24 Antioxidants and Multistage Carcinogenesis in Mouse Skin

8/19/2019 24 Antioxidants and Multistage Carcinogenesis in Mouse Skin

1/32

Free Radical Biology Medicine, Vol. 7, pp. 377-408, 1989 0891-5849/89 3.00+ .00

Printed in the USA. All rights reserved. © 1989 Pergamon Press plc

R e v i ew r t i c l e

A N T I O X I D A N T S

N D M U L T I S T G E C R C I N O G E N E S I S I N M O U S E S K I N

JEAN-PIERRE PERCHELLET* and ELISABETH M. PERCHELLET

Anti-Cancer Drug laboratory, Division of Biology, Kansas State Universit y, Ackert Hall, Manhattan, KS 66506, U. S.A.

(R e c e iv e d 21 A p r i l 1988; R e v i s e d a n d a c c e p t e d 1 S e p t e m b e r 1988)

Abstract- -The two-s tep ini t ia t ion-promotion protocol for the induction of skin tumors in mice is a convenient

model to e lucidate what molecular events are involved in the mult is tage process of carcinogenesis and how they

can be mo dulated. The cur rent theor ies concerning the mechanism s of skin tum or init ia t ion, s tages 1 and 2 of

tum or p r om o t ion , and tum or p r ogr es s ion a re r ev iewed . B ecause chem ica l ca rc inogens and tum or p r om ote r s m ay ,

direct ly or indirect ly, generate react ive oxy gen species ROS) and becau se var ious ant ioxidants inhibi t ef fect ively

some of the biochem ical and biological events linked to tumor init ia t ion, prom otion and /or p rogress ion, i t is

conceivab le that dif ferent sequences and levels of free radical-induced mac romo lecule damag e may contribute to

the evolut ion of the epidermal target cel ls f rom the preneoplas t ic s tage to the malignant s tage.

Ke yw ord s- -C arc ino gen esis , Free radical, Antioxidants , Skin tumors , Ini t ia t ion, Promotion, Progress ion

INTRODUCTION

A c c o r d i n g t o t h e m u l t i h i t t h e o r y f o r t h e m o n o c l o n a l

o r i g i n o f c a n c e r , n e o p l a s i a a r i s e s w h e n t h e s t e m c e l l s

o f th e h u m a n t i s s u e s t h a t a re t h e r a n d o m t a r g e t s o f a n

u n d e t e r m i n e d n u m b e r a n d s e q u e n c e o f i n h e r i te d , a c -

q u i r e d a n d / o r s p o n t a n e o u s c e l l - d a m a g i n g e v e n t s a c -

c u m u l a t e n o n l e t h a l , u n r e p a i r e d , i r r e v e r s i b l e , d e f e c t s

t h a t c a n b e t r a n s m i t t e d t o s u c c e s s i v e g e n e r a t i o n s o f

*Author to whom correspondence should be addressed.

Jean-Pierre (PhD, 1974) and Elisabeth (PhD, 1973) Perchellet

were trained in Endocrinol ogy under Dr. A. Jost (Laboratory of

Comparative Physiology, University Paris VI). After serving in the

French Army, Jean-Pierre did postdoctoral work in Biochemistry

with Dr. R. K. Sharma (University of Tennessee Center for the

Health Sciences, Memphis) and in Oncology with Dr. R. K. Bout-

well (McArdle Laboratory for Cancer Research, Univers ity of Wis-

consin, Madison). He is now Associate Professor at Kansas State

Universi ty where he directs the Anti-Cance r Drug Laboratory and

teaches graduate courses in Human Oncology and Cancer Therapy.

His research concerns the biochemistry of mouse skin carcinogenesis

and focuses on the molecular mechanisms by which oxidants, an-

tioxidants, and anthracycline antibiotics modulate the multi-stage

process of tumor promotion. His wife and collaborator, Elisabeth,

held full- and part-time Research Associate positions in Gastroen-

terology with Dr. J.-J. Bernier (INSERM-U54, St. Lazare Hospi tal,

Paris), in Biochemistry with Dr. R. K. Sharma (University of Ten-

nessee, Memphis) and in Gastroenterology with Dr. W. A. Olsen

(Veteran Administration Hospital, Uni versity of Wis consin, Madi-

son) while raising 3 children. Both authors enjoy hiking in National

Parks, playing bridge, and visiting art, history, and science muse-

ums.

d a u g h t e r c e l l s . 1-4 G e n e t i c a n d s o m a t i c m u t a t i o n s , a s

w e l l a s e p i g e n e t i c a l t e r a t i o n s , m a y r e s u l t i n n e o p l a s t i c

t r a n s f o r m a t i o n .

T h e p r e s e n c e o f i rr e v e r si b l e D N A d a m a g e o r a l t er e d

p r o t o - o n c o g e n e s i n c r e a s e s t h e p r o b a b i l i t y t h a t t h e i n -

i t ia t e d c e l l m i g h t n o t r e s p o n d t o t h e r e g u l a t o r y s i g n a l s

f o r n o r m a l g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n a n d , a f t e r n e o -

p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n a n d a p o s t u l a t e d p e r i o d o f d o r -

m a n c y , m i g h t t h e n p r o l i f e r a t e i n t o a b e n i g n o r

m a l i g n a n t t u m o r . B e c a u s e i t i s i m p o s s i b l e t o m o n i t o r

c o n t i n u a l l y t h e l e v e l o f D N A l e s i o n s / r e p a i r i n i n d i -

v i d u a l s t e m c e l l s , i t a p p e a r s d i f f ic u l t t o p r e d i c t i f an d

w h e n s u c h i r r e v e r s i b l e i n i t i a t i o n a n d t r a n s f o r m a t i o n o f

a s i n g l e p r e c u r s o r c e l l m i g h t o c c u r a n d , t h e r e f o r e , t o

d e t e r m i n e a t t h e c e l l u l a r l e v e l w h e n c a r c i n o g e n e s i s

r e a l l y b e g i n s .

T h e e a r l y d i a g n o s i s o f c a n c e r , w h i c h i s c r u c i a l to

t h e e f f i c a c y o f c a n c e r m a n a g e m e n t , i s u n f o rt u n a t e ly

d e l a y e d b y t h e e x t e n d e d p e r i o d o f t im e b e t w e e n t h e

i n it i al i n t e r a c t i o n o f p h y s i c a l , c h e m i c a l o r b i o l o g i c c a r -

c i n o g e n s a t th e c e l l u l a r l e v e l a n d t h e a p p e a r a n c e o f a

n e o p l a s m . I n m o s t s y s t e m s s t u d i e d , t h e r e i s n o e v i -

d e n c e o f n e o p l a s ti c g r o w t h t h r o u g h m u c h o f th e l a t e n c y

p e r i o d . 3 T h e n , a p p r o x i m a t e l y 3 0 c e l l d o u b l i n g s a r e re -

q u i re d f o r m o s t n e o p l a s m s t o g r o w e x p o n e n t i a l ly f r o m

a s i n g l e t r a n s f o r m e d c e l l t o a b o u t 109 t u m o r c e l l s , t h e

e s t i m a t e d l i m i t o f c l i n i c a l o r r a d i o l o g i c d e t e c t i o n i n

h u m a n , s-7 A f t e r o n l y 1 0 f u r t h e r d o u b l i n g s i n v o l u m e ,

377


2/32

378 J. -P . PERCHELLET nd E. M. PERCHELLET

t h e t u m o r b u r d e n m a y b e c o m e l e t h a l t o t h e h o s t . A s

i l l u s t r a t e d b y t h e c u r r e n t c a n c e r s u r v i v a l s t a t i s t i c s , 7

e r a d i c a t i n g b y c o m b i n a t i o n t h e r a p y 1 0 0 % o f t h e c e l ls

r e s u l t i n g f r o m t h i s l o n g p r e c l i n i c a l g r o w t h o f h u m a n

t u m o r s i s a v e r y d i f f i c u lt t a s k . T h e i n c i d e n c e o f c a n c e r

a t a n y a g e s e e m s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e n u m b e r

o f i n it i a te d s t e m c e l l s a c c u m u l a t e d a t t h at a g e ? S i n c e

i t i s i m p o s s i b l e t o p i n p o i n t t h e t i m e o f t u m o r c e l l i n i -

t i a t i o n , t h e r e i s n o w a y t o k n o w h o w l o n g t h e p r o g e n -

i t o r c e l l r e m a i n e d d o r m a n t i n t h e t i s s u e b e f o r e i t

s t a r t e d p r o l i f e r a t i n g . F u r t h e r m o r e , i t i s d i f f i c u l t t o

e x t r a p o l a t e f r o m d o u b l i n g t i m e s i n t h e c l i n i c t o p r e -

c l i n i c a l c i r c u m s t a n c e s i n o r d e r t o e s t i m a t e t h e t i m e a t

w h i c h t h e t u m o r s t a r t e d g r o w i n g i n t h e p a t i e n t b e f o r e

i t w a s d e t e c t e d .

