .
9]
3 . RESU LTADOS
Losestudios realizados en el transcurso del presente trabaio de Tesis tomaron como punto de
partida el trabaío de Licenciatura sobre Sintesis de Quitina en Insectos ( 164 ) . En el mis
mo se obtuvo la evidencia de la formación de un acetilglucosamínil derivado de un políprenol
endógeno.
AI inicio de los presentes trabaíos se desconocia la existencia en insectos de políprenoles
de cadena larga como los encontrados en bacterias y mamiferos. Por ello, los estudios se de
sarrollaron en Formaparalela, caracterizando tanto la actividad de las glicosil transferasas
como los sustratos Iipidicos endógenos que las mismasutilizaban.
Una vez detectados el dolicol y el dolicol Fostato presentes en los extractos lipidicos de
insecto y estudiada Ia biosintesis de los principales poliprenil-monosacóridos, pudo encararse
la de los lipo-oligosacóridos. Las sustancias obtenidos fueron ensayadas como sustratos de
nuevas reacciones. Asimismose estudiaron posibles factores de regulación a lo largo del
ci:lo de vida y enzimas-clave como la quinasa de dolicol descripto en el capitulo 3.8, prime
ra de este tipo detectada en eucariotes.
Se describen los resultados obtenidos en orden de complicación creciente tratando de que
la información necesaria para la comprensión de cada capitulo esté contenido en los preceden
tes.
92
3.1. EXISTENCIAE_NINSECTOS RE DOLICOL LIBRE DOLICOL FOSFATO
La detección en los extractos Iipidicos de insecto del dolicol artropodiano y de sus deri
vados metabólicamente activos fue Ia consecuencia inmediata del descubrimiento en Triatoma
ínfestans de Ia GIcNAc-poliprenil transferasa, mediante el uso de trazador radioactivo
(capitulo 3.3 y Ref. (164) ).
Ante Ia evidencia de que extractos butanólicos o cloroformo/metanólicos de insectos
incrementaban Ia sintesis de poliprenil derivados, se estudiaron sistemáticamente las propie
dades de la sustancia estimuladara.
3. I . I . Evidencias de gue el Iipido d_einsecto aceptor d_emonosacóridos se comportó como
doliquil fosfato
Losextractos cloroformo/metanólicos de Ceratitis y Triatoma se utilizaron como esti
muladores de la formación de polipreniI-monosacóridos catalizada por enzimas microsomales
de higado de rata ( ó ) . En Ia Tabla 32 se observa que se estimularon levemente tanto Ia
TABLA 32 : ¿srimulacíón 6L-¡a biosïnvcsis de Dol-P-azí'cares y giiccproteinas,cato¡izada por microsomas ¿e higado, por extractoscrudos de Ceratitis :opitc-M
Sustratos cpm incorporados aHidroaolubte Liposoluble Fase ¡nierior Gli;oprorcinav,
¡4pDP-( C )C-Ic ENDOGENO ¡.279 ¡.057
DOL-P 3.686 6.444(6 44M; I05 cpm) EXTRACÏODECeratitij I.40| I.:’58
DOl-P 4 EXTR.S_cI_cii_I_i'_. 3.308 4.706
4 .UDP( l C ) GIcNflc ENDOGÍNO !7/ 00
A OL-P ¡.300 I. l 78(40 pM ; 5,5 x IO cpm) EXÏRACI'O DECeratitis 682 498
DOL-i’ I OUR. Ccrotili‘. ¡.54 I.406
[I extracto (¡moron-n / metanal 2:1 0'..- L-sel cylructo de partida cn ci Método B (página 59 ) . El Dal-Pcmu-gmnrlc o 74 nonmngIcs (Io ‘ósI-uu loml . Lu muxclu un incubación count-nit“. : .VrcCI I? 'nM ; [-DTA , No 2 rnM ;'Innqu'm ÏriL-M-flrulo C,I M a ¡:H 7.4 ; 2 r'lzrcnptumunoi 0.| M; ‘Ïrilón X-IOÚ , 0.6 % on ci caso dv UDP-GI:o dt'OIiCOinio , [In , "¡.3 '71.(-n el con, (le UDP-GIcNAc. (mimo l. Ing dc plot-tina . La: íxuiwcionns se realizaron a30 " C por '10 'nin. "Glicuprcluinu'. " indica mutcriai mdimmrccdn ¡molubk- nn ÏCA culionin (Métodos ) .
93
sintesis de polipreniI-azücores como lo de glicoprote inos. Dichos extractos se purificoron en
columnas de DEAE-celulosa y los fracciones, libres de soles, volvieron o dosorse mediante el
ensayo con enzimas de higado de rato, que se trató Fueron pobres en doliquíl fosfato endógeno.
El material lipidico que emergió o lo concentración solino de 50 mMestimuló la incorpora
ción de glucosa ol Dol -P-G|c y de GlcNAc o Dol-P-P-GIcNAc (Tabla 33 ) (Ver
también Figura 25 y Toblo 35 ),
TABLA 33; PURIFICACION PARCIAL DEL LIPIDO ACEPÏOR DE TRIATOMA INFESTANS
cpm _incorporodas enACEPÏORES
prido-Glucosa Lipido-GlcNAc
ENDOGENO “732 353
+ DoI-P 3.638 ¡.273
Eluutm (lo Columna
b lo mM 1.079 377
t 20 mM 320 364
5' 50 mM 7.596 7'13
Condiciones como las de la Tabla 32.5o utilizó una columnade DEAE-Celulosa de I x 20 cm.
Se comprobó que lo estimulación no fue debido o un efecto de detergente de los fosfoli
pídos contenidos en los eluatos de la columna de DEAE: en lo Tobla 34 se observo que lo
estimulación debida a detergentes o o cardiolipino no posó del 30% sobre lo biosintesis
endógeno. (Ver pógino siguiente)
Se dosó la capacidad estimuladoro de los Iipidos purificados de Cerotitis y de Tríatomo0
comprado con lo del dolicol fosfato preparado sintéticamente o partir de dolicol de higado.
En lo Toblo 35 se aprecia que tonto lo glucosil tronsferosa como la N-ocetilglucosominíl trans
terosa de higado de rata reconocieron los lipidos de insecto c0mo sustratos.
"BLA 34; CCNTRCLDELEFECTO"DHERG[NIL"
EN LA FORMACION! DEL D()L-P-G|c
cpm
EINDOULNO ¡.260
l Trilnn 0.I“í> |.57|
' Nnnirh'l PAD 0.| 93 1.602
- <:.¡..¡¡..I;..¡..u 0.! '33 LMJ
. |:..¡.I.. Mmm... (main) una
I-uM ((Ïul.lIl/\L) -¡.JÏÓ‘ ll-viilu '.
incuqmradal
‘M
FIGURA ZEL: Efcc'o de la concentración del DoI-P de inscclo en la biciimnis drol-P-G c
I Í Ï V¡.000 -1, n, _ .
¿(Nmo
.‘ul’u
,, 1 P lm
Accrron. A"
Condiciones del ensayo corno en Tabla 32 . Codo microlino del exnacio que comio _DoI-P proviene de IW mg de insecto vivo. El 'iempo de incubación fue de l hora .Figura pub|icoda en Quesada y col. ( 60 ) .
IABLA 35 z Dmaie del ncrp'm do inxcclo puiíicodo on columna de DEAEcon Dal-Psintético como ponían
Adicionar. UDP- l4C QuE-.2 UDP- HC N-acclilglucowmina
[1p. l Exp. II Exp. | Exp. ll
cpm cpm
.‘a'inqana ¡705 720 325 35Do!—Pde Cczcnivii 6|?!) 9500 ¡350 540Dal-P de |riargm 45m ¡280 950 250Dol-P° W2C! |3l40 ¡220 “50
a) So uwron lO nnnomolos ¿a Do|-P ¡inválicm en términos de Íósïoro loval
VicmComiiclunex(om en TLMOIpecedcnn‘. [n |0| elpvrimenloi I y II se Ulílilurou diíeran'ei puparucionnl enzlmó
( Ïulrlo publicada en Quesada y col. (w) )
El efecto de |a concentración de Iïpid
cio en la Figura 23 . (arriba)
o de mosca en la síntesis del DolicoI-P-Glc se apre_
95
3.1.2. Propiedades d_e_l_lipidod_einsecto aceptar de monosacóridos
La naturaleza lipidica de la sustancia estimuladora de insecto parece evidente a partir
de sus propiedades de solubilldad: es soluble en mezclas de cloroformo/metanol ( 3:2 /
2:1 / lzl / 5::2 ) , en cloroformo/metanoI/agua ( lO:]0:3 ) , etc. Es insoluble en so
luciones acuosas. Cromatografiado en una columna de ácido silicico equilibrada con solventes
poco polares, el glicolipido de insecto se adsorbió a la mismay permaneció retenido cuando
se pasó por la columna clorotormo y acetona. Cuando se hizo pasar metanol la sustancia
estimuladora eluyó ¡unto con el Dol-P de higado. Enesta mismatracción eluyeron habitual
mente los glicerotosfolipidos ( Figura 24 ) . El Iipido de insecto fue retenido por columnas
de resina de intercambio aniónico, como DEAE-celulosa forma acetato ( Figura 25 ) .
Esta es la propiedad que se utilizó en el presente trabaio como método primario de purifica
ción ( ver también Tabla 33 ) . De los datos de cromatografía en columna ya se pudo
colegir que se estaba en presencia de un fosfolipido. Teniendo en cuenta que el extracto
habia sido previamente saponificado quedó descartado la posibilidad de que lipidos conte
niendo acidos grasos fueran receptores de glucosilos.
El comportamiento en cromatografía de capa fina del lipido de insecto y del dolicol
monotosfato de higado fue similar ( Figura 26, a, b ) y ambos cromatografiaron con
ligeras diferencias a como lo hizo el ficaprenol de elástica fosforiladoquimicamente
(Figura 26, c ) .
96
FIGURA 24 Comportamiento del Il'pído de insecto aceptor de monosacóridos encromatografía de adsorción de ócído silïcíco
1000 '- 0‘O ‘.‘
cpm > l X.I lamb I
__Cl0R0f0RHo_ L. ACETONA_ . b _HETAN0L__1- I
n‘
aoo- ; ,Í
h Í |Í' I
I
400 - :I
. .' b_. . \ ..‘ fi \ ‘ | , \\ t ¡ d .
ZOO» “s.—'. N _—' . ._.__--. .I.100
4C A A 1 l l l l ¿J 1 L n 1 LL A 1 1 l A l
10 20 JO 40 50 100 ¡50 200 ml 300
Mé lodo vu página B? . O --- O DoI-P de hfgudo. 0- o Dai-P de Ïtiatomn ( Lucción 50 mM 1k columna DÍAL. Ver Figura 75 ). En lo figura se I|OHCQTPETPUEEÍOlos elucione. sucesivas de ambas sustancias, en lo mhma columna. Dosaie : vuMirador y Ïabla 3? .
TABLA35 Tratanuenbos ando y alculíno del aceptardo imecto.
A)Esc1muJ.ación de la. GLcNAc-cransforusn do higado.
ACEPIORES cpm 1ncorporn'rma
ENDOGFJD 556
<7 Dal-P lJfil+
+ DolP; H 1.11))
+ Flo-P 7h2
+ m-r z 11" 522 4Ensayos corno en Tabla 32 ( página 92 ) . (A ) H indico que
. . antes dul doscie, el oceplor tue sometido o hidrólisis ócídu (0.! N+ EXtracto do m 63“ 3 tu o 37 ° C). L0)entramosde Triotonnse IeÍíerena eluolosd..
. + columna de DEAE ( Figura: 25 ). Í B 5 Se faponiíicó según el mé+ FIC-do Bam 3 H 595 todo c (página72) .
B)l'lstimu1ac16n do 1a GLc-trnnsternsa ue higado.
EEPKWFS 'I‘RA'J‘AMIEN'I'O(cpu incorporadas )NINGUNO ACIDO ALCALIÏD
Endómno 1.2(2 - 4
f Dol-P 7.2”)1 H.2‘)0 ".607
i ¡I'm-P 2.4171 1.1)¡5
f HthmtO"'rzira'ar:1. hdr“! h .';‘ H 7.775
(.
..;
,--..._.
1.1|“!
.¡H,-I
{500
¿"¿U'Lïi =columna do DFAC-cclulow
Cornpmlomiomo del prído de insecto acepto: de mvmwlcóvidosen una
97
I I I l
l J l l l____ -_¡o7¡ïdïd_6ïuï7_ _ "
I
f)“I’M't‘l/l'¿fl d
l
on
85 30NUMERO DE FRACCION
Ver Mi."¡odos . Lnl lípidos olvidos ¡e demon como en Ïablo 32von por el «¿lodo de página 66 ( Folch / Lcloír ).
FIGURA 26 :
A ) DoI-P de hígado B ) prído
con HCI 0.6 N en cloroform/me-l : origen .7 z DoI-P-Glc (hígado ) . 8 :
um" (I m)
obioluvo/ ficído acético l N ( 10:l5:4 ).
2: UDP-G]: . 3 :
Figurapublicado on Quando y ool. (60)
do ¡nacio
DonolGIcN . 4 :
DoI-P-Glc ( hígado ) .
C ) Fic-P ( ¡inlótico ) .togroííoron en cvomoroploccsdo Sílico gel pro-lavada. Se las demrrolló con clotoformo/ohmol
Dalpuh ¡o rmpó lo sflico, ¡o outroieron los “pido;( 2:| ) y se lo} donó sean so doscvíbió en Toblo 32 .
Glc. 5 'z9 2
(50
Rz;
- no};O
S?ÉEN.J ,50;É5b
l O40 45
. Lm salta se elimina
Cromologrofïo on copa fino del "pido de ¡macro
LM lu'pídmse crom
Fic-P-Gol . 6 : Fic-P-Glc .Front. del orom'ognmo .
98
Por otra parte se trató el lipido de insecto con HCl ( 0,] N durante 5 min a 100° C o
3 hs,a 37° C ); al cabo de ambos tratamientos la actividad estimuladora permaneció incólu
me ( Tabla 36 ) . El dolicol fosfato se comportó en la misma forma.
Esta parece ser una caracteristica de los poliprenoles monofosfato con la primer unidad
isoprénica (X -saturada ( Dankert y Behrens , 20 ). Con los mismos tratamientos el
ficaprenol monofosfato perdió el fosfato ( 359 ) y, por consiguiente, su capacidad aceptora
de glicosilos ( Tabla 36 ) . Esta labilidad parece debida a su estructura alilica ( 20, 359 ) .
Por otra parte, sometidos a un tratamiento alcalino suave, el Dol-P de higado y el acep
tor de insecto retuvieron gran parte de su capacidad estimuladora ( Tabla 36 , B ) . Esto
coincide con el hecho de que el aceptor de insecto aparece siempre activo en la fracción
no saponificable de los fosfolipidos.
Propiedades del aceptor d_einsecto glicosilado
Se estudiaron los glicolipidos radioactivos obtenidos por incubación del lipido de insecto
con las enzimas de higado de rata: el producto radiomarcado con glucosa co-cromatografió
en Ia columna de DEAE-celulosa con el Dolicol-P-Glc sintetizado a partir de DolicoI-P de
higado de cerdo y enzima de higado de rata ( Figura 27 ). Ambosemrgieron de la columna
a lo concentración de 50 mMde acetato de amonio.
El producto radiomarcado con N-acetilglucosamina quedó retenido en la columna des
pués de la elución del DoI-P-Glc de higado, eluyendo a la concentración de 100 mMde
acetato de amonio ( Figura 27, B ) . El comportamiento de ambas sustancias es tipico de los
pol iprenil derivados.
99
Cromatografiados en papel con diferentes solventes los glicolïpidos se comportaron también
como los poliprenil derivados de bacterias o de mamíferos. Las cromatogro‘iasen el solvente D.
permitieron excluir una posible unión no covalente entre el lipído y el azúcar radiomarcado.
Ao-o Dal-P ¡"vado . uan JH G/c
1':
2— 2O 3 .
F ¡GURA 2 7 ¡3g ¿Pm o-o «¡proa VINCHUCA. UDP/’97al:
A: É Acetato de Amon/oen Cloro] chan. 2:1
¿SE 9*10é E _s OmH 10m4 20mM 50mM2 1, o e .2° s e l '¡.9 '5 3 ‘2 6 ' '
"3 o l.2 E 5' . .es? ‘ fSiA 8 2 _ '. _ . A '°És¿ mw#s&?F%&8%mrtarw&4. .# . . . .(5>_ 6 O 1 2 4 6 a 10 f2 7'4 16 :8 n' [racnon 26n .(E Z Bo .2
:1. o /o\o A‘A ACEPTO}?DE VINCHUCA., U I
ig 1 ‘LDPPÏI GIc Nac
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535% 4“ \s-AAo%,od_a 2' p_| t” 4x ogo. 2 56'” #1343”.4 “HW-- 1-9??? 7979EAAÉ 0 ¿v 4 6 E 10 12 14 16 {8 20 2’? 24 20 28 n1/ra-zuon35,510
El tratamiento ácido suave ( 0.] N HCIa 100° C por 20 min ) liberó la mayor parte de
la radioa ctividad que se volvió hidrosoluble. La identidad de la sustancia liberada se com
probó por cromatografia en papel ( Figura 28 ) . Se ve que los azúcares continuan siendo
los mismosentregados por los nucleótïdos derivados.
El tratamiento del Iipido-glucosa con 0.] M NaOH liberó l-ó anhidroglucosano como
se observa en la Figura 29 . Este resultado es idéntico al obtenido por tratamiento alcalina
100
: Identificacióndo tusluncíosliberadosdel "pido do insecto: A Lïpído-Glchidrolízcdo B Lïpídos-az-Jcalessin hídról¡s¡¡( I ) Lïpído-Glc (2 ) Lípido-G'cNAc C Lïpído-GICNAC hidrolilodo D idem, papelimpregnado con 0.2 M NOZÜAO (390, 39l ) . Solvenre A. 0 : origen F : Frente7ï
“g su su m. sm. B 0 |F9 0% 0 1
J Ü uz f< 2ctÉ c ÜUM
c ® 9 a D sum g ‘
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E .cr:
D'nsmNa'A «¿contigo
HM}? 7 Ïratomicnloalcalinadel [ip-(“CJGIC
Er .... _. __ _.
É A a ez B Üv' n ‘ ¿JI 92É 1
¿3.
«a
ur l l . l n l7 o Ao ¿o 0m o ¿o zo m
( A ) <9 somelíó el glucoh'pido al Irohmiento e (página 72 ) y se cromatogro-‘ió el producto hidrosoluble en papel con elwlvente E ).. B) Se cluyo el pico radíoactivo de (A) y Sc trató con HZSO 0.05 N a IO’)° C por 2 hs y crawno'ogmhó en el mlsmoautom. ( l ): GI: (2 ): ¡,6 - anhidroglucasano 4 0 ):origen —
del DoI-P-Glc y sugiere, además, que la posición del Fosfatoen la glucosa es (5 con
respecto al Có . Cuando se aplicó el mismotratamiento al Il'pído GIcNAc y se hizo una
electroforesis a pH neutro, se detectaron dos picos cargados negativamente, Uno de ellos
se comportó como Glc-NAc-fosfato ( Pico 1 de la Figura 30 ). Se eluyó este pico del
lOl
..J.-'. .
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i . . . . 1 L l . L .. 1_ l...
r. "J 1. G ‘2 ‘ó ¿‘O
{Usinnaa del m-¡m (cz
FIGURA 30 : Tratamiento olcclíno del lipido-[l4C]GlcNAc
(A) Se lo calentó en NHÁOII ol lO % por 7 hs o ¡00° C. Se porticionó y lovó scan l'olch y col. (Mñtudos) y se sometiuon lm sustancias ocumm o olerrroiov-sis en tampón ( l i ( fiüqinu 77) con un campo eléctrico 'de 30 V/cm. ( B ) Elpico l de ( A ) Ilatodr) con lozíohno alcalina y analiloulo en lu mium lovrna. 0 : mig-cn. Fiqma publicado en Qui-suda y(al. (60).
papel, se lo trató con fosfatasa alcalina de E. coli y se lo sometió nuevamente o electrofo
resis. En la Figura 30 se aprecia que el tratamiento convirtió parte del compuesto original
radioactivo en una sustancia neutra que co-migró con la N-acetilglucosamina. Siguiendo
una marcha similar con el pico ll de la Figura 30, A , éste no carrbió sus caracteristicas eleí
troforéticas, por lo que no se prosiguió su identificación.
Sometiendo el dolícol-pirofosfato-GlcNAc de higado a idénticos tratamientos, por hi
drólisis alcalina se obtuvo un pico como el l y por tratamiento con fosfatasa éste se convir
tió en GlcNAc . De lo expuesto se deduce que los derivados de lipido de insecto se compoi
taron en lo fundamental como los correspondientes derivados de dolicol de higado. Se estudió
el comportamiento de ambos grupos de sustancias en cromatografia de capa fina, con diferen
tes solventes. De los datos de la Tabla 37 se deduce que los derivados del lipido de insecto,
tanto en solventes neutros como ácidos o básicos se comportaron como poliprenil-derivados y
lO?
TABLA 37 : Comportamiento cromatogrófico del lipido de insecto glicosiladojen capa fina
de Silica Gel G .
Solventesl 2 3 4
RF
hDol-P-Glc 0.78 0.6] 0.68 0.7]iDol-P-Glc 0.78 0.61 0.65 0.70Fic-P-Glc 0.76 0.50 0.60 0.65Fic —P-Gal 0.75 0.49 0.59 0.62Glucosa 0.38 0.35 0.25 0.2|Glucosamina 0.24 0.19 0.17 0.27UDP-Glc 0.07 0.02 0.00 0.03Glucosa-l-P 0.02 0.00 0.00
Solventes : l = clorotormo/metanol/ etanol abs./agua ( l:2:2:l ) 2 = Solvente X3 = idem X en proporción (5:6:óz3 ) 4 = c|orotormo/2-propanoI/etanol abs./NH4OHconc. ( 2:4:5:3 ). Se rasparon de las cromatoplacas bandas de 0,5 cm y se contó encentelleo liquido. hDol-P se refiere a doliquil-P de higado. iDol-P al de insecto(M l' Tablapublicadaen (60) .
- en particular - comigraron con el Dolíquil-P-Glc en el Solvente X, especialmente dise
ñado para obtener la separación de los ficaprenil derivados ( Figura 3] ) .
Se sometió el Iipido-Glc de insecto a tratamiento con fenol ( 68° C durante 3
horas ) . Se observa en IG Tabla 38 que no se rompió la unión “pido-azúcar, a seme
¡anza de lo que ocurre con el dolicol-P-glucosa. Encambio el ficaprenoI-P-glucosa se
hidrolízó ya que casi toda la radioactividad se volvióhidrosoluble. La estabilidad a este
tratamiento parece propia de los poliprenil fosfato derivados CX- saturados ( 359 ) .
Por otra parte se ha podido hacer una estimación de tamaño aparente del poliprenol me
tabólicamente activo de insecto mediante experimentos de filtración molecular ( ver página
144 y Figuras bli-6.4|) . Parece tener un largo de cadena ligeramente inferior ( 18 iso
prenos ) al de dolicol de mamiferos pero claramente mayor que el ficaprenol de Ficus elastica.
l.
103
g
l FIGURA 3! - Crornaia Í' ' ' 'o _ __. gm ¡a en copa Íunn (SII co l ‘ 'F mlíp'cnc’le’ I ge b ) de mezclas de los glucosul
l i.l
- l... _—J
Í 1 .." >
J- ' l ..:.1
1' l
' "7'1A V y I
Ju nwgup on “¡ml/y
o
_ 'í.E ¿uo‘
¡h — — 'áaf am) .Ü I'., y-n 301,;‘_¡- j... .r"-
- I
II:‘,
TABLA 38 :
Se dmouollnron con el solvenle X y ¡e proccsmon para conlor en ccnvelleo líquido ( ver Ïdplo37 y Método: ).
. . . 4 ‘
Agy B : {Mezclasde! Inf ado de mmdo- [l C] Glucosíhdo con DOI'P'[3HJIG|C y Fic-PH] G cl4les¡necluvunvnle.3 C: Mezcla de Dol-P-[ C] Glc y Fic-F-l H) Glc. Línea:
llenos: C . Punloodo: H. 0 : eligen. F : Frente . Figura publicado en (60 ) .
Tratamiento fenólíco de los glucosiI-políprenoles
ANTES DESPUES DEL TRATAMIENTO
Glucolïpído Capo acuosa Copa fenólíca
cpm cpm
¡DoI-F-g|ucosa 1976 242 1785hDoI-P-glucosa 2108 210 1756Fíc-P-glucoso 2149 1676 370
Lo'. ¡nuestros nc calientan en fenol 3 horas, y se procesan ( Gorc I'a y col. ( 359 ) y página70 ) . Se cuentan los copas fenólico y acuosa. Tabla publicada en Quesada y col. ( 60 ) .
104
De los datos expuestos se concluyó, hasta que sea posible obtener pruebas quimicos di
rectas, que la sustancia aislada es dolicol de insecto fostorilado. Es muy dificil estimar la
cantidad de DoI-P presente en los extractos de insecto. De los dosaies enzimáticos, comparg
dos con cantidades conocidas de DoI-P de higado se puede obtener un valor móximo, en
términos de fósforo total. De las incorporaciones de manosa o glucosa radiomarcada al respeg
tivo derivado de doliquil-Fosl'ato se puede obtener un valor minimo, en términos de nanomo
les, descontando el DoI-P-azücar Formadoendógenamente. Losrespectivos valores obteni
dos para el Dol-Pde (kw. fueron0.05pg/g de insecto ( promediominimo) y 0.3pg/
g ( promedio móximo ) .
3.1.3. Dolicol libre d_einsectos
Ante las primeras evidencias de la existencia de un poliprenil-P metabólicamente activo
en insectos,se trató de hallar el alcohol libre en los teiidos de diferentes insectos. Para ello
se aislaron los lipidos no polares mediante varios métodos ( ver Material y Métodos ) . Me
diante el método clósico de purificación de dolicol de mamiferos, ligeramente modificado,
( Método A ) se aisló de los teíidos de Triatoma y de Ceratitis una sustancia con propieda
des quimicas y cromatogróficas de poliprenol de cadena larga.
Tipicamente las fracciones 2 y 3 obtenidas según el Método A, diagrama de la Figura
24, página 58, asi como el extracto neutro del Método B, contenían una sustancia que,
cromatografiada en capa fina se comportó como el dolicol estóndar de higado de cerdo. La
coloración con anisaldehido/SO4H2 reveló el putativo dolicol con una coloración verde hoia
que se considera (377,378) tipica para los isoprenoides ( Figura 32 ) .
\ I ,, y r .ll ¡ULA .1.7 ‘ (.nmnlnwullu ¡le ll(l(( lulu a mnlqum Illul en iluliufl ¡le llum In ( l )
Se desarrolló la crnnmtoplaca du Silico gel "G" lavado ( Métodos ) con el solvente R(o la“ C,). Se reveló con onisaldehido (página 88) .
zum. a l FSIIOSTEROL
, , ,3 o i DOLICOLHIGADOc5.m--»Do o0m o D C» o o FRACCION2 (27.eterén El?)
o ¡a a o, c, o a FRACCIONJ(157.eteren 5.9)
.0 o , {metro Fraccio'nSCMefodoA30344071)
.0 m InsertaExtracto Manny/Vendo a)
ESCUALENO
GER-aria I
Ao O FI70576ROL + GERANIL-GCRANIOL
Losextractos conteniendo el presunto dolicol de insecto ( FR2 + FR3 ) se cromatogrg
fiaron en columna de alumina según el esquema de la Figura 18 . La sustancia eluyó de la _
mismaa la concentración de 10% de éter etilico en éter de petróleo ( Figura 33 ) .
FlGURA 33 : Cromatografía de fracciones enriquecidos en Dol de insecto.
CARRIL
' -_,.. 1 = Geranbl(M 2 = B —sitosterol3......- 3= Escualenor. 4 = Dolicolde higado
L...- 5= Fracción (2 + 3 ) (Fig.32)' 14 = Fracción ( 0%+4% + 7 %)
15 = Fracción lO % (Ver fig.l8)r18 = Citronelol/Cromatoplacas desarrol lados con .elsolvente R.y revelados con lodo yluego con anisaldehído/SO4H2 .
l ‘ Fotografia (en color ): gentileza0mm Dr.H.N.Torres. '
106
En cromatografía de fase invertida realizada con dolicol de higado como estándar, se ve
( Figura 34 ) que el aparente dolicol de insecto se comportó también como tal. El poliprenol
® .IJRIBEN I vt
"a - l <" n. "¡gAnu"a. 9 —::':; INSEBIÜ
. o 12‘ FIC.
V v9 " HIBAUIJ
J -’ D IusunuI
i N FIC
EIGURA 3-3 : Cromatografía en capa lina (lam reversa ) del dnlícol' de ¡nu-cio
[I dolícol obtenido dc la columna de olúmíno ( IO% éter tt. en éter dep. ) purilicó en cromatogrolias similares o las de la Figura 33 (página¡05 ) , cn escala preporotivo. Se obtuvo asi un enriquecimiento aprecioble en Dol; se lo cronmtogrolió en fase reverso (pógino 70 y ( ¡37, _¡97, 396 ) ) con cl solvenlc N. QA) 5 % do agua cn ucctona.
7 Él: agua en acctona .
de insecto cromatogratíó en capa fina como dolicol en diferentes solventes ácidos, neutros y
básicos ( Tabla 39 ) . La identificación del mismoen base solamente a la movilidad croma
togról’ica Fue frecuentemente dudosa debido a que ésta cambió con Ia cantidad de lipidos
totales sembrados en la cromatoplbca ( Figura 35 ) . Similarmente a lo propuesto por Rouser
para otros foslolipidos ( 397 ) las identificaciones en base a movilidad deben hacerse,
al menos, con pares de solventes. Cuando la sustancia a analizar está suficientemente puri
ficada es conveniente desarrollar cromatografias bidimensíonales con los solventes elegidos.
107
1329333 : Cmnuiogrolio d.- l‘ol dv inwnh) un dilmnnlos mlvmm's
l 2 3 4 5 ó 7 3
355m)? RÍ 4 RÍ ¿emuoilkescuah Rf . Rf . Rf
Ficopn’nol 2.3 0.30 0. ¡B 0.54 0. ¡8 0.73 0.80 '
Dal (higado de cerdo) 7,9 0.26 0.12 0.55 0.23 I 0.7| 0.36 0.5
Dol de insectos
. CeroïiiLscoEilmo 3 O 0.28 0.15 0.54 0.26 0.70 0.33 0.87
. Maliophoro ruiicondo 2.9 3 i
____ _ - - 0.25 - - . 'Lriovomoinfcsficns , - 0.15 - - - -
—Colom-vol ¡.13 0.07 - 0.29 - 0.30 - 0.90
- (5 -Sii.m.-ml ¡.co - 0.27 0.07 0.71 0.17 —
- [si U’J:IIII(D - ¡.00 ¡.00 0.80 (LUIJ "
Solvenles : ( l ) Cloroforvro ( 2 ) Solven'e P ( 3 ) Solven'e T (4 )So|ventu U
(J ) Solvente R ( 6 ) Solven'e O ( 7) Solven'e X
( 3 ) Cloroformo/metonol/omniaco conc. ( 70:2l:l )
En los solvenyoï l, 4 y 5 el Ri o: muy sensible o lo saturación do lo cubo, por lo que se utilizolo relación o un esióndar.