T H E N E E D F O R E X P E R I M E N T L

MODELS

OF CARCINOGENESIS

A s k i n p a p i l l o m a ( P a ) b e c o m e s v i s i b l e w h e n t h e

c l o n a l e x p a n s i o n o f th e i n i t ia t e d e p i d e r m a l c e l l r e a c h e s

a s i z e o f 105 106 c e l l s . I n c l a s s i c a n i m a l e x p e r i m e n t s

w h e r e t h e c o m p l e t e c a r c i n o g e n e s i s o r t h e i n it i a ti o n -

p r o m o t i o n t r e a t m e n t s a r e a p p l i e d d i r e c t l y t o m o u s e e p -

i d e r m i s , t h e f i r s t s k i n tu m o r s a p p e a r a f t e r 5 - 7 ( b e n i g n )

a n d 1 6 - 1 8 ( m a l i g n a n t ) w e e k s , s T h e s e t i m e i n t e r v a l s

r e p r e s e n t a b o u t 5 a n d 1 2 % o f a m o u s e ' s l i f e . I f w e c a n

e x t r a p o l a t e t h is i n t e r m s o f a h u m a n l i fe l a s t in g 7 5

y e a r s , t h e s e l a g p e r i o d s b e c o m e 4 a n d 9 y e a r s . B e c a u s e

t h e s t e m c e l l s o f th e h u m a n t i s s u e s a re u n l i k e l y t o b e

e x p o s e d t o s u c h d r a s t i c c a r c i n o g e n i c t r e a t m e n t s , a n d

f o r o t h e r r e a s o n s , t h e w h o l e p r o c e s s o f c a r c i n o g e n e s i s

i n h u m a n s m a y t a k e m u c h l o n g e r , i t s h o u l d b e n o t e d

t h a t a s m a l l p e r c e n t a g e o f th e m i c e w h o s e s k i n s a r e

e x p o s e d t o t h e s e p o t e n t c a r c i n o g e n i c t r e a t m e n t s n e v e r

d e v e l o p a n y v i s i b l e n e o p l a s m s . I t i s p o s t u l a t e d t h a t

m a n y m o r e s k i n c e l l s a r e i n i t i a t e d t h a n f i n a l l y t r a n s -

f o r m e d i n t o n e o p l a s t i c c e l l s a n d t h a t p o p u l a t i o n s o f

i n i t i a t e d a n d d o r m a n t t u m o r c e l l s m a y e x i s t i n o r g a -

n i s m s f o r a l i f e t i m e w i t h o u t e v e r e x p r e s s i n g t h e i r p o -

t e n t ia l f o r n e o p l a s t i c t r a n s f o r m a t i o n a n d e x p o n e n t i a l

g r o w t h ? T h e d o r m a n c y o f m a l i g n a n t n e o p la s t ic c e l ls

h a s c l e a r ly b e e n d e m o n s t r a t e d , i n d i c a t i n g t h a t f u r t h e r

s t i m u l i a r e r e q u i r e d t o t r i g g e r t h e i r p r o l i f e r a t i o n . 9

E p i d e m i o l o g i c a l a n d t u m o r c el l k i n e t i c s s tu d i e s s u g -

e s t t h a t p o p u l a t i o n s o f i n i t ia t e d o r d o r m a n t t u m o r c e l l s

m a y e x i s t i n t h e h u m a n t i s su e s f o r s e v e r a l d e c a d e s

b e f o r e t h e y a r e , r e s p e c t i v e l y , t r a n s f o r m e d o r t r i g g e r e d

i n t o a h y p e r p l a s t i c b e h a v i o r l e a d i n g t o t h e d i a g n o s i s

o f a n e o p l a s m ? H o w e v e r , m o s t h u m a n t u m o rs h a v e a

m e a n c e l l c y c l e t i m e o f a b o u t 2 d a y s b u t a m e a n v o l u m e

d o u b l i n g t i m e o f a b o u t 5 0 d a y s b e c a u s e o f t he s m a l l

p r o p o r t i o n o f p r o l i f e r a t i n g t u m o r c e l ls ( g r o w t h f r a c -

t ion) and the h igh ra te o f tum or ce l l d ea th . 3'5'6 ~°'~LT h e

g r o w t h o f m o s t n e o p l a s m s i s r e g a r d e d a s a n e x p o n e n t i a l

f u n c t i o n l i m i t e d b y a n e x p o n e n t i a l r e t a r d a t io n . S i n c e

m a s s a n d d o u b l i n g t i m e a r e i n c r e a s i n g c o n c o m i t a n t l y ,

t h e r a te o f t u m o r g r o w t h d e c e l l e r a t e s b e c a u s e t h e

g r o w t h f r a c t i o n d e c r e a s e s , t h e c e ll l o s s f a c t o r i n c r ea s e s

a n d s o m e t i m e s t h e d u r a t i o n o f t h e c e ll c y c l e l e n g t h e n s .

T h e s e t u m o r g r o w t h k i n e t i c s s u g g e s t t h a t i t s h o u l d t a k e

o n l y a f e w m o n t h s o r y e a r s f o r th e s e l e c t e d t r a n s f o r m e d

c e l l t o p r o l i f e r a t e i n t o a t u m o r r e a c h i n g t h e c r i t i c a l

m a s s o f c li n i c a l d e t e c t io n . T h e p r o c e s s o f t u m o r i g e n -

e s i s i n h u m a n s , t h e r e f o r e , m a y b e c h a r a c t e r i z e d b y a

r e l a t i v e l y l o n g p e r i o d o f l a t e n c y , w h i c h i s p o s t u l a t e d

t o c o m p r i s e a n u n d e t e r m i n e d p e r io d o f d o r m a n c y p r e -

c e d i n g t h e p r e c l i n i c a l p o r t i o n o f t h e th e o r e t i c G o m -

p e r t z i a n g r o w t h c u r v e (F i g . 1 ).

T h e h y p o t h e t i c a l m o d e l i n F i g u r e 1 s u g g e s t s t h a t

t h e c e l l s t h a t a r e s e q u e n t i a l l y s u b j e c t e d t o g e n e t i c m u -

t a t io n a n d p h e n o t y p i c t r a n s f o r m a t i o n b y y e a r s o f e x -

p o s u r e t o c a r c i n o g e n i c h a z a r d s , i n c l u d i n g t u m o r

i n i ti a t o rs a n d p r o m o t e r s , m a y r e m a i n d o r m a n t , t h a t i s,

m a i n t a i n t h e i r n o r m a l r a t e o f s e l f - r e n e w a l , f o r a p a r t

o f t h e l a t e n c y p e r i o d o f t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s u n t i l

o n e o f t h e m f i n a l l y a c q u i r e s a p r o l i f e r a ti v e a d v a n t a g e

o v e r i t s n e i g h b o r s t e m c e l l s . I n a d d i t io n t o th e u n k n o w n

s t i m u l i t ri g g e r i n g p r o l i f e r a t i o n , t h e d o r m a n t n e o p l a s t i c

c e l l s m a y h a v e t o o v e r c o m e i m m u n o l o g i c a n d o t h e r

d e f e n s e m e c h a n i s m s o f th e h o s t a n d in d u c e s u f f i c i e n t

v a s c u l a r i z a t i o n t o s u p p o r t t h e i r e x p o n e n t i a l e x p a n s i o n .

T h u s , a f t e r g o i n g t h r o u g h o c c u l t c a r c i n o g e n i c c h a n g e s

a t t h e m o l e c u l a r l e v e l f o r s e v e r a l m o n t h s o r y e a r s , a

t r a n s f o r m e d h u m a n c e l l m a y a l l o f a s u d d e n s p e e d u p

i ts r a te o f r e n e w a l w i t h t h e r e s u l t t h a t , w i t h i n a f e w

m o r e m o n t h s o r y e a r s , b o t h p a t i e n t a n d p h y s i c i a n b e -

c o m e f i n a l ly a w a r e o f th e p r e s e n c e o f a n e o p l a s m . B y

u s i n g e x p e r i m e n t a l t u m o r m o d e l s , t h e l o n g - t e r m o b -

j e c t i v e o f f u n d a m e n t a l c a n c e r r e s e a r c h i s to e l u c i d a t e

t h e m o l e c u l a r e v e n t s s p e c i f i c a l l y i n v o l v e d i n t h e p r e -

c l i n i c a l p o r t i o n o f th e n e o p l a s t i c p r o c e s s ( F i g . 1 ). E a r -

l i er d e t e c ti o n a n d m o d u l a t i o n o f s u ch e v e n t s s h o u l d

p r o v i d e v a l u a b l e i n f o r m a t i o n t o d e s i g n n o v e l c a n c e r

t h e r a p i e s a p p l i c a b l e i n c l i n i c a l o n c o l o g y .

T H E MOUS E S KIN S YS TEM F OR

MULTIS TAGE CARCINOGENES IS

E x p e r i m e n t a l c a r c i n o g e n e s i s i n m o u s e s k i n w a s p i -

o n e e r e d b y t h e w o r k s o f M o t t r a m 12 a n d B e r e n b l u m a n d

S h u b i k , ~ 3 a n d s t u d i e d e x t e n s i v e l y b y B o u t w e l l . ~ 4 T h e

i n i t i a t i n g a n d p r o m o t i n g e l e m e n t s i n s k i n t u m o r p r o -

4 5

d u c t i o n h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d . • T h e d e m o n s t r a -

t i o n o f th e m u l t i s t e p n a t u r e o f c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s

i n m o u s e s k i n w a s g r e a t l y f a c i l i t a t e d b y t h e s y n t h e s i s


3/32

o ~ 1 0 1 4

~

o 1012

• I O i °

I o 8

1 0 6

.~_ 10 4

} °

6

E

Z

A n t i o x i d a n t s a n d s k i n c a r c i n o g e n e s i s

t l . . . . . II . . . . . II . . . . . . . . . . . . .

M a x i m u m M o s s C o m p a t i b l e w i t h U f e

. I 7. . . .

L i m i t o f C l in i c a l D e t e c t i o n /

/ i

T u m o r T u m o r P r o m o t i o n _ / ~ ,

I n i t i a t i o n I I . / I

c ~ ~ ' ~ / i

- - 2 7 ' l

S t e m C e l l S t e m C e l l N e o p l a s t i c C e l l / i . . . .

I n i t ia t i o n T r a n s f o r m a t i o n P r o lif ,e r c d io n / I ,~ '~ x ~ L Y

l , / i u ~ . t = u ,

I I I

, . . i . , . , ~ ' ,_ T _ , ' , e _ >

- I I ' ' ,~ ' , •1 , . . . . . . . . . . ,

I , ,P o d o f t _ r f i o f

P o s t u la t e d P e r io d o f ' a ~ P r i o r t o , C l i n i c a l

D o r m a n c y , D e t e c l i m I G r o w t h

I ) ,

P e r io d o f L e t e n ~ ; y

I<

) '

P t ~ i o d o f ~ 1 G l ~ t h

Fig. 1 H y p o t h e t i c a l g r o w t h o f a h u m a n n e o p l a s m .

3 7 9

o f p u r e p o l y c y c l i c a r o m a t ic h y d r o c a r b o n ( P A H )

c a r c i n o g e n s ~6 s u c h a s 7 , 1 2 - d i m e t h y l b e n z [ a ] a n t h r a c e n e

( D M B A ) a n d th e i s o la t i o n o f t h e p o t en t t u m o r -p r o -

m o t i n g a g e n t f r o m c r o t o n o i l ,

T

1 2 - 0 - t e t r a d e c a n o y l -

p h o r b o l - 1 3 - a c e ta t e ( T P A ) . M o r e o v e r , t h e b r e e d i n g o f

p r o m o t i o n - s e n s i ti v e S E N C A R m i c e h a s p r o v i d e d a n

e x c e l l e n t m o d e l s y s t e m t o p u r s u e s tu d i e s o n t h e m e c h -

a n i s m s o f m u l t i s t a g e s k i n c a r c i n o g e n e s i s . '4 ,1 9 T h e e x -

p e r i m e n t a l i n d u c t i o n o f tu m o r s i n m o u s e s k i n is

b e l i e v e d t o c o m p r i s e a s e q u e n c e o f i n i t i a t i o n , p r o -

m o t i o n ( c o n v e r s i o n + p r o p a g a t io n ) , a n d p r o g r e s s io n

( T a b l e 1 ). T h e v a r i o u s t r e a tm e n t s p a i n t e d t o t h e

s h a v e d b a c k s o f t h e m i c e d u r i n g t h e i n i t i a t i o n - p r o -

m ot io n pr ot oc ol s 14' 15,20a n d th e c o m p l e t e c a r c i n o g e n e s i s

p r oc es se sS .2 ~ .2 2 c o m m o n l y u s e d f o r t h e i n d u c t i o n o f s k i n

P a a n d c a r c i n o m a s ( C a ) a r e d e p i c t e d i n T a b l e 1 .

T a b l e 1 . P r o t o c o l s f o r M u l t i s ta g e C a r c i n o g e n e s i s i n M o u s e Skin

N u m b e r

D e s c r i p t i o n o f T r e a t m e n t s D u r a t i o n ) *

A g e n t s A d m i n i s t e r e d D o s e / A p p l i c a t i o n s ; T o t a l N u m b e r of A p p l i c a t i o n s ) f

I n i t ia t i o n C o m p l e t e P r o m o t i o n 40 wk)

1 . D M B A TPA

0.1/~mo l; ix) 8.5 nmo l; 80x)

T w o - S t a g e P r o m o t i o n

40 wk)

I n i t i a t i o n S t a g e 1 2 wk) Stage 2 38 wk)

2 . D M B A T P A M E Z

0.1 ~tmol; ix) 8.5 nmo l; 4x) 8.5 nmo l; 76x)

I n i t i a t i o n P r o m o t i o n 20 wk) Progression 20 wk)

3 . D M B A TPA B Px

0.1/lm ol; Ix) 8.5 nmol; 40x) 20 mg, 40x)

4 . D M B A T P A E N U

0.1 pm ol; ix) 8.5 nmol; 40x) 10 ,umol; 4x)

5 . D M B A TPA MN N G

0 . 1 / l m o l ; i x ) 8 . 5 n m o l ; 4 0 x ) 1 / ~ m o l ; 4x)

C o m p l e t e C a r c i n o g e n e s i s

40 wk)

6 . D M B A

3.6/ tmol ; ix)

7 . D M B A

0.1/ tmol ; 80x)

; t h e n T P A

8.5 nmol; 36x)

; t h e n T P A

8.5 nmol; 36x)

*All t reatment s are appl ied topica l ly in 0 .2 ml o f acetone to the same shaved dorsa l area o f the skin .

tDosages vary w ith s t ra in . Da ta are for Charles R iver CD -1 m ice; the f requency o f appl ica t ion for repeated t reatment s i s 2x/wk.


4/32

380 J. -P . PERCHELLET nd E. M. PERCIqELLET

Tumor in i t ia t ion

A s i n g le s u b c a r c i n o g e n i c d o s e o f D M B A [ T a b le 1

( P r o t o c o l 1 )] p r o d u c e s n o t u m o r s d u r i n g t h e l i f e - s p a n

o f t he a n i m a l s b u t , a f t e r m e t a b o l i c a c t i v a t i o n , t h e e l e c -

t r o p h i l i c u l t i m a t e c a r c i n o g e n i n t e r a c ts c o v a l e n t l y w i t h ,

a n d d a m a g e s , c r it ic a l m a c r o m o l e c u l e s , p r e s u m a b l y e p -

i d e r m a l D N A , 23 t o i n i t ia t e s k i n c a r c i n o g e n e s i s . W h e n

t h e D N A t e m p l a t e i s r e p l i c a t e d b e f o r e i t i s r e p a i r e d ,

t h e i n i t i a t i n g g e n e t i c d a m a g e b e c o m e s i r r e v e r s i b l e a n d

• 34

h e r i t a b l e . - N e w e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t t h e c ras m

p r o t o - o n c o g e n e i s t h e t a r g e t o f t he i n i t ia t i n g m u t a t i o n

in m ou se sk in ca r c in og ene s i s : 25 .~2 1) the ac t iva ted c -

ra s Ha o n c o g e n e h a s b e e n i s o l a t e d f r o m s k i n P a ; 2 ) t h e

i n t r o d u c t i o n o f m u t a t e d ras m o n c o g e n e i n to e p i d e r m a l

c e l l s c a n s u b s t i t u t e f o r D M B A i n i ti a t io n i n t w o - s t a g e

m o u s e s k i n c a r c i n o g e n e s i s ; a n d 3 ) t h e k e r a t i n o c y t e s

d e r i v e d f r o m D M B A - i n i t i a t e d s k i n s a n d / o r r e s is t a nt t o

C a 2 + - i n d u c e d t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n c o n t a i n a n a c -

t i v a t e d c ras m o n c o g e n e a n d f o r m s q u a m o u s P a i n s k i n

g r a f t s o n a t h y m i c n u d e m i c e . A s i n g l e b a s e s u b s t i t u ti o n

a c t i v a t e s t h e c ras m p r o t o - o n c o g e n e . T h e f r e q u e n c y o f

t h is m u t a t i o n i s d e p e n d e n t o n t h e in i t ia t i n g a g e n t . O v e r

9 0 % o f m o u s e s k i n tu m o r s i n i ti a te d w i t h D M B A h a v e

a p o i n t m u t a t i o n ( s p e c i f i c A - - - ~T t r a n s v e r s i o n ) a t t h e

2 n d n u c l e o t i d e i n c o d o n 6 1 o f

c ra s m .