,uiti
".o - /30 . o
(r._Jl ,Ó FIGURA 35 : Efecto de la cantidad de lípidos totales'_¡c o —5?] o en lo movilidad cromatogróficaLól
' Oa (c _t: 7 .1: 5 —
f2. s _ o\_J 4 /
3 eÏo 9.o 4070 Cm7
ofi_ L 4 1 n Aos 0.1 os R1.
En lo Figura 36 se identificó el dolicol purificodo de Ceratifis mediante esta técnica. Además
fueron datos importantes en la identificación:
108
- el color baio revelado de anisaldehido, inmediatamente de calentado a 100-110° C
y a las 12-16 hs.
- la velocidad de revelado a temperaturas de 85-120° C ( por eiemplo: los esteroles reve
lan antes ) .
- la forma de la mancha en la cromatoplaca ( en general es ligeramente dispersa debido a
que el dolicol es mezcla de 2 o más especies isoprénícas ) . ( El dolicol de insecto pare
ció de menór tamaño que el de higado ).
- la fluorescencia baío luz ultravioleta, débil y que se intensificó revelando con fluoresceí
na ( Métodos ) .
El dolicol que se aisló del diptero MallgEhora ruficauda resultó idéntico al de Ceratitis
( Tabla 39 ) . (Página anterior). ¿ml
F2 4 .¿sauna/vo
FIGURA 36 : Identificación del Dol de inseclo ‘ UBIOUINONA
Las mezclar de enérdaret (A ) o de Dol du incho más Escualano ycole-Jerol ( B ) ie ¡entraron cn un ángulo de la ploco respectivo (prolavado y pre-cromrografiodo con cloroforrm ). Se cromotogroiió enclorolormo (dirección 1 ) y en ¡oh/enla U (página 79) (dirección2 ) . Se reveló primero con ¡odo y luego con «mimlclol'iido/504H2 .
DOLICOL HIGADO
8I6543ZIO
C : orígen ESC: Euualeno UQ : Ubiqulm COL: colenorol . COLÉSÏÏROL fF¡ y F2 ; Frame de lar. y 2 do. Iolvonlo i,
21.1.
un BíJ12 F: ESCUILEAOH
'9 una mom ,
g 001. ICOL ms6 15‘J
í ’“comn'koa r,o , l¡Lv
\_¿_¡ _¡.¿._L_L_.¡_¡._J0123 5.1]09 fl IJ cm
Prefiración ydosaieílg dolicol-fosfato sintéticos partir d_edolicol d_einsecto
El dolicol purificado en una cromatografl'a en capa fina preparativa de silica gel H con
el solvente R7 fue sometido a fosforilación mediante el método de Popíaclo ( 35l)- l
El producto se calentó a 37°C en propanol / HCI‘ 0,] N durante 2 hs
para eliminar el posible PP-derivado y selo cromatografió en capa fina ( ganó un 60 % de
la capacidad estimuladora ) z los lipidos eluidos del gel de silice se dosaron para su capaci
dad de estimular Ia formación de DolicoI-P-Glc. La Figura 37 muestra que la sustancia
FIGURA 37 : TLC de lipido fosforilado de insecto
_l (Mi6|; no?“. . v Se cromatografiaronen carriles vecinoszdoliquil
¡Im_ 1 fosfato natural de higado(A) y de insecto (B) y elpresunto dol ¡col de insecto fosforilado quimicamelM te (C).LasplacasdeSilicagelG,prelavadascon
‘ Metanol/HCl (9:1) y pre-cromatografiadas con clor_o_B formo ,se desarrollaron con el solvente:
una. M Cloroformo/Etanolabs./Ac.acéticolN(10:15:14);Tras lo cual se separaron bandas de l crn de silicaJ i A I gel y se eluyeron los lípidos (ver pág.78).
c Después de eliminación de los ácidos se dosó la capacidad de las fracciones para estimular la sinte
4000»M 5is deDol-P-Glc.(enzimade insecto).Se preparóÍosiotode di-trletllamlna (l87). Sobreoldollcolseconaflodió gotoagota: bencenoervhldrolvolln n l ¡tor ctl'llco en ¿tercio petróleo (30°- 65°) (4:94 ), |vol.; di-Irletilamlm-ios‘oto en ocotonitrllo destllodo
.; acalonitrllo 2,25 vo|.; tricloro-acetanitrilo (sol. condemonte) 2,25 vol (ver 35l y¡87) . [I producto Íoslorllado ¡e llwó o seco y so lavó varias veces por el «¿todo de Folch ( ¡ln Mgzi ). Tras lahidrólisis ácido ( texto ) ¡a croriatogruiió on TLC
r
O O ¿p s. 0‘3. ES N <°_
áfüfilfiléüfitá‘lnecontenia un componente cuya capacidad estimulodora coincidió con el presunto
Dolicol-P aislado directamente de los teíidos de insecto y con el dolicol fosfato natural de
higado de cerdo. Si bien ésta resultó relativamente baía con respecto a la obtenida mediante
DoI-P natural ello podria explicarse por la presencia de impurezas provenientes de la fosfa
rilación, ya que al mezclar el putativo DoI-P sintético con Dol-P natural, éste perdió parte
de su poder estimulador ( Tabla 40 ) .
HO
lAblA 40 : COPOCIdOdestimulado-a dr! lipido de intacto faslorilodo
Formación dr: Dol-P-Glccpm incorporados
End-390m 977
+ Dvl'P de l-u'gcdonatural 8 .94l
4 Lipido de insecto loslorilado 3. 623
idem + DoI-P higado 5. IIB
¿anual ( + Dol ) 506
Sc utilizó el Dal-P sintético como activador de la iormación de Dol-P-Glc, usandoenzima de higado de rata. Incubnción y procesamiento ver Métodos y Tabla 32( pagina 92 ) .
De lo expuesto se concluyó la presencia de dolicol libre en los insectos. Este resultado
. . . . 14 , .ha sudoconfirmado por Beedle y col. que arslaron dolrcol- C de larvas aseptrcas de
Calliphora erythocephala crecidas en presencia de 2- [MC] ócido mevalónico ( 28 ) .
Estosautores estiman en base a cromatografía en TLC ( Fase invertida ) que el dolicol de
insecto posee 19 a 18 unidades isoprénícas con trazas de l7 unidades. En la presente
Tesis ('ver mas adelante pág. 144 y Ref. ¡43 ) se encontró que, en base al análisis
por filtración molecular del derivado manosilado el dolicol de insecto tenia un PM de
lo que corresponde aproximadamente a 18 unidades (ver Figura 65 , página ¡45 ) . No
se ha podido obtener suficiente dolicol de insecto purificada como para someterlo a un análi
sis por espectroscopl'a de masa. La cantidad máxima que se obtuvo ( ¡.8 mg a partir de
1/2 kg de pupas de Ceratitis ) se utilizó en el experimento de fosforilación. Además no era
rigurosamente puro.
lll
3.2. BIOSINTESIS " IN VIVO " EE POLIPRENlL-AZUCARES
Se utilizaron dos enfoques para los estudios de biosintesis fisiológica de poliprenil
azúcares en insectos: a) inyección de precursores radioactivos en hemolinfa del insecto;
b) cultivo de órganos y/o teíidos, Fundamentalmente epidermis y cuerpo graso, en presencia
de precursores rcdioactivos.
3.2. l . Inyeccióndiprecursor eihemolinfa
Se trabaió con vinchucas y cucarachas mantenidas en laboratorio.
Larvas de 5° estadio y adultos de Triatoma infestans fueron inoculados con 5pl de solu
ción fisiológica de insecto conteniendo Trehalosa - ( 14 C ) . Se realizaron diferentes ex
perimentos con eíemplares en momentosdistintos del 5° estadio, entre la alimentación y la
muda a imago. El periodo más interesante, debido a la aparente activación del metabolismo
de poliprenil derivados, es el que va desde poco antes de la muda hasta el momento en que el
¡magoemergente todavia posee cuticula translücida, apareciendo por ello rosado ( a causa
de los pigmentos epiteliales, fundamentalmente insectorubinas ) . Se realizaron periodos
de marcación desde l a 72 hs, al cabo de los cuales se extraieron los lípidos totales. Como
se aprecia en la Tabla 4] del total de radioactividad incorporada a lipidos entre 2] % ( a
las 8 hs ) y 17 % (a las 72 hs ) correspondió a Iipidos polares.
H2
TABLA 4] : Biosintesis "in vivo'I de lípidos en Triatoma infestans.
Radioactividad incorporada ( cpm )
Tiempo después de inyección (hs.) 3.5 8.0 24 72
Extractos Totales(Clorotormo/metanol 2/] ) “7.420 89.20l 27.448 25.357
Columna DEAE/Celulosa- Fracción Neutra 101.526 68.400 2]. 7'34 21.664
- Fracción Polar ¡2.409 17.68] 5.089 3.895
Hidrólisis Acida de LipidosPolares :
- Fase Superior Acuosa 2.606 3.800 620 283
- Fase Inferior Orgónica 9.307 13.551 4.33] 3.525
LosFosfolipidos marcados fueron sometidos a la hidrólisis ácida suave tipica para detección
de poliprenil azúcares ( Métodos ) al cabo de la cual una parte de la radioactividad se hizo
hidrosoluble. La radioactividad liberada por el tratamiento se distribuyó en varios sustancias
una de las cuales se comportó como una acetilhexosamina cuando Fue cromatografiada con el
solventeA( Figura 38 ) . Enalgunos experimentos, la fracción glicolipidica lóbil al ácido
liberó, además de la acetilglucosamina una sustancia que, por criterio de movilidad, parecia
diacetil-quitobiosa. No pudo analizarse en detalle por su escasez y por la aleatorio de su
obtención.
Por otra parte, se descartó - por dosaíe enzimótico con trehalosa fosforilasa - que alguna de
las sustancias unidas a lipido fuera trehalosa.
Losexperimentos paralelos en que se inyectó [uq- Glucosa , se interpretaron con
113
FIGURA 38 : HídrólíS¡Sdel gliC0lïpïd0 sintetizado "in vivo“ por Triatoma; identificación de [os sustancias hidrosolubles
Clan Glc Glcllac“’"‘ «w am m
300
“¡si-ft
450
lo 0:5 4:0 4.5 86,6
TABLA 42 : Hidrólisis del material radiomarcado " in vivo " por Periplaneta americana
Fracción Radioactividadcpm %
fracción soluble en clorotormo / metanol 62.l02 lOO
idem, particonada fase acuosa 32.970 52fase orgónica 29.55] 48
Fase orgónica particionado después de hidrólisis aócida fase acuosa 925 1.5
fase orgónica 28.002 46.0
Métodos como para Triatoma ( Métodos y Figura 38 ). ( a ) en dos experimentos idénticosse obtuvieron porcentaies de 1.0 y 1.3 . Tabla publicada en Quesada y col. ( 180 ) .
dificultad debido a la rópida marcación de numerosas sustancias liposolubles, incluyendo los
ócidos grasos. Se verificó - no obstante - la formación de glicolipídos lóbiles al ácido.
En la Tabla 42 se aprecia que en experimentos similares realizados con cucara chas
( Periplaneta americana ) también una parte de los fosfolipidos resultó sensible a la hidróli
sis ócida suave. En estos casos los productos de hidrólisis no se caracterizaron debido a la es
casez del material radiomarcado en cada experimento.
H4
3.2.2. Marcaciónïi cultivo d_e_te'|ido
Epidermis abdominal
Se utilizó material de 5° estadio larval y adultos recién mudados de Triatoma . A los
efectos de obtener epidermis Io menos contaminada posible con otros teiidos, se disecaron
los abdómenes eliminando cuerpos grasos, sistema digestivo, gónadas y tubos de malpighi,
lavando con solución fisiológica. Se controló al microscopio que sólo quedara la pared ab
dominal adherida a la cuticula. ( Se consideró el sistema traqueolar como cuticula ) .
Enexperimentos paralelos se incubaron alas en pedazos,asumiendo que éstas constan
básicamente - de epidermis recubierta por cuticula no tonificada.
Al medio de cultivo completo, diseñado para estos experimentos, se le adicionó, según
los casos, Trehalosa ( 14 C ), Manosa ( M C ) o Glucosa ( ¡4 C ) durante periodos de
3 - 5 hs.
En un experimento tipo de 3 hs de duración como el que se muestra en la Tabla 43
( ver página siguiente ) se observó que en término de nanomoles las incorporaciones a mate
rial clouoformo/metanol soluble de epidermis fueron similares en el caso de trehalosa y gluco
sa. La incorporación de manosa Fue la mitad. Sin embargo la incorporación a sustancias so
lubles en fase inferior de la partición de Folch ( ver Métodos ) - también en término de
nanomoles - fue mayor cuando los trazadores fueron manosa y trehalosa.
Sin embargo, debido a las baias actividades especificas,las incorporaciones de [14 C]
Man y [14 C] Trehalosa en términos de cuentas por minuto fueron baias/opor lo que en la
mayor parte de los experimentos solamente se pudieron estudiar con comodidad las sustancias
¡15
l
radiomarcadas a partir de [ C] Glucosa.
TABLA 43 : Incorporación de radioactividod a lípidos de epidermis
Precursor Radioactivo
[‘4c].GIc [14C]-Man ['4c]-Trehalosa
cpm nanomolesa cpm nanomolesa cpm nanomoleso
Extracto total 571.670 1.98 45.112 0.90 45.600 1.82
Particíón:- Fase Superior 473.100 1.6] 29.670 0.59 35.280 1.4]
—Fase Inferior 26.700 0.09 13.350 0.26 10.320 0.4i
Extracto C/M/HZO10:10:3 1.700 0.006 40 0.001 212 0.005
Se incubó la epidír is como se describe en Métodos con 1,5 x 107 cpm de [Md-Glucosa288 Ci/mol o [ JTrehalosa 25 Ci/mol o [14C]Manosa 50 Ci/mol.
Para el cólculo de los nanomoles de monosocóridos incorporados no se tuvo en cuenta Iadilución debida o los sustratos endógenos, por desconocerse el dato.
a) nonomoles de monosacóridos incorporados, calculados en base a la actividad especificadel nucleótido-azücar dador.
Análisis cromatogrófico de las sustancias radiomarcados de epidermis
Losextractos cloroformo/metanólicos de Ia epidermis incubado con los diferentes traza
dores se particionaron para separar las sustancias hidrofïlicas ( Fase Superior ) de las Iipofi
lló
licas ( Fase Inferior ) ( ver Métodos
En la Figura 39 ( ver página siguiente ) , carriles l a 3 se aprecia que la mayor parte
de la radioactividad hidrofilica se comportó como trehalosa, independientemente del precur
sor radioactivo empleado. En los casos de glucosa y manosa ( l y 2 ) todavia se detectó
algo de la radioactividad original.
La posición cromatogrófica de las sustancias lipofl'licas radiomarcadas se aprecia en la
Figura 39, carriles 4-6. Como se indica en la Tabla 44 la sustancia que arbitrariamente se
denomina ( I ) cromatografió en la zona en que lo hacen los cerebrosidos y esterol-glucó
l/xNA 4-! : Duhn ¡lu ¡IznxilüÏuJ un l'H wnhux ln. rmn-Ilnqulhmlul rn. cmumtoqluun;como e: ("-¡\"‘|Inllt'l|!u un lu l ¡llum J‘r'
Eslómlurn 5‘ El
. Ralinoza ( CJ) 0. ll. Cumbrósidos 0.8|
. Glucosa-P 0.00. PMP-Gol 0.47
. UDP-Glc 0.02. iDol-P-Glc 0.52
. GDF-Man 0.00. ¡Dol-F-Man ‘0.50
13’.°f.“.’_ü”í“.‘Z’-‘_‘ (i‘f‘_"'"l‘¡"" 5""
. Glc 0.26 .“c Glc l 0.31
. M o.¡77 u 0.3| o
. M3 0.12m 0.44 o
M4 0.07¡v 0.29 +
“c Man l 0.a:
sidos. Eluida de la placa esta sustancia resultó resistente a las condiciones de hidrólisis
lóbil para poliprenil-azücares (pH 2.0; 100° C; 20 min ) .
La sustancia ( ll ) co-cromatografió con el DoI-P-Glucosa y en las mismascondiciones
de hidrólisis liberó glucosa como Única sustancia radiomarcada ( Figura 40, ll y Tabla 44 ).
La sustancia III cromatografió en la posición en que lo hacen los polipreniI-oligosacóri
O
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2
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¡17
118
: OpH2.0delosglicolfpidosseparadosen capa fina (Cromatografias en el solvente B)
I5L“°“”‘°°5 ¡“3 39) au‘cou’pioas uioaoaimos
l
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I I I 'De:l'úJ‘aÍ'L
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dos de 3-4 hexosas y resultó lóbil a la hidrólisis a pH 2.0 (Tabla 44 ) |iberando un aparen
te trisacórido radiomarcado ( Figura 40, lll ) .
La sustancia ( IV ) fue la principal sustancia radiomarcada,|óbil a la hidrólisis en ócido
lóbil .
Se confirmó su naturaleza lipidica, cromatografióndola en papel con los solventes J y
B y con agua ( Figura 4], A - C ) (ver página siguiente ). La sustancia liberada en el
tratamiento ócido exhibió una movilidad cromatogrófica similar a Ia de un maltoolïgosacórido
de 5-6 unidades ( Figura 4] , D ). Este presunto oligosacórido cromatografiado en Biogel P 2
mígró con un Peso Molecular aparente de 630-740 que corresponde aproximadamente a un
tetrasacórido ( Figura 42 ) .
H9
FIGURA 4| : Comportamiento delglícolïpido IV
A COIrrROL{soumrc J) D Híoaáusïs Adon (Sat-«MI B)H5 H H5 H], 5|;
Him» °B Cannm (At-un) E Tánnnimro Muu'flo (saucnrz ¡(/nc)
Gk-l-Í’DoL P-(1k Fv
1Í I
C (011mm. (¿envían B) F ¿Licruonusis la PA'EL TAHPMJI
O F e ouHPGD
A) B) y C) Glïccln'pido eluido de TLC y cmma'ogroíiodo en pop-l
D) Glicolïpida sentido o hidrólinísácido suave (pH 2.0 h crmrognflo enpale de la ¡valencia hidrowluble liberado ( lolvenlo Il )
E) y F) Suuoncio hidromiuble libemáo por Iru'omíomo alcalina: nomina-unoen cnpo hno ( ¡olvenrc X ) ( E ) y eloc'roíormh on popol (AcetatoPiriJina pH 6.5 J (F)
¿Pmx 2. _ A 0
ml ¡“e
1 ’ B1.» L 50
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9L l Á. . .
40 A5 1° l 5 J O J 5 ¡1 115 ¡o n? ¿e ¡(reducen
I'KUURA 42' ; Cmumlugmíïu ¡Iv Íillvuciúu vn uqlumna de Bing-¡clP, (Vo> 23,0 cc ) dnrl nlíqoqncñrillo Iíhnado por hidrólisis Gcíduü-I'1-ól:\(.llí.l:lr'l”l" . Nu lu u-Iuyó (lvl CIumolnng'III d\ In Huum 4| , l) (cnilm ) , u- lo lovó y reunpcudió en Ïunvón Íosíolo pH 7,0IO 'ILM. Cnm. ¡".liurhu .I.- Vu ",4-ulílízó :lr ¡"(I'm orul. Í!IC\1II¡IIU\[HL‘V¡(Hu.- coiíbvó lu columna, dnlccvóndom los ozücuves por e"¿-1va de (hdmi) y ml, (¿mi ) ,A) RIH”U‘|L“\¡1¡\IIIEI1Im lun (¡um-s B) Cunvu dc cu'ibluc ión
120
Por otra parte se sometió el glicolipido a un tratamiento en NaOH 0.] M a temperatu
ra ambiente durante una noche. La radioactividad se hizo hidrosoluble y se comportó como
una sustancia cargada, cromatografiando igual que azúcares-fosfato ( Figura 4l , E ) .
El comportamiento en electroforesis a pH 6.5 fue el de un onión ( Figura 4] , F ) .
Debido a la escasez del material obtenido en cada ensayo todavia no se ha caracterizado
debidamente el glicolipido de epidermis abdominal.
EEidermis de alas
En las incubaciones de alas, utilizando Glucosa - [M C] , se formó un glicolipido que
se comportó, boio diferentes criterios como Doliquil-P-Glc ( Figura 43, A )
A H H H GI
ss l 'Ééao“af mi °t'“r’
3 ElGURA4¿ :
“á l5Wc W Croulalugrufiode Instanciashidrowlubln liberadosde la ira“ ión
É a l L L l _" " "' whidrólilinócidn wave
Q. a: BQ ‘ty.ha‘u3Q.WWkuE,
x 1 I t __Jo ,40 zo Jo 0m
Los lípidos polares extraido: de Alas (A ) y cuerpo groso (5 ) lueron sov'netidps a hidrólisis ácida suave y cromtograliodos en papel con el solvente B .
Cuerpos grasos
En los cuerpos grasos se radiomorcaron numerosos lipidos pero sólo una pequeña fracción
de glicolipidos resultó lóbil a pH 2.0/IOO° C (Figura 43, B ) .
Losglicolipidos extraidos de los diferentes órganos se sometieron a hidrólisis ácida suave
y se cromatografiaron en papel con el solvente B .
12]
3.3. BIOSINTESIS _[)_EDOLICOL MONOSACARIDOS
Se utilizaron como fuente de enzimas homogenatos parcialmente purificados de varias
especies de insectos. Se dosó la capacidad de los extractos para transferir GIcNAc y Glc
desde los respectivos nucleótido azúcares a glicolipidos hidrolizables por tratamiento ácido
suave ( HCI 0.0] N/ 20 min / 100° C ) . Esta sensibilidad al ácido es tipica de los polipre
noles-fosfato(s)-azúcar. En Ia Tabla 45 se aprecia que los resultados más promisorios se alcan
wifi : Formacióndu glicolïpidos lóbilesal ácido colalirada por extractos de ¡nm-cios
INbECTO cpm incorporadas/ 3 mg de proteina enzimática
marcador rodioactívo
' 1
[ ‘c] Glc [“c] GIcNAc
. fgschnawings ( adulto)( [pidermís abdominal +alos ) 85 12
. Aris Telliiera (adulto)( npidcrmis abdominal ) 127 0
. Cinrïmoius M ( pupas)( Homogenalo total ) 275 ¡63
Rrïipimïta (¿nu-yich ( larvas)( [piclcrmis Abdominal ) - 442l
- .P‘JLÉ'YJEX"92"2‘3“ ( WPm tri lonmgpvnuloÏolal 7 l. l 73 3?]
- ("dv'w>2( [pidunnis aulominul ) Lab? 675
. Ceravitiscapitulo (papas)THomogenan total ) 3.478 ¡.208
Se utilizaron mezclas de incubación estándar (página 65 ) conteniendo 50.0)0 cpm deUDP-[MCJGicNAC y 60.000 cpm de UDP HC Glc y fracciones ricas en microsornas( página 62 ).l ) sólo hubo incorporación cuando vr añadió NaF IO mM o la rnozclo2 ) adultos con cuticula sin tonificar
zaron con Triatoma, Ceratitis y Periplaneta . La Tabla 46 indica que, al parecer, las
enzimas capaces de transferir GIcNAc y Glc en la vinchuca se localizaron fundamentalmen
TABLA 42 :
ÏLuchIa ¡nteslanl
- Hnmogumto total
- Si-nii-MnluJoa ¡7.000 I g
- Subir-mutante ¡to I?.000 l 9
- Scdinu-ulmto u 95.000 x g
- Subvrnudunlc d“ 95.000 I 9
l?
860
¡002
3|“
Purificación parcial dc la GIcNAc-tranxfcmza de abdomen de
SPI:EL??? '°f‘9}.¿J 9;":12292110
Acetato-Mg
Draxicolalo'Na
FNa
[mayo
Ïril Ml pH 7.4
2 rnorcuplo-¡tonoi
te, en Fracciones ricas en microsomas. Utilizando similares fracciones de mosca de la fruta
se ve que (Tabla 47): 1°) Existió transferencia de Glc, Man, GIcNAc y Gal,- 2°) Dicha
"¡ANA 47 : Traníoroncla de gllcmlios de mclobtldo-ozócuol o la ficción Ilpídlca la)"
al ócldo en Ceratlrln
NUCLEOTIDO-AZUCARADICIONES
UDP-GI: GDF-Man UDP-GÍCNA: UDP-Gal
cpm incorporadas
Ninguno 576 793 297 49
+ Dal-P a. lnncloo 4349 4906 ¡900 ¡s7
+ DoI-P de hígadob 327o 9436 ¡m ¡92
r Del-Pws)" - M9”b 110mM EDÏA 538 ¡56 99 48
lllI.Ulr'I( ¡unes y IIIUCBHIIIIÍOH'Oo.lólnlulo| ( Mótmlos )u) ln cuulillurl ¡tu ¡II-¡"actoconteniendo Dal-P omnlirln a Curl-Jtubo procedía de 4° mg d. lnnctovivo .b) “ul-r cumlnuielulu 74 uunumulel de Íozlnlu,Ïnlnln pulullurlu nn (Juan-"Io y ¡.nl. ( I'J'r ).
transferencia se estimuló por el agregado de Dolicol-P de higado de mami'feroo del extracto
de insecto que aparentemente contiene DolicoI-P de insecto ( ver capitulo 3.1. ) . Por otra
porte los cationes divalentes fueron necesarios para todas las transferencias dosadas ya que
123
cuando se compleiaron los cationes endógenos por agregado de EDTA, la incorporación deca
yó por debaio de los niveles basales (Tabla 47).
3.3. i . Dolícol-pirofosfafo-acefiIglucosamína
Cronológicamente el primer Iipido azúcar de insecto con caracteristicas de políprenol
derivado se detectó en experimento diseñados para la sintesis " ¡n vitro " de quifina, en
los cuales simultáneamente se dosaba la incorporación de radioacfividad a la fracción Iipidíca
del incubado ( Tabla 48 ) . EI Iïpido-azücar sólo era defecfable en ciertas preparaciones
ÏABLA 48 : Detección de la formación de lípido-GIcNAc
["(Z,'(JI\.\'.\( ¡mm ¡muda
l'\¡¡|. (hgallismo I’lgnulí- Adiciones Fmio’n “(ani-HL qu'o'n ría. (¡Guitínqmiento
(.pJIL/ 2;, in- l .||.lll. ’ % inllI mg ('m'puru- ll) mg (orlmru
prulcina (ión proteina. (ión
h 'I'unlmlm (Lllpil)Ihnn‘nq’ Nu --- -»— 447 0.54
5 HIM (¡ICNAC --« -— 2060 .250
lÏ 'I'vinlnma Bulnuulo
Nu l 700 "Li? '58!) livlh5 HIM (¡lt'NAc --< —-— 650 0.78
:¡u 'I‘mnm." I-‘ulvh u "IF .\'n 1 103 l.|l l 723 ¡.7'23') ¡“M (¡ICNAC l ¡50 1.15 ¡374 1.87-.\lq"' 4* L’UmM
HU'I'A 2'24) 0.22 {IU-i (i .3”
H Í'rn/n'llnrln Hulnlml«904° ha. mn I.4I I 182 2.3".
HI Ill.\i NJ]: l L’Ím 3:10 |9I6 3.82
Iil'l (.rmluu lnh'h rI III.c Nu Mm) 0.7| ii L’H-i 3.“?
Se utilizaron incuhocíoncs estandar ( Métodos ) . Las funciones ricas en
microsomas (Mélodo‘) se obtuvieron de pared abdominal. Se utinmon50.000 cpm de UDP C GlcNAc (cone. final 20M Molar ) y ó mgdo onleïna enzimática.a) se refiere al "¿todo de domia de quitina (306)b) se refiero al «¿todo de Garcia y col. ( 359 ) de ob'ención de la fracción
Iipïdica. Laquirina se dasó com ¡c indicó en Métodos (página 73)c) se refiere a la extracción de la fracción lipn’dica (355 ) . Dato. letrado!
de la Tabla similar publicada en Quesada y col. ( im ) .
124
(generalmente dependiendo del momentodel ciclo de vida del insecto ) y se precisaba, ade
más, el agregado de Dolicol-P y detergente para la obtención de cantidades significativas
de radioactivídad incorporada a lipídos. La transferencia resultó máseficiente en presencia
de deoxicolato de Na que utilizando otros detergentes no-iónicos como Triton X-IOOo
Nonidet P-40 (Tabla 49) .
TABLA 49 : Eleclo del Dolicol-Íosfato y detergentes en lo biosïnresis de lu'pio'o-GlcNAe
Adiciones c_ucntas incorErodas Z 6 mg de EroteïnuMg l rnM -. Mg lO mM
* EDTA 20 rnM
- 2ló ( 327 ) ( ¡30 )
+ 0.5 96 Deoxicolato 87 ( ¡23 )
+ DoI-P 389 (439 )
+ Dal-P + 0,5 % Dcoxicolato 1200 ( 1305) (272 )
+Dol-P +0,5%Tritón X-IOO 721 (727) (¡55)
4' Dal-P i 0,5 % Nonidet P-vAO 760 (304 )
Dol-P = 24 nanomolos llum» of. {i’mft'hlUDPAG '= 75.000 cpm
La Figura 44 muestra que en esas condiciones experimentales, el Dolicol-P de insecto
FIGURA 44 : Efecto de la concentración del aceptor lípidico enla formación de DoI-P-P-GlcNAc
_UDP-GIcNAtNe a
í .“ . Condiciones estándar ( Métodos ) cadapl de
° l ¿lol ¡lo"¿la l ¿L l 5:" iDoI-P procedió de 100 lg e insecto vixío. Las"’“°l“l\Dol-P(O-o)J ¡Ml¿ooLp cpm corresponden a la C GIcNAc liberada
del Iipido e í' dentíficada por cromatografr'a enpapel .
125
resultó ligeramente móseficiente que el dolicol monofosfatoextraido de higado de cerdo.
La temperatura óptima de transferencia resultó de 24-25° C para lo enzima de Ceratitis
( Figura 45, A ) . EIpH óptimo se situó entre 7.7 y 7.9 utilizando una solución tampón
FIGURA 45 : Condiciones para la formación de lipldo - GIcNAc
cpm
2000
1500
1000
500
de Tris-Maleato o de Tris-HCI ( Figura 45,
A B
\ rm- Halecto‘O FIS-HC!
llllJlllJL-IJI IllllgLLlllllll°C 20 22 24 26 28 JO 60 6.4 6.8 lO 7.4 la ¿2 8.4 PH
taron ser de menor eficacia.
Efectos de polícationes
B ) . Otros tampones como fosfato o hepes resul
La Tabla 50 y la Figura 46 muestran la acción estimuladora de las poliaminas sobre la
GIcNAc transferasa. El efecto se manifestó tanto en ausencia como en presencia de magnesio
y fue más notorio cuando la enzima fue preparada en ausencia de M92+ ( Tabla 50 ). El
manganeso pareció interferir con el efecto. Dado que diferentes poliaminas actuaron en
forma similar ( Figura 46 ) y que los microsomas de higado de rata también fueron sensibles
a la putrescina ( Tabla 50 ) parece tratarse de un efecto inespecifico probablemente estabi
126
Iizonte de los membranas microsomales.