O t h e r i n i t i a t o r s

m a y i n d u c e a p o i n t m u t a t i o n ( s p e c i f i c G - -~ A t r an s i t io n )

a t t h e 2 n d n u c l e o t i d e i n c o d o n 1 2 o f c ra s m .

A l t h o u g h e p i g e n e t i c t h e o r i e s a r e a l so p l a u s i b l e , ; t u -

m o r i n i t i a t i o n i s g e n e r a l l y r e g a r d e d a s a p e r m a n e n t

a l t e r a ti o n o f th e c e l l g e n o t y p e w i t h n o n e o p l a s t i c p h e n -

o t y p e . ~533 E p i d e r m a l c e l l s i n i t i a t e d w i t h t h e v ra s H~

o n c o g e n e r e m a i n d o r m a n t w i t h i n t h e s k i n i n t h e a b -

s e n c e o f t u m o r p r o m o t i o n a n d r e q u i r e T P A t r e a t m e n t s

t o f o r m P a , s u g g e s t in g t h a t D M B A - i n d u c e d p o i n t m u -

t a t io n a n d a c t i v a t i o n o f th e c ra s H~p r o t o - o n c o g e n e r e p -

r e s e n t s a n i n i t i a t i n g e v e n t , w h i c h i s i n s u f f i c i e n t f o r

s k i n tu m o r i g e n e s i s u n l e s s a m p l i f i c a t i o n o f t h e m u t a t e d

o n c o g e n e i s t r i g g e r e d b y t u m o r p r o m o t e r s . T h e p e r -

s i s t e n c e o f l a t e n t i n i t i a t e d c e l l s w i t h t h e p o t e n t i a l t o

g i v e r i s e t o f u t u r e n e o p l a s m s h a s b e e n d e m o n -

s t ra ted . 14.34.35 Th e m ec ha ni sm by wh ich the c ras H~ o n -

c o g e n e i n d u c e s tr a n s f o r m a t i o n i s u n k n o w n . I n i t i a te d

c e l l s a r e u n i f o r m l y r e s i s t a n t t o C a 2 + - i n d u c e d t e r m i n a l

d i f f e r e n t i a t i o n . T h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t u m o r i n i t i a -

t i o n a n d r e s i s t a n c e o f e p i d e r m a l c e l l s to s i g n a l s f o r

t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n s u g g e s t s , t h e r e f o r e , t h a t t h e

i n i ti a t in g e v e n t i n s k i n c a r c i n o g e n e s i s c a u s e s a g e n e t i c

a l t e r a ti o n i n t h e p r o g r a m o f te r m i n a l d i f f e r e n t i a -

tion 36 3s

C o m p l e t e t u m o r pr o m o t i o n

R e p e t i t i v e a p p l i c a t i o n s o f t h e m o s t p o t e n t p h o r b o l

e s t e r t u m o r p r o m o t e r T P A [ T a b l e 1 ( P r o t o c o l 1 )] a re

r e q u i r e d t o t r i g g e r m o l e c u l a r e v e n t s l e a d i n g t h e i m -

m e d i a t e p r o g e n y o f th e D M B A - i n i t i a t e d e p i d e r m a l

c e l l s t o th e f o r m a t i o n o f g r o w i n g s k i n t u m o r s a n d

a c h i e v e c o m p l e t e t u m o r p r o m o t i o n • ~5,~3 I t i s t h e o r i z e d

t h a t T P A s t i m u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f t h e a b n o r m a l

g e n e t i c i n f o r m a t i o n w i t h i n t h e i n i t i a t e d c e l l s w h i c h ,

b e c a u s e o f th e i r a lt e r e d p r o g r a m o f d i f f e r e n t i a t io n , a c -

q u i r e a n e o p l a s t i c p h e n o t y p e a n d a p r o l i f e r a t i v e a d -

v a n t a g e o v e r t h e i r n o r m a l n e i g h b o r s . 3'~ P r o m o t i n g

a g e n t s b y d e f i n i t i o n a r e n e i t h e r m u t a g e n i c n o r c a r c in -

o g e n i c a n d , t h e r e f o r e , i n c a p a b l e o f i n it i a ti o n o r c o m -

p l e t e c a r c i n o g e n e s i s b y t h e m s e l v e s . M o r e o v e r , t h e y

c a n n o t p r o m o t e t u m o r f o r m a t i o n i n t h e a b s e n c e o f

p r e e x i s t i n g i n i t i a te d c e l l s , a s i n d i c a t e d b y th e e x p e r i -

m e n t s i n w h i c h t h e s e q u e n c e i n i t i a t i o n - p r o m o t i o n i s

r e v e r s e d . H T h e o c c a s i o n a l n e o p l a s m s r e s u l ti n g f r o m

l i f e t im e t r e a t m e n t o f m o u s e s k i n w i t h l a r g e d o s e s o f

T P A a l o n e a r e l i k e l y a t t r i b u t a b l e t o t h e p r o m o t i o n o f

i n i t i a t e d o r d o r m a n t t u m o r c e l l s o f s p o n t a n e o u s o r i -

g i n . ~4.33 T h e e x p e r i m e n t s i n w h i c h p r o m o t i o n p r e c e d e s

i n i ti a t io n o r t h e f r e q u e n c y o f T P A a p p l i c a t i o n i s d e -

c r e a s e d p r o d u c e n o t u m o r s , s u g g e s t i n g t h a t th e p r o -

m o t i n g e f f e c t s o f i n d i v i d u a l T P A t r e a t m e n t s a r e

t r a n s i e n t a n d , t o a c e r t a i n d e g r e e , r e v e r s i b l e . ~4 A l -

t h o u g h t h e e v e n t s c r i t i c a l f o r t h e s e l e c t i v e c l o n a l e x -

p a n s i o n o f i n it i a te d c e l l s t o f o r m a n e o p l a s m a r e p o o r l y

u n d e r s t o o d , t h e e v i d e n c e t h a t t h e t u m o r p r o m o t e r s i n -

t e r a c t w i th m e m b r a n e s , s t i m u l a t e a n d a l t e r g e n e t i c

e x p r e s s i o n a n d e v e n t u a l l y i n c r e a s e t h e r a te o f c e ll p r o -

l i f e r a t i o n h a s b e e n r e v i e w e d . 3 3 ~ 44 T P A h a s b e e n

s h o w n t o p r o d u c e a se r i e s o f p l e i o tr o p i c c e l l u l a r e f f e c t s

i n c l u d in g t h e i n d u c t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C ( P K C ) a c -

t i v i t y . 45'46 p h o s p h o l i p i d s y n t h e s i s 47 a n d p r o s t a g l a n d i n

( P G ) r e l e a s e , 4~ t h e s y n t h e s i s a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f

e p i d e r m a l h i s t o n e s , ~ t h e i n c r e a s e i n p r o t e a s e a c t i v -

i t y , 5° t h e p r o d u c t i o n o f R O S , 5t t h e o v e r e x p r e s s i o n o f

t u m o r - s p e c i f i c , p r o m o t i o n s e n s i t i v e , t r a n s f o r m i n g o r

ce l lu la r p r o to -o nc og en es , 252'~ 32.52.53 the indu c t ion of

t h e p o l y a m i n e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y 54 f o l l o w e d b y

s e q u e n t i a l i n c r e a s e s i n R N A , p r o t e i n , a n d D N A s y n -

t h e s i s , 55 w i t h c o n c o m i t a n t a l t e r a t i o n s i n c e l l u l a r

m o r p h o l o g y , 5 6 m i t o t ic r a t e , 44 a n d d e g r e e s o f m e t a b o l i c

• ~7 44 58

c o o p e r a t i o n - a n d t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t io n . ,- A m a j o r

p r o b l e m i s t o i d e n t i f y th e c r i ti c a l r e s p o n s e s w h i c h m e -

d i a t e s p e c i f i c a l l y t h e e a r l y a n d l a t e e v e n t s r e q u i r e d f o r

t w o - s t a g e t u m o r p r o m o t i o n . H 59.~'°

M u l t i s t a g e t u m o r p r o m o t i o n

O n e t o f o u r a p p l i c a t i o n s o f T P A a r e s u f f i c i e n t to

t r i g g e r t h e 1 s t, p a r t i a ll y i r r e v e r s i b l e , s t a g e o f p r o m o -

t i on c a l l e d c o n v e r s i o n [ T a b l e 1 ( P r o t o c o l 2 ) ] . M u l -

t i p le a p p l i c a t i o n s o f t h e i n e f f e c t iv e p r o m o t e r m e z e r e i n

( M E Z ) a r e t h e n r e q u i r e d t o a c h i e v e t h e 2 n d s t a g e o f


5/32


6/32

382 J. R PERCHELLET and E. M. PERCHELLET

s i v e to t h e v a r i o u s i n i t i a t i o n - m u l t i s t a g e p r o m o t i o n p r o -

t o c o l s b e c a u s e p o p u l a t i o n s o f c o n s t i t u t i v e l y a l t e r e d

e p i d e r m a l c e l l s d e v e l o p s p o n t a n e o u s l y i n t h e s e a n i m a l s

a n d t h e i r s k i n s c o n t a i n a g r e a t e r p r o p o r t i o n o f p r o -

m o t a b l e i n i t i a t e d c e l l s t h a n t h e s k i n s o f o t h e r l e ss s e n -

s i t ive s t ra in s . 37

A s o p p o s e d t o m o d u l a t i n g t h e h y p e r p l a s t i c e v e n t s

r e s p o n s i b l e f o r t h e l a t e p r o p a g a t i o n o f t h e n e o p l a s t i c

e p i d e r m a l c e l l s i n s t a g e 2 p r o m o t i o n , a b r e a k t h r o u g h

i n u n d e r s t a n d in g t h e k e y m o l e c u l a r e v e n t s i n v o l v e d i n

t h e e a r l y i n i t i a t i o n a n d c o n v e r s i o n p h a s e s o f s k i n c a r -

c i n o g e n e s i s w o u l d a p p e a r m o r e l i k e l y to s t im u l a t e n e w

i d e as f o r t h e d e v e l o p m e n t o f n o v e l m e t h o d s o f c a n c e r

d e t e c t i o n o r e f f e c t i v e t h e r a p ie s t o p r e v e n t , b l o c k o r

i n h i b i t t h e n e o p l a s t i c p r o c e s s i n h u m a n s . H o w e v e r ,

m o s t i n v i v o s t u d ie s o n e x p e r i m e n t a l s k i n c a r c i n o g e n -

e s is a r e d e v o t e d t o t h e a n a l y si s o f p r o m o t i o n o n l y ( o v e r

6 0 ) w i t h s u r p r i s i n g l y f e w c o n c e r n e d w i th in i t i a ti o n

a l o n e ( 1 3 ) . 86 R e c e n t f i n d i n g s i n d i c a t e t h a t a ll

D M B A - i n i t i a te d s k i n P a p o s se s s a p o i n t m u t a t io n i n

t h e 6 1 s t c o d o n o f o n e c ra s Ha a l l e l e i r r e s p e c t i v e o f

w h e t h e r c o m p l e t e t u m o r p r o m o t i o n i s a c h i e v e d w i t h

b e n z o y l p e r o x i d e ( B P x ) , T P A o r th e c o m b i n a t i o n s t a g e

1 T P A - s t a g e 2 M E Z . ~7 T h i s m u t a t i o n i s d e t e c t e d

u n i q u e l y i n t h e s k i n P a a s e a r l y a s 9 w e e k s a f t e r s ta r t i n g

p r o m o t i o n a n d n o t i n t h e o t h e r e p i d e r m a l c e l l s o f t h e

d o r s a l s k i n t h a t s u r r o u n d t h e t u m o r s a n d a r e a l s o e x -

p o s e d t o t h e p r o m o t i o n t r e a t m e n t . T h e s e d a t a r e i n f o r c e

t h e t h e o r y t h a t t h e p o i n t m u t a t i o n c o i n c i d e s w i t h t h e

i n it i at i n g e v e n t a n d t h a t a n y t y p e o f p r o m o t i n g r e g i m e n

c a n s e l e c t t h e s e m u t a t i o n - b e a r i n g i n i t i a t e d e p i d e r m a l

c e l l s a n d i n d u c e t h e i r t r a n s f o r m a t i o n a n d c l o n a l e x -

p a n s i o n i n t o s k i n t u m o r s .

T u m o r p r o g r e s s i o n

A f t e r a r e l a t i v e l y s h o r t i n d u c t i o n p e r i o d , t h e t w o -

s t a g e s y s t e m o f t u m o r i g e n e s i s [ T a b l e 1 ( P r o t o c o l 1 ) ]

p r o d u c e s m o s t l y b e n i g n s k in P a w h i c h m a y e i t h e r p er -

s i s t , r e g r e s s o r l a t e r d e v e l o p i n t o i n v a s i v e C a . T h e

d e v e l o p m e n t o f m a l i g n a n t s k i n C a f r o m p r e e x i s t in g P a

i s a r e l a t iv e l y r a r e ( a p p r o x i m a t e l y 5 - 1 0 o f P a p r o g -

r e s s to C a ) a n d l a t e e v e n t ( 2 0 - 4 0 w e e k s a f t e r t h e s t ar t

o f p r o m o t i o n ) 88 a n d i ts f r e q u e n c y a p p e a r s t o b e p r o -

m o t e r - i n d e p e n d e n t . E x p e r i m e n t s w i th P a - b e a r in g m i c e

d e m o n s t r a t e t h a t t h is l o w f r e q u e n c y o f m a l i g n a n t c o n -

v e r s i o n o f P a t o C a i s u n a f f e c t e d b y t h e c o n t i n u e d

app l i ca t ion of TP A 89 ,9° bu t can be s ign i f i can t ly in -

c r e a s e d b y t r e a t m e n t s w i t h t h e f r e e r a d i c a l g e n e r a t o r

B P x o r t h e t u m o r i n i ti a to r s e t h y l n i t r o s o u r e a ( E N U ) a n d

l - m e t h y l - 3 - n i t r o - 1 - n i t ro s o g u a n i d i n e ( M N N G ) [ T a b le 1

Proto cols 3- 5) ]. 89,91-94 A b a l a n c e b e t w e e n t h e p r o -

m o t i n g a n d c y t o t o x i c e f f e c t s o f c h r o n i c T P A t r e a tm e n t s

h a s b e e n p r o p o s e d t o e x p l a i n t h e f a c t t h a t i n c r e a s i n g

t h e d o s e a n d d u r a t i o n o f p r o m o t i o n w i t h th i s a g e n t

a d v e r s e l y a f f e c t s t h e y i e l d o f C a . 20 N e w s t u d i e s p r o v i d e

s t r o n g e v i d e n c e t h a t t h e d o s e o f c a r c i n o g e n u s e d a s

i n i t i a t o r p l a y s a c r i t i c a l r o l e i n d e t e r m i n i n g w h i c h i n -

i t ia t e d c e l ls w i l l p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y d u r i n g o r a f t e r

p r o m o t i o n . 95 T u m o r p r o g r e s s i o n , t h e r e f o r e , i s p r o -

p o s e d t o i n v o l v e a n u m b e r o f g e n e t i c a l t e r a t i o n s . I t is

t h e o r i z e d t h a t s u b p o p u l a t i o n s o f e p i d e r m a l c e l l s m a y

a c q u i r e p o t e n t i a ll y m a l i g n a n t c h r o m o s o m a l c h a n g e s a t

a n y t i m e b e f o r e o r a f t e r t h e i r i n i t i a t i o n , c o n v e r s i o n o r

p r o p a g a t i o n . 96 S u b s e q u e n t l y , t h o s e b e n i g n n e o p l a s t i c

c e l l s t h a t h a v e a c c u m u l a t e d a d d i t i o n a l s u b l e t h a l g e -

n e t i c a l t e r a t i o n s , b e s i d e s t h o s e a s s o c i a t e d w i t h t u m o r

i n i t i a t i o n , m a y b e s e l e c t e d t o d e v e l o p m a l i g n a n t c h a r -