TLBLA 50 : Efecto da policalionos
cpm / 3mg ¡nomina
Adiciones Enzima + Enzima 2* Emi-.1prepome con Mg ptcpurodo sin Mg de higado
- 2.173 2.643 2.236
- M92+ + Pulrescino 60 mM 3.05! 4.002 4.433
4-i‘ulrescino ¿0 mM 3.665 4.967
- M924, + Punescina 60 rnM+Mn 8mM 2.442 3.798
Condicionm M6. B mM "¿Nauru «(u'nídauu's ¡Ii-R“¿I‘minÏ.M. pll 7.7 100 mV\ Wmin 30' CDoc. 0.5%
FIGURA 46 : Efecto de poliaminos en la formación de lipido-GlcNAc
cpm
3000 Lf \--..-.-()_ .
-. . , . encamina
1
2000 ‘Se uhlizoron las condiciones estándar ( pág.65 ) y se incubó por60 min o 27°C . 0 mM indica elóptimo valor obtenido en una curva de concentración de MgCl ( 9mM ) . A los restantes tubos
o ¿o ¡o ¡o ¿o 5:, ¿É ,"Ïn se les añade io poliamina. Las diferencias con la Tabla 50 son ofribuibles a los condiciones de ensayo y que se trata de diferentes pïeporociones enzimáticos. _
¡1000 "
Caracteristicas del glicolipido formado
El Iipido -G|cNAc obtenido en varias incubaciones se llevó a seco baío N2 y se resus
pendió en poco volumen de cloroformo/mefonol 2:] . Uno olicuofa del mismo ( aproximada
mente 4.000 cpm en 0.2 cc ) se pasó por una coiumna de intercambio oniónico de DEAE
127
celulosa lormo acetato de 1,? x 40,0 cm equilibrada con metonol 99% en la forma descripto
por Garcia y col. ( 359 ) . Como se aprecia en la Figura 47 la mayor porte de la radioacti
(Pm Ac NHI,¡Ulol ‘CEluloso,4.0il“)o m I
Humo; 997o LHOH995', L. . f, d . no» _momN FIGURA 7. Cromatograua e Interfl ' cambio ióníco del leIdo-GlcNAc.
12v
‘° ' - .‘C-Om!“
5r- i50m)“:¿/ añdrfueaMV‘woij-‘fl'g . TÍÏV‘ÏA.1L) .90 JO (¡0 50 60 70 60 90 IOO
,n' ¡fraccion
vidad permaneció unido o lo resina y fue eluida de la mismacon un gradiente lineal de aceta
to de amonio en metanol 99% . Se requirió alcanzar lo concentración de lOOmM para la re
cuperación ( 80 % ) de la radioactividad. Por otra parte una alícuota similar del lip-Glc
NAc se pasó por una columna de ócido silicico equilibrada con cloroformo, quedando lo radio
actividad adsorbida a lo mismo, debiendo ser eluida con metonol (Tabla 5] ) .
TABLA5]; Cromatografía de adsorción en Unísíl (ácido silicico) dellipido-GlcNAc
fl % de recuperaciónCloroformo 187 4 .0
Cloroformo/ocetona anhidro l:l 42 0. 9
Acetono anhidro 889 19.0
Metanol anhidro 2877 62.0
Total recuperado 3495 85.9
l 78
Como el comportamiento fue tipico de lipido Fosforílado,se pasó la sustancia por pequeñas
columnas de intercambio iónico ( DEAE-celulosa equilibradas con cloroformo/metanol ) que
habitualmente se usan para discriminar poliprenil derivados. La Figura 48 A, muestra que el
L r v ' r ' v r í ,fl T 1 . . . | 1 I .DEALCAulomlumen A
600 “Www/“M” z" Do/P-GI: ' —
400
FIGURA 48 :Cromfogralfa de Intercom
... bio agíónico en DEAE-Celulosa del lipido - [ C] GlcNAc _
200
H. Seprocediócomose indicaen Mé'odosJ—l (Tabla 30, página 84) IO mM, 50 mMO ‘ indico la conccnlwción de acetato de urno
30 nio en el solvcnle. Para pvopiedadcssopa:varivas ver Mó'odos y n:on . En B , los¡Iacc¡0nes se conten’ron y su sicvulnan cn
w y . . . . w v l u v 1 r I - - v v 1 v v v pequeños piezas de papel SS 204|alá3x0,5 que se sccon y se down para C
Q DEAE(rialmn 4 X0-6 W y J)“ en ccnlnllcador (Ver Métodos) .__ .‘ Souénrc J 1q) Í Fiqumsimilarpublicadaen ( la) )
4- 2- '. , z “rl- i; Quo Col-P-15”],el;
_; y400 —
200
I..l+.nCÏILI.4_‘JO 5 10 15 20m/
glicolipido quedó retenido en la columna y eluyó con una concentración salina de 50 mM.
Se cromatografiaron muestras similares en otras pequeñas columnas de intercambio iónico
( DEAE-celulosa equilibrada con cloroformo/mefanoI/agua lO:lO:3 ) . En esas condiciones
el dolicol monofosfafo glucosa no fue retenido por la resina ( Figura 48, B ) mientras que
los pirofosfafo derivados lo son ( 143 ) . El lipido GlcNAc Fue retenido y eluyó con
lO mM Formiafo de NH4 en lO:l0:3 . En las antedichos cromatografias de columna descrip
RESPUESTADELÜHEUÜR(ctm)
1000 “G/c1p
A kDoL P-(1k
' CEKEHáSiDOS (OLES‘fÉROL
o R¡:o_32 go
F
L | l A A n I l l A
0 2 4 6 8 10 12 14 16
> B \ ‘'d o os u t ECX \ s. s.o u c 3 3
‘t E = 3l É Ex o Q0 '.’ 6\ D \
DP-G/cu Go o '¿4-SolvpnlIron!
L 1 l l 1 l 1 l 1 1
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Ugg-PA 49 ; Cronukunuíïg y EIECÍIOÍOICLÍDdcl Iïpído - GICNÁC
A ) Cra-mn,g:oífa ch plucus lle-¡ble! [ommn OGG](o un pupe' impregnado con ¿cido si"nico) con al "nlw-Me P . Lo! cnónduws 2* ¡if-rn can Iz . [I Dol-P-Glc te cvormingmííó
en un conil contiguo. H 3B ) te melcló el "pido-í CJ'GICNAC(0-. ) con Fic—P[ “10h: (°"'° ) (prepatod'; con (-mí'm do hïqtulo ) y u.- Io wmluó cn placa con wpult- Ih- vívhio . La cuor'vnog'ulïo'.r‘Ilu'nnolló u l')-'/I " (L nn culm pt-¡lrclauwula- wnnm'n con (-l Snl'u-nle X . Lm Inlóndole!Iipn'J'u5-, ze "11-qu m (un Rhwlmníuu b B . In', "161m"; y uxócun 5 Ímíulo con In', "¡Ind-n«in-Trvu-lym.y mi. (377 ) xhunmw y unl. IJm )u-qu-clívuuw-uhr. lm nmlcólídm H ¡04:0“¡num con ¡(I'upuul U.V. ¡"ua loculizm lu unlilnlzlivi-lud ".0mwomw bandas de 0.5 cm un nlu ruumnqplmm y se «Mruiumn ¡01glicolïpídos que v. midicIo-n en cer-velleodor .
J1.0
RI
129
130
tas, el lipido-GlcNAc se comportó como un poliprenol pirofosfato derivado ( 135,143 ) .
El lipido-GlcNAc cromatografió en capa fina con el solvente P en la posición esperada
para un fosfoglucolipido de cadena ¡soprenoide ( Figura 49 , A ) . La Figura 49, B muestra
que el comportamiento cromatogrófico fue cercano al de Dolicol - Glucosa de higado y dife
rente del FMP-Glc. Ensayando en un sistema experimental de electroforesis en papel en
acetato de piridina-Triton X-lOO-SDS en medio acuoso, el compleío l ip-GlcNAc-detergen
tes mígró, separóndose del compleío ficaprenol-P-Gal-detergentes . Esto
constituyó una indicación indirecta de posibles diferencias en la cadena Iipidica y/o en la
carga neta de la molécula.
Tratamiento ócido
Por tratamiento ócido suave del Iipido-GlcNAc de insecto parte de la radioactividad se
hizo hídrosoluble y co-cromatografió con la GlcNAc en el solvente B ( Figura 50 , A y B ) .
FIGURA 50 : Tratamiento ócído del lipido-GlcNAc
40"“0“ QD Glc- l‘lacx A w , C o?”'Q, o 6h. (¿IL-Hal. fl al.U
E o
í Iíz‘Zl AL 4 4 4 l A A..‘2 oo ot ol os oq os 0h R,
AGSPJEi"
l L A l n l A n 1
oo o-l o: os oa os oc o: or oa 4.o RF
Cromatografía del lipido-azücar antes ( A ) y después de la hidrólisis ( B ) en solvente B .( C ) Identificación del GlcNAc por cromatografia en papel impregnado con borato, con elsolvente (A) .
131
Para decidir si el azúcar liberado eia totalmente o sólo en parte GlcNAc ( dado que pueden
existir epimerasas ) se cromatografió un hidrolizado del lipido en papel impregnado en
0.2 M Na2B407 con el solvente A . Como se aprecia en la Figura 50, C toda la radíoac
tividad coincidió con GlcNAc y se distinguió de la GalNAc. Comoquiera que en las condi
ciones estóndar de hidrólisis sólo se hidrolizó el 75% del Fosfolipido se estudió la labilidad
del mismocomparada con la del DolicoI-P-P-Glc NAc sintetizado con higado de rata y el
DolicoI-P-Glc sintetizado de igual mado.
En la Figura 51 se ve que, por razones dificiles de explicar los GlcNAc-lipidos son mós
FIGURA 5| : Hidrólisis ácido del lfpida-GlcNAc
Se lniro una hidrólisis ócldo Ifibil con HCI 0.0l5 N o ¡00°C por los tiempos indicodos y se contó la rodioactividad remanent- -.n el lipido .
0/0. hDol-P-RGIcÍ'lAcI L. Dol-PP-GlLflÁcA lLDol-P- Glc
\I‘x.
.\ II O ‘ ‘ s . s N.: I
\%A A1 1 L i L 445 4o 45 za 25 Ja mín
resistentes que el Dal-P-Glc. La velocidad estimada de hidrólisis para el lipido-GlcNAc de
insecto es aproximadamente la mitad de la del lip-Glc. Si bien se conoce que el grupo amino
parece estabilizar la unión éster en glucosami'nidos ( 104,415) ( probablemente debido a la
Formación del grupo amonio en la molécula ) , ( Ver Behrens y col. ( 104 ) ) , en
los acetil-amino derivados la mayor resistencia es de dificil interpretación. Parte podria ser
¡32
atribuible a la sustitución en el C2 y parte a impedimento estérico que, por eíemplo, difi
culte la formación del ión carbonio, intermediario en la hidrólisis ócida de glucósidos.
Tratamiento alcalina
Se sometió el glicolipido a un tratamiento alcalino suave (0.1 N NoOH en cloroformo/
metanoI/aguo 6:4:l , por lO min a 37° C ). Enesas condiciones el glicolipido permaneció
estable. Se lo trató con 0.1 N NaOH en n-propanol/ agua lzl durante 90 min a 68° C
y el Iip-GIcNAc se rompió obteniéndose dos sustancias que aparecieron como negativamente
cargadas una vez sometidas a electroforesis. Este resultado es idéntico al que se obtuvo tra
tando en la mismaforma el Dolicol-P-P-GlcNAc de higado y el glicolipido obtenido incu
bando aceptor de insecto con enzima de higado ( ver capitulo 3.1.2. y Figura 30 ) . Por
tratamiento con fosfatasa alcalina se obtuvo N-acetilglucosamina.
De los experimentos precedentes se deu ¡o que el lipido-GIcNAc de insecto es indistin
guible de un poliprerol-pirotosfato-GlcNAc similar al que se obtiene con microsomasde
higado .
3.3.2. Propiedades de la enzima transferente de manosa
Las fracciones ricas en microsomasde insecto catalizaron la transferencia de manosa a
sustancias solubles en medio orgánico y a glicoproteinas ( Figura 52 ) .
¡33
Hu.n...\ 52 .....u. ¡la GDI' -|Hcl Mm. .. .m...........'"h‘duul‘
20 ———v---—-—-- - 1
"¿:3 . .
á, rasa oxonmcn —E2
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Se uliiuó la ner. iu I-flóndunde ¡mulmq-ión, u- aiumun lo: Iipidcn y su ol1|6 lo Írocción inmlublo rn ICA ¡ulienlr (póqinn Mi , M I o B . LosproclplIudm lui-mniiixuelhn tu th -.(I (.lllil‘llicl urulmliludm y |.0||'Ud0\liqum publicada en Quesada y Brlncnpilow ( 201i) .
En la Tabla 52 se muestran los efectos de diferentes agregados:
EÉEA 52: Condiciones para la incorporación dc radioaclividad del GDF-(NUHan.g la fracción lipidica.
MODIFICACIONES MMC-ACTIVIDAD EN FRACCION LIPIDICA (CPH)
[HDOGLNO MiDol-P yiDol-P
.Experimnlo A
Sin qu’mns [DÍA ÏOnIH - - - “¡7 177
Sin Irilóu 'A-lOO 7‘33 90’! 3h;
3,7; 53.5. _r.;.«¡,_|_n_¡(_)_ 550 9.Iu36 ¿.906
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o (.H" linH - - - 8.07€. lulon
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o nano-m i'i un 32. IÜS
e Famosa-¡J , 3 KH 33-|77
Sin CDP(“‘C)H.)n_n-nt (“‘C)H.1n')'.:. IO}
(“La N-zcla dl: incu‘mcir‘m cenleni.1:'l’ampón Tris-HC|,pH 7.8.l00n-J1 ; 2-morcuploetanni,100 mn ; GDP("'C)Han 9...1 (60.000 cpm);Tril(In ¡"IDO 0,67.. Los lipidosse llevarOn .1 seco con [DTAJM .o.5 miurumlvu y Mg“2 .l.5 micromflvs y se les¿nadienm ios rcuantes compuncnIesde la mezcla.Con la proteína enzimática (0,6n'q) ¿e Cvr.‘li(i’-_ se llevó a un volumen final de 50 ul .Datos publicados en(UC). _(¡IÍ 13-0ulili7ó Nunidel P-‘aOal 0,117 en lugar de Trilún.Se aumentó lacantidad de enrlm (7,14 mq.dc prolelna). (C) Idem 0. pero con l.5 x IO cpmde 'ZOP-( 'C)H.m . (n lullu'. Ink uno! se Incubó our 20 mln o 25'6.Cudidan. r'. prom-dm ¡Je-nl munnu- dns rnpcrimenlrn. H y C 'e publicaron en (203)
134
- Lipidos exógenos : En (A) se aprecia que la reacción se estimuló por la adición al medio
de incubación de dolicol fosfato de insecto o de higado de cerdo. El ficaprenol monofos
tato de Ficus elastica estimuló igualmente la incorporación, aunque en menor grado.
Cantidades crecientes de lípidos exógenos aumentaron la incorporación ( Figura 53 ) .
FIGURA 53 z Curva de concentración de sustrato
_ .,L 1-71,1 l_l. l I I- Condiciones como en Tabla 52 (A)o '° 2° 1° 4° 5° ( pógina anterior ) . Cadapl de
Dol-P de insecto (circulos abiertos ) provino de 80 mg de insectovivo. Figura publicada en Quesadaycol. (135).
hDaIHP (M101) al 4; Da/NPÚJ)
- Nucleótidos : En (A) y (B) se muestra que la adición de GDP disminuyó la incorpora
ción de radioactividad a la Fracción lipidica sugiriendo que el GDP es uno de los productos
de la reacción de transferencia. El GMP no alteró la tasa de incorporación de Man mientras
que el GTP Fue inhibitorio, probablemente a causa de su conversión a GDP durante la in
cubación. Estosresultados concuerdan con los obtenidos por Tetas y col. ( 109 ) en
higado, que describieron la inhibición no-competitiva de la Formacióndel Dol-P-Man por
el GDP. También coinciden con Richard y Hemming ( lll ) que obtuvieron Ia formación
de GDP -Man a partir de estos Últimos.
- Manosa XManosa-P : El experimento (C) ( Tabla 52 ) excluyó que la transferencia
se haya producido a través de productos de degradación del GDP [14 C] Man : ni la manosa
ni la manosa-l-P compitieron con la transferencia y, en las condiciones ensayadas, la
135
[14C]Manosa no se incorporó al glicoli'pido .
- Nucleótidos-azücar : En experimentos de desplazamiento se vio que ( Figura 54 ) el
o JO?
ol .
.(Cch'aiOn"L1'A‘(’T|:¡
FIGURA 54 : Efecto de la dilución ísotópica y de Ia adición de diferentes nucleótídoazúcares
Condiciones como en Figura 52 ( pógina 133 ) , usando óO nanomoles de DoI-P de higadoy 0.2 % de Trítón X-iOO . A los 3 min de incubación se añadieron 3p| de agua odel nucleótido azúcar ( 1.2 mM final ) . Figura publicada en Quesada y Belocopitow( 203 ) .
UDP-Glc y el UDP-GIcNAc apenas inhibieron la formación de Iïpído-manosa mientras
que el GDP-Glc fue ínhibitorio. Este efecto parece debido a la aparición de GDP como
producto de degradación ya que éste y GMP se detectaron en la cromatografia del medio
de incubación conteniendo GDP-Glc.
- Detergentes : Cuando se adicionaron Iipidos al medio de incubación se necesitó agregar
detergentes. Se ensayaron diferentes detergentes neutros y polares, resultando másefi
cientes Ios primeros. Las incorporaciones al aceptar endógeno se inhibieron por Ia presen
136
cia de detergente, en forma similar a lo descripto por Tkacz y col. para la enzima de
páncreas de bovino ( 12] ) .
Se estudió el efecto de la concentración de detergentes no iónicos con respecto a la pre
sencia de 20-30 nanomoles de Dol-P en el medio de incubación . En general, el óptimo
se situó en una concentración de alrededor de 0,3 % para una concentración de proteina
de lO mg/ml (Figura 55).
la concent racióncpm“al RA FIGURA 55: Efecto de
' II"? de detergentes no polares en la forma16" t ‘\ ción del lipido-manosa. (0'—° )Tritón' ,‘ ‘\ X-IOO (Il-"'43 )Nonídet P-Lio .(u-----n )
1/ \. Kyro.a
“r ,'l l ‘
I." D A °\¿Lili \\ °oli, I._I\\I¡«F/1 A
d
o) l Oli l ola L All .416 o¿Cono
Se estudió con mós detalle el efecto de Triton X-lOOentre 0.1 y 1.0 % de concentración
y se observó una curva bimodal ( Figura 56 ) que aparentemente es dependiente tanto del
lipido exógeno agregado como de la cantidad de proteina.
Si bien no es posible interpretar este resultado, se conoce un efecto similar para Ia manosil
) . Entre los fosfolipidos ensayados como deter_transferasa de linfocitos humanos ( 59
gentes, la cardiolipina resultó el máseficiente.
137
16000
12 OOO
Fn 6.000
o _-___L _____.__L-7...0 02 014
.. 1._ ..___V.L- _ 7-06 0.a
TR/TON X-IOO CONCN. (°/.)
7.o
ERA 56 : Dependenciade la concentración de TritónX-IOO en io formación del manolr'pidc de insecto. Condiciones estandar de incubación. Dal-P, 3p| ( ¡5 ng en P) y0.6 mgde proteina enzimática (o -O ) . Dal-P lOul y0.6 mgde proteinaenzimática (I‘m . Dal-P3y| y 6 mg(Á- A)do pralou'na. Figura publicada on ( 136 ) .
- Cationes : La actividad transferósica depende de la presencia de cationes divalentes.
Las poliaminas pueden substituirlos y el EDTAen exceso ínhibió la transferencia de
manosa ( Tabla 53 ) .
Tabla 53:Efecto de cationes
ADICIONES
Ninguna
lO mM MgCl2
IO rnM MnCl220 mM EDTA.Na
6 mMPutrescína
Condiciones estándar.Tab|a publicada en Quesada y col
CPM
2.836
9.]h3
10.002
356
6.773
(203)
A menores concentraciones de EDTA, sin embargo, se observó una estimulación parcial.
Este efecto se ha descripto también en (89 ) y quizás sea debido a problemas de
138
conformación de membrana.
+La concentración óptima para Mg fue de lO mM como se aprecia en la Figura 57. El Mn2
2+ . . . . .y el Co , en esas conducuones fueron menos efluentes. Por resultados prevuos se
í l3000
FIGURA 57 : Curva de concentración deMg + . La mezcla de íncuba
ción estóndar contenia 30 ng en P de Dol-P_y 0.] mg de proteina enzimática. Figurapublicada en ( 136 ) .
cpm
5 OOO
____1_4. “P. 1.._,_._1___..J.-.7“.1O 5 10 15 20 25
CATlóN CONCN. (mM)
estimó la concentración endógeno de cationes divalentes en la preparación de membranas
en alrededor de l mM .
El efecto de la variación de pH en Ia manosil transferasa se aprecia en la Figura 58
(ver página siguiente ) .
El pH óptimo es de alrededor de 8.0 . Este valor es mós alto que el encontrado para en
zimas de vacuno (121-5) e higado de rata ( 416 ) , aunque en esta Última Leloir
y col. ( datos no publicados ) han obtenido un pH óptimo de 7.8 - 8.0 . También un
pH de 8.0 se encontró para la manosil transferasa de linfocitos humanos (59,122 ) . Los
óptimos aparentes de pH quizós tengan que ver con el tampón empleado y con el grado de
fluidez de las mezclas de incubación.
139
"'1"'""T"'*““I"‘ ““I "’"Ï" ""
12.000
WIR-“(1.
E 8,000 “ FIGURA 58 : Curva de pH para la Formación3 de DoI-P-Man. La mezcla
_ de incubación estándar contenía 0.] mg deproteina enzimática. Figura publicada en
4000 _ (136) .TVI“ mulcuh.
o .__.__nJ_¿. .lv.‘__i-r.._ l,<_r_.J....._]4 6 8 10
pH
Concentración de proteina enzimática
Como se aprecia en la Figura 59 la incorporación de manosa al DoI-P es función linear
Í" "-1'“ ' " T“ t '"T' —7_"'_"'Y"
zaooor
E i
3 10000 ., v .FIGURA 59 : Formacuon del manolupndo en
Función de la concentración/ de enzima
o l l l 1 l . a
o 02 04 0.6
PRO“ INA (mg) Condiciones estándar excepto para el tiempode incubación que fue de 5 min. Figurapublicada en ( 136 ) .
140
de la concentración de enzima.
Cinética
Locinética de incorporación de marca radioactiva a glicolipidos endógenos y exógenos
se grafica en Ia Figura 60 .
"‘r" Í Y l 'T ï 1’ “4T
3h o A
FIGURA 60 : Formación del manolipido enFunción del tiempo
cpmx10.4
( i>-4>) aceptor endógeno (0-0) másDoI-P de insecto ( cantidad obtenida a partir de 38 mg de insecto vivo ). Las incubaciones contenian 5,7 mgde proteina enzimótica. Figura publicada en ( 136 ) . —
¡ww-0- | l '_,. l
(mln)
La incorporación creció por Io menos hasta los 40 min cuando en el ensayo se utilizaron
5 mg de proteina enzimática. Enotros sistemas ( 124,115,116 ) la incorporación
decae rápidamente debido a la acción de las hidrolasas por una parte y de las transferasas por
otra( “8 ).
TemEeratura
En Ia Figura ó] se ve que latemperatura óptima para Ia transferencia fue de 25° C ,
como era de esperar en un organismo poiquiloterno y a semeianza de lo descripto para hongosl, ¡4] a
( JJ ) y plantas/ En los organismos homeotermos la temperatura optima para Ia manosil
transferasa oscila alrededor de los 30° C .
Ml
40,000 Ï I I T
30,000 v- —
Eq 20,000 t- HU
FIGURA ól : Dependencia de la temperotura en la formación de Dol-P:Man
10,000 L’ d Condiciones estándar con 0,5 mg de proteinaenzimática. Figura publicada en ( l3ó ) .
o l l l l20 25 30 35 40
TEMPERATURA(°c)
Propiedades del lipido manosilado
El extracto cloroformo/metanólico de las incubaciones con GDP- 14C - Man , se cro
matografió en columna de ácido silicico activado ( cromatografia de adsorción ) . La ace
tona, que eluye los glicolipidos neutros en este tipo de columna (395,397 ) no eluyó las
sustancias radiomarcadas. La radioactividad se recuperó en el eluato de C/M/H2O, como se
aprecia en la Figura 62 I en forma similar a como se comporta el DoI-P de higado de vaca
( 328 ) y otros glicero-Fosfolipidos ( 397,418).
142
l l l
I. ACEÏONA ><CHCIJÍCH30H3H
6,000 " H ‘*
l- “ FIGURA 62 : Cromatogratia en ócido silicico del Dol-P-Man de insecto
E 4,000 — "3 El lipido obtenido en diferentes experimentos
se introduio en una columna de Unisíl de 1.0"' _ x12.0 cm, tras lo cual se eluyó ésta con
‘P 80 ml de cloroformo se continuó como índiY
_ ca Ia Figura. Cada fracción Fue de 4 ml.2,000 *' Figura publicada en ( 136 ) .
_. 0 _a
o Lanka.“ , ___ -30 4o 50 60-” 7o
n" de fracciónSe sometió el dolícol de insecto manosílado a cromatografía de intercambio aniónico,
en una columna de DEAE-celulosa equilibrada con MetOH 99% , en la Formadescripta por
Garcia y col. ( 359 ) . El manotostolipido fue retenido por la resina y eluyó a una concen_
tración salina de 50 mM cuando se aplicó un gradiente de AcONH4 en Metanol 99% a la
columna. Otros poliprenil manofosfato derivados se comportan en forma similar en este tipo
de columnas ( 118 ) .
Enalgunas cromatogratias se observó que alrededor de un 7-8% de la radioactividad
ligada a la columna de DEAEpermaneció en ésta hasta que la concentración de sal abanzó
los lOO-l lO mM, Ese es el comportamiento esperado para los poliprenil pirofosfato azúcares.
Se cromatografiaron los manolipidos radiomarcados obtenidos en diferentes experimentos,
143
pasóndolos por pequeñas columnas de DEAE-celulosa equilibradas con cloroformo/metanol
2:] y eluidos con el mismosolvente y con cloroformo/metanol lzl . Se continuó la elución
con C/M/H20 10:10:13 . En este tipo de columnas los dolicol-monofosfato-azücares no
son retenidos por el DEAE (quizás debido a la poca cantidad de sitios de intercambio y a
las trazas de sales ) . Losdolicol pírofostato derivados, sin embargo, quedan unidos a la
columna( 143 ).
En la Figura 63 se ve que el lipido-manosa no fue retenido por la columna ( Pico | ) ,
l Pito l I Ï Pico :1 l _u-g a- pq I- —'
A B C D
3,000
FIGURA 63 : Cromatografía en DEAE-Ce2’000 Iulosa del manolipido
cpm
_ Se procedió camo se explica en página 84.Después de colocar la muestra la columna(de 0,6 x 3.0 cm ) fue eluida con: 32 mI de
__ Y. . l , cloroformo/metanol ( 2:] ) (A); 12 ml de clo10 20 ,30 40 roformo/metanol ( l:l ) (B); 84 ml de sol
FRACCIONNUMERO vente J (C) y luego (D) 40 ml de formiatode amonio en el mismosolvente ( J Cadafracción fue de 4 ml. Figura publicada en(136).
de acuerdo a Io esperado. Una pequeña cantidad de sustancias radiomarcadas eluyó solamen
te cuando se pasó una solución 30 mM de acetato de NHn en C/M/H20 lO:lO:3 por la
columna (Pico ll ) .
La sustancia radiomarcada, sometida a diferentes análisis, se comportó como poliprenil
difosfato oligosacórido y su estudio se detalla en el capitulo 3.4.
Peso molecular del glicolipido
Se estudió el peso molecular aparente del lipido fosfato manosa en columnas de filtración
de Sephadex G-150 equilibradas con deoxicolato Na, según el método de Behrens y col.
( 143 ). El Dol forma compuestos de inclusión con los lipidos y se ha calculado (143,419)
que el número de moléculas de DOC combinadas depende de la longitud del Iipido.
En la Figura 64 se aprecia que el volumen de elución del Ficaprenol monofosfato glucosa
difirió del dolicol de insecto manosa en 8.5 ml mientras que este último sólo difirió en 1.4 ml
1‘l—m 3A Q
16 — Ev:v:3
_ a\.a’N9
6 " e 6.- \" FIGURA 64 : Peso mleculor del Dol-P-Manosode Inacioav e . E “'—
53 ‘ cR l l l g Se utlllló uno columna de Sephodex G-ISO do |,2 l 90 cm equilibrado con l’E 0 N Fosíotode No 50 mM (pH 7.2 ) conteniendo deulcoloto No al 0.5 %. [al pri8 B mm determinacionesfueron realizado! exclusivommo por el doctor Laloil, Direc
16 __ Ü tor de esta Tous, tros lo cool lucron repetidos por el wtor. Lo"¡un lo publicó en.8 ( I36 ) .I:
P g A) Mezcla de hDol-P- [3M]Glc (o-¿x ) . IDol-P-[I‘C] - Glc (o —o)g a) Mezclad. .9. animoytlc-P-[3H16lc («n-n)
a ,s 02 3. '-. ‘I
— -° ' - 0.1
0 Y ¡._J.. l l0 8 76 24 32 40 46
Fracc/o'n Nl
del dol-P-Glucosa de higado.
Teniendo en cuenta que el Peso Molecular aparente para los compleios ( DOl-P-Glc )
145
deoxicolato es de 11.300 ( 143 ) y para (FicP-Glc ) - deoxicolato de 6.143, el
Peso Molecular aparente para el lipido-manosa de insecto es de 10.567. Ese Peso Molecular
aparente correspondería aproximadamente a un poliprenol de 18 isoprenos, con 22,5 molécul
. . r FIGURA Uy, : Nomgrann para el cálculo del tamho aparente del Dol-P-«Vanlas de DOC UhldOS ( Figura 64 ) . —'_ deinsecto
n‘l ne pM(MAA|RIU¡10'
90 ‘c __.\ (¡loputnuoe; R -\5 ' n'nulwun1° 12-- ""43
ra .
G, lJ-«- 1 4'! -46 ..
Aceptanao lo teoria de Herndon ( 4|9) y lol cálculos de Üeluem y col. ( |43 )( ver texto ) se construyó un nmmgrarna para relacionar volumen de separación( ml ) er: lu columna, con respecto a estándares, con el n° de impugnar y con elpaso mulcculur upurcnlc. La; firmo; - y t indican el volumen de autencianeluidus rmlcs 01lMpur’H(le lu imógniln ( O ) ; en este cmo el ( V )iDol-P-M.Iu.(O -O) H1:-l’w(7lr. í (fl -I J Dol-P-Glr
Esto coincide con los datos de cromatografía en copa fina, fase reversa, para el presun
to dolicol de insecto ( ver página lOÓ ) y ( 28 ).
Por otra parte cuando se preparó manolipido de insecto y se lo comparó en cromatografía
de capo fina con Dolicol-P-manosa preparado tanto con enzimas de higado de rata como
con extractos de insectos, resultaron indistinguibles ( RGlc = 1.82 - 1.98 ) ( Figura 65 A ).
El manolipido co-cromatogr-afió también con Dol _ P_[3H_lGlc ( RGlC = 1.85 ) (Fi
gura ó5B) y se separó netamente del FícP-[BHJ-Glc (RCNc = 1.60) (Figura 65 C).
146
¡CURA65¡ Comportamiento cromatográfico del Dol-P-Manosa de insecto
B o
6'c3 GIL
(ousr.fl!)
A (A. I _ q
UDP-(1k 39 .\ .¿H gc
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raid“,¡cummilnquf¡anda en gvngu'. ¡h- vndiin ¡fc Silica (ici C a un;|.::[H'I'ullul'd (le li‘-I|"C . (f\)Huvi'.ide ¡lvl ¡Dni-¡“Han (liviJJ ¡H‘ n.\-.\‘..-‘qliu-uilado (mi curima du íll'.ef_lfl)(.l)c¿,flv,,)'.lqldu cun I.\ del Ï¡7«)I-P-.".f.n
4 a2,0 H6]:
ïn [mt-u los nuxn'. '.1'Illi'¡¡
(lípidn ¡le 'I:’].ld0/\‘I|/íl|l.\ th: hrqqnlo) (b) y Lun la o l ‘ 315.. pvc;mundo (on cui/¡nm (h: ¡nun-ch) (L). "7' y (C)\'._.)hnnl-P-(¡UU-CL:(I'M-I )'íDn| P-(¡"(.)H.¡n; (A“'A)riL'P'(’II)GIL . (nlesl-colcslurolÍ>I|7'I||.II|JI\.I (,ltyvn-Jll-pllih-nl
Tratamientos ócido Xalcalino
Losderivados de manosa del dolicol fosfato de insecto y del DoI-P de higado, sintetiza
dos por enzimas de Ceratitis se trataron con ácido (0.0] HCI a 100° C por 20 min ) .
El 9 % de la radioactividad se hizo hidrosoluble ( Tabla 54 ).
147
TABLA5h: Sensibilidad al ácido y al álcali del iDolP-Man.
TRATAMIENTO hooI-P-(ll‘cman ¡DoI-P-(H'CManFASE SUP. FASE INF. FASE SUP. FASE INF.
CPM
NINGUNO 16h 2.002 176 2.056
ACIDO SUAVEl 2.032 176 2.06h ¡89
ALCALINO SUAVE2 2146 2.106 ¡71 2.211.3
ALCALINOFUERTE 2.057 31h 2.015 3l9
DeSpuésdel tratamiento el material hidroiizado se separó según el método deFolch y col (355) y se lavó cada fase (pág.66). I)Método 2.13.].a (pág.69) ;2)Método 2.|3.2. c (pág.72); 3) idem ,e,pág 72.Tabla publicada en (¿36)
Se identificó el azúcar liberado como manosa en diferentes sistemas cromatogró'icos,
como se aprecia en la Tabla 55 .
TABLA55: Identidad del resto liberado del aparente iïpido-Manosa de insecto.
SUSTANCIA SOLVENTESA B c D H (IT (2)
RGlc
.Galactosa 0.87 0.93 0.82 -- -- 0.92 0.93.Manosa 1.20 1.06 1.26 ¡.010 1.03 1.18 i.¿i5
[(11%) liberado 1.19 ¡.06 ¡.25 ¡.05 1.014 I.l9 1.1i5.Haltosa 0.69 0.85 0.198 0.60 0.87 0.6] -.GicNAc 1.162 ¡.13 1.39 1.26 ¡.12 -- -.Fructosa I.|7 -- -- -- -- ¡.15 -A a H indican los solventes detallados en métodos (pág.76). (l) Butanol/piridina/Agua (9:5:7); (2) Acetona 91i9Z/Agua6% . En todos los casos,salvo en el SOIVente C,se cromatografió en forma descendente.
Se sometió el iDoI-P [14. C] Man a tratamiento alcalino usóndose el hDoI-P P
[MC JMon como control. Ambos resistieron el tratamiento suave ( Tabla 54 ) mientras
148
que ul tratamiento enérgico tornó todo la radioactivirlml llidrosolublc ( Tabla 54 ) .
Este material se comportó como un azúcar monofosfato en electroforesis ( Figura óó, 0 ).
FIGURA óó : Identificación del producto originado por hidrólisis alcalina
fiD Glc-ó-P
6-)
IN ,.a «¿hd “Nqdwasn-M-MNAW’ M
i I sowcuub
Las electroforesis se realizaron con el Tampón I ( página 77 ) a pH 6.5 . a) producto del tratamiento alcalina b) tratamiento ácido del anterior ( ver texto )c) pico de b tratado con fosfatasa d) cromatograin en papel del pico "neutro" dec con el solvente B
Tratado con 0.] N HCl por 7 mín a 100° C y sometido nuevamente a electroforesis vol
vió a comportarse como azúcar-fosfato ( b) . Se eluyó la sustancia resistente a hidróli
sis ócida del papel y se trató con fosfatasa alcalina de E. coli . El tratamiento transfor
l D I h ' lmo lo esencnal del compuesto I'CldlomeCGdOen manosa C (c ) segun se comprobo
por cromatografia en papel con diferentes solventes ( d ) .
Losresultados obtenidos excluyen la posibilidad de que el fosfato unido a manosase
encuentre en la posición l . En cambio, la resistencia al ácido indicaria que el produc
149
to del tratamiento alcalino es manosa-2-fosfato que se habia originado via manosa 1,2 fosfa
to ciclico. La formación de éste, sólo puede explicarse si el fosfato en el manolipido se en
cuentra unido a la manosa en posición K5 ( 69 ) .
Tratamiento fenól ico
Este tratamiento rompe Ia unión entre fosfato y lipido en los derivados de alcoholes ali
licos ( 359 ) . Como muestra Ia Tabla 56, la [14 C] Manosa se liberó del ficapreÏAILA 56 : Tratamiento ¡anóllco dal "pida de Coratllh mnollloda
Anton dal Dospuós del trotamlontotratamiento
capa acuosa two fanSÏicocpm cpm
lipldo endógenod. cmum."unnsildo ' ' l .293 69 l .204
IDol-P mnonlloda“ 2.402 ¡92 ¡.920
hDol-P-Manb 2.40! 202 2.22?
Fic-P-Manb ¡.309 ¡.469 2m
So realizaron incuboclonu estándar y ¡e aislaron lot poliprnnil-derivados. a )prepon:do¡ connuit-I: de ¡mado b )pleparodos con enzima de higado . So utilizó ol procedimiento deGavcia y col. (359) (ver página 70 ) calentando en lenol durante 3 ln. y separando luegoIm losas para cantar en cantelleodor . Ïohlo publicado en ( ¡36 ) .
nol monofosfato [MC] Manosa tratado con Fenol caliente mientras que tanto el manolipido de
. 14 ] . .Insecto como el hDol -—Pl C Manosa reSIStIeron el tratamiento. Este resultado es indica
tivo de que el Iipido de insecto es un poliprenol d -saturado, luego seria el dolicol tosta
to de insecto.
150
3.3.3. Dolicol fosfato glucosa de insecto
La transferencia de glucosa desde UDPGIc para formar DoI-P-Glc se estimuló tanto por
adición de DoI-P de higado como del análogo de insecto ( Figura 67 ) . En la Tabla 47,
FIGURA 67 : Transferencia de glucosa de UDP-Glc a aceptores lipidicos
UDP-Glc
.4
cpm¡IOJ
-—<
J 4 J 1 1 J4 1 J-lo 40 20 JO 4° JD
nanomoles LDol-P o'jhl ¿Dal-P
0
Se utilizaron condiciones estándar ( Métodos ) (°'—' ) hDoI-P.; (°-—°.)iDoI-P ( cada microlitro corresponde a 2 g de insecto vivo ) . Figura publicadaen Quesada y col. (135 ) .
pógina ¡22 , se mostraron los requerimientos para Ia incorporación. La omisión de Mg o Mn2+
y el añadido de EDTAno eliminó totalmente la incorporación de Glc o material liposoluble.
Esa incorporación se ha interpretado provísoriamente como una sintesis de esteroles-glucósidos
dado que la sustancia radioactiva cuya sintesis fue insensible a EDTAapareció como neutra
en columnas de intercambio iónico y no resultó degradado por el tratamiento ócido tipico para
romper poliprenil-azücares. El añadido de detergentes se hizo necesario cuando se agregaron
lipidos exógenos y se ve en la Figura 68 (ver página siguiente )que el óptimo para Tritdn
X-lOO se situó en 0,] % . Lo temperatura óptima para la transferencia fue de 25° C y
la actividad máxima se obtuvo con Tris-HCI a un pH de 7.4 ( Figura 69 ) .
FIGURAS 68 Y 69 : Influencia dd detergente ( 68 ) y la temperatura ( 69 ) en
4 la biosintesis del DoI-P-Glc
l l L L0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 xTRïro'H x-«oo
l l l I 1 J l 4..24 25 26 27 28 29 30 “C
(o -o ) y (A-A ), incubaciónen presenciade DoI-P . (0 "0) endógeno
En la Figura 70 se observa ( ver página siguiente ) la curva de concentración de proteina
enzimática. Esde hacer notar, sin embargo, que las incorporaciones a lipidos exógenos Fueron
o I t I 0'muy senslbles a las concentracrones relativas de detergente en Io mezcla de mcubacron por
lo que las curvas de este tipo tienen un valor limitado. El gráfico de incorporación de1
[ C] Glc a Dol-P-Glc, en función del tiempo llegó a una meseta en 10 min, lo que podria
sugerir una posible transferencia de Dol-P-Glc a otras Fracciones ( Figura 7] ) .
lb?
CPM FIGURA 70 : Efecto de la concenx109- tración de proteina enzimótica en la biosintesis de DoI-P
Glc
Incubaciones estándar conteniendohDol-P ( 15 nonomoles de fosfato )o iDol-P ( cantidad obtenida de0,3 g de insecto vivo). EnzimadeCeratitis .
l l l 1 l l l
0 0,5 1/0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
¡1118.ProteLqu
FIGURA 7l : lncorporación de [MC] Glc en Función del tiempo
(P1L
800l BO
600- /¿i’m hoo- /
¡aoo- ._________—————.zoor¡zoo r ' I) 4 1 3 min
¿ool O
| I L44__o 1 ¡o ó 8 ¡o ¿2, Jl! ,46 ¿a ¿o min.
Circulos : incorporación a lipido-Glc sensible a hidrólisis ácida suave . Trióngulos :inco poración a material ¡nsoluble en TCA caliente . B ): expansión de A ) en lazona de 0-3 minutos .
153
Propiedades
En la Figura 72 se aprecia el comportamiento del lip- [14 C] Glc en columnas
FIGURA 72 : Comportamiento cromatogrófico del Lip-Glc de insecto
¿Pm A w“. ‘F "1hDol-P-Glc2000 .. zoo 50 ‘W
- ’ c hDol-P.(,lc 2.——————- _ _ _- 1v r ¡
b- I q 2.0 a
490° fi. f 2° J f.. :1... .. - . - . ¡o g
o l .. f.O
a ¿s ao 1.5 .60 15 eo 'o ¿o A ¿o 25 .30 .n? ‘r-aCCLón 5 n! (ríuián
“fm url '1‘" . l fi"- - 3 c ."umsuh¿“6mAooo r- B 934},ng P ['ÍÉÉ’L‘--- .100 OL,-' '-. u tf; - mou Mato
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_:.‘3/ . :¿ïé¡3F asumimos ¿a: I500- .._ tx-----| «50
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Y. A ., .5 "¡A I Xxx A A .. A “A N ,A\¿__O l 1 l ‘|\‘v‘-.*i\"hlll'A ,
o 1 ¿r 6 t ¿o ¡z U4 IG u zo zz zu mu (Language “¿mm Himno; ¿ln/Hp “¡40:5
A ) B ) C ) Cromatografias en DEAE-Celulosa forma acetato. Ver texto y Métodos . B y Cfueron microcolumnas (0,6 x 4.0 cm ) . La concentración salina en ordenadas se refiere alos gradientes continuo (A ) o discontinuos ( B y C ) de elución . D ) Cromatografiade adsorción en ácido silicico ( Métodos ) . Las eluciones se efectuaron pasando lO vol decolumna de cado, solvente .
cromatogróficas de intercambio iónico/Met 99°/o(A ); 2:] ( B ) y l0:l0:3 ( C ) y en
cromatografía de adsorción ( D ) . En todos los casos el lipido Glc se comportó como el
hDol-P [3H] Glc obtenido con higado de mamífero.
EI análisis cromatogrófico en capa fina con diferentes solventes mostró también ( Figura
73, A )que el iDol-P-Glc obtenido con microsomasde insecto cromatografió como el Dol
P-Glc y se distinguió claramente del Ficoprenol-P-Glc. En electroforesis experimental en
154
presencia de detergentes se comprobó la mismasemejanza al Dol-P-Glc y separación de Fico
P-Glc (Figura 73, B).
73 : ' ' _ avalar-ln)“Comportamiento del LIP Glc _ m 00m“, + B
Glc.
¿PM (0|,D°l_ ¡mom
0 0 l A 1una“; “3 Mz Gli. a ¿Dol.l’.(sll—.sfl
. ¿Lip-["‘dGlc bM Mc{tooo - c l ,hDd-Rukm
0K:6€f1 l'LDOl-P-URJC)“: app.(¡kSM¿ooo p :5
. .0 . 3 .2- O
O S. .ELnnAA ¿AA-AMcen f ' ¿“Him1000!- . ¡y W “hp-GlcF¿¿R[CGlC gjlannnl-30 o 3.o ¿o Um
Á OD ro II I' ‘I‘l I. I I I‘ .I.
° o J i si. g z ; 2 ¿”MJ-z-L-¿twmmP l L 1 n L Ro 0.1 0.a oe. os LO F
A ’(.IOI"I.I)AJ'°‘r° en Si'lica gel "G' con el lolvanta X
de ln nl'lClO de dllivadcn do dolical (arriba ) en
¡II-Iulel') con Fic-P-Glc (alt-cio ) .
B ) Cramola-electraiaresis en lnmpón l con SDS 0,4 96 . Í'l papel (húmedo ) "tu.vo ligeramente inclinado l l0 ") hacia el ánodo ,- ¡e sembró sobre él ¡al ll'pidm- oxócau (l y g ) a Estas incuhqu previamente con SUS 0.4 °/.. en el Ïanpón ( a,c y d) o Ion“¡El!” de éstos ólliuon ( 'h y e J . Se reali15 la electralaretis entrevidrios silicomdai . Se mnluvo un campo de 42 Vall/cm .
La hidrólisis ócída suave del Iicali ido liberó Únicamente lucosa ue se identificó enI
diferentes solventes. El tratamiento alcalina suave (ver capitulo 3.3.2. ) no degradó el
glicolipida, que se hidralizó parcialmente cuando se elevó la temperatura. En este Último
caso se liberó una sustancia hidrosoluble que migró como
ve en la Figura 74 , A .
Glc de higado donde la glucosa estó unida como anómero -(b
l,ó-anh¡droglucosana, como se
Esta Última sustancia se obtuvo también en la hidrólisis del Dal-P
Camo era de esperar,
la hidrólisis del producto de tratamiento alcalina con 0.5 N H7 50,1 praduia glucosa libre
155
(Figura 74, B).
FIGURA 74Tratamiento alcalina del glucolïpído
cpm
0 -—ro “.50 firm-310
A) Cromatografía en papel con el Solvente EB) Se eluyó el pico radíoactívo de (A) y se tratóel material con 0.05 H SO por 2 hs a ¡00° C,se neutralízó y se crom togratíó en el mismo sístema. Figura publicada en Quesada y col. ( 135 ) .
El Iïpído-Glc resultó estable al tratamiento con fenol, a semeianza de Io que sucede con
otros polípren ¡loderívados -saturados ( 60,359 ) . En Ia Tabla 57 se aprecia que todos
LM: Tratamientocon fenol de] lïpído-glucosa de insecto
SUSTANCIA ANTES DEL TRATAM.o DESPUES DEL TRATAMIENTO
Fase acuosa Fase fenól ¡ca
C P M
Lïpidn manosílado do Iínsccto(cndógeno) 1.298 69 |_20¡
íDol-P-Glc 1.877 186 1.75AíDol-P-Man 2.1402 192 ¡.920
hDol-P-Glc 3.190 210 3.059thl-P-Glc(enz.de hígado) 3.000 15h 2.377
Fin-P-Gal (en7.de DEEJOÜOCIQL¿Ljinum) 2.h73 2.22] 370
So utilizó cl método de García y col.(359) (Ver Tabla 56,pág.lll9).Exceptocn los casos. indicados se emplearon enzimas de Ceratltls.
los derivados de dolicol resistieron el tratamiento mientras que el Ficapreml -P-Ga| ( alilico )
se hidrolizó en un 90 % .
3.3.4. Evidencias sobre formación de otros dolicol monosacóridos
Cuando se incubaron mícrosomosde Triatoma o de Ceratitis con UDP-, [MC] - Galacto
so se formó una sustancia que se comportó como polipreniI-fosfato-azücar ( Tabla 47, página
122 ) . Sometida a la hidrólisis ócida débil, se comprobó que la mayor parte de Ia radioac
tividad acuosolubie liberada del glicolipido se comportó como glucosa y sólo una pequeña
proporción ( 8-15 % ) co-cromatografió con lo galactosa. Debido a lo escaso de estas in
corporaciones no se continuó el estudio de este glicolipido, desconociéndose si su formación
es debida a una enzima especifica o a una inespecificidad de la enzima sintetizante de Dol
P-Glc .
LI'Eido P-P-GOINAC
Dada la presencia en glicoproteinas de insecto ( ver pp.4ó-47) de galactosamina
(acetilada o no ) y la presencia de UDP-GaINAc en hemolinfa de mariposa gigante ( 4|] )
se estudió la posible formación de Iipido-GalNAc .
Como se aprecia en la Figura 75 , cuando se incubaron extractos de larvas y/o de
pupas de Palendus dermestoides con UDP [MC] GaINAc se formó un glicolipido Ióbil con
|as propiedades de los poliprenoles azúcar que liberó GaINAc y GlcNAc por hidrólisis
ácido débil. Por cromatograin en capa delgada de Silica Gel se verificó la identidad de los
dos aminoazücares ( Figura 76 ) . También se comprobó la existencia de las dos acetilhexo
¡57
q vt“s _, i¡ l“
,1“, "1mm; www/M! lu;
o uuvi‘uwnm2° P. UDP-["CIGlcÜAL
GlcllnoI
,45- m (m i60‘ GIC ("A “¡HJ ' FIGURA 75 : Formaciónde un Iipido-GalNAc
0 l
M3 M2, (chll ' ‘| | L'amezcla de incubación contenro : Ïampón Ïrix-Moloolo pH 8.0,
Ü w w g t 25mM;M902 ¿mM;EDTA-Nu¡.5 mM;¡Del-P (a ¡00mmÁO __ , l‘ insecto ); hDol-P (50 nanomoles ),-Tritón X-lw l ‘36; ¡marcap
O.o‘ ‘ toetonol 15 mM;Enzimade Palendus ó mgproteína. Nucleótidosl o ¡ azúcar, 250.000 cpm volumen final 200 ul. Se incubó 30 mmo
. | 75° C , se hidrolizaron los respectivos lípidos polares y se cromto’r l gruliaron en papel con el solvente C ( ascendente ) . En la ligan;' l' se han superpuesto los perfiles. Se utilizaron estándares endógeno!I o | como control de la movilidad.
5 ’ II ll |
n : 'v\ 0- "
oE‘ oSiD W
tiraucn. Phaseolvsvut‘gfiLEN)
RESPuEsn02mm
:ÍlG‘
F JD rx Qf‘
u Gol Hac
(ch Nac Gir.
,J'(Jai Pica
.___ - ., _,- ____—‘l.r
FIGURA 76 : Cromatograin en capa fina del resto hidrosoluble del aparente lipido-GaINAé
Ensayo y procesamiento como en Figura 75 ( arriba ) . Después de la hidrólisis ácida suavese cromatografía la sustancia radioactiva hidrosoluble liberada del glicolipido obtenido a partir de UDP- C GalNAc en Silica Gel G con acetato de buti|o/2-propanol/pirídina/agua(40:31:14:15 ) . e hicieron corridas en ausencia (A) y presencia (B) de una "barrera" defitohemaglutinina de Phaseolus (que interacciona con GalNAc ) . Enambas casos la radioactividad se repartió entre la GalNAc y GlcNAc . _
158
saminas utilizando cromatografía en papel impregnado en borato, con el solvente A ( ver
Métodos y página 76 ) . Probablemente exista en los homogenatos de insecto una epímersa
que pasaria el UDP-GalNAc a UDP-GlcNAc en forma similar a la que se conoce en otros
organismos. ( Salvo que la epimerasa sea a nivel de Iipido-azúcar) . Resta saber,entonces,
si las transferasas involucradas son una o dos.
Lipido-ócído glucurónico
Se ha detectado la transferencia de ( l4C ) desde UDP- ( M C ) ócído glucurónico
a una sustancia lipidica lóbil al ócido. Sin embargo las incorporaciones son sumamente baias
por lo que no ha podido demostrarse la identidad de la sustancia radíomarcada que podria ser
lipido-P- ( 14C ) GlcUA. Un lipido similar se forma en Acetobacter leinum (Couso y
col., comunicación personal ) .
3.3.5. Dolicol monosacóridos en otros organismos
Al inicio del presente trabaio de Tesis sólo se conocian poliprenil derivados en mamife
ros, plantas y hongos. Cuando se detectó en Triatoma infestans la formación del Dolicol
P-P-GlcNAc y, poco después, otros poliprenil-monosacóridos, se quiso conocer si éstos
intermediarios se formaban en otros invertebrados. Se prepararon enzimas con diferentes
grados de purificación de diversos artrópodos y otros organismos. Como se aprecia en la
Tabla 58 en casi todos los organismos estudiados se detectó formación de poliprenil deriva
dos.
TABM_5_8 : Detección "in vitro“ u dv 'hidrólhi. ácida y cuyo biuuillln‘is m nililnul') pm [MI-P
CRUSTACLOS
— Porcel'ic so¡hicRo boina)
- Sino-¡lucha 1p( CanIl’ÍO do Sombarotrbón )
- Anemia wlinu
IOOI' IAC-ELADOS
- Íuqir-nu viiidis_..___.___.
nomas
- 31:2!2912'11'15'9212 "VT
- itgla'yng mara CR'( 161. )
- Elycn'nflm bla'vralrmnus
Lipido—monosacóridosde Artemía salina
Se estudiaron en detalle los glicolipidos de Artemia,
dv Ü, KL ' ’ ‘ ' mmilnln a
LI-pldfl- (;IL Lip - C-IxNA; Lil‘"M\ll|
sr No' sr
DUDOSO -
SI SI SI
SI TRAZAS
Sl Sl SI
SI - SI
159
llegandose a la conclusión de que
el lipido aceptar endógeno es similar al Dal-P de insecto. Este Último estimuló la biosintesis
de los glicolipidas de Artemia , cuando fue agregado exógenamente a la incubación ( Figura
77 ) . En la misma Figura se aprecia que Ia casi totalidad del UDP- ( 14 C ) Glc fue degrada
do mientras que el GDP- ( 14 C ) Man permaneció - aparentemente - como tal.
FIGURA77 :AuforodíogrofïadelocromofogrcfïoencapofinadelospolíprenH-monosacóri
dosdeArtemía*
¿iii
fNucleófído
azucardador
2237v
UDP-(MOGIC
C
-GDP-(I4C)Man -¡dem —-ídem
'-—UDP-(MC)Glc
¡dem
‘TORIGEN
Lo;quistesdeArtemiosalinasecuhivaronenscïuciór.salinaduranle5hs(ver413190”)tras¡ocuaÍsehorno’geneizoronen:Sacarzïsa190mM;glicerol|9m;Z-mercapfoevanol1,5mM;EDTA-No¡,5mM;NaCl 4mM;KCI|5mM;MgClz4mM;TumpónTrís-HCIpH7.50.]MyB.H.T.(6-7cristales)comoonliarïdonle.Sep.‘eparéunafracciónricaenmíuc.omasresuapendídaenelmismoTampón(VerMétodos) .Se¡neubcron360.0mcpmdeCDP-Ii"C1Man(óNo.000deUDPIHC]Glc)enpresenciayausenciadeDel-P.L3 nezclcdeincubacióncontenía:MnCI22mM;¡“‘ng1ómM;Trïs-MalemopH7.175mM;EDTA-Na0.7ITM,-Z-mercoptoefonol150mM;TrïróqX400.0996 .Seincubó30mma25°C ,seoíslofunloslïpí daspolares(Métodos) ysecramofogrcfícmnenpintasdeSl'licaGelGconelsolven?eX ,conlossíguíemesestérdares:l.UDP-Ok:‘2.GIc-l-F3.Rufino“:4.Trehclcsc5.Glcó.DOFP-Man7.DoI-P-Glc8. -Silosierol9.Dglïcolf =frentedeisoi-vente.Seaqtorcdïografïólaplacadurante15dïasyÍ‘chose¡valorenlo;eflándaresconAnímldeisíJc/SOAHZ. a)LoÍ-Pdehígado,40nonomalesenfash'o;b)MétododeFolch(página66) ;c)nceptoresemïgmes
DCI-I"J
Fasedeg:
exógeno
partición sembrado
—ACUOSA _ídem -° ORGANICA +ídem
ídem
+ídem
(VertambiénFíg.¡03,pógína195)
160
«una.DELDETECTOR(gsm)
Rasruís'm
lól
En Ia Figura 78 , A y B se muestran las cromatografias en papel de los azúcares liberados
Figura 73: Crumnloqrulín du rrnduclns dr Fifllúli8:\ Jr—" "-V-nn- de ¡mliprvuil-nnicnucu dl‘ Arl_c_1_ni¿\_.[_ur¿|llv_:a_y
Neuroupurn.
Prvparnción de
c Huele r.
A mp am» [1 Ea «IDM1 Call.
l L l l l l I I l A l l l l l I
B w Gli M) “Mi.
/ /\,//l V'“HAHN¿/’N\v_av.JÍ/ 'vJfi/\/\\\\Jfl#Nyh/«JJV/«\P
J, l l l l AJ 41 41 l 1 l A . l A
c w (HDGlc
l l l l l I l l l A n A A L l l
O 0.25 0.50 015 4.00 Ro“; o 0.1 0-2, 03 04o 0-5 0-6 0-1 08 0-9 4-0 Rem“,
. (élula'. ¡lr l'IIr¡lr‘n.¡ turn-H1scqún cl |II¡:(0dl)I-\T:>rl_.('l|gi|y Hilru':'(h.‘0).ll micrNpur2¿ngri se molió con arenacuhncioncs estándar
‘clpcrimcnlos con ¡nscclu>.Lo=similares o
unlimns de Artemia camo las de insecto.rolas nor descompresién
lio ¡.‘l‘lavada.Se utilizaron inlas empleadas para ¡osglicniipidas bio>inlrtih
os se procesaron,hidro|iznron y sc cromatografió elresto hidrofilico en papel con cl
principal de Figura 78, A ) y además, aparentes oligosacóridos ( Ver capitulo
solvente B
del glucolipido y manolipido por hidrólisis ácida suave. El glucolipído liberó glucosa y una
sustancia que permaneció en el origen ( Figura 78, B ) . El manolipido liberó manosa ( pico
3.7 ).
El Glc NAc-Iipi do, por su escasez, no pudo analizarse debidamente.
Entre otros, se obtuvo la biosintesis de Dolicol-P-Glc en un protista fotosíntéfico unice
Iular flagelado, Euglena virídís , ( Figura 78, C ). Poco después Keenan y col. ( 55,I33 )
obtuvo lo mismoen otro protozoario, Tetrahxmena pyriformis .
Parodi ( datos no publicados ) encontró biosinfesis de dolicol glucosa y de poliprenol
162
olígosacórido en lombriz de tierra.
En base a los datos propios y de otros autores se concluyó que Ia bíosïntesís de dolícol
azúcares era un fenómeno general para todos los invertebrados. A los efectos de comparar
propiedades de la parte Iipïdica se obtuvo también la formación de aparentes Dolícol-P-P
GIcNAc, DoIPMany DolPGIc en el ascomycete Neuro ra M ( Figura 78, D - F )
y en el hon go primitivo phzcomzces blakesleanus .
163
3.4. BIOSINTESISEl; DOLICOL-OLIGOSACARIDOS CONTENIENDO MANOSA
Se incubó GDP- ( 14 C )Man con una enzima rica en microsomasde Ceratifís en las
condiciones habituales para la bíosinfesis de DoI-P-Man. El material lipofflico rodiomarcado
14con C se cromotografió en una columna de intercambio iónico de DEAE-celulosa, equi
librado con cloroformo/metonol ( 2:] ) . En la Figura 79 se aprecia que no se eluyó radio
F¡Qura 79: (Publicada en Quesada y Belocopitow,(203))
(P .3 r l I a l I ¡ l —-—,x10 __ _ _
(LOROFORHO/HETAHOL í Faunia-ro De Anonío ¿H EL SOLVEHTE DH lr'ou (Soul J)
,- 4 1 1 1 0 mn 5 nn ‘Á 30 mn x ¿100.-1Hl ‘ ';‘ r 1‘ F ‘: 7‘ 7 Ñ. .2
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actividad con el poso de cloroformo/mefonol ( 2:| ) ( 100 mi ) y de los mismos solventes
en proporción 1:] (50 ml ) .
El solvente de Leloír ( J ) , cloroformo/mefanoI/oguo ( 10:10:3 ) ( 100 mI )
tampoco eluyó sustancias radiomarcadas. La mayor parte de éstas ( 93 % ) eluyeron ¡unto
con un estándar interno de Dol-P - ( 3 H ) Glc, cuando se pasó acetato de amonio 5 mM
en cloroformo/metanoI/agua ( lO:lO:3 ). Sustancias mósaniónicas ( 5% de la radioactivi
'dad ) eluyeron a una concentración de 30 mM de la sal, en Forma similar a como se comportan
los políprenol pirotostato derivados (143,145 ) . Se sometieron a hidrólisis ócida débil las
fracciones de Ia columna que eluyeron con 5 y 30 mM de tormiato de amonio y las sustancias
hidrofilicas liberadas se cromatogratiaron en papel con el solvente A . Como era de espe
rar el producto de hidrólisis de Ia sustancia menos aniónica comigró con la manosa ( RF =
0.30 ) indicando que se trataba dol dolicoI-tostato-manosa descripto en el capitulo ante
rior ( 3.3.l . ) . La(s) sustancia(s) hidrotilicas originadas en los manolipídos móscargados
se comportaron como oligosacórido(s) dado que permanecieron cerca del origen en el mismo
sistema cromatogrótico.