a c t e r i s t i c s . I n t e r e s t i n g l y , B P x i s a w e a k c o m p l e t e p r o -

m o t e r o f m o u s e s k in t u m o r s b u t n e i th e r a t u m o r

i n i t i a t o r n o r a c o m p l e t e c a r c i n o g e n . 97 T h e g e n o t o x i c

e f f e c t s o f th i s f r e e r a d i c a l -g e n e r a t i n g p e r o x i d e m a y n o t

b e s u f f i c i e n t t o p r o d u c e c r i t i c a l i n i t i a t i o n l e s i o n s b u t

m a y c o n t r i b u t e t o c e r t a i n D N A d a m a g e o r c h r o m o -

s o m a l a b e r r a t i o n s a c c e l e r a t i n g t h e p r o g r e s s i o n o f b e -

n i g n e p i d e r m a l t u m o r c e l ls t o w a r d a h i g h e r d e g r e e o f

ane up lo id y and ma l ign anc y . 93'94

C o m p l e t e c a r c i n o g e n e s is

S k i n t u m o r s c a n b e i n d u c e d b y e i t h e r a s i n g l e a p -

p l i c a t i o n o f a c a r c i n o g e n i c d o s e [ T a b l e 1 ( P r o t o c o l 6 )]

o r r e p e a t e d a p p l i c a t i o n s o f a s u b c a r c i n o g e n i c d o s e [ T a -

b l e 1 ( P r o t o c o l 7 )] o f D M B A . T h e t u m o r s t h a t a r i s e

i n t h e s e p r o t o c o l s a r e t h e o r e t i c a l l y t h e r e s u l t o f b o t h

t h e in i t i a ti n g a n d p r o m o t i n g a b i l i ti e s o f D M B A . T h u s ,

t h e i r r e v e r s i b l e a n d c u m u l a t i v e e f f e c t s o f m u l t i p l e s u b -

c a r c i n o g e n i c d o s e s o f D M B A [ T a b l e 1 ( P r o t o c o l 7) ]

c a n a c h i e v e t u m o r i n i t ia t io n , c o n v e r s i o n , p r o p a g a t i o n

a n d p r o g r e s s i o n . I n c o n t r a s t t o t h e D M B A - i n i t i a t i o n

T P A - p r o m o t i o n r e g i m e n [ T a b le 1 (P r o t o c o l 1 ) ] , c o m -

p l e te c a r c i n o g e n e s i s b y D M B A [ T a b le 1 ( P r o t o c o l s 6 ,

7 ) ] i s c h a r a c t e r i z e d b y t h e l a t e o c c u r r e n c e o f f e w e r P a

b u t t h e C a d e v e l o p m u c h e a r l i e r . I n t h e D M B A p r o -

t o c o l s , t h e r e f o r e , t h e y i e l d o f s k i n t u m o r s i s l o w e r b u t

t h e y h a v e a h i g h e r f r e q u e n c y o f m a l i g n a n c y a n d p r o g -

r e s s t o C a m o r e r a p i d l y . ~

T h e f a c t s th a t t h e g l u t a t h i o n e ( G S H ) p e r o x i d a s e a n d

O D C r e s p o n s e s t o T P A a n d M E Z a r e d i f f e r e n t f r o m

t h o s e t o D M B A , a n d t h a t a n t i o x i d a n t a n d r e t i n o i d tr e a t -

m e n t s i n h i b it O D C i n d u c t i o n a n d s ki n t u m o r p r o m o t i o n

b y T P A a n d M E Z b u t n o t b y D M B A , s u g g e s t t h a t t h e

n a t u r e a n d m e c h a n i s m o f t u m o r p r o m o t i o n b y t h e p h o r -

b o l e s te r s a n d r e l a t e d d i t e r p e n e s m a y b e d i f f e r e n t f r o m

t h o s e o f t h e p r o m o t i n g c o m p o n e n t o f D M B A c a r c in -


7/32

Antioxidants and skin carcinogenesis 383

og en es is . 8,gs-l°°

T h e m a g n i t u d e a n d t i m e c o u r s e o f i n -

d u c t i o n o f e p i d e r m a l O D C a c t i v it y b y th e a n t h r a c e n e -

d e r i v e d t u m o r p r o m o t e r s c h r y s a r o b i n a n d a n t h r a l in a r e

c o n s i d e r a b l y d i f f e r e n t f r o m t h o s e c h a r a c t e r i z i n g t h e

O D C r e s p o n s e s t o T P A a n d M E Z b u t r e s e m b l e t h e

e f f e c t s o f D M B A o n O D C i n d u c t i o n , l° l m 2 M o r e o v e r ,

t h e l o w e r t u m o r i n c i d e n c e , t h e l o n g e r l a t e n c y o f P a

d e v e l o p m e n t a n d th e g r e a t e r r a t io o f C a : P a o b s e r v e d

w i t h c h r y s a r o b i n a n d a n t h r a l i n a s o p p o s e d t o T P A s u g -

g e s t th a t t h e m e c h a n i s m o f O D C i n d u c t i o n a n d s k in

t u m o r p r o m o t i o n b y c h r y s a r o b i n a n d a n t h r a l i n i s d i f -

f e r e n t f r o m t h at o f T P A a n d m o r e l ik e t h e p r o m o t i n g

s t a g e w h i c h o c c u r s d u r i n g c o m p l e t e c a r c i n o g e n e s i s

w i t h D M B A . 8 4 1 °1 1 °2 A l t h o u g h i t i s n o t c l e a r w h e t h e r

t u m o r f o r m a t i o n a c c o m p l i s h e d b y t h e c o m p l e t e c a r -

c i n o g e n e s i s p r o c e s s i n v o l v e s a p r o m o t i n g c o m p o n e n t

w i t h a m e c h a n i s m a n a l o g o u s t o T P A , D M B A , a n d t h e

a n t h r o n e p r o m o t e r s m a y p r o m o t e t h e e x p r e s s i o n o f a

s u b c l a ss o f P a w i t h a h i g h p r o b a b i l i t y o f p r o g r e s s i n g

t o C a . T h e o v e r a l l tu m o r i g e n i c i t y o f v a r i o u s c o m -

p o u n d s o r p r o t o c o l s m a y r e f l e c t m a j o r d i f f e r e n c e s i n

t h e i r r a t i o s o f i n i t ia t i n g : p r o m o t i n g a b i l i t y . 103 A l t h o u g h

d i s t in c t u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s m a y b e r e s p o n s i b l e f o r

t h e s e d i f f e r e n t k in e t i c s o f t u m o r d e v e l o p m e n t , t h e p r o -

c e s s o f s k i n c a r c i n o g e n e s i s b y e i t h e r o f th e s e p r o t o c o l s

i s l i k e l y t o in v o l v e t h e s a m e b a s i c s e q u e n c e o f c e l l u l a r

a l t e r a t i o n s ( T a b l e 1 ) .

THE ROLE OF OXIDANTS IN MULTISTAGE

SKIN CARCINOGENESIS

C e l l u l a r p r o o x i d a n t s t a t es a p p e a r t o p l a y a n i m p o r -

t a n t r o l e a t c r i ti c a l s t e p s o f th e p r o c e s s o f sk i n c a r c i n -

oge nes i s . 104-110 Ep ide r m a l ce l l s t r ea t ed wi th che m ica l

c a r ci n o g e n s a n d / o r t u m o r p r o m o t e rs m a y o v e r p r o d u c e

R O S a n d b e d e f i c i e n t i n t h e i r a b i l i t y t o d e s t r o y t h e m .

I n c r e a s e d l e v e l s o f p o t e n t i a l ly d a m a g i n g o x i d a n t s a r e

a s so c i a t e d w i t h n e o p l a s t i c c e l l s b u t i t i s u n c l e a r

w h e t h e r f r e e r a d i c a l r e a c t i o n s a r e a m a j o r c a u se o f

c e l l u l ar l e s io n s o r m e r e l y a c o n s e q u e n c e o f t h e m . I n -

c r e a s e d r a d i c a l f o r m a t i o n m a y s i m p l y r e s u l t f r o m t h e

r e l e a se o f i n t r a c e l l u l a r , n o n - p r o t e i n b o u n d m e t a l c a t-

a lys t s w i th in d am age d c e l l s , ll~

Production of R S

Much research link ing free radicals and neoplastic

transformation has focused on the intermediates of 02

reduction. The sequential formation of the various

types of O2-ce ntered free ra dica ls 112 is illu stra ted (Tab le

2). The reduction of the molecule of ground-state 02

by a single electron produce s the superoxid e anio n rad-

ical 02 ~ (reaction a). It should be noted that 02 ~ exists

in equilibriu m with a protonated form, perhydroxyl

radical HO2 , which is a more reactive radical then is

02 ~ in aqueous solution. Sp ontaneous dism utation of

(a)

(b)

(c,

(d,

(e)

(f)

(g)

(h)

i )

(J)

(k)

(I)

(m)

(n)

Table 2. Production and Detoxification of Reactive 02 Species

Reaction

Fenton)

Haber-Weiss)

Radical Generation

02 + e ~ 02;

02- + H + ' HO2

2 02: + 2 H + ~ H202 02

H202 + Fe2+ , Fe3+ + -OH + OH

H202 + 02 ~

F e s a l t

02 + -OH + OH-

catalyst

LH + .OH , L. + H20

L + 02 , LO2'

LO2' + LH , L + LOOH

2 LOOH ~ LO + LO2 + H20

complexes

LO. + LH ~ L. + LOH

Radical Degradation

Fe3+-Desferrioxamine complex

aTH + L(O)O. ~ aT. + L(O)OH

aT. + L(O)O. , Termination products

2 02- + 2H + SODH202 + 02

2 GSH + H202 CAW ~ 2 H20 + GSSG~

G + LOOH S~-d~.d¢.tGSH eroxide

LOH + H20 + GSSG

Se independent GSH peroxidase

GSH S t ransferases

GSSG-R

N A D P ~ . ~ N A D P H

Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase :~ , ,~

Glucose-6-Phosphate 6-Phosphoglucolactone


8/32


t w o m o l e c u l e s o f O 2 ~- i n a q u e o u s so l u t i o n g e n e r a t e s

H 2 02 ( r e a c t i o n b ) . T h e

H202 so

f o r m e d c a n b e r e d u c e d

b y v a r i o u s m e t a l s a l t s p r e se n t i n t i s su e s t o f o r m t h e

h y d r o x y l ra d i c a l - O H ( F e n t o n r e a c t i o n c) . 0 2 - a n d

H202

m a y a l s o i n t e ra c t i n v i v o to f o r m . O H o n l y i f th e

o v e r a l l e q u a t i o n i s c a t a l y z e d b y t r a c e s o f t r a n s i t i o n

m e t a l i o n s ( i r o n - c a t a l y z e d H a b e r - W e i s s r e a c t i o n d ) .

B e c a u s e o f it s e x t r e m e r e a c t i v i ty , . O H w i ll i m m e d i -

a t e l y r e a c t w i t h m o l e c u l e s n e a r t h e s i t e o f i t s g e n e r a -

t i o n . i r o n i c a l l y , t h e l e s s r e a c t i v e 0 2 ~ a n d

U20/

m a y

b e m o r e d a m a g i n g b e c a u s e t h e y c a n d if f u s e a w a y f r o m

t h e i r si te o f g e n e r a t i o n a n d i n d u c e . O H p r o d u c t i o n in

r e m o t e c e l l u l a r l o c a t i o n s . I n c o n t r a s t t o 0 2 ~ ,

U202 can

e v e n c r o s s c e l l m e m b r a n e s a n d d a m a g e o t h e r c el ls .

T h e r e f o r e , t h e b i o l o g i c a l d a m a g e d o n e b y 0 2 - a n d

H202

t h a t i s m e d i a t e d b y . O H f o r m a t i o n d e p e n d s

l a r g e l y o n t h e l o c a t i o n o f t h e m e t a l i o n c o m p l e x e s

c a t a l y t i c a l l y a c t i v e i n r e a c t i o n s c a n d d .~ l~ L o w c o n -

c e n t r a t i o n s o f

H202

i n d u c e D N A d a m a g e i n v i v o a nd

i n v i t r o , p o s s i b l y t h r o u g h f e r r y l r a d i c a l s g e n e r a t e d b y

t h e f e n t o n r e a c t i o n . ~ 3

T h e h i g h l y r e a c t i v e . O H m a y a b s t r a c t a h y d r o g e n

a t o m f r o m a n u n sa t u r a t e d f a t t y a c i d L H t o f o r m a l i p i d

r a d i c a l L . ( r e a c t i o n e ) a n d , t h e r e f o r e , i n i t i a t e a r a p i d

a u t o c a t a l y t i c c h a i n r e a c t i o n l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n

o f li p id h y d r o p e r o x i d e s ( L O O H ) . A f t e r r e a r r a n g e m e n t

o f t h e d o u b l e b o n d s t o f o r m a c o n j u g a t e d d i e n e , t h e

s t a b i l i z e d l i p i d m o l e c u l e c o n t a i n i n g a c a r b o n r a d i c a l

r a p i d l y r e a c t s w i t h m o l e c u l a r 0 2 t o g i v e a p e r o x y l r a d -

ical

LO2

( r e a c t i o n f ) , w h i c h c a n t h e n a b s t r a c t a h y -

d r o g e n a t o m f r o m a n a d j a c e n t l i p i d m o l e c u l e t o

p r o d u c e a L O O H ( r e a c t io n g ) a n d s o c o n t i n u e t h e c h a in

r e a c t io n o f l i p id p e r o x i d a t i o n . ~2 T h e d e c o m p o s i t i o n o f

t h e se l i p id h y d r o p e r o x i d e s i n t h e p r e se n c e o f tr a n s i t i o n

m e t a l i o n s y i e l d s a l k o x y l ( L O . ) a n d p e r o x y l

(LO2 )

r a d i c a l s ( r e a c t i o n h ) , w h i c h m a y t h e m s e l v e s a b s t r a c t

f u r t h e r h y d r o g e n a t o m s a n d c o n t r i b u t e t o t h e i n i t i a t i o n

a n d p r o g a p a t i o n o f n e w c h a i n r e a c t io n s o f l ip i d p e r -

o x i d a t i o n ( r e a c ti o n s g a n d i ). T h e s m a l l t r a n s i t p o o l

o f n o n - p r o t e i n b o u n d i r on m o v i n g b e t w e e n t r a n s f er r i n ,

c e l l c y t o p l a s m , m i t o c h o n d r i a a n d f e r r i ti n c o u l d p r o v i d e

t h e c a t a ly s t r e q u i r e d f o r . O H f o r m a t i o n a n d c h a i n - p r o p -

a g a t i o n o f l i p i d p e r o x i d a t i o n ( r e a c t i o n s c , d , a n d h ) . l~t

T h e l i p i d p e r o x y l r a d i c a l s L O 2 m a y b e t h e m a j o r

O 2 - c e n t e r e d f r e e r a d i c a l s g e n e r a t e d i n a c e l l a s a r e su l t

o f 0 2 r e d u c t i o n o r l ip i d p e r o x i d a t i o n . C o m p a r e d w i t h

o t h e r O 2 - c e n t e r e d f r e e r a d i c a l s , L O 2 a r e m o r e s t a b le

sp e c i e s c a p a b l e o f d i f f u s i n g t o c e l l u l a r lo c i d i s ta n t f r o m

t h e s i te o f t h e i r g e n e r a t i o n . T h e r e f o r e , t h e i r r o le i n

i n t e r a c t i n g d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y w i t h D N A a n d / o r

o t h e r m a c r o m o l e c u l e s a n d p r o d u c i n g c e l l u l a r l e s i o n s

a s s o c i a t e d w i th c a r c i n o g e n e s i s m a y b e m o r e i m p o r t a n t

t h a n t h a t o f . O H . l J4 H o w e v e r , l i p i d p e r o x i d a t i o n s e e m s

t o o c c u r a t a l a t e s t a g e i n t h e i n j u r y p r o c e s s a n d m a y

con t r ibu te l i t t l e t o i t. ~J5 Nu c le i c ac ids and pro te ins ma y

a l so b e o x i d i z e d a n d / o r c o n v e r t e d t o f r e e r a d i ca l f o r m s ,

w h i c h i n tu r n a r e h i g h l y r e a c t i v e a n d m a y c r e a t e c r o s s -

l i n k s . O n e o f t h e c u r r e n t h y p o t h e s i s i s th a t su c h a n

o x i d a t i v e c h a l l e n g e m i g h t c o n t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y t o

t h e i n d u c ti o n , p r o m o t i o n a n d / o r p r o g r e s s i o n o f s k in

t u m o r s . F o r i n s t a n c e , t h e r o l e o f O 2 - d e r i v e d f r e e r a d -

i c a l s i n m e d i a t i n g i o n i z i n g r a d i a t i o n - i n d u c e d D N A

dam age and c y to tox ic i ty i s we l l e s t ab l i shed . ~16'~7 The

g e n e t i c m a t e r i a l i s u n d o u b t e d l y t h e p r i m a r y t a r g e t o f