3.4. l . Estimulación de la sintesis p_o_rextractos de Ceratitís capitata
Se prepararon proteinas microsomales de larvas de ó dias y de pupas en Ia etapa de "oios
pigrnentados " ( ver Métodos ). Se incubaron cantidades equivalentes de cada preparación
con GDP- ( ¡4C ) Man para obtener Ia manosilación de los aceptores endógenos. Como se
aprecia en la Figura 80 la hidrólisis ócida débil de material soluble en solventes orgánicos
originó varias sustancias radioactivas que migraron como oligosacóridos en cromatografía en
papel. Las enzimas larvales ( Figura 80, B ) incorporaron mayor cantidad de ( 14 C ) que
los adultos tarados ( Figura a), A ) . Muchas de las preparaciones enzimóticas obtenidas
de estos últimos fueron Frecuentemente capaces de sintetizar cantidades detectables de
FIGURASïFormación dc lipído-ol ígosmjridos manosilndos de Ceratít is
. Y , ‘ , ,‘.,.(“wav (.6 r” ..,' r . .2 k _ ManA Hit t -—
1l.
¡flv J. mv ¡unvc ora-D u 01’) meu.02a» -n una; o.r-«mo ¡:.-_-):.--—u:-’ - y 'Jea- con Uma. l «cuan-«a¿ts“¡oA .u... .....u II..... un 'a 'v‘h- -.. ,.-' ' ' ‘ -.. c w o n. u - q c“L. 1' ‘l i f i «l l °_C“Uf_°.__°°°¡_' . ' _ u'.‘--c0v no aoC _H I.'(‘¡I.J'J ova =—»._ i." a muvny un:
E ¡11-1 aca 'I (-flnw-uü mv“) a» :\ r tu .-u- nu ooun -0:¡.ocu.n c»- uvao -‘uLCU".-- 60-Augu... u—:.-— ¡.-— --—r 14's,c P.. ——q(.'. 'J'J'- LNGMn r. -, 1; ¡. u ¡9- 7.-- un)G) :u-umevuo ¿n o-cn3 u --R\\.G— un: umvuvU C.'u_Ja--:\--vv eau!--NF, r, yv:-v Gano-‘r --lcuC-Lh 0 UH¡_ '¡OWMNONQAW LD 'o x: unico 101: U oo>.:>o c-I'V 9'30"-' \. (¡LLLOU'U nuouU 1',»- muouLA-a ecuoo tEm-or. La: ¿y _.¿_ cn: «cagao ->ao0 VTUWOÜQ') U'-U O-v.n-r 6.00€" 'M'- 000-U m0.. kCuA'-- mnc>Lurfi uco-t- v a- °_m.. gún..- 5-1100 a .nvoufi -co un o
'o —o tivo 0-61 1-1.Isob - —'4! -- O: vao Nvum—oo.0.=— ‘DOAIIy °.__.;...o .-\,N> ¿conan-um ---o --\ UG0- QEGL-H mua ocn"‘- '21: 0.o: -F.u veu:O —onnc-:.vL-v u-o_ U g ._ es. ocao o: r, .—cg|-(:—I 1:—-vlvl- v- oooonuu: — v
mvuc ua>uo 0031-1; --c -:vn \. 'JE -G'('N67U *——Who'¡n ,,\ _ utsnruoco U -G--a, J Jlu—17—HO omhnrx-r-uu-.—u>: cua}D ouL.:(:I\'U>-O ¡UV-¿0.Q_ w‘n_v.-0ufi>um0.)o:
de Iipido-oligosacóridos radiomarcados (ver también ciclo de vida , página 202 ) .
Se suplementaron incubaciones conteniendo enzimas Iarvales con una fracción Iipidica
polar extraido de Ceratitis ( ver Material y Métodos ) . La mezcla de incubación estándar
contenia el material lípidico correspondiente a 2 g de insectos vivos. La incorporación de
i:14C] Manosa en los oligosacóridos unidos a Iipido aumentó 10 veces ( Figura 80,C ) . Para
descartar la posibilidad de que el extracto Iipidico estuviera eierciendo un efecto de detergente
se Io sustituyó - en experimentos paralelos - por diferentes concentraciones de cordialipina
lóó
( como "detergente" natural )Tritón X-IOO, o Nonidet P-40, o deoxicolato de sodio. En
ningún caso Ia estimulación fue mayor de una vez y media sobre los valores basales.
Para comprobar Ia especificidad del sistema transferente se preparó a partir de higado de
cerdo una fracción de lipidos aceptores de glicosilos ( ver Métodos ). El agregado de Iipido
heterólogo estimuló en forma similar la biosfntesis de lipidos-oligosaoóridos. La radiolectura
del cromatograma reveló diferencias cualitativas ( Figura a), D ) en el perfil de distribución
de la radioactividad: el aceptor de insecto favoreció la formación de los aparentes lipidos
"trisacórido" y "tetrasacórido" mientras que el aceptor de higado estimuló en mayor medida
los aparentes lipidos-"pen tasacórido" a "heptasacórido".
Propiedades del aceptor lipidico de insecto
Para excluir la posibilidad de que el estimulador de la sintesis de Iipido-oligosacóridos
sea el DoI-P descripto previamente ( capitulo 3.1.2. ) se llevaron a cabo experimentos de
control en que este Último lipido purificado se adicionó o no al estimulador.
Cuando a la incubación tipica, en que sólo se hallaban presentes los aceptores endógenos,
se le añadieron 3 ó nanomoles (en fosfato ) de doliquil fosfato la incorporación de
14C al Dol-P-Man. Se estimuló 12 veces, mientras que a los lipido-oligosacóridos se
inhibió levemente ( Figura 8], A ) .
Probablemente este Últimoefecto se debió a la competición entre enzimas por el GDP
Man. Cuando el Doliquil-P se adicionó a Ia mezcla de incubación suplementada con aceptar
de insecto ( Figura 8] , B ) se produio una notoria inhibición de la biosintesis de Iipido-oli
gosacóridos. Aqui también se tratarïa de un fenómeno de competencia por el GDF-Man.
En la Figura Bi , C se aprecia que el tratamiento del aceptar Iipidico con HCl 0,] M por
167
FIGURA 8| : Efecto de lo adición de lioidm e-‘oenm
¿ooo A T I Ig IB l I l l I ' I I —: ¿,0 (¡6095.2 c, c. 9,. 63 Gchun, G 6 o G Gitfla E: m'uú’Hiï ¿"’H’muu ¿”uh‘n’uÜ z_ :1 o: —1lI
a“ o"-.3
:15I
lllJlll
llllllll l
Ao í ¡i
:5 Z 5. _.._ _: 12.2“ _‘____ -.__..- - - - ;_ _'_. _1L l Jo 4o 20 bo m o AO .20 30 Cm O 40 20 50 Cm
Mezcla y "¡todos estándar salvo en la concentración da Tritón X-IOOquo ¡ue de I,5 96 , ylol odlcionu de lípidos. Cromtogrofïos en papal, solvente B . Se cuento la rodiooctividadan contclloador, cortado on 0| cromatograma bandos transversnlu de 0,5 cm . A ) Las incubociorm n suplomonron (. . . . ) o no ( ) con 30 nonomoles de hDol-P .l ) Igual qm A pero cada tubo contiene el lípido aceptar obtenido de 2 g de ¡mecto ( página
. C ) igual o A y B pero al aceoror de insecto fue calemodo o 99 °C durante 70 minon O.| M HCI, lavado por el método oe Folch y las ¡om orgánicas añadidas o lo mazda doIncuboción . Figura pmlicodo en ( 203 ) .
20 min a 98° C, destruyó su capacidad estimuladora. Es de hacer notar que este tratamiento
no destruyó al DoliquiI-P.
EI aceptor Iipïdíco de insecto se comportó como un sustrato para Ia enzima transferente,
como se aprecia en la Figura 82, donde cantidades crecientes de aceptor ocasionaron suce
sivos incrementos en Ia cantidad de Il'pido-oligosacóridos biosintetizados. En la Figura 82
se ve que también se estimuló la formación del DoI-P-Man debido quizás a la liberación al
medio del dolicol fosfato unido a azúcares. Ello puede ser debido a hídro lasas que hemos
comprobado se hallan presentes en las preparaciones de extractos microsomales de mosca
( datos no presentados ) .
168
FIGURA82: Efecto de la adiciónÏ l l del aceptor iipídico de insecto.
Se obtuvo l mi de solución que conteníalos aceptores de insecto,partiendo de16 g.de Ceratitis(pupas),vivas.Las cantidades de_acepÏ37-índicadas se llevaron aseco bajo N y se las resuspendió en .Tris-HCI 82mM,pH7,ü;MgCl 8.2mM;Trit6nX-lOO 3,3%;2-mercaptoetanol 80mMy GDP(th)
-Man 6.6 uM (90.000 cpm).Voiumen final60 ui .Se íncubó 20 min a 25°C.Despuésde la extracción de los lípidos ,se separaron ios manosil-derivados en columnade DEAE-ceiulosa .Fígura publicada en(203).
“3
cpmx/iO
(__.._._ ..l__.__.__r. l _ 7 7-1't; lili HI WK)
LfP-oo nunca oe ¡macro (/ui)
Teniendo en cuenta el comportamiento del lípido estimulador de insecto en diferentes
sistemas cromatogróficos, sus propiedades en cromatografía de DEAE-celulosa, Ia analogía
con los sistemas de mamíferos y los precedentes resultados, se puede asumir que se trata de un
polipreniI-pirofosfato derivado, conteniendo oligosacóridosde diferentes tamaños.
3.4.2. Estudio d_e_|oligosacórido unido c_1_|lípido: Dolicol trisacórido
Laspropiedades del lípido-oligosacórido intacto se han descripto en las secciones prece
dentes. Su sensibilidad a la hidrólisis ócida débil es ligeramente menor que la del DoI-P
Manosa y del Dol-P-Glc de insecto ( Figura 83 ) . Behrens y col. ( 104 ) han descripto
también una velocidad de hidrólisis menor para el Dol-P-P-GICNAC.
169
FIGURA 83 : Susceptibilidad al ócido delos lipo-oligosacóridos
El Dol-P-Man y los lipo-oligosacóridos sesepararon en columnas de DEAE-celulosa. EIDol-P-Glc se preparó con enzima de higadode rata. Las muestras en duplicado con aproximadamente 5000 cpm por tubo se secaronbaío N2 y se hidrolizaron (2.13.1. a ,página 69 ) . El grafico indica el porcentaiede radioactividad remanente en las fases orgánicas después de la hidrólisis. ( Figura publicada en Quesada y Belocopitow, ( 203 ) ) .
anuioacriv-woEun“Ploom'o!
Del comportamiento de los hidrolizados del lipido oligosacórido(s) en cromatograin en
papel se infirió que la sustancia que migró entre maltosa y maltotriosa ( Figura 80 y 8] )
podia ser un trisacórido.
En cromatografia de filtración molecular ( Biogel P-2 ), el olígosacórido radiomarcado
se comportó como un pico simétrico que migró entre la rafinosa y la estaquiosa ( Figura 84A).
Estimando el Peso Molecular en base a los patrones usados, se obtuvo ( Figura 84, B ) un
valor de 650, próximo al de un tetrasacórido. Sin embargo, es frecuente que la presencia de
una acetil hexosamina haga decrecer el volumen de elución en este tipo de filtración mole
cular. Es lo que sucede para Ia GlcNAc ( Figura 84, B ) y con la di-Nl-N-acetilquitobiosa
( ¡57 ) .
El putativo trisacórido se comportó como una sustancia neutra cuando fue electroforetizado
en papel, tanto con tampones ácidos como alcalinos. Se lo reduío con borohidruro de sodio
para evitar el ataque del ólcali por el extremo reductor y se lo trató con KOH ( ver Métodos ).
'ÏlllTlfÏllllllllll- l‘ | lalaq eno
A Estoqulflq “llum. Mal Ingo (-l! NA! l
lo
lDnva nu»
PJ
cn
l l
/"C .ol
hl l
‘.OI'Padioacllvïdci(rpm)
2 l- “ FIGURA 84 : Filtroción mlocular del trlmcórido' unido o lipido en Biopl P-2
le 20 u 28 32 I 36 ¿o 44 ¿8 El trlsooórldo rodionnrcodo fue eluido de crornoroVol Qlurion 'l
lm l groul como los de lo Figura BI. So concentraronlos oluotm y ¡o los pasó por una columna de Biogol P-2 equilibrodo con agua. L0!el omo: rodiooctlvoi volvierono ¡or comentados, "lolodol cononándon: y parados por lo -.n'\.nocolumna
. l n l - lll 'l equilibrado y oluida cor. Tompón losloto 5 mM| . ll (pH 7.0). LasÍroccionei de C,5 ml \O.l ml/
_‘ mln ) ¡o ovopororon on Dlnncl’lelos de vidrio v contaron, después de lo cuol so tomaron en oguo pandotorrnímr lo posición de los ostónúros ( verMétodo! ) .A ) Perfil de olución del trimcórido rodiomarcadoB ) la "ocho indico ol peso mlecuolr ooorente del
U 7 3 4 5 6 7 39 trimórido. Figuro publicado en (203 ) .
0 2' PNA) HoLuuLAR.
Sometido a lo electroforesis la radioactivídad se repartió en dos sustancias cargadas positiva
mente (Figura 85, A).
En lo Figura 85, B se ve que el pico de menor migración apareció primero y gradulamen
te fue desapareciendo a medida que aumentó lo radioactividad en el pico más rápido. Este
resultado puede atribuirse a la de-N-acetilación de dos grupos N-acetilhexosamino
( ¡88 ).
14C se lo trató previamente con. Por otra parte al oligosacórido rodiomarcado con
N<JB[3Hj para radiomarcar el extremo reductor y se lo hidrolizó totalmente en ácido, cro
matografiando el hidrolizado en papel. El azúcar marcado con 14C que se obtuvo migró
171
g; A Mm cut.23“ “m” “UD3 ¿g S
ea a 5 FIGURA ü : Tratamientoolcollno dal oligoiafi
, É l l n l l n 1 A l L . .
o 4 2 3 q 5 6 7 8 m chido unidoa 'Il'prdo
‘00 I I r l l l fi' ' Í .
OO B /A_ Despuésde reducidascon borohidruro( 15Ing/ml- , - l hora/2P C) las muestroi ¡e pasaron por unaBO _ mícrocohunna de Donar-50. El ácido bórico so
eliminó por repetidos adiciones de neronol y eva; '10 by}, — porocíón en vacio. El mterial reducido ¡ue trovaÉ. do con KOH 2 M a ¡(13°C durante Im tienpostg 60 (Í; " indicados, neutralizado con ácido pcrclórico y loE 50 _ _ nation o electroforesis en papal con Tamoónll _«¡.3 (¿cido ) . El como electrico promedio fue dag 1.0 P -' o¿y _ A )Perfi| de la distribución de radiooctividad
u) — B ) los olectrotoretogromas correspondiente) a losy” _ tiempos do tratamiento indicados se cortaron en
Nor,er bardo: de l cm y se contó lo radioocrivídad "picoV) - - lento" se refiero ol que migró atrás de lo GlcN yU l l l J l J fill? q "rhido' , adelante.
(J ¡C ’10 1) ¡.0 {,0 60 ¡,0 Floora parcialmente publicada en Quevedo y leiamin) cqntow (203).
como manosa en los solventes A, B y D mientras que el azúcar trítiado co-cromatografíó
con glucosamínitol. Este resultado indica que la N-acetílglucosamina se halla situada en el
extremo rechtor del olígosacórido.
De los datos precedentes se desprende que la sustancia analizada debe ser el trísacórido
( Glc NAc )2 - Man , llamado X3 en el sistema de higado de mamiTero ( 167) y biosin
tetizado también por otros teíidos de eucariotes ( 14, 40, 42, 43 ) .
3.4.3. LosdolicoI-oligosacóridos de mayor tamaño
Las incorporaciones de [MC] Manosa a los oligosacórídos unidos a Iipído, aparentemente
mayores que el trisacórido descripto, fueron baías. Por ello fue dificultoso el análisis de los
172
azúcares componentes. Enel caso del aparente Iipido-tetrasacórido se obtuvieron evidencias,
mediante el tratamiento alcalino del oligosacórido reducido y posterior electroforesis ( idérl
tico al de la Figura 85 ) de que también contiene un par de acetilhexosaminas. Habria
ademós dos manosas. Todo indicarl'a que para los oligosacóridos mayores sucede lo mismo,
por lo que podria estarse en presencia de una Familia de lipidos oligosacóridos que se fueran
sintetizando a partir del miembro de menor tamaño por adición de sucesivas manosas.
Asumiendo este hipótesis, si se toma el trisacórido como "cabeza" de la serie de oligosg
córídos de insecto, estos tendrian entre 3 y 9 unidades monosacaridicas, por criterio de cro
matografia en papel en diferentes solventes. Coma se aprecia en la Figura 86, la presunta
FIGURA 86 : Movilidad relativa de los oligosacóridos de insecto unidos a dolicol
Rx A Rx B4.o
1.0 ¿o o\OL/GOSACAR/Dos DE .aï °xo K \_ \° o ¡NSEC ïO '3- 0\ K
7 - \o\ h o\ .\I .6. oxo..5 - \°\ '5‘ \°\\?
. 2\o ,4, O\..\o . 0\
03 - \ 3. ¡ l . i. a q 4o
°\° . A á ¿.5 ¿i g C 1;
.2. \ É9A)Cromatografíaenpapel,solvente B, 3 dias
B ) ídem, solvente H
5 6 789101112anule or. unimots ¡Acáaioims
123H
"familia" de oligosacóridos se comportó como los maltooligosacóridos alineóndose ambos en
una recta, en cromatografía con el solvente B, o en una linea de idéntica curvatura, con el
solvente H.
La porción oligosacórida del presunto lipido-tetrasacórido co-cromatografió con el molto
tetrasacórido en papel y eluyó inmediatamente antes de la estaquiosa en Biogel-P4 ( no se
muestran los datos ) . Por conveniencia se Io calificó de "tetrasacórido" pero ello no im
plica un conocimiento acabado de Ia molécula.
En los experimentos de estimulación con añadido de lipido de insecto los incrementos
porcentuales decrecieron a medida que aumentó el tamaño aparente del oligosacórido ( Figura
87 ) sugiriendo una relación precursor - producto entre los mismos. En el caso del presunto
FIGURA 87 : Estimulación, con respecto al material endógeno, de los lipo-oligosacóridos deinsecto según el tamaño aparente del oligosacórido
96 de biimulndo'n,
Ü + acervo». Losrestos oligosacaridicos del lipo-oli. +MEPTOR+UDP-Glenn _gosacórido se co-cromatografiaron con
malto-oligosacóridos y se les otorgó eltamaño aparente ( salvo el trisacórido,que se demostró ) . No se detectó estimulación en ninguna sustancia que cromatografiara como pentasacórido .
6 I 8 - ? - 9_ . - Aramno APARear: ocn. OLIOOSACA¡uno (cuan: mm sou. 5)
lipido-hexasacór‘ldo podria tratarse de una mezcla de dos sustancias, ya que tanto el aceptor
como el UDPGIcNAc estimularon Ia incorporación de marca. Como, además, no se detecta
l h Ü O I l O .4generalmente el aparente pentasacarldo podria suponerse la exustencra de una ramificaCIon que
hiciera variar la movilidad cromatogrcïfica y, entonces, la sustancia que apareció como
174
. . . .."hexawcórido" seria una mezcla de dosdiferentes ( el "pentasacóndo" y el "hexasacóndo ).
3.4 ,4. Caracteristicas de la transferencia d_emonosas
I'l'ln la Figura 88, A se ve la incorporación de radioactividad a los diferentes lipido
FIGURA 88 : Incorporación de rodioactividad a
doliquiI-oligosacóridos
Incubacíón estándar con l % de Tritón X-lOO y elIipido aceptor que correspondia a 4 g de insectovivo. Se tomaron 2 alicuotas iguales de la incubación . Una de ellas se hidrolizó y se separaron losoligosacóridos en cromatografia en appel ( Métododestructivo ) . La otra alicuota se crornatografió enDEAE-celulosa con el solvente J y se separaron loslípo-oligosacóridos del DoI-P-Man ( Método conservativo ) . A ) radioactividad incorporadaB ) distribución porcentual de cada compuesto marcado en función del tiempoFigura publicada en Quesada y Belocopitow ( 203 )
Rdioutavda¡(en¡r40'".
17- ,m l l l l l J l lw 't ".) l') '}U L”) JU J‘.) 1.0
Tiínvo (mín)
¡)u|-I'-\|;m tu. (ÍCNiI'lIuHO.I. nn: llcslrucluo‘:LiPioa-otiooudm'oo: (u. ¡lcsliucluo o. Im (Icsbutivo
¡Vl- living-"HVMLMA'Aiu- (Ai Lirios-"Iniuu'aipo".
oligosacóridos en función del tiempo. El DolicoI-P-Manosa y el lipido trisacórido llegaron a
una meseta a los 5 min de incubación mientras que aumentó el 14C en el aparente lipido
tetrasacórido hasta los 20 min.
El lípido-tetrasacórido acumuló Ia mitad del 14C incorporado a glicofosfolipidos, en
las condiciones del ensayo. Encambio, el Dol-P- Man y el Iipido trísacórído decrecieron
175
simultáneamente en función del tiempo ( Figura 88, B ) . Estosdatos sugieren que la segun
da manosa, en el presunto tetrasacórido, posiblemente entre via DoI-P-Man.
Caracteristicas generales
14. Preincubando Ia preparación microsomal por 1-5 min antes del agregado de GDP-( C )
Man la incorporación a DoI-P-Man y a Iipido-oligosacórido decrec ió en forma similar
( Tabla 59 ) . Esto refleiaria una similitud en las manosiltransferasas en cuanto a los
ÏABLA 59 : Sensibilidad o Íac'orcs presench en la incubacn'on
Ego de Breincubación Lipido-oligosacóridos LiEido-Moncpm 96 cpm T.)
O min 34.235 ¡oo 33.|07 iOO
l mln 25.876 76 20.48! 6|
5 min 25.9l5 76 ¡7.458 SJ
Después de incubar Ia enzima microsomal ( 0,] g ) con la mezclade incubación por ios tiempos indicados, se incorporó el GDP-( 14C )Mon ( 105 cpm ) . Condiciones idénticas a Figura 88 .
factores del medio (proteasas, fluidez de membrana, agotamiento de los sustratos
endógenos, etc. ) .
. El pH óptimo para la incorporación a los lipo-oligosacóridos Fue el 6,8 cuando se
empleó un tampón de Tris-Maleato mientras que empleando Tris HCI la incorporación fue
menos eficiente y el óptimo se situó en 7.4 ( Figura 89 ). Esta discrepancia puede
atribuirse a que se están promediando datos de varias manosil transferasas.
l7ó
Curva(le[JHel
5..
n O94» . \
x / 0E3 nus-mmm . \ V iRIS-Hcl¡12- / u’ ""- ..0 ,O y.‘.‘.VV
_ O1O 4 1 1 l L 1 n l n n l l l l l LA52 6.0 7.o 8.0 pl'l
. La temperatura óptima para la incorporación fue de 25° C ( Figura 90 ).
FIGURA 90 : Curva de temperatura óptima
OxO’ O/ \o o(o)
I
N vcpml103
I J l l22 23 24 25 26 27 28 29°
. La formación endógeno de lipo-oligosacórídos se inhibió ligeramente por la adición de
detergentes, como ocurre en la sintesis del DoI-P-Man de insecto y en muchos otros
sistemas similares. Sin embargo, cuando se agregó el lipido oceptor de insecto ( u otro
lipido ) a la mezcla de incubación, se precisó asimismoalgún detergente. Tanto el
Nonidet P-4O como el estructuralmente similar Tritón X-lOO resultaron adecuados para
la estimulación de la formación de lipo-oligosacóridos. En la Figura 9] se grafican las
curvas de formación de éstos Últimos respecto a Ia concentración de Tritón X-IOO. Se
observan muybuenas incorporaciones a altas concentraciones de detergente. Cuando la
concentración del detergente llegó a 4.8 % final en la mezcla de incubación, el
83 % de la radioactividad incorporada a la fase inferior estuvo constituida por lipo
oligosacóridos ( Figura 9|, B ) .
FIGURA 9| : Efecto de le concentración de detergente en la bimimelil de doliquil
ollgosecóridoa
t-J-Qadíoaclividai(crm)
xCll
\\3e,
¿é 60 — ‘E _81.0 — ‘8 — _JE. 20
o l l l lo 1 2 3 4
Triton (WO)
Condiciann del emayo y limboloecom Figura 83 (página ¡74 ) . ( Se incubaron 20 míno 25 ' C) . A ) Radioactivicod incaporodo B ) Distribucíén porcentual de lorodlomrca en codo anuencia. Figure pub|icoda en Quemadoy Belocopí’w ( 203 ) .
Se aprecia que, en las condiciones para biosïntesis de lipo-oligosacóridos como las de la
Figura 9], la máxima formación de DoI-P-Man se obtuvo con 1,5 % de Tritón X-IOO.
Encondiciones más favorables para la sintesis de este último la concentración óptima de
¡78
Tritónera de 0.2 - 0.7 % (Figura 56 enla página 137) .
Ello se debe a la presencia, en la mezcla de incubación, del lipido estimulador de Ia
biosïntesis de lipo-oligosacóridos, que asocia parte del detergente, con lo que lo concen
tración real de éste se hace menor.
Para experimentos como los descriptos en el presente párrafo se utilizó también un método
no destructivo para la separación de los derivados mono y difosforilados de dolicol. Este
método consistió en separarlos por intercambio iónico con DEAE-celulosa ( ver Métodos ) .
Como se aprecia en las Figuras 88 y 91 , se obtuvieron resultados similares a los propor
cionados por el método destructivo ( en que se analizaron los productos de hidrólisis
ácida ) . (El método fué puesto a punto por E.Be|ocopitow)
La formación de los lipo-oligosacóridos se estimuló en presencia de iones Mn2+ mientras
2++ . , 2+que el Mg2 estimulo poco y el Ca o Co no parecen tener efecto, en las con
El EDTA en concentración de 20 mM inhibió la biosintesis de losdiciones dosadas.
glicolipidos pero a concentraciones menores estimulo la sintesis ciertos miembrosde
la familia de oligosacóridos. Un efecto similar fue descripto en células plasmáticas
tumorales de ratas por Baynes y col. ( óó ) . La espermina ( 20 mM ) y la putrescina
. . . +( 15 mM ) sustituyeron el efecto de magnesuo aunque no estimularon tanto como el Mn2 .
179
3.4.5. Origen d_e¡gs residuos d_emanosa incorporados g_|0_sli o-oligosacóridos
Teniendo en cuenta que las preparaciones de Ceratitis ricas en microsomasson capaces
de transferir glucosa al doliquil fosfato endógeno a partir de UDP-Glc ( ver 3.3.3. ), se
añadió este nucl eótido azúcar como competidor del GDP( 14C )Man en incubac iones tipicas
para lo sintesis de lipo-oiigosacóridos.
Se hicieron adiciones simuitóneas o previas (5 min ) de 1 mM de UDP-Glc y a los
10 min se obtuvo una inhibición del 50 % y 30 % respectivamente en Ia biosintesis de
DoliquiI-P-Man mientras que la del Iipido-trisacórido no se alteró ( Figura 92 ) . Este
FIGURA 92
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2.5 i Doi-P-Hon.2-0 '
45 'Ó
¡LOP /O
0,5
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Efecto de la disminución de DoI-P-Man ocasionado por la competencia delUDP-Glc por el DoI-P mientras que el Iipido-oligosacórido no varia
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resultado indica que el DoI-P no parece ser un sustrato necesario para Ia biosintesis del
DoI-P-P-(Glc NAc )z-Man, como se aprecia también en los casos en que se agrega Doliquil
P a Ia mezcla de incubación ( Figura 81, pógina 167) .
En la Figura 88, pógina 174, se observó que la incorporación de manosa al Ii'pido
(GIcNac) -Man no tuvo un tiem o de latencia, su ¡riendo ue la transferencia a artir del2 p 9 q P
GDP-Man fue directa. A pesar de ello, no puede descartarse una transferencia de manosas
via DoliquiI-P-Man por lo que se hicieron experimentos en que se testeó este glicoll'pido
-( 14C ) como dador de manosas.
En la Figura 93 , A-C , se ve que Ia manosa radioactiva del Dol-P-Man no se incorporó
FIGURA 73 : Biolïntnil de lípida-olígoucóridor de tamb grande
A GDI." (sofiflfi, (ya (x: (5‘ (J, G, (¡lc Man
1000 'Ü'Ü'Ü'Ú' ' Ü Ü l —Origin
l I A
/‘ _ á E3354 ¿1'23500 — 5 2 o- u °"86 2 .— "10'0. gusfiglwe gE¡HCi ¿“ásfiïá 38 "lO gzn; ¡0°«1000 83%28’252 sggso 3.a ¡322 13,2”y ¿ia-.51 E ‘3¡j son “¿mg 523:.- gáí)—' 33"“ ¡iii E'ïou "F “oo ,P a,3 u°'°N.QEm_>8 313-"z H.En-a" a!
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“o '. x) ¡5Ill-.Ianña (rm)
al lipido-trisacórido. En cambio apareció marcado un glico-lipido cuyo resto hidrofi'lico se
comportó como un maltooligosacórido de 8-10 unidades sacóridícas No ha podido obtenerse
suficiente cantidad de este oligosacórido como para evaluar su Peso Molecular por otros
IBI
métodos.
Esta sustancia se obtuvo también por incubación de una mezcla de Iipido-trisacórido y
Iipido-"tetrasacórido" iunto con GDP-Man y enzima mlicrosomal ( Figura 93, D-E ) .
Losexperimentos expuestos indican que la manosa del Iipído trisacórido procede del
GDP-( 14C ) Mon mientras que para lipo-oligosacóridos de mayor tamaño, al menos uno de
los manosilos procede del DoliquiI-P-Man. Los experimentos de cinética apuntan en esa
dirección,- por eiemplo, en la Figura 87, página 173 , se ve que Ia incorporación de marca
radioactiva al Iipido-"tetrasacórido" creció siguiendo una curva sigmoidal precedida por Ia
biosintesis previa de DoI-P-Man y de Iipido-trisacórido.
En la Tabla 60 se aprecia que la disminución de radioactividad especifica en el
Ï_A_BLA60 : Desplazamiento do la mulco radiooclíva entre giicaiipidm
cpm lncorporadm enAdiclunm a los 70 mín
de incubación Dol-P-Mun Lipido-Iriwdrido LIp-"h-trusac '.' (Up-X!) Proteina+ [ip-X7
efllÍ-“O ¿alentado ¡9.840 4.007 403 5. i io l. Si Ü
enzlrrn ¡5.999 3.738 B7| 7. “’.‘: 3.587
enzima + CDP-Man4 mM “.884 ¡.920 8‘70 6.932 4.373
Condiciones como en figura 87,póg. |73.Proteina se refierea material insoluble en TCA caliente.Enzima= I mg.deproteina de Ceratitis .
GDF-Man acarreó un aparente desplazamiento de MC desde el Iipido-trisacórido hacia
los Ii o-oli osacóridos la rotel'na. Esto su iere una relación recursor roducto verp
también Tabla 62 en pógina 186 ) .
182
3.5. FORMACION D_EDOL|COL - OLIGOSACARIDOS CONTENIENDO
ACETILG LUCOSAMINA
A pesar de que el Dolicol-P-P-GlcNAc fue el primer poliprenil-azücar de insecto
detectado, concomitantemente a la sintesis de quitina (ver 3.2. y (ló4, 180) ) ,
resultó muydifícultoso obtener lipo-oligosacórídos con radiomarca en acetilglucosamina.
Esta parece ser una caracteristica general Iparaotros eucariotes donde, como en artrópodos,
las transferasas de GIcNAc son lóbiles y los sistemas "¡n vitro" muy poco eficientes.
3.5.1. DoliquiI-P-P- ( GIcNAc )2
No se pudo elongar el Dol-P-P- ( 14C ) GIcNAc por re-íncubacíón con UDP-GIcNAc,
como se ha descripto para otros organismos ( 167 ) . Sólo se obtuvo un aparente lípido
( disacórido ) con radiomarca en GIcNAc cuando se utilizaron larvas de ó dias de
Ceratitís y se incubaron sus homogenatos en condiciones apropiadas ( Figura 94 ) . La mitad
hidrofïl ica, liberada por hidrólisis ácida débil del glicoll'pido, se comportó como
N, N'-diacetilquitobiosa en cromatografía en papel, con diferentes solventes ( Tabla ól ).
. (GlcNAc)2
idem
de hígado ídemPapel/ B
0.870.81
.Disacárido de insecto idem 0.7|
RGlcNAc0.66Papei/ A. (GlcNAc)2 de higado
(II) PRODUCTOS DE HIDROLISlS ACIDA SUAVE
.Lïpído-dísacárido de insectoTLC / P
ídem 3
3,24-0J cm¡o j: 09 3 cm
Dol-P-P-(GlcNAc)2 de hígado
(I) GL|COL|PIDOS INTACTOS
SISTEMA/Solvente MOVILIDAD
insecto y de su producto de hidrólisis ácida suave.TABLA6];Comportamiento cromatográfico del lipído-disacário do de
“Diem-Mm¡ñcoRPoMDA(Cpm)
M
iOGuam.
Pam“
15
FIGURA 9h
um)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 05 06 07 0.8 09 lOEáTANOAREs
Fiqura9h:FormafiióndeIipo-oligosacáridosradionarradas
mUUcnnm.
seincubaron30nanomoles(enP)deDal-PconzïrítónX-IOO|,52 uDP(‘°C)GlcNAcnouH(¡05cpm);2-mercaploelanolSDmHyenzimade punas(|mg.deproteina).Vol.final-SSul.Lasmuestras¿unlicadas seincubarOn,procesaronycontaroncomoenfigurasanteriores.Las cromatografíasenpapelsedesarrollaroncnnelsolvente9.(A)7 minutosan:esdeterminarlaincubacióníZOmín)seañadieron:Gui deaguabidestilada.(8)AdemásdelDai-Plaincubacióncantcnïa aceptoresdeinsecto(lipidoaceptor.p59.60)ytambiénseañadió aguacomoenA.(C)igualaBperoelagua«csustituvápor0.2 aícromolesdeGDF-HandísuellosenIOpldeagua.Glc-G‘Jclígosacáridosañadidoscomoestándares.Fígura9ubHcadaenQuesadayBelocopitau(20]).
183
3.5.2. Doliq¿1il-P-P- ( GlcNAc )2 - Man
Cuando se añadió el Iipido aceptor de insectos a la incubación-tipo para sintesis de
lípido diacetilquitobiosa no se modificó la distribución de radiocctividad en los cromatogra
mas ( Figura 94, B Cuando se incubó simultáneamente en presencia de GDP-Man sin
marca, tampoco se apreciaron cambios significativos. AI añadirse el GDP-Man (4 mM )
7 min antes del término de la incubación ( 20 min ) decreció la incorporación de 14C
en el lipido diacetil-quitobiosc y simultáneamente aparecieron marcados lipo-oligosacóridos
de mayor tamaño ( Figura 94, C ) . Este resultado parece indicar que el lipido disacórido
se elongó con manosas a partir del GDF-Man. En realidad, en las incubaciones sin GDF-Man
agregado se advertian pequeñas pero significativas incorporaciones de marca a estos glico
Iipidos largos ( Figura 94, A y B ) probablemente por adición de manosas provenientes de
GDP-Man endógeno ( una hipótesis alternativa seria que se estén agregando acetilglucosa
minas "externas" a cadenas preformadas ) .
El resto hídrofl'lico que migró en cromatografía en papel ( con el solvente B ) entre
maltosa y maltotriosa se comportó exactamente como el lipido trisacórido radiornarcado en
monosadescripto en 3.3.2. A modode control, ambos trisacóridos con la marca respecti
vamente en GlcNAc y en Man, se mezclaron y recromatografíaron en papel con el solvente
B obteniéndose un único pico simétrico ( Figura 95 ) .
l D lM5 n11 M5 firmo“ (,u
fiólcl'l
onism
quvuasmszfiuou.DETELïofl,((Pn) 1 1 1 4 r l l 1 l l L0.o 0.4 0.7. 0.3 cu 0.5 0.6 0.; 0.3 0.9 4-0116“
FIGURA95: Cromatografía en papel de la mezcla de trísacárídos dehigado y de insecto.(Solvente B)
Debido a su escasez los lipo-oligosacóridos radiomarcados con ( 14C ) GIcNAc de
mayor tamaño no han podido ser analizados todavia.
Por otra parte, la presencia de UDP-GlcNAc en el medio de incubación favoreció la
formación de lipido-oligosacóridos radiomarcados con manosa (Tabla 62 , A ) . Tanto el
¡{pido-frísacórido como el Il'pi'do-"fetrasacórido" aumentaron ligeramente ( lO % ) su
marcación con respecto a los valores en ausencia de UDP-Glc NAc ( Tabla 62, B ). Esto
puede explicarse como el resultado de una mayor cantidad de Iipido-quifobiosa disponible
para su elongación con manosas. La estimulación observada en lipído-olígosacóridos de
mayor tamaño es dificil de interpretar debido a las baias incorporaciones.
ÏABIA 62 : DesplozomIeMode la l4C Manmo-por adición de UDP-GIcNAc
rodíoocfivídod Incorporado o
A) Adiciones Upído-vmnosn Lípidp-olioowcórído
cpm % cpm ' %
NINGUNA ¡0.489 IW 0.085 i ¡oo
+ acepto: 33.107 IN . 34.235 423
+ UDP-GlcNAc ¡5.161 sl 3.742 los
+ nc of . . I'+ UDP-GIcNAc 29.30 ¡58 44.7|3 5,53
Ll'pldmmayo!“
I) Adicional prldo-Ïvlwc.‘ Upldo-“Ïenmacárido' (X6 * X7 4‘X9)
_ cpm 96 cpm ‘ïv i cpm %
NINGUNA |.757 ¡oo 3.2|0 100" 3.1” Im
0 acepto: ' ¡3.630 775(lm) l3.7|7 427W”) 6.621 212 (IW)
+ acopio:+ UDP-GIcNAc _|5.599 867 (l lo) 15.637 487 (ll-1) !3.477 432 (203)
187
3.6. FORMACION D_EDOLICOL - OLIGOSACARIDOS CONTENIENDO GLUCOSA
Cuando se incubaron extractos microsomalesde insecto con UDP- [HC] - Glc,
además de la Formacióndel Dolicol-tosfato-glucosa descripto en el capitulo 3.3.3. , se
observó incorporación de radioactividad a material insoluble en TCA y a sustancias extraibles
con cloroformo/metanoI/agua lO:lO:3 ( Figura 96 ).
FIGURA 96 : Incorporación de radioactividad a material soluble en cloroformo/metanol//agua lO:lO:3 y al ¡nsoluble en TCAcaliente
¿OL® '/‘J
Material lipofflico ñ(souan In uuu)
8 ‘ ° . 0M 1 J 1013 10 min 204". ¿fi/"f
/ / EeterinlLnsolubleenTCAcaliente. .A
cpmx10'
l I l l
01 3 7'O mín 20
A Se procesaron las muestras de acuerdo a lo explicado en Métodos ( página 66 )El material extraido con el solvente de Leloir se cromatografió en papel con elmismo solvente. Las sustancias lipofilicas migraron con el Frente y se eluyeron ycontaron en centelleo liquido.
W
188
El 80 % de las sutancias extraidas con este Último solvente resultó ser hidrosoluble.
Cuando se pretendió reducir esa contaminación mediante el recurso de aumentar el número de
lavados previos ( ver Métodos, página 66-67 ) se observó que también disminuia 1a sustancia
lipofl'lica ( migra con el frente, Figura 97 ) .
FIGURA 97 :
J manos Pnevtos
6 ¡.Avnoos mvios
F
wC
RCSPUESTARcmrivnoa.ocrccroqo-mcpm)
leiuo (aúoouu‘tuw16k ot w'anoo
Radiocromatogramasde sustancias extraibles con el solvente de Leloir
A) Extracción estándar ( Materiales yMétodos, página 66 )
B) Extracción precedida de lavadosadicionales
C) AE-Glc de higado, cromatografiadocomo patrón.
Las muestras se cromatografiaron en tirasde 14 cm de papel con el solvente de Leloir,en forma ascendente. En el origen, o conpoca movilidad, se encuentran las sustanciashidrcfilicas; las lipofilicas van al frente.
Se comprobó que la sustancia lipofilica era ligeramente soluble en el solvente utilizado
en los lavados ( cloroformo/metanoI/agua ) ( 1:16:16 ) por lo que sólo se hicieron tres
lavados previos, manteniendo la contaminación de material hidrofl'lico.
Análisis de material hidrosoluble
Se eluyeron las sustancias radioactivas cercanas al origen en cromatogramas como los de
la Figura 97 y se las cromatografió,nuevamente, con el solvente E . Como se aprecia en
la Figura 98 las sustancias radiomarcadas se separaron en tres entidades. Estas se recromato
«wa ) ) 1104”; 90 'uo vnuvi 3X4 stsnd <3?!
n GDP-Glcuna;lc-é-P
UDP-GlcUHP¿nA9@allen-«t
l(wásïammsv
m Uvnuvúíl- VLHSIJÓJSJ-fl
11620
EImaterialeluídodecramatagramascomolosdelaFigura9-7secramatografïóentiras depapelde9 cmdelargoconelsolventeE,parasepararloenlassustanciasdenominadasA,ByC(Cuadral).EstasFueroneluídasycromatografíadasporseparadodurantel4hs conelsolventeE.(Cuadra2),
Glo{a
1Ah_¿_;
0m
FIGURA 98 Anólisís de sustancias hidrosolubles extraídas con el solvente de Leloír
189
grafiaron por separado en el mismosolvente. La sustancia de menor movilidad co-cromatogrg
fió con UDP-Glc y , sometida a hidrólisis ócida liberó una sustancia que se comportó como
glucosa. La sustancia de movilidad intermedia se comportó como Glc-ó-P y resistió una
hidrólisis ócida suave. Por tratamiento con fosfatasa alcalina ( Métodos ) liberó gluco
sa radioactiva. La sustancia de mayor movilidad se comportó, por los mismoscriterios, como
Glc-l-P.
EI anólisis cromatogrófico de la curva de marcación "in vitro" de sustancias a partir de
UDP- ( 14C ) Glc permitió apreciar una muy rápida degradación de éste dando Glc-l-P y
Glc-ó-P ( no se muestra ) .
3.6.1. lndentidad dil material lipofl'lico
Al cabo de un minuto de incubación ya pudo detectarse la sustancia liposoluble en los
extractos con el solvente de Leloir. Esta sustancia fue totalmente hidrolizada a pH= 2,0 en
caliente, liberando una sustancia con comportamiento de oligosacórido. Por su solubilidad ,
su comportamiento cromatogrófico y su labilidad al ócido, se pensó que la sustancia podia
ser un polipreníl-oligosacórido - ( Glc ) similar al AE-Glc descripto en higado de mamifero
( 143 ) . Se comparó el comportamiento del presunto lipido-oligosacórido de insecto
con el AE-Glc de higado de rata en diferentes sistemas cromatogróficos . Tanto en capa
Fina ( Figura 99 ) como en columna analítica de intercambio aniónico ( DEAE_celulosa )
( Figura ¡00 ) el glicolipido de insecto se comportó en forma similar al AE-Glc de higado
y en forma diferente al DoI-P-Glc.
¡91
FIGURA 99 : Comportamiento en cromatografía de capa fino del oceptor endógenode glucosa, de insecto.Solvente O
(pm _T '5 A qm B 00d
’“m Dot-P-Glc °°' AE-[“'C](alc,h.'¿.¿.0 o‘o l / \
e.r- m - . lo o¡.I ‘. \ '.'.-’o.' ‘ .T.6 ' __.¿ 1 l L L L n , l l n 1 n
O ‘P' C 00dO
4 ' ./ . i'm" — 0/ \ AE'LNÜGic¿Matoo \ . .o 0.. | , , s .0 ober"to." 3‘... m ol. ° \o. \e.lllellllllllllllll lllljllllllllllL
o 0.1 o: 0.5 044 0-5 0-6 0-3 0-8 0-9 4-0 ¡tk oo 0.1 0.2 es 0.a 0.5 M 0-1 0-8 R4,
Lo propiedad de lo Concanavalina A de retener al Iipido-oligosacórido ( Glc ) de
higado ( Staneloní, co municación personal ) se aprovechó para comparar el lipido
oligosacórido de insecto con aquel y con los Iipido-oligosacóridos Q( ( 14C ) Man )
de insecto.
En la Figura 10] ( ver página ¡93 ) se aprecia que los Iipo-oligosacóridos conteniendo
Glc fueron retenidos por la barrera de Con. A , mientras que el Dol-P-Glc no fue
retenido en absoluto.
192
FIGURA 100 : Cromatografía en columna de DEAE-celulosa microanalïtica delAE-Glc de insecto
cpm’ÍOOO ï I I 31 r I I 400
‘O
\°\o ,
zoo
\|||| ._|O
\°\ 4' 3“!n 1
,0 \0O ' ‘
O n/.-0+ nan| Agodlzooobon o cfoonfilunñkao O
I400O\
A 3H A
800“ o {11d IY; —4OOZCLu¡‘9 oI \A.' '\ —E’OO
O A A A A--AGI. 1 \\AA O4 8 72 "/6 20 24 28
n9 de ' {vt-acción
La cromatografía se realizó como se describe en Métodos ( página 84 ). Se mezcló elglicoh'pido de inwcfo ( 0-". ) con DoI-P-Glc de hígado ( o—o ) 6 con AE-Glcde hígado (A-A ) y se pasó Ia muestra por la columna, que se eluyó con 2 y 15 mM( flechas )de formiafa ( NH4 ) en el solvente J .
Figura 101: Afinidad del AE-Glc de insecto por la Concanavalina
Cgmwnu'ru'fi'C "1 ' '
P . A : 'Mm Se utilizó papel SSZOH3a de 25,5
mmde ancho por lh cm de largo.En el tercer cm. a partir del o
w° rigen se sembró,a todo lo anchodel papel, una solución contenien
o do : l mg de Con.”A” (Grado Iv,Ï)15 micromoles de NaCl;0,02 micro
an moles de MgCl y 0.02 micromolesde MnCl .Se secó con aire frioy” forzado y se sembraron lO_ul decada solución conteniendo los
’ lipido-azücares.No se secó.Se cromatografió en forma ascendente con el solvente J,con unflujo promedio de 9cm/hora.Después de la corrida se cortaronbandas de lcm y se contaron encentel leador. A)EA-Glcde higado.B)EA-Glcde insecto .C)DoI-P-Glc insecto.WW
El anólisis de los productos de degradación de la hidrólisis ócida débil reveló que el
oligosacórído de insecto se comportó como una sustancia de mayor dispersión que el de higa
do y de tamaño aparente menor ( Figura 102 ) . Ademós, en ambos casos una pequeña parte
de la radioactividad permaneció en el origen como si fuera un oligosacórído de mayor tama
ño. Esto sustancia, extraída y recromatografiada volvió a permanecer en el origen del cro
matograma. Por lo escaso del material no se pudo analizar si poseia carga neta.
194
CRM l l I l l l I l l
. 0-0 [MC]
omo .[JH]
2 OO 7000
.' .
\ —5oo100 .Q ,0
I L"o"8..n\&o<2 14 6 8 C M
Figura 102: Cromatografía en papel del resto olígosacarïdíco del AE-Glc de insecto.
Se Tfizcló AE-(3H)Glc de hígado (l0.000 cpm) (ONNO) conAE( C)Glc de insecto (l.700 cpm) (0——O) y se llevarona seco.Se los sometió a hidrólisis acida suave(PH=2,0)y los restos hidrofïlícos liberados se cromatografíaroncon el solvente B.Se cortaron bandas de 0,3 cm y se contaron en centelleador ambos ¡sótopos.
Resultados previos indicarian que Ia biosintesís del lipido ( oligosacórido ) glucosa
se inhibió en presencia de detergentes y se estimuló por ciertas fracciones de lípidos acepto
res de insecto. El manganeso y el Mg estimularon la biosintesís endógeno.
¡95
3.7. DOLICOL-OLIGOSACARIDOS EL! ARTEMIASP (CRUSTACEA )
Se estudió Ia capacidad de las preparaciones de Artemia ¿“JE y Artemia sE para
sintetizar Iipo-oligosacórídos radiornarcados con manosa. En Ia Figura 103 se aprecia que se
formaron glicolïpidos que cromatografiaron en Ia posición del Ii'pido frisacórído y " retrasa
córido " de insecto, además de 0to s que por su escasez no han sido caracterizados.
El glucoiipido principal sólo se hidrolizó (a pH = 2.0 ) en un 20 % ) , lo que indicarïa
que se trata de una mezc|a, donde predominan glucósídos resistentes.
FlGURA103: Autoradiografía de la TLCde lípo-olígosacárídos de Artemia
Dol-P-(I4C)Glc estándara"!.4 GDF-(“C)Man+Dol-P
- 14-- GDP ( C)Man
- UDP-(“C)Glc+DoI-P
.. UDP-(“C)Glc
AE-G|c= %fi¿gosacóndo-GlcDol = dolicol3 = Lipido (GIcNAc)2 -Man de
l V Dol InsectoAE'G c 4 = Lïpido-"tefrasacórido"deinsechPlaca desarrollada con ei soIV.Ó
. Las flechas indican Ia posición deD. los estándares en placas paralelas.
.a Fic-P-(I4C)Gal estándar
yf
(Ver también fig 77,pógina 160 )
196
3.8. BIOSINTESIS D_EGLICOPROTEINAS
3.8.]. Glicosilación g Eartirdsnucleótido-azücares
A partir de GDP- ( 14C ) Man se incorporaron manosas a la fracción insoluble en
ócido tricloroacético caliente al 10 % en prácticamente todos los ensayos en que se obtuvo
biosintesis de manolipidos.
Mós de la mitad (entre 55 y 70 % ) de este material pasó a ser soluble en TCA IO %
después de ser tratado durante 72 hs con proteasa de Stre tom ces griseus (ver Métodos ) .
Laquimotripsina y otras proteasas también fueron capaces de solublizar la marca radio
activa. Se asumió, por tanto, que se trataba de una glicoproteina que contenía manosa.
Las sustancias solublizadas se cromatografiaron en Sephadex G-15 . Casi toda la marca
emergió con el volumen muerto . AI pico de radioactividad se lo sometió a electroforesis
sobre papel y se obtuvieron dos picos radioactivos que migraron tanto en solvente ócido co
mo bósíco como si fueran glicopéptidos.
A partir de UDP- ( 14C ) GlcNAc seobtuvo una sustancia precipitable por TCA que,
sometida a [5 - eliminación, sufrió la pérdida de un 60 % de la radioactividad que pasó
a ser soluble en TCA .
Se hicieron electroforesis en geles de poliacrilamida (con y sin SDS)del material pirotei
nico radiomarcado,obtenido a partir de ambos nucleótido-azücares. Los resultados fueron erra
ticos (gran dispersión de la marca radioactiva y poca reproducibilidad de un ensayo a otro).
Ello parece debido a la acción de proteasas ya que la biosc'ntesisconcomitante de quitina fué
reproducible.
197
3.8.2. Glicosilación d_eHoteinas a Eortir dgdolicol derivados
Losdatos cinéticos sugieren que los lipo-oligosacóridos pueden estar involucrados en Ia
manosilación de proteinas mencionada en 3.7. i . No se ha podido obtener manosilación
fehaciente de proteinas de insecto a partir de los manolïpidos aqui descriptos. Sin embargo
se probó la capacidad de estas Últimas para actuar como sustratos de las manosiltransferasas
de higado de rata.
En Ia Tabla 63, experimento l se ve que tanto los restos oligosacan'dicos de los mano
TABLA63¿ Transferencia de radiomnrcn de lus manolípidos de insectoa los acentores de higado de rata.
[XPERIHÉNTO Ihnnlipidns Incorporación de aadiuactividndde Sun ¡ncubar(control) Incubadas __
FAsr ¡nsnLunLr ¡Asi IkaLUÜLE
OPGAN. EN TEN OFGAN. LN TCA
l HlCAnfl S-OLÁ 0' 5.7|l SLÏ
INSECTO |h.55h 70 |2.||7 973
2 IN‘ECTO 2.300 ¡IO 376 |.7k5
los lípn-oiinosncárídos prcparndos con las respectivas enzima!se purificnron en columnas miCuunnolltícas de DEAE-Celulosa (métodos)-Se inaulmrnn a-I.1(l.1mrnlo (omo drscrilmn FQ-lvrns y {(IIUUÚ con mirromv'a‘ de higado Lonloníeudn h,5 mq.de proleín¿.ti detergente usado vn el caperintnlol fué Dcunícnlalo dc Na nl 0,51 mientras que en el experimcnln 1 se utilnlóTrllón l-IOO nl 1,01.Sv incuhG 5 min a 75"(.Yudns los cnsnyo> sr hicieronpor duplicudn (ln cifra cu ln (abla cs el promedio) v han consignado losnujones rupcrlumnlnn.1nbla publicada nn Quesada v flelocnpílaw (203).
lípidos de insecto como los de higado son transferidas a glicoproteïna(s) por las enzimas
microsomalesde higado. Cuando el experimento se realizó en condiciones de total disgrega
ción de las membranas ( 3.8 % final de Tritón X-IOO ) se ve que alrededor del 80 % de la
radiooctividad se transfirió a la fracción TCA-insoluble ( Tabla 63, Experimento 2 ) .
¡98
No se sabe si estos resultados in vitro representan un fenómeno fisiol ógíco o - por
el contrario - se trata de un artificio. Se sabe que en parecidas condiciones la ovoalbümina
puede llegar a glícosilarse en sitios fisiológicamente aglicosilados ( 206 ) .
En cualquier caso es evidente que las manosiltransfenasas de higado reconocieron los
glicolipidos de insecto como si fueran los sustratos naturales.
Losmicrosomasde Ceratitis fueron aptos, en cambio, para transferir la parte azúcar del
Iipído-oligosacórido ( ¡4C ) Glc de rata ( EA-Glc ) a la proteina endógeno. Como se
demostró en 3.6 este gluco-oligosacórido-Iipido es prácticamente idéntico al homólogo de
insecto. En la Tabla 64 se ve que los microsomas de insecto transfirieron la radioactividad
con similar eficiencia a la de los de higado.
TABLA64 : Formación do gllcoprotefnal a panlr de dallqull ollooncóricos
AE-Glc de intima de C/M/HZO 0:1023 Proteina(YCAinsol.)
Hrgodo Higado I. 745 819
Hígado Hígado ( control ) 3.024 67
Hfgodo [macro l. 356 667
Hígado Insecto ( control ) 2.668 51
El AE-Glc de higado se obtuvo como se explica en Métodos (Página 61 ) . Después de loincubación las muestras se procesan com se describe en Métodos. Losdiferencias correspondena sustancias aparecidos en otros Fracciones. Lascontroles se realizaron con enzimas pre-celeriados. l
La curva de incorporación de radioactividad a glicoproteina parece indicar que existió
degradación del AE-Glc y/o de la glicoprotel'na sintetizado ( Figura ¡04 A los 8 min
¿pm
2000
Á OOO
l Figura 10h:|ncorporacón de radíomarcal a giicoproteínals) en función del t.\. ¿[H/Hzo(4021025)
. La solución con AE-Glc se llevó aseco bajo N2 y se procedió como seindica enla Fig.105 y en métodos.
e--'--D----— xÏ O
,/ msaLume en TCA' l l 1 l l r
O 4 2, J 11 .5 "un
el AE-Glc está totalmente consumido y casi no se detectó radioactividad en material inso
Iuble en TCA .
El producto insoluble en TCA se trató con urea para romper los puentes hidrógeno entre
cadenas polipéptidas y con ditiotreitol para clivar los puentes disulfuro. Se lo cromatografió
por Sephadex G-50 obteniéndose el perfil que se observa en la Figura 105 . La heteroge
neidad de tamaños podria explicarse por la presencia de proteasas endógenas en forma simi
lar a lo que parece suceder en levadura ( 140 ).
cpm Sephadex (¡-50 1x58cm
200
'IOO
..- | 1 l A10 20 30 40 5 O (Fracciónn’)
FlGURA l05 : Filtración molecular de las-sustancias radiorrarcodas insolubles en TU calierto
La l'nnslerencia del EA-G'c a proteina st realizó de acuerdo a lo indicado en ATP-xfa, co"unu concennoción (¡nal de ïrilón X-iOO de 0.5 “6 . Para evitar la En'cv‘erencia de esc Trïrónen la precipitación du la glicoprotcirna (aprox, 0.04 '75 cucivio se añuríe ui TCA l , u.añadió SDS (0.05 ".5 linal ) y KCI (ó mM final ) . La suspensión en ÏCA se dció a C " Cpor min , sc centrilugó y se descartó el ¡obrcnauunte que contum’c la) detergente“ Se v:l\¡¿a resuspender en TCA lO ‘35 durante 2 lu. o lcmperulula ambiente y luego v: caicnsó 5 nina l00 ’ C . Despuér de lavados ¡uccsivar coH.éler etilico y melanol, se añadió a la msnm0,4 ml de: Tris-HCI pH 7,2 50 mM; diliolrcitol 35 mM; urea 4 M; Tritén x-¡oo 0,75 se;SDS 0,] % y glicerol 1,5 % (¡amado de diferentes autom: ) .Se utilizó una columna de Scphadcx 6-50 der l ,0 x 50 cm equilibrada con 0,l °.\'vSDS en tarrpónfosfato 5 mMa pH I 6,8 . A partir de la fracción IO se tomaron voló nenes de ¡,3 cc.5.0. indica dextrano azul. Cit.C._ 3 Citocromo "C". El olignsocórido del EA-Glc, enuna cromtograíia' previa da calibración aparec ió en lar fracciones 40 a 45 .
Por otra parte, la incubación del Dolicol-P-P-GlcNac y Dol-P-P-(GlcNAc)2 de insec
to ( o de higado ) con microsomas de insecto originó la sintesis de un material TCA lO %
( frio ) insoluble. Parte de este material se solubilizó en TCA lO % calentando a ¡00° C
durante 3-5 minutos. Tratado con ólcali suave ( P - eliminación ), un 75 % de la radio
actividad incorporada a partir de Dol-P-P-GlcNAc se solubilizó en TCA, en forma similar
a lo que sucedió con la sustancia sintetizado a partir de UDP-GlcNAc (Tabla 65 ) . La
incorporación a partir de Dol-P-P-( Glc NAC)2 fue sumamente baia, por lo que resulta pre
mafuro sacar conclusiones.
TABLA65 : limfnfeth de um olleoprotefm P- eïlmlneblo
20]
cuentos / mín ¡neo o
( Despuénde e) - ollmlnoclón )Material vodíomrco'do IHIO'UbIGo porfir de en TCA Solubl‘e en Inlolvb'o en %
TCA TCA.
UDP-GICNAC ¡5.4W 9.453 5._9|2 30
Dol-P-P-GICNAC 4.40 337 ¡05 25
DoI-P-P-á GIcNAc )2 ¡69 HO y 0 0
Le:Mal-och“: a realizaroncon onzïmpde Po'endusdermfloldu ( larva ) en una nulocan-eñïendo : '5,- y UDP-(“cmlcNAc (200.000 cpm) con Dol-P ao
ïvís-Mcleovo 0,1 M n pH = 8.6 como tampón,- MnClz IO mM; Nonidev P40nanoqu (en ÍosÍolo) o
bien DoI-P-P-( I‘C)GIcNAc 3.100 cpin o bien Dol-P-P-( I‘C ) GIcNAc-GICNAC ( ¡.ówcpm .
202
3.9. BIOSINTESIS D_EDERIVADOS É DOLICOL E_NRELACION A_LCICLO D_E_VIDA
Se realizaron experimentos tendientes a correlacionar aspectos cualitativos y cuantitati
vos de la biosintesis de DoI-P-monosacóridos con el ciclo de vida de diferentes artrópodos.
3.9.1. Insectos: Ceratitis
Como se aprecia en Ia Figura 106 las sintetasas de DoI-P-Glc fueron aparentemente más
Figura 106:Bíosïntesís de glucolïpidos a lo largo del ciclo de vida
..:.-._-¡"/a,nsL A R VA s chat/qu; A PO LlS LS ¡”w/qm P u PAS
EHDÓGEHO m r1J"¿Glc ' ADP-Glc® Glc a ’ AD!!le 6k e;a! H I EflDOGEflO enoooeno
oaioen ADP'G'C
l l l I l l I l l l n l J L
1-Dol-P +AE fDol-P+AE +Do|-P+ AE
Wl' 1 r n 14l__¡_ 1 1 L I I 1 l l0 ¿o 20 ¿LO 140C/fl‘.O AO 20 .30 40 O AO 20 .50 40 .l
Incubaciones estándar. Cromatografía de los restos hídrosolubles en papel,so|v.B
203
activos en los estados pupal y larval, como era de esperar, pero siguieron siendo detectables
enla opohsk.
En todos los casos el añadido de DoI-P estimuló Io biosinfesis de DoI-P-Glc.
TABLA66: Incorporación de radíoactivídad a material ínsoluble enácido trícloroacético,en diferentes estadios.
LIPIDO ACEPTOR Estadio MATERIAL INSOLUBLE EN TCA (cpm/mg proteína)
(“‘c)Manosa (“’cmlc (“'cmlcNAc
#Endógeno Larvas 3.758 1.710 1.082
Apolísís 559 550 20h
Pupas 8.750 2.706 1.157
fl+Dol-P Larvas 2.h52 2.003 593
Apolísís #32 #6] 376
Pupas 6.906 3.136 1.324
fl+ Doi-P+ Lïpido aceptor
Larvas l.h3h 1.792 60h
Apolísís M5 31+3 hs]
Pupas 5.690 2.654 800
Condiciones experimentales estándar.
204
En el caso de las manosíl transferasa de Doi-P-Man, también fueron más activas las de
larvas y pupas y todas se estimularon por agregado de DoI-P. Las larvas, como ya se demos
tró en el correspondiente capitulo ( página 165 ) , síntetizaron Iipido-oligosacóridos en
presencia de aceptar exógeno de insecto ( Figura 107 ) . También en apolisis hubo sintesis
Figura ¡07 :Bíosïntesís de manolipídos a lo largodel ciclo de vida.