o x i d a n t a t t a c k i n

v i v o 1°SA°9tlSA18 t19

s i n c e t h e a b o v e

R O S c o n s i s t e n t ly i n d u c e m u t a t io n s , D N A a d d u c t s a nd

s t r a n d b r e a k s , a n d c l a s t o g e n i c e f f e c t s in c e l ls su b j e c t e d

t o o x i d a t i v e s t r e s s . T h e p o s s i b i l i t y h a s b e e n su g g e s t e d

t h a t t h e i n i ti a t i n g a n d p r o m o t i n g c o m p o n e n t s o f ca r -

c i n o g e n e s i s m a y b e t r i g g e r e d b y q u a l i t a t i v e l y a n d

q u a n t i t a t iv e l y d i f f e r e n t l e v e l s o f p r i m a r y a n d s e c o n d -

a r y o x i d i z i n g a g e n t s c a u s i n g d i f f e r e n t l e v e l s o f m u -

t a t i o n , D N A d a m a g e a n d c h r o m o so m a l a b e r r a t i o n . ~ ° 4

etoxif ication of ROS

T h e m a j o r i n t r a c e l l u l a r a n t i o x i d a n t d e f e n se r e l i e s

o n e n z y m a t i c a l l y r e m o v i n g O 2 - a n d

H202

h o p e f u l l y

b e f o r e t h e y r e a c h t h e i r o n c a t a l y s t s a n d f o r m O H a n d

f e r r y l r a d i c al s . C o n v e r s e l y , a n e x p e r i m e n t a l m e a n s o f

a n t i o x i d a n t p r o t e c t i o n i s t o d e c r e a se t h e a v a i l a b i l i ty o f

m e t a l c a t a l y s t s r e q u i r e d f o r t h e d a m a g i n g f r e e r a d i c a l

r e a c t i o n s c , d , a n d h . F o r e x a m p l e , t h e sp e c i f i c a n d

p o w e r f u l i r o n c h e l a t o r d e s f e r r i o x a m i n e m e t h a n e s u l -

f o n a t e ( D e s f e r a l ; C 1 B A - G E I G Y ) m a y p r o t e c t a g a i n s t

•O H g e n e r a t i o n a n d l i p i d p e r o x i d a t i o n b y p r e v e n t i n g

c o m p l e x e s o f i r o n s a l t s f r o m p a r t i c i p a t i n g a s c a t a l y s t s

i n r a d i c a l r e a c t i o n s ( j ) . ~ I n a d d i t i o n t o t h e d e t o x i f y i n g

e n z y m e s s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ( S O D ) , c a t a la s e ( C A T ) ,

a n d G S H p e r o x i d a se , t h e c e l l s m a i n t a i n a m u l t i - l e v e l

p r o t e c t i v e sy s t e m a g a i n s t f r e e r a d i c a l g e n e r a t i o n a n d

l i p i d p e r o x i d a t i o n i n c l u d i n g b o t h l i p i d - so l u b l e m e m -

b r a n e s c a v e n g e r s su c h a s c x - t o c o p h e ro l ( o~ T H, v i ta m i n

E ) a n d w a t e r - so l u b l e c y t o p l a sm i c a n t i o x i d a n t s su c h a s

G SH (Ta ble 2) . 12°

A t t h e m e m b r a n e l e v e l w h e r e t h e c o n c e n t r a t i o n o f

t h e n a t u r a l c e l l u l a r a n t i o x i d a n t G S H i s p r o b a b l y m i n -

i m a l , t h e l i p i d - so l u b l e f r e e r a d i c a l s c a v e n g e r o ~T H m a y

p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n p r e v e n t i n g o x i d a t i v e p r o -

c e s se s f r o m t a k i n g p l a c e . E f f e c t i v e a n t i o x i d a n t p r o -

t e c t i o n b y o L TH a p p e a r s t o b e d u e t o e f f i c i e n t i n h i b i t i o n

o f l i p i d o x y - r a d i c a l p r o p a g a t i o n i n t h e b i l a y e r r a t h e r

than to in t e rce p t ion of i n i t i a t ing 02 rad ica l s . 121 Co n-

c e n t r a t i o n s o f c~ T H i n c r e a s i n g a b o v e t h e t h r e sh o l d o f

0 . 2 m o l e p e r c e n t ( b a s e d o n p h o s p h o l i p i d c o n t e n t o f

l i p o so m e s ) d e c r e a se t h e a v e r a g e r a d i c a l c h a i n l e n g t h

a n d t h e r a t i o o f L O 2 t o L O . i n t h e b i l a y e r a n d i n d u c e


9/32

Antioxidants and skin carcinogenesis 385

t e r m i n a t i o n o f l i p id o x y - r a d i c a l p r o p a g a t i o n ( r e a c ti o n s

k and 1) .

O t h e r t y p e s o f an t i o x i d a n ts m a y s p o n t a n e o u s l y a n d /

o r e n z y m a t i c a l l y p r e v e n t t h e f o r m a t i o n o f t h e d a n g e r -

ous •O H r a d i c a l s b y r e d u c i n g

U202

b e f o r e i t c a n r e a c t

f u r t h e r . T h e e n d o g e n o u s a n t i o x i d a n t G S H ~22 m e e t s t h i s

r e q u i r e m e n t b e c a u se i t i s p r e se n t a t r e l a t i v e l y h i g h c o n -

c e n t r a t i o n s i n th e a q u e o u s p a r t o f t h e c e l l s w h e r e r e -

a c t i o n s a - d a r e l i k e l y t o o c c u r . M o r e o v e r , r e d u c t i o n

o f o x i d a t i v e s t r e s s i s a l so a c c o m p l i sh e d b y t h e a c t i o n

o f t h e f o l l o w i n g e n z y m e s w h i c h c o n t r o l t h e c e l l u l a r

l e v e l o f

H202

( T a b l e 2 ) .~ 2° N a t i v e S O D o r S O D - m i m -

i c k i n g c o m p o u n d s s u c h a s C u ( I I ) - ( 3 , 5 - d i i s o p r o p y l s a l -

i c yl a te ) 2 ( C u D I P S ) a c c e l e r a te t h e r e m o v a l o f 0 2 ;

r a d i c a l s ( r e a c t i o n m ) . I n a d d i t i o n t o C A T a c t i v i t y , t h e

d e t o x i f i c a t i o n o f

H202

i n t h e c y t o p l a sm i s a c c o m -

p l i s h e d l a r g e l y b y t h e G S H p e r o x i d a s e - g l u t a t h i o n e

r e d u c t a s e ( G S S G - R ) c o u p l e , a N A D P H - c o n s u m i n g

s y s t e m w h i c h i s e x t r e m e l y s p e c i f i c f o r G S H a n d r e -

q u i r e s a d e q u a t e c o n c e n t r a t io n s o f g l u c o s e a n d S e t o

work 122

U n l i k e C A T , t h e S e - d e p e n d e n t f o r m o f G S H

p e r o x i d a se c o n t a i n i n g s e l e n o c y s t e i n e a t i t s c a t a l y t i c

s i t e i s c a p a b l e o f r a p i d l y d e t o x i f y i n g b o t h

U202

a n d

l i p i d h y d r o p e r o x i d e s ( r e a c t i o n s n a n d o ) . I n c o n t r a s t ,

n o n - S e d e p e n d e n t G S H p e r o x i d a s e u s e s o r g a n i c

h y d r o p e r o x i d e s b u t n o t

H202 as

su b s t r a t e s a n d h a s

b e e n s h o w n t o b e a s s o c i a t e d w i t h a n o t h e r f a m i l y o f

p r o t e c t i v e e n z y m e s , t h e G S H S - t r a n s f er a s e s ( r e a c -

t ion 0) . 123 125 Th ere a re m ul t ip l e fo rm s o f GS H S- t rans-

fe rases loca t ed pr inc ipa l ly in the cy toso l .~26 Al though

c o n j u g a t i o n o f G S H t o c e r ta i n x e n o b i o t i c s m a y b e a c -

c o m p l i s h e d t o s o m e d e g r e e b y s p o n t a n e o u s n o n - e n -

z y m a t i c r e a c t i o n s , c o n j u g a t i o n w i t h G S H c a t a l y z e d b y

t h e G S H S - t r a n s f e r a s e s i s a n i m p o r t a n t p r o c e s s f o r t h e

c e l l u l a r d e t o x i f i c a t i o n o f h y d r o p h o b i c a g e n t s b e a r i n g

e lec t rop hi l i c s i t e s . 122.127 Th us , t