LARVAS APOLÍSÍS PU PAS
P15” “JÍLGICHan, ADP—G(cHz Han a; Man/
oníacn ADR“; ¿3% ORIGEN w ORIGEN . m
l. l, @ i .i 1ENDOGEHO EHDOGEHO
l l l l 1‘ L | l l _L L L l l .91 ' n 1 A l 4L 4. n _¡_ 1o A° 1° .30 lao0m o ¿o zo so 1.o o 40 20 30 1.o am
+Dol-P I+Do|—P ¿+Dol-P
á l A 21° l 31° l “10% a l Alo .n A 31° Palo ó l ¿lo l L 31° 610
+Dol—P+AE 1+ norma" +Dol-P + AE
MMA WCL) l Áto I 21° 1 31° l CIF", L ó l Ano 1 2no 4 sin. L “lo ó 1 ¿Lo L 21° A 3.o l ¿a un
Los manolïpídos obtenidos en íncubaciones estándar se hidrolizaron a pH=2.0 y losrestos manosílados se cromatografíaron en papel con el solvente B.
205
de lipido-trísacórido .
Los lípido-olígosacïnridos no se sintetizaron en pupas. Sugiríendo una aparente relación
precursor-producto, en este estadio se sintetizaron más sustancias ínsolubles en TCA y radio
marcadas con manosa que en larvas ( ver Tabla óó, página 203 ). El añadido de lipidos exá
genos ( DoI-P y lipido aceptor de insecto ) inhibió las manosiltransferasas a proteinas
( Tabla óó ).
Finalmente, la sintesis de quitina ( la mayor parte ) y otras acetil-glucosaminil-proteï
nas, fue mayor en pupas,como era de esperar, debido a la construcción de la nueva cuticula.
Loescaso de la biosintesis obtenida de Dol-P-P-GlcNAc no permitió hacer análisis en nin
guna de las series distintas de experimentos.
3.9.2. Crustóceos: Artemia salina
Loseventos de la reiniciación del metabolismo de las góstrulas desecadas de Artemia se
encuentran indicados en la Figura 108 . En la misma se aprecia una muy temprana biosintesis
de lipido-Man y de Iipido-Glc, seguida poco después por la de proteinas y polisacóridos,
todos ellos radiomarcados con los respectivos trazadores. Losestudios indicaron que el lipido
Man es una mezcla de un aparente Dol-P-Man y Lipiclo-o|igosacórido ( ver capitulo 3.7.)
%¡+20 H 50 25
Correlccïónen":losevenlo:deldesarrollode¡a!gínrulcsdesecodmde Anerríuylaformacióndcpoliptcnil-czúcares
A}5'21'2'.eneljesarrollodeAnemia,opunïrdeloinmeniénenaguadelasgósfrulcu
ern_Z.-:dm.DatosIomc'osdevalio".autores(403al405).Locurvaindicaelporcenloic:eh'árc'uién.
B)1.:;:7quderifle-1hsewmrgíeronensoluciónsalinaconogilacíónintensa{ verMétodos)
endï'even‘eserenrryerconveníendocomidadesiguales,enpen)seco.Alo!0,30ya)so gmdmyclo:2,5,3y¡6mín¡eprCGlOrOn¡andas¡olesdeAnemia,recogiendolosquiuupor¡Zinccíámlcvondoyhomgoinílondoenmicrodecer'vmícoenfrío.Losextrocrotrico'.er.«Jamon:nprepararonylosemayol¡erealizaroncomo¡odescribeenMétodal.
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206
207
3.10. FOSFORILACION QE DOLICOL POR ENZIMAS D_EINSECTO
Como se vio en la Introducción ( capitulo 1.2.1. ) , Ia formación de poli-¡soprenil
pirofosfafos bacterianos, con n unidades isoprénicas, implica Ia condensación de una molé
cula de dí-mefiI-aliI-pirofosfafo con n-l moléculas de isopenfenil pirofosfafo (ver Intro
ducción 1.2. l . y Figuras3 a 5 . Este fípo de reacciones es cafalizado por varias enzimas
llamadas prenil pirofosfafo sintetasas ( E.C. 2.5.1.1. ) .
Por su parte, Ia formación del isopenfeníl pirofosfafo es consecuencia de la sucesiva
fosforilación de mevalonato por Ia mevaionafo quinasa ( E.C. 2.7.4.2. ) . También se ori
gina por isomerizacíón del dimetil-aIiI-pirofosfafo (E.C. 5.3.3.2. ) (ver Figura 3 ,
página 8 ).
Lcs poliprenil pirofosfafos serian defosforilados a monofosfatos ( 14,19 ) y éstos a
alcoholes libres ( Figura 109 ) .
Fígura 109: Esquemaaceptado de la formación de políísoprenolesy poliisoprenoles fosfato.
ACIDO MEVALONICO AC.MEVALONICO-P AC.MEVALONICO-P-P
ATP ADP ATP ADP
+POLIISOPRENOL Polí-ísoprenil -P-P C02 “2°
l.) Pi (precursor)POLIISOPRENIL-PL POLllSOPRENILn+]-P-PL ISOPENTENIL-P-P
El esquema está basado en lo conocido en bacterias ( 14 ) y,en príncípío,se acepta que es válido para los eucaríotes (Kornberg,Comunícaciónpersonal).
208
La biosintesis de dolicoles parece seguir este esquema (19,6] ,63 ) con la particularidad
de que deberia existir una enzima capaz de saturar la unidad d -ísoprénica. El dolicol
podria, eventualmente, Fosforilarsepor la acción de una poliprenil quinasa similar a la des
cripto por Strominger y col. ( 32 ) en los procariotes. Sin embargo no existe hasta la fe
cha en la bibliografia ninguna evidencia en ese sentido.
El presente capitulo intenta aportar pruebas de la existencia de una posible quinasa de
dolicol en insectos, que seria entonces una novedad para los eucariotes.
3.10.1. Evidencias indirectas
Como se vio en 3.1. la cantidad estimada de dolicol presente en los teíidos de pupas de
Ceratitis capitata fue muy superior a la de dolicd fosfato, como sucede en otros eucariotes
Tabla 67 .ÏABLA67: Comenlroción de Dol y Dal-P en insectos, comparada con otros organismos
Concentración en ug/g teiído Dalos calculados o tomadosMaterial biológica Dol Dal-P de
. Levadura 6 0.6 Juno y ïanner ( 57 )
. Cerebro de vaca ¡5 - Breckcnridgc y col. ( 30 )
. Celebra do ruta 0.0| - idem
. Higado de cerdo 100 - Burgos y Morton ( 3| , 5| )
. Hígado de cerdo 73 - Inóu (le Iannino ( CJI'I'nlCUCÍ'SHrv'mm
. Hígado de cerdo - l,0 161mm ( ¡87 ) y comunicaciónpersonal
. Higado¿e rata - 0,7 Dal|ner y col. (56)
. Pupasde Soluti'i’SEI-lili“: l.4\'|.7 0.05-0.” [sia Ïells'
So cnlcuh“ lu .um rulluclóu Ja- lX-lcn lso-.-ul ¡ww u-co ¡lc (Iluidns (ln cromnlnqnuïns propamlivm un calm l'l'llllh'l‘ run w-qwclo ul ¡wm (lo Im pupos vivas. 'le indii nn vnlmm culn‘mmlmllmlns. lo runs c-ulmríóu ¡lvl [Ml-l' sr ¡Idiuú ¡nvilinnla muuy-s biológico. Conil-murth concnulídmlm cul.“ ¡.lrn ¡lo "ul-P ¡lr liiwulv, rn ¡firmimu (ln lu-luln ln-Iol, sc olilmn cil vulnlmin-im) ( puc-Inn («huso ¡:umidn-Iulhln .\||-|\ '\‘)'\‘II-I‘í(l\“ ) . ll vulw minimo so (uh ulf: rnImul ol aluliquII-u-unwu loIm-hlo en uu --n-uy0 Iiph), ¡lrwmllunlu all lomiuk‘ mulóupvuumcnlo.
209'
En el transcurso de los estudios de formación "in vitro" de DolicoI-P-Manosa ( capitulo
3.2.2. ) y de Dolicol-P-P-GlcNAc (capitulo 3.3.l. ) en los insectos, se observóque, en
ciertos casos, el ATPfue capaz de aumentar la cantidad de glicolipido biosintetizado. Esta
observación parecia depender del momentodel ciclo de vida del insecto ( meíores larvas ),
del tipo de fracción subcelular utilizada ( meior fracción mitocondrial ) y de las condiciones
de la incubación.
Resulta interesante conocer el origen y/o el mecanismo de recambio del fosfato en el
Dal-P .
En los experimentos que se describen aqui se demostró que el fosfato en posición
del ATP-[x- 32P] fue incorporado por extractos de larvas de insecto a dolicol-fosfato-manosa,
dolicol-pirofosfato-oligosacórido y a una sustancia que se comportó como dolicol-fosfato.
32_"3.10. 2. Formación de sustancias radiomarcadas con
Losextractos de Ceratitis capitata suplementados con NaF 3 mM ( para disminuir la
degradación de los sustratos ) y con GDP - Man ( con obíeto de retener el Dol-P como
. . 32 -32 .DoI-P-Man ) , catalizaron Ia transferencna del P del P - ATPa material
lípidico.
Las sustancias radiomarcadas se comportaron como fosfolipidos en una columna cromato
grófica de ácido silicico y co-cromatografiaron con el Dolicol-P- ( ¡4C ) Glucosa de insecto
en una cromatoplaca de celulosa desarrollada con el solvente A ( isobutr'rico/ OHNH4
5:3) (Rf: 0,87) (Figura HOa). Elagregado de Pi frio no produíocambios (HO b).
La incorporación óptima se obtuvo en presencia de ATP de 2 mM ( Figura llO c ) .
210
FIGURA110: Fosforilación de lipid s endó- Las mezclas de incubagenos.(TLC en celUlosag ción conteníanzTampón
Trís-Haleato,pH=7.h5,hO mM; EDTA.Na lmM;
GDP-Man NaF 3 mH;Tritón X-lOO
' D°|_P_G] 0,18%;2-mercaptoetanol30 mH; GDF-Man 1 EN;(32P)ATP 1,6 x 10 cpm(actividad especificainicial 109 cpm/umol);y extracto enzimátíco(3 mg de proteina) enun volumen final de150 ul.(a). En (b) seañadió 1 mMPi y en(c)lmMATP(conc.final2,06 mM). Se incubópor 30 mín a 25°C y
l 1 caca: se procesó en forma¡10 0m ÁZ estándar.Las fases
(sigue Fíg.111,pag.sig.
La incorporación no se alteró tampoco por la adición de Manosa-l -P . De los datos que
l
o 2 l; 6 8
preceden se puede deducir que el sustrato para la actividad transferente no es alguno de los
productos de degradación del ATP. Se eluyó el material radiomarcada y se lo recromatogra
fió en cromatoplacas de celulosa con el solvente Q , donde se separó en dos sustancias. Una
de ellas co-cromatografió con el Dol-P-Man de insecto ( ver capitulo 3.3.2,póg. 132 )
mientras que la otra se movió con un R Dol-P-Man de 0.88. Resultados similares se obtu
vieron con cromatogratia en capa fina con el mismosolvente: se visualizaron dos sustancias
con R Dol-P-Man de 0.80 y 1.0 respectivamente.
Cuando los extractos larvales fueron incubados con -32P]-ATP y GDP [HC]
Man se formó una sustancia doblemente radiomarcada q ue se comportó como una dolíquil
fosfato-hexosa ( Figura lll A ) ( Rf.: 0.65 ) . Otra sustancia radiomarcada con 14C
y que sólo contenía trazas de 32P exhibió la movilidad de un poliprenil-P-P-oligosacórido
(ver capitulo -3.4 ) (Rf.: 0.44) (Figura lll A).
2|]
FIGURA 111: Incorporación de 32P de ( 32P)ATP a Do]-p—Man
C P M .TP Man Dol-P-Mcm 53ml. _(Ver.F¡g.Ho)P-i """"‘ Inferiores se la_’_P_i‘ CPL-abr. . varon10-15vecs
40-00 Ei) [M 100° ÍÏZOÍÏÉÉInsïïñíéï’
(Figura 110 ).
En ésta Fig|.(iii)a
9°., [s-sitoïerol niendo imMATPy‘ - 3' . _ se cromatografióOrlgen cp en TLC con el
-' 4€ solvente :Acido—l GT isobutïrico/lM
:' J: ' H .0H :(5/3)
É se utilizól
,..E misma incubaciónD que en HO,c pero
3 sustituyendo elB_ GDP-Man por 2,0
fi x 105 8pm dem (1
(Í
_ GDP- c Man(aE .n'‘.| A, \ próx .10 cpm).
_ o'. 'ó i" ‘.\/ J¡I . ' o ‘\
Los fosfoi ïpidos
.r“..se cromatografí
b\ . aron en siiíca' 'O-n. .. IO | ; °/‘ ‘ ' ' A n O X.Secortaron ban
o 2 6 3 dasy se contóla
|HC.(cpm)
O D
4.... gel G con el solv.
radíoactívidad.. (A)S¡n y (B) con
_ _ hidrólisis acidaNo se detectaron otras sustancnasdoblemente radiamarcados (ver texto) _
3.10.3. Hidrólisisócida
Se sometió la sustancia doblemente marcada al tratamiento en ácido débil tipico para los14
polípreniI-azúcares. La mayor parte del C se hizo hidrosoluble mientras que la mayor
32 I ' 4 ’parte del P suguio solubilizando en la fase organica de una particion de Folch.
La sustancia marcada hidrosoluble se resolvió en otras dos que cromatogrofiaron respecti
vamente como monosa y como un oligosocórido ( Figura Hi, B ). El material [32P1-marcado
212
se comportó como doliquil-fosfato tanto en cromatografía en capa fina ( Figura lll, B )
como en papel ( Figura l12 ) .
FIGURA ll2 : Cromatografía en papel de losioll'pldo resluonto a la hidróliii) ácida suave
C. Dot-P Do_l-_P_i“’lc1n
-1 [223
" o .n. l d'. U.
1‘
0---0MC(CPM)
._\ OOO (A)OO
o_.oHP(cpmla. \..-. o ¿8.
O nïnnd‘llin 9/..\n 1': n Y '¿nt'lnO4 812162024cm
O
Las bandas 7,8 y 9 del cromatograma (B) mostrado en la figura lll,(pág.anteríor)correspondientes al Dol-P,se lavaron conTolueno(para eliminar el centelleador)yse raspó la silica que se extrajo con 0.6N HCl en Clorof./met. (2:1).Se cromatografió en papel utilizando el solvente ;2-propanol/agua llzl.
El eslbmim de Dol ¡o localizó por rovelada conanlsaldehido . [l Dol-P-Nan esloba radionernda con C . El Dal-P se localiló pordosaie enzimúlico ( Métod» ) . La ubicación de las ¡unoncías incógnitas ¡e hito cenandotivítal de l cm el _, y " ‘ ‘ ' e " J (liquido) con el «¿tododa canales diferenciales .
3.l0.4. Hidrólisisalcalina
El material doblemente marcado fue sometido a tratamiento alcalino débil ( 0.1 M KOH
en 50 % n-propanol/ó9° C por óO mín ) y parte de la radioactividad pasó a ser soluble en
agua. La sustancia hídrosoluble fue sometida a electroforesis de alto volta ¡e en papel. En el
radioelectroforetograma se obtuvieron 2 picos negativamente cargados: uno de ellos doble
mente radiomarcado, se comportó como Manosa-l -fosfato mientras que el otro fue más lento
y tenia una relación de marca 32P/ 14C mucho menor. Su comportamiento pareceria el
de un oligosacïzrido - fosfato ( Figura ll3 , ) . Además se observaron en el electroforeto
. 4 32 .. .grama dos sustoncms marcadas con C pero no con P : una permanecro en el origen y
la otra migró ligeramente hacia el cótodo, tal como lo hizo la manoso estándar ( debido a la
213
Man-(r?m
96114700..
Ktm¿summmou.
DISTAHUA “¿canon
electro-endósmosis ) ( Figura H3 ) . Se eluyó del papel el pico aniónico "rápido" , se
lo trató con HCl por 5 min a 98° C y se lo volvió a someter a electroforesis en papel. Como
se ve en la Figura H4 volvió a comigrar con la Manosa-l-P . Después de un tratamiento con
Figura IllizzAnálisís dela Hexosa-PÉ A doblemente radiomarcada.
_ Man-MP (A)Después de la hidrólisis ácida53 mi“, ab ® se hízo una electroforesis ¡dentíca22M aladelaFig.ll3(pág.anterior).
munua ntcotfl-¡Dl
¿Pm B ww m (B)Se trató la hexosa-P con fosfa2oo “¿4" P¿ Han tasa alcalina (métodos) y los pro
45" O'O-...'*c ductos de hidrólisis se cromatogra
Á: . 3519-.ícchgxïoa ¿o fiaron en papel con el solvente E.Ï'.‘ ‘. Q“. f’f'ttjfi Se cortaron tiritas del cromatogramaO 2 A zo On], . , , .1‘ 6 84° n 4k46 3 n ul y se anallzo con centelleo liqUIdo.
14Fosfatasa alcalina de E. coli , la radiomarca de C pasó a comportarse como manosa
. . 32 , . .mientras que la radiomarca de P paso a comportarse como fosfato morgómco .
Dado que un tratamiento alcalino idéntico del DoI-P-Man de insecto liberó manosa - 2
fosfato ( debido a Ia configuración (5 de la manosa en el glicolipido ) (ver capitulo
214
143.3.2 y 136 ) , seasume que la sustancia "rápida" aniónica debe ser i. C]-manosa
-2- [32P] proveniente de doliquil- [32P] - [MC] Man.
3, 10.5. Adición d_edo|ico| fosfato
Se diseñó un experimento de dilución ísotópica consistente en incubar extractos de in
[ -32 ] [14 J . .secta con K P ATP y GDP C Man con o sun 50 nanomoles de Dal-P de higado
32purificado. La incorporación de P al Dol- [32P]- [I4C1Man decreció 18 veces
sugiriendo una competencia entre el DoI-P exógeno y el aceptar endógeno radiomarcada
( Tabla 68 ) . Analizando en cromatografía de capa fina los productos de las incubaciones
2TABLA68: Efecto del Dol-P en la marcación de Doi-P-Man con 3 P
Proporción 32P / “’c en
Do]-P-Hanosa Dol-P-P-OI ¡gosacárídos
SIN ADlClONES 0,350 0,023
+ Dol-P (SO nanomol) 0.019 0.056
Cálculos en base a 3 experimentos.La concentración de Dol-P seexpresa en base a la cantidad de fósforo presente.
conteniendo DoI-P exógeno se observó un pico de radioactividad diferente del que se ve en
32el control, en ausencia de DoI-P . Se trata de una sustancia radiomarcada con P de
movilidad intermedia ( Rf.: 0.55 ) entre la del DoI-P-Man (RL: 0.60 ) y la de los
215
polipreniI-oligosacóridos ( Rf.: 0.44 ). Esaes la posición en que cromatografía el DoI-P
( dosado enzimáticamenfe ) por Io que puede asumirse que el Dol- [32P] se acumuló debido
a la presencia del DoI-P no marcado.
3.10 ó. Adición d_edo|ico|
EI dolicol de higado añadido a la mezcla de incubación suplementada con ATP estimuló
la biosintesis tanto del DoI-P-Man marcado con ¡4C como la del DoI-P marcado con
32P ( Tabla 69 ) . Esta estimulación dependióde la cantidad de dolicol de insecto endógeno
TABLA69:Efecto de la adición de Dolícol
(A)Biosïntesis de Dol-P-(H'C)Man (B)Biosïntesís de DoI-(3ZP)
ADICIONES CPM Z DO] añadido CPM Z deestim. estim.
Ninguna h.232 ' EXPERIMENTO I
+2,3mM ATP ¿6.9616 ¡7,2 Ninguno 907
+50 ug Do] A.AI3 h,o + ¡5 ug I 7h3 92.2+ 2,3 mM ATP+ S ug Do] 5.185 22,5 EXPERIMENTO Il
+ 2,3 MM ATP . _+15 ug Do] 5.6¿‘2 33,3 Ninguno 1.19“!
+ 2 3 mH ATP + ¡5 ug 2 875 99.1+ SO ug Do] 5.867 38,6
La misma mezcla de incubación que en la Faura con las siguientes modificaciones: (A) Se omitió e] ATPradiomarcado y se hicieron los añadidos indicados. Laconcentración del Tritón X-IOOfué de 0.03% . (B) Se omitió el detergente y seutilizaron ¡,6 x105 cpm de GDP(1hC)Man (apFóx.9 uM) en lugar del GDP-Man. Lasmuestras se procesaron y cromatografiaron comose indicó anteriormente.La radíoagtividad se localizó cortando bandas de 0,5 cm. y contando en centelleador líquido.
216
presente en las membranas Ceratitis que se ha estimado entre 1.4 y 3.7 ¡Jg por gramo de
de proteina ( ver capitulo 3.8.0. ) . Por ello se precisa para observar el efecto de dolicol
que las membranas posean baios niveles del mismo.
El posible efecto de solubilidad de membrana o de disminución relativa de los detergentes
naturales ( fosfolipidos ) se descartó, ya que en los presentes experimentos el agregado de
Tritón X-lOO entre 5 y 30/JMOICII’estimuló sólo ligeramente la formación endógena de poli
prenil derivados.
Esto es opuesto a lo previamente descripto para las preparaciones enriquecidos en micro
somasy puede ser debido a que éstas tienen habitualmente mayor proporción de fosfolipidos
con respecto a los Iipídos total . Esdecir que las suplementaciones de dolicol, realizadas
en presencia de Tritón X-lOO estimularon por encima del ligero incremento de incorporación
proporcionado por el detergente.
Losresultados indican que gran parte del 32? incorporado apareció en los doliquil
derivados. Esto quizás se explique por el ba ¡o nivel de sintesis de glicero-fosfoli'pidos a los
ó - 8 dias del ciclo de vida de Ceratitis ( 421 ) y a la baia tasa de recambio de
muchos de estos lipidos en los insectos ( 422 ) .
Como el dolicol estimuló la incorporación de 32P , la mayor parte - al menos - de
los Fosfatosdeberian ser atribuidos a una poliprenil quinasa similar a la descripto para bac
terias por Strominger y col. ( 32 ) ( ver discusión al respecto en la página 208 ) .
La(s) actividad(es) de quinasa no hdp)podido purificarse en los teiidos de insecto, aún
usando solventes orgánicos, método empleado por Strominger y col. en la purificación
de lo poliprenil quinosa procariófica ( 32
217
218
4. DISCUSION
Losresultados obtenidos en el transcurso del presente trabajo de Tesis han extendido los
conocimientos previos sobre el metabolismo de dolicol a los artrópodos ( fundamentalmente
a los insectos ) . Además, en e'stos se han realizado hallazgos que probablemente sean ex
tensibles a los demós eucariotes, como la detección por vez primera de una dolicol kinasa.
Se aportan también en el presente trabaio, datos que correlacionan estadios de diferencia
ción con biosintesis de derivados de dolicol .
Walton y Pennock, en 1972, habian descripto la biosintesis en invertebrados de poli
prenoles de cadena larga, a partir de ( 14 C ) - mevalonato . En particular, el cangreio
ermitaño, EuEgurus bernhardus, y el cangeio de playa, Carcinus maenas, resultaron capa
ces de sintetizar "in vivo" un aparente dolicol ( 25 ) . Este trabaio, al menos en lo que
a artrópodos respecta, no tuvo confirmación hasta que, al comienzo de esta Tesis, se detec
taron dolicol y doliquil fosfato en extractos de la mosca mediterránea, Ceratitis capitata,
y otros insectos. El dolicol de insecto se identificó en base a su comportamiento cromatogrcí
fico en diferentes sistemas ,a su detección colorimétrica con reveladores relativamente es
pecificos, a su fluorescencia baio luz ultravioleta y - fundamentalmente -, cuando está
Fosforilado, a su capacidad de activar doliquil monosacórido transferasas de higado. La
sustancia radiomarcada de crustáceos solamente se identificaba por su movilidad cromatogra
fica. Poco después, confirmando nuestros resultados, Beedle y col. , encontraron que los
. . . . 14extractos de la mosca Calllphora erythrocephala suntehzaban a partir de ( C )-mevalonato
una sustancia que co-cromatografiaba con dolicol ( 28 ) . Losdatos de estos autores refe
219
rentes al tamaño del dolicol de insecto coinciden con los nuestros que estimaban al componen
te principal como de 18 isoprenos (ver pógina 145 ) .
Se acepta generalmente que la mayor parte de los insectos ( 406 al 408 ) y de los
restantes artrópodos ( 409, 410 ) asi' como muchos invertebrados, SOnincapaces de sintetizar
colesterol y otros esteroles. Una dieta sin estas sustancias es letal. El ócido mevalónico, el
escualeno o el Ianosterol son incapaces de reemplazar los esteroles (406 ) . Clayton
( 407 ) y otros autores han sugerido que los insectos requieren colesterol y otros esteroles
como precursores de ecdisonas ( hormonas de la muda ) y como componentes de membranas.
Por otra parte, todos los invertebrados investigados hasta ahora, salvo una esponía, son
capaces de sintetizar dolicol y también ubiquínma ( 25, esta Tesis ) .
Losexperimentos en moscas con ócido mevalónico marcado muestran que este precursor
puede incorporarse al dolicol ( 28 ) . En cambio ese mismo precursor no se incorpora al
colesterol. Esta Última deficiencia no es letal porque los insectos reciben colesterol en su
dieta. Seguramente también reciben dolicol . ¿ Porqué en un caso la cadena metabólico
se ha hecho deficiente y no en el otro ? Una posibilidad es que el dolicol de la dieta no es
absorbido ( o - aunque lo sea - es insuficiente ) y esto habria acarreado, a lo largo de
la evolución, la desaparición de los organismosdeficientes.
Esde destacar que en presencia del antibiótico tunicamicina, que inhibe la formación
de Dol-P-P-GlcNAc, además de detenerse la biosr'ntesis de glicoprotel'nas, se interrumpe el
desarrollo. Por eiemplo en el hongo Neurospora c_ras_sg_las conidias desarrollan en un micelío
aberrante, muy fino, a su vez incapaz de conidiar normalmente ( Torres y col. , datos no
publicados ) .
En el presente trabaío se ha detectado por primera vez doliquil fosfato en los teíidos de
220
insecto. Behrens y Leloír lo habian descubierto en higado de mamífero ( ó ) . Después,
Jung y Tanner lo detectaron en levaduras ( 57 ) y, en el Instituto de Investigaciones Bioquí
micas, en plantas ( 58 ). Lascantidades calculadas de Dol-P presente en teiidos de insec
to ( capitulo 3.1. y Tabla 67) son sólo estimativas. El dosaie enzimático sólo proporcig
nó una idea aproximada, pues se desconocen las condiciones óptimas para muchas incubacio
nes y el Kmde las glicosil transferasas Dosaíes más exactos podrian haberse obtenido reali
zando curvas de concentración del Dol-P de insecto y del nucleótido-azücar ( Dankert,
comunicación personal ) .
En general se acepta que el Dol-P se biosintetiza - a semeíanza del undecaprenil-P
bacteriano - por defosforilación del Dol-P-P ( 19) ( ver capitulo 3. lO ). Enesta
Tesis se describe la obtención de Dol- ( 32P ) - Man y Dol- ( 32P ) a partir de
ATP - ( .32P ) . Como ya se ha indicado, Beedle y col. demostraron que los huevos de
Calliphora sintetizan [HCJdolicol incubóndoloscon DL- 2-[14C] ócido mevalóníco
lactona. Luego seria necesario descartar que el 32P que aparece en Dol-P-Man no pro
venga de la mevalonato kinasa ( Figura 108 ) . No se han detectado ácido mevalónico
fosfato ni isopentenil pirofosfato en nuestros extractos. Sin embargo no se puede descartar
que una parte del 32P provenga indirectamente del ‘32PJ-ATP a través de la via
indirecta de Ia fosforilación de mevalónico.
Por otra parte no se puede excluir que el verdadero dador de fosfatos se: otro nucleósido
trifosfato, previamente fosforilado por ATP .
Hasta ahora sólo se conocia la poliprenil quinasa de procariotes, descripto por Strominger
y Col. ( 32 ) . Teniendo en cuenta que la cantidad de Dol-P presente en todos los
teíidos estudiados por diferentes autores ( ver Tabla 67 , página 208 ) es menor que la
221
cantidad de dolicol, cabe suponer que exista una poliprenil quinasa similar en todos los
eucariotes. Esta enzima tendria como función aumentar la disponibilidad de Dal-P por una
via más rápida que la sintesis a partir de mevalonato . ( En los ensayos "in vitro", la can
tidad de DoI-P endógeno/¿Barentemente limitante de la actividad de las poliprenil-glicosil
transferasa ) . Por tanto es posible que la poliprenil quinasa eucariótica sa: una enzima
clave, suíeta a regulación.
Losresultados obtenidos sobre formación de doliquil monosacóridos en los artrópodos re
fuerzan la idea de que se trata de un proceso común a todos los eucariotes.
La doliquil-fosfato-manosiI-transferasa de insectos ha sido detectada en varios estadios
del ciclo de vida ( larva, larva en apolisis, pupa, pupa madura y adulto ) . En el crustáceo
Artemia sp se detectó también sintesis de Dol-P-Man desde poco después de la completa
hidratación de las gástrulas enquistadas ( Figura 107) . En todos los casos pudo observarse
formación de Dol-P-Man a partir de Dol-P endógeno.
La doliquil-fosfato-manosil-transferasa presente en los extractos microsomales de insecto,
preparados en presencia de Mg2+ y de anti- oxidantes, permaneció activa a -70° C durar;
te un año, manteniendo al término el 15 % de su actividad. Encambio, la acetilglucosa
mínil transferasa de los mismosextractos se inactivó en menos de una semana. Parecerl'a que
la manosil transferasa es menos sensible a la acción de las proteasas bien por su estructura
o bien por su ubicación en las membranas.
En insectos se formó Dol-P-Glc "in vitro" en todos los estadios del ciclo de vida pero
222
- frecuentemente - la biosintesis a partir del Dol-P endógeno fue indectectable, debiéndose
añadir a la incubación Dol-P exógeno. En experimentos con teiidos de Triatoma en cultivo
se detectó, también ( ver página H4 ) biosintesis de Dol-P-Glc, a partir de [14 C] Glc.
La actividad especifica aparente de la glucosil transferasa comparada con la de la mano
sil transferasa fue, en insectos, mucho menor. Establecer comparación entre actividades
aparentes puede carecer de sentido dado que no se conocen las concentraciones endógenas de
sustratos, los Kmde las enzimas, las condiciones óptimas, etc. En insatos se conocen
numerosas manoproteinas (ver Introducción ) y en los mamíferos la parte interna de las gli
coproteinas sintetizadas via Iipidos intermediarios es rica en manosas. Cabe suponer, enton
ces, que la aparentemente alta actividad de las doliquiI-manosiI-transferasas sea un refleío
de la multiplicidad de funciones del DoI-P-Man como intermediario en la manosilación de
diferentes proteinas.
Se detectó la Iipido acetilglucosaminil transferasa de insectos - en ensayos "in vitro"
solamente en ciertos momentos del ciclo de vida. En Triatoma se pudo medir transferencia de
GIcNAc a Iipido sólo inmediatamente después de Ia emergencia del imago. En Ceratitis las
preparaciones másactivas fueron las realizadas con larvas de ó dias ( antes de entrar en
inmovilide ) y los adultos farados ( pupas ) en el momento de comenzar la pigmentación
de las ommatidias. Esta dificultad en la detección de la GIcNAc-transferasa ( habitual
también en otros sistemas ) puede responder a numerosas causas. La baia radioactividad
especifica del UDP- [MC] GlcNAc probablemente se ve agravada por el alto contenido de
UDP-Acetilhexosaminas ( hasta 4 .umoles/g ) en teíidos de insectos (411 ) . Además,
como para las otras transferasas/se desconoce el Kmy las condiciones óptimas de incubación
estas varian de acuerdo al contenido de lipidos totales, alimentación previa, etc.
223
Por Último, como ya se indicó, la doliquíl-GIcNAc transferasa es muy sensible a las
condiciones de preparación y almacenamiento. La preparación del homogenato debe ser lo
conpreferenciaconviene usarN2 liquidoparacongelar losinsectos. Se
requiere la presencia de un antioxidante de sacarosa y magnesio. En experimentos "¡n vivoll
se obtuvieron también pequeñas incorporaciones de radioactividad a un aparente poliprenil
GIcNAc. Tanto en Triatoma, como en Períplaneta, sólo se lo detectó inmediatamente des
pués de la muda.
En los experimentos "in vitro" , para obtener cantidades medibles de Dol-P-P-GlcNAc
se necesitó suplementar con Dal-P exógeno. Es interesante destacar que una cantidad dada
de Dol-P de higado agregado estimuló en mayor medida la biosïntesis de Dol-P-Man o de
Dol-P-Glc que la de Dol-P-P-GlcNAc, con respecto a como la hizo el Dal-P de insecto
(Ver Figuras 44 , 53 y 67 , páginas 44 , |34 y l50 ) . Esdificil
interpretar este hecho experimental, pero parecería haber una mayor necesidad de especifici
dad en Ia bíosintesis del DoI-P-P-GlcNAc. Esta especificidad podria estar dada por una
utilización preferencial, por parte de la enzima, de dolicol de un largo de cadena menor.
Fenómenos de este tipo han sido sugeridos por Pennock ( 290 ) . En cuanto a la posibilidad
de que el aceptar de GlcNAc en insectos no sea dolicol ( posibilidad siempre latente porque
no existen identificaciones a nivel de espectro de masa ) existe un gran número de isoprenoi
des de cadena corta en los teiidos, que se descartan por sus propiedades cromatogróficas. Las
vitaminas con cadenas isoprenoides( A, E, K, D ) podrian quizas actuar como aceptores del
resto GlcNAc ( u otros azúcares ) pero el comportamiento cromatogrófico del glicolipido
resultante seria diferente al exhibido por el Dol-P-P-GlcNAc. La transferencia de GlcNAc
reviste en los artrópodos una importancia particular. Además de las acetilglucosaminas presen
224
tes en las glicoproteinas, alrededor del 30 % del peso de la cuticula está constituido por
quitina ( fundamentalmente poli-N-acetilglucosamina ) . Enel capitulo 1.4.2. se discutió
la posible composición de la quitina y su unión a glicoproteina (ver Figura l5, página
43 ) . Hackman ( 315 ) estima probable que existaademós de la unión a proteina a través
de residuos Aspartilo, otras uniones a histidilos. Lipke y col. ( 310, 313 ) concluyen
también que Ia quitina está unida a aminoácidos no aromáticos por enlaces covalentes.
Esde hacer notar que se detectó por primera vez la Doliquil -G|cNAc transferasa de
insectos en experimentos "in vitro" diseñados para obtener sintesis de quitina ( 164, 1m ) .
En la incubaciones de Dol-P-P-GIcNAc con enzimas de insecto se ha obtenido transferel'n
cia del GIcNAc a una proteina con el resto oligosacaridico (5 -e|imínable. Esto hace
suponer que se trata de una glicoproteina con un enlace del tipo O-glicosidico ( ver Figura
12, página 35 ) , que no tendria que ver con la quitina (425 ) .
Por otra parte, varios autores han estudiado en hongos la posible participación de lipidos
intermediarios en la sintesis de quitina, sin obtener ningún dato concreto (423,424) . Sólo
McMurrough y Bartnicki-Garcia observaron un aumento en Ia biosintesis de quitina en
Mu_cor,suplementando el medio de cultivo con extractos Iipidicos del mismo hongo ( 358 ) .
Encualquier caso, la "quitina" de hongos - que es el residuo insoluble en ólcali caliente
está relacionada con otros componentes de la pared celular de manera totalmente distinta a
como se estructura la poli GIcNAc en la cuticula de insectos ( 308 ) .
Eneste trabaio de Tesis, se ha detectado la incorporación de [MC] GaINAc a glico- '
Iipidos, a partir del derivado de UDP. Analizados,|os glicolip'dos formados se comporta
ron como doliquil-azücares y liberaron por hidrólisis ácida suave [MC] GalNAc y
[MC] GIcNAc. Aparentemente, se trata de la primera vez que se ha detectado un
225
aparente polipreniI-GalNAc. La formación de este glicolipido se obtuvo en diferentes
experimentos, con diferentes preparaciones enzimáticas. El hecho de que se obtenga también
la biosintesis del doliquil-P-P-GIcNAc implica que durante la incubación actuó una epime
rasa bien a nivel de nucleótidos azúcar ( 39] ) , o bien a nivel de lipidos. Esta cuestión
y el eventual papel que cumpla la presunta lipido-GaINAc transferasa requiere mayores
estudios. Se puede pensar que la enzima biosintetiza nte del Doliquil-GaINAc sea la
mismaGIcNAc-transferasa que posea inespecificidad con respecto a la hexosamina. Sin em
bargo se debe tener presente que se acepta que el UDP-GaINAc es el nucleótido azúcar más
abundante en teíidos de insecto ( 41] ) sin que se sepa a dónde son transferidos los restos
GalNAc .
En preparaciones realizadas con larvas de Ceratitis de ó dias ( ¡usto antes de que entren
en apolisis ) se logró obtener un aparente Iipido-diacetilquitobiosa. Este lipo-oligosacórido
se logró elongar con manosas a partir de GDF-Man.
La naturaleza de los productos obten ¡dos se discute más adelante.
Seria interesante, sin embargo, obtener cantidades suficientes de lipido-diacetilquitobiosa
de insecto para estudiar la posibilidad de que el disacórido sea transferido directamente a
proteina, como se ha comunicado sucede en hongos ( l58 ) . Datos previos ( ver Tabla
65 , pagina 20] ) indican'an una posible formación de la misma glicoproteina (Ó
eliminable que se formóa partir del lipido-GlcNAc.
226
Losexperimentos expuestos en el capitulo 3.4. demuestran la formación in vitro
en insectos de polipreniI-oligosacóridos conteniendo manosa. Estosparecen ser sintetizados
a partir del lipido difosfato diacetilquitobiosa. Las evidencias surgen del análisis del resto
sacaridico del Iipido-trisacórido, de los experimentos de competencia ( página 179 ) y elon
gación ( pógina 184 ) y del comportamiento de los lipo-oligosacóridos sometidos a diferen
tes ensayos. El manosilo para la formación del lipido-trisacórido proviene del GDF-Man.
Se descartó la posibilidad de que los productos de degradación de este nucleótido-azücar o
el Dol-P-Man fueran los dadores. Losdatos para los insectos coinciden con lo descripto por
Levy y col. ( 20] ) : los microsomas de oviducto de ga Hina transfieren la Man del GDP
Man al Dol-P-P-diacetilquitobiosa agregado exógenarnente. Estosdatos del grupo de Leloir
han sido confirmados por otros autores, en diferentes sistemas ( 43 )
Los lipo-oligosacóridos de insecto radiomarcados en manosa y de tamaño aparente mayor
que el lipido-trisacórido, parecen formarse por sucesivas adiciones de manosas a este Último.
Losexperimentos de incorporación de radiomarca ( página 174 y siguientes ) y el análisis
de los restos oligosacan'dicos manosilados indicarian también que los lipo-oligosacóridos de
insecto forman parte de una " serie cuya " cabeza seria el lipido-trisacórido al cual
se ensamblarl'an,secuencialmente, las manosas ( Figura 86, página 172 ) . Y esto parece
confirmarse por el hecho que los lipo-oligosacóridos radiomarcados con ( 14C ) Glc NAc ,
obtenidos por elongación del |ipido-P-P-( Glc NAc )2 mediante la adición de GDP-Man en
la incubación, son indistinguibles de los radiomarcados en la manosa.
En nuestro sistema, se obtuvo una relativamente mayor sintesis endógeno de lípido-trisg
córido y lipido-" tetrasacórido que en otros sistemas eucarióticos. En higado ( H4 ),
aorta ( 128 ) y plantas ( 102 ) es mayor la proporción de lipido-oligosacóridos
227
de tamaño aparente mayor. Estopuede ser atribuido a la presencia, en insectos, de más
aceptores endógenos de menor tamaño. A este respecto, resulta interesante el hecho de que
la adición exógena de extractos lipidicos de higado a la mezcla de incubación con enzimas
de insecto, estimuló la sintesis en forma diferente a como Io hicieron los extractos de insecto
( Figura 80, página 165 ) : Lasenzimas de insecto sintetizaron un espectro de lipo-oligosa
córidos tipico de las incubaciones con enzimas de higado. Esto indica que los aceptores pri
sentes en Ia incubación fueron determinantes; confirmando, de paso, la aparente inespecifi
cidad - destacada por otros autores ( 43,45,4ó ) - de las poliprenil transferasas.
Por incubación de Dol-P-Man o de Iipido-trisacórido con enzimas de insecto se obtuvo
la formación de un lipido-oligosacórido cuyo resto sacaridico se comportó como un malto
oligosacórido de 8 - 9 u nidades. Este glicolipido presenta caracteristicas similares al ob
tenido por Brett y Leloir ( 62 ) en plantas, por elongación de un |ipido-" pentasacórido."
Oliver y Hemming ( 205 ) describieron también una sustancia similar cuyo resto azúcar
se comportó como un malto-oligosacórido de 8 a lO unidades. Desconoce mos hasta el momen_
llto si el lipo-oligosacórido de mosca que se comenta en este capitulo y que se obtuvo
vitro " , está relacionado con la sustancia de tamaño aparente similar obtenida en cultivo
de epidermis de " vinchuca " ( sustancia IV, ver página H7 ) . En cualquier caso,
tanto los datos sobre formación de sustancias in vitro como los obtenidos en condiciones
l D I o a I a n o Ímas fusologlcos, indican que existen numerosas reaccnones de transferencra de azucares entre
lipidos intermediarios y desde éstos a las proteinas, muchas de las cuales no conocemos
todavia. Parece existir una compleia regulación de esas reacciones ya que hemosvisto
( capitulo 3.9. , pógina 202 ) que la actividad aparente de las glicosiltransferasas varió con
el momentodel ciclo de vida. A este respecto, es de destacar que en Artemio se detectó
228
una muytemprana actividad de poliprenil fosfato glicosil transferasas con respecto al comien
zo de la activación del metabolismo de las gastrulas desecadas. Durante ese proceso, y
hasta pasadas ló hs, no existe crecimiento ni duplicación celular pero si una gran diferencia
ción; ello sugeriria que los poliprenil-azücares ¡uegan un palel primordial en este proceso de
transformación celular.
El lïpido-oligosacórido-glucosa de insecto obtenido " in vitro " presentó todas las
caracteristicas del aceptor glucosilado de higado descripto originalmente por el grupo de
Leloir ( 143 ) ( ver Figura 7, página 23 ) . La sustancia de insecto presentó la solubilidad
caracteristica del EA-Glc: es insoluble en mezclas de cloroformo/metanol y en agua y total
mente soluble en el solvente de Leloir ( cloroformo/metanol/ agua 1021023) . Si se lo
lleva a seco con N2 y se lo resuspende en l-propanol/agua 65:35, se lo puede precipitar
selectivamente duplicando la proporción de propanol. Este comportamiento es tipico de la
sustancia de higado ( 145,146) . Finalmente, ambas sustancias se comportaron igual en
presencia de concanavalina A (página ¡91 ) . El tamaño aparente del principal resto
sacaridico de insecto parece algo menor al de higado ( Figura 102, página 94 ) . En leva
dura, Parodi demostró que hay dispersión de tamaños y aisló, además de una especie de tama
ño similar al oligosacórido de higado, otra de menor tamaño ( 139,140 ) .
Es llamativo el hecho de haberse encontrado formación del Iipido-oligosacórido contenieg
do glucosa en todos los sistemas eucarióticos debidamente estudiados (43:45 ) . Esta sus
tancia parece ser el Último intermediario en la glicosilación de proteinas. En éstas, habitua_l
mente, no se encuentran glucosas (comparar Figura 7, página 26, con la Figura ll, página
34 ) . Esto ha hecho pensar que las glucosas ¡ueguen un papel clave en la regulación de la
transferencia del glicolipido a la proteina , siendo eliminadas posteriormente 095,427).
229
Significativamente, Ugalde y col. , han encontrado en higado una glucosilasa que actúa
especificamente sobre el EA-Glc y sobre el oligosacórido unido a proteina ( 32| ) .
También otros autores han detectado enzimas similares (320,426 ) .
En incubaciones de homogenatos de insecto se obtuvo la glucosilación de proteinas en
dógenas a partir del EA-Glc ( de higado ) agregado exógenamente. Este tipo de ensayo
in vitro puede en algunos casos carecer de significado fisiológico, debido a Ia presen
cia de detergentes que distorsionan las estructuras de las membranas. De todas maneras, el
hecho de que, a su vez, las enzimas de higado reconocen los lipo-oligosacóridos de insec
to, transfiriendo el resto azúcar a proteinas endógenas, abona Ia idea de que, en los artró
podos, la formación de poliprenil-oligosacóridos forma parte de un mecanismo de glicosila
ción de proteinas común a todos los eucariotes. Este razonamiento se impone cuando se
c0nfecciona un diagrama esquematizando la evolución de los eucariotes ( Figura 115 )
(ver página siguiente ) .
Losartrópodos presentan similitudes notorias,en lo tocante al metabolismo de los poli
prenil-azücares¡con aves y mamíferos.Es decir,que en ramas evolutivamente tan diferentes
como los protostomiados y los deuterostomiadosmrece haberse mantenido idéntico el meca'-.
nismo de sintesis de glicoproteínas. Comoquiera que también hay similitud con grupos fi
logene'ticamente muy leianos como hongos y plantas,todo parece indicar que dicho meca
nismo fué tempranamente adquirido en la evolución y seria característico de toda célula
eucariotico actual. Hipotéticos mecanismosalternativos y/o modificaciones en el ciclo de
los dolíquiI-derivados deberian,entonces,haber sido eliminados a lo largo de los procesos
evolutivos.Una excepción podria ser la glicosilación del retinol-P,sí éste tuviera participa_
ción en la glicosilación de proteinas.(429).
230
Esquemade las relaciones filogenéticas entre grupos de eucariotesFIGURA 115 :
Q DOLlCDLSOLAMENÏE
DOLiQU I L TRANSFERASAS
DOUQUIL TRANSFERASAS
( ESTA ïESlS )
(El (who de hs flechas de Ideadel "duro ¡to reacclonos detectadas)
€¿ o“005
. L0“Ate
‘ N. u Lai.... 'Esvonxns" .
l ‘ '. ¡r l I ' 2: z-¡' g R’Paamsnwï;
Ü a, "PLD I _ Ïi., ¡ya‘ g ’ ¡humos '
. 2-! C = xï.‘ A.3 0 . .. ‘ 3; :;
“2.. * 5 ‘ Zwoéaas - M E T A1005 aatr- ' \ 46 ' '_ e \ g -. q .
.. ¿3; ' 14391105 °"tu: .e' a ' . ‘V h É. ..,\ ' . . 5.... . 1.“' PHOTOZOOSEUCARioTES
AL‘ASAIULCS . .PROCARtOTES
Estímamosque los estudios presentados aqui apuntalan la idea de que el papel de los
doliquil intermediarios en esos procesos se estableció tempranamente en la evolución de los
(55,I33 ) eneucariotes. Nuestros datos en Euglena y los estudios de Keenan y col.
Tetrahzmena son, a ese respecto, sumamente sugestivos.
231
Cuando aumente el número de organismos estudiados se podrá saber si, realmente, en
todas las células nucleadas el dolicol es el principal transportador de azúcares. De ser asi
se reforzari'a la idea de un origen monofilético para todos los eucariotes. Por tanto, es de
sumo interés investigar grupos de protozoarios y algas eucarióticas primitivas con obíeto de
constatar si todos ellos sintetizan dolicol y doliquil derivados. También resulta necesario
con0cer si las cianaficeas (algas azules ) poseen Iipidos intermediarios del tipo bacteriana
o del tipo eucariótico . Por otra parte, no se puede descartar que en algün grupo eucario
te ( especialmente en talófitas ) exista formación de sustancias del tipo poliprerol -azücar
péptido, como persistencia de caracteristicas del hipotético ancestro procariótico.
Llama la atención el hecho de que, quimicamente no existen grandes diferencias entre
los lipídos intermediarios bacterianas y los eucarióticos : los primeros son de cadena corta
( lO u ll isoprenos ) , e insaturados en el isopreno d , mientras que los segundos son
largos ( entre l7 y 22 isoprenos ) y saturados. Aunque en plantas existen, además,
en gran cantidad, poliprenoles cortas ( ó a 13 isoprenos ) , como Pont Lezica y col.
( 58 ) han sugerido, éstos no estarian involucradas en el transporte de azúcares. Perma
nece abierto el interrogante de Romero ( 197 ) sobre cuál seria su función.
En esta Tesis, comprobando lo encontrado anteriormente en otros sistemas ( 58, 197
se vió que las enzimas de insecto pueden utilizar undecapreníl monofosfato como sustrato
en lugar de Dal-P. El grupo de Dankert ha observado - a su vez - que algunas enzimas
bacterianas son capaces de utilizar el Dol-P ( 58, 197 y comunicaciones personales ) .
Estosy otros autores ( 14, 42, 43 ) han destacado la aparente inespecificidad
de las polípreniI-fosfato transferasas eucarióticas; sin embargo, y como se indicó mós
arriba, el principal acept or de glicosilos en todos los eucariotes estudiados parece ser el
232
dolicol fosfato.
Es decir que, a pesar de su similitud quimica y de una notoria inespecificidad de los si
temas enzimáticos, es un hecho que los poliprenoles cortos y alilicos estén asociados a un tipo
de proceso ( formación de peptidoglucano bacteriano ) y que los largos y saturados están
involucrados en otros ( glicosilación de proteinas ) . Nuevamente baio una óptica de
evolución bioquímica se podria postular que se han producido tres eventos para originar los
intermediarios eucarióticos : la selección de una cadena larga, la saturación del isopreno
terminal y la especialización para la glicosilación de proteinas. Loque nos lleva otra vez a
una discusión filogenética como la realizada más arriba.
233
5. CONCLUSIONES
i - Se detectó, por primera vez en invertebrados pluricelulares, Ia formación in vivo
e in vitro " de derivados de poliprenoles.
2 - EI aceptar de glicosilos en los insectos y crustáceos resultó indistinguible del dolicol
fosfato de mamiíeros .
3 - Se extraio por primera vez dolicol de teiidos de insecto; parece estar constituido por
17 a 18 isoprenos.
4 - Se estudió la formación, en Ceratitis capitata y otros insectos, del DoI-P-Man y
Dol-P-Glc que,por los criterios usados, resultaron indistinguibles .de los homólogos
de vertebrados.
5 - Se comprobó la formación de Lipido-P-P-GIcNAc en Ceratitis, Triatoma y otros insec
tos - " in vivo " e " in vitro " - .
ó - Por primera vez se ha detectado la formación de díacetiI-quitobiosa, unida a lipido,
en artrópodos. Este disacórido es Ia unidad repetitiva en la quitina, poli-Nacetilgluco
samina, principal componente del exoesqueleto cuticular en dicho phylum.
7 - El polipreniI-P-P-trisacórido de insecto parece idéntico al de otros eucariotes:
DolícoI-P-P- ( GIcNAc )2 - Man . Se comprobó que se forma por elongacíón del
234
Dol-P-P-( GlcNAc )2 con la manosa procedente del GDF-Man.
8 - Se estudiaron los lipido-oligosacóridos de insecto radiomarcados en manosa, que parecen
formarse por elongación del Iipido-trisacórido con manosas procedentes del DoI-P-Man
y del GDP-Man. La cinética y condiciones de formación in vitro son similares a
las de otros eucariotes. Algunos de estos lipo-oligosacóridos se han detectado " in
vivo " en insectos y en Artemio salina.
9 - A partir de Dol-P-Man y Dol-P-P- ( GIcNAc )2 Man se obtuvo " in vitro " la for
mación de una sustancia que se corríportócomo un poliprenil-azúcar con el resto sacarí
dico de un tamaño aparente de 8 - lO monosacóridos. Esta sustancia podria ser rela
cionada con una de similares caracteristicas que se obtuvo cultivando epidermis de
vinchuca con [MC] Glc.
lO - Se obtuvieron fracciones purificadas de insecto que estimularon la biosintesis ¡n vitro
de los poliprenil-oligosacóridos y se demostró que contienen derivados de dolicol.
ll - En insectos, como en todos los eucariotes debidamente investigados, se formó un polipre
nil-oligosacórido largo, conteniendo Glc, de caracteristicas idénticas al aceptor endó
geno glucosilado descubierto por el grupo de Leloir en higado. Esta sustancia parece
ser el Último intermediario en la glicosilación de proteinas.
12 - El DoI-P-P- ( oligosacórido ) Glc de higado fue reconocido como sustrato por las enzi
mas de insecto, que transfirieron el resto oligosacarl'dico a un aceptor endógeno. Inver
samente, los microsomasde higado catalizaron la transferencia del resto sacan'dico del
235
lípo-oligosacórido de insecto.
Se obtuvo, por primera vez en los eucariotes, la fosforilación del dolicol por una pre
sunta poliprenil quinasa. Este resultado abre interesantes perspectivas de estudio, ya que
se trata de una posible enzima clave para la regulación de la biosintesis de glicoproteinas.
Muchos de los resultados obtenidos en Triatoma y en Ceratitis han sido comprobados en
otras especies de insectos y en Artemio salina. En este Último organismo se ha demostro
do que la formación de poli prenil-azücares es un evento muy temprano en la reiniciación
n . .1 Ide la diferencmcuon de la gastrula desecada.
La actividad de cada poliprenil transferasa sufre variaciones o lo largo del ciclo de vida
del insecto. En la apolisis de Ceratitis y en la intermuda del V° estadio de Triatoma
algunos enzimas fueron indetectables.
Losdatos obtenidos en artrópodos y los estudios preliminares en Euglena y Neuros ora
han aportado solidez a lo postulado por otros autores que sugirieron la extensión de los
resultados obtenidos en mamíferos, levaduras y plantas, a todos los eucariotes.
Se han discutido los resultados de la presente Tesis baio la óptica de la bioquimica evo
lutiva, y se ha sugerido que:
- éstos apuntalan la idea de que el papel del dolicol, como aceptor de azúcares e in
termediario en la glicosilación de proteinas, se estableció tempranamente en la evolu
o) 0' IClon eucaruotica.
- se deben realizar estudios en grupos clave, por eiemplo, en las algas azul verdosas,
236
para conocer qué tipo de “pido-intermediario poseen ( pro- u eucoríófíco ) y en
profísto y algas unicelglores para ratificar que el dolícol es el principal intermediario
en eucoríotes. Se propone que si esto fuero cierto se reforzon'o lo idea de un origen
monofilefico para todo célula eucariótica.
237
Abreviaturas de los titulos de las revistas
Se utiliza la nomenclatura aceptada internacionalmente salvo para los
titulos de revistas citadas numerosas veces que se abrevian como se indica
a continuación, de acuerdo al criterio adoptado por Thomas E. Barman en
el Enzyme handbook, T0mos | y II (1969) y Suplemento (1974). Springer
Verlag. (Berlin).
ABB
NN. REV. BIOCHEM.
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Distribución de las referencias por revista
N°citas % del total
. ABB 14 3,2
. BBA 30 6,9
. BBRC 30 6, 9
. Bíochemistry 9 2, l
. BJ 8,0
. Comp.Biochem 8. Bio. 9 2,]
. EJB ió 3,7
. FEBS Lett. 25 5,8
. lnsect Biochem. 9 2,l
. JBC 63 14,6. Nature 9 2,]. PNAS 15 3,4. Restantes lóó 39,0 (c/u menos de 2% ). Total 429 100,0
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INDICE DE PRIMEROS AUTORES
ADAMANY, 125,393ADAMS, 285ALAN, 92,9AAMINOFF, 38AANDERSON,J.S., 8ANDERSON,J.M. 279ARNOLD, 177,220ASHwELL, 300ATTwOOO, 2A1
BABCZINSKI, 78BAHL, 37ABALLOU, 288BARR, 23,38,86BAYNES, 66BEEDLE, 28BEHRENS, 6,AO,10A
11A,1A3BELOCOPIT0w,136,305BERTHILLIER, 120BEYTIA, 19BIANCHI, 295BRAY, 356BRECKENRIDGE, 30,105BRETT, 62BRETTHAUER,77,82BURGOS, 31,51BURRows, 380BUTLER, A16BUTTERwORTH,52,5A
CABIB, 306,390CACCAM, 37CAPUTTO, 2CARDINI, 1 ,391CAREY, 270CHALVARDJIAN,362CHANBERs,128,21ACHANNON, A7,A8CHEN, P.S. , 361CHEN, D.H. , 399CHEN, T.T. , 250CHEN,w.w. ,173,17A
1 0
CHINO, 2A9,260,261CLARCK,A.F. ,96CLARCK,A.J. ,906
/CLAYTON,53,AO7COLLINS 299, 301COOPER, 181CONNOR, 39CLEGG, A05CREAN, 91CRONE, A22
DALEO, 61,63DALLNER, 56, 35AOANKERT, 20DATA FOR BIOCHEMI
CAL RESEARCH, 376DAVIES, 389DEFRETIN, 23ADE FERRARI, 382DEJMAL, 252DE LUCA, 216DIMTER, A9003015, 367DUKSIN, 3A1DUNPHY, 2A
ElSON, 368ENDO, h2hENGELMANN,255.256ERICSON, 98, 3h6EVANS, 65
FAIRBANKS, A1AFINAMORE, A28FlNCHER, 287FISKE, 360FOLCH, 355FORSEE, AA,101,102,
129,162,163,213,FOSTEB. 309FRENCH, A20FRISCH, 3A5
259
GARCIA, 259GAROFF, 3 2GAYLOR, 22GELLISSEN, 258GHALAMBOR, 171GLYNN, 30AGODELAINE, 170GOLD, 85GOTTSCHALK, 5GOUGH, 29GRACE, A01ORANGE, 6A
HACKMAN,239,2A0,315,A25
HARFORD, 108HASSID, A17HART, 331HEATH, 16HEIFETZ, 202HEMMING,1A,112HENTSCHEL, AOAHERNDON, A19HERSCOVICS, 172,69,110
122,123,1A8HICKMAN. 330HINMAN, 99HIGASHI, 12,32HOPP, 32AHOPNOOO, 155HOYLE, 398HSU, 199HUANG, 227HUBER, A13HUNT,L.A. 318HUNT, s. , 225
JEANES, 383JEANLOZ, 113JOCHEN, 218JUNG, 57
KANG, 332KATES, 395KATO, 278KAUSS, 35KEAN, 132KEENAN,55,133,181KELLER, 357KENT, 283, 288,285,
86KIMURA, 312KODAMI, 273KOEPPE, 257KORNFELD, 222,827KRAG, 207KRISHNAN, 282KRISHAN, 316,372KUNKEL,253KUO, 327,339
LAMPORT, 286LEAVITT, 383LEE, 226LEHLE, 337,338,80,
97,157,160LELOIR, 3,81,138,
167,388LENNARZ, 18LETOUBLON,87,88,89,
90LEVY, 201LI, 307LINDAHL, 288LINDH, 287LIPKE, 198,271,310,
311,313,h08Lloyd,3hOLOCKE,298,314LOHR, 373LOWRY, 36hLUCAS,83,131,208LUNDT, 812
HADDRELL, 800MANKOWSK1,119,182,
187MARKHAM, 398MARKS, 823MARSHALL,A.T.,235,236MARSHALL, R.D. ,282
MARTIN, 115MARTIN-BARRIENTOS,151McEVOY, 158McFARLANE, 278McMURROUGH, 358McswEENEY, 377MES, 385MERRITT, 221M1LLER,815MOLNAR, 165MOOKJELA,166MORGAN.'378MOULE. 352MUIR, 802MUNICIO, 210,821MUNN, 263,262MYERS, 350
NAKAJIMA, 289NAKAYAMA, 158NEVILLE, 308NEUBERGER, 283NISHIZAwA,232
OIE, 25h0L|VER,20h,205OSBORN, 15
PALADINI, 387PALAMARCZYK,79,8#,
68PAN,M.L. 288PAN, S.c.,811PARODl,85,86,139,
180,185,186,150,188,291
PATT,176,178PENNOCK,50,29OPERKOWSKA, 272PEwSAR, 292PlGMAN, 223PLESS,200,206PONTLEZICA,58,100,
137POPJACK, 351PORTER, 353PRATT, 353
260
/PORATH, 375PRICE, 297PUCCI, 188
QUESADA,60,135,168180,203
REISSIG,369,370REUVERS, 159,161,333REYNOLDS,3I7RICHARDS, 67,111RILEY, 277ROBBINS, 13,189,319ROBERTS,266RODEN, 228ROMERO, 197RONIN,126,323ROSEMAN,228ROSSO,217,829ROYHFIELD,7ROUSER, 397ROWLAND, 27RUOALL,237,238
SANTELLI,296SASAK, 26,298SCHACHTER, 229SCHNEIOER,E.G.,138SCHNEIDER,G.,388SCHER,195SCHwARz, 322SEFTON,325SEKERIS,26SSENTANOREU,78,76SHARMA, 81SHARON, 8SIAKOTOS, 269SIEWERT, 338SINOHARA, 387,388SISSAKIAN, 280SMITH,103SOMOGY|,365SP|R0,M.J. 192,198SPIRO,R.G.,|93.230
281.393STANELONI, 212STACEWICZ, 215
261
/ YDOYAGA, 191STEINER, 392 YAMAZAKI,H. 231ST0NE,21,396 YAMASAKI,K. 251STORM, 95STROUT, 233STRUCK,179,219 ZANDEE, A10SUSHEELn,ho3 ZATZ, 36SWEELEY,h18 ZATTA, 117,153,169.189
ZINKEL, 293ZWEIG, 371
TABAS, 320,h26TABORA, 187,190TAKATSUK1,326,329,335,
336TANNER, 33,75TERENZI, 162TETAS, 109THOMAS, 259TKACZ,68,121,328TOENNIES, 381TOJO, 26hTREVELYAN, 379TUCKER, 209TUNG, 386TURCO, 156,211
UGALDE, 321
VAN DEN OORD, ho9VESSEY, 116,118VILLANUEVA,83VILLEMEZ, 3h,93
WAECHTER,IO7,h2,12h,152,175
wALTON,25WARBURG,363wARREN,7o,71,72,73,182,
183,18h,185,186weocwooo, 59,196WEINER, 9WHITHE,127WILSON, 275,276WINZLER,366WOLFE,L.S. 106WOLFE,J., 267wRIGHT,1o,11,17,3o3wvATT, 268
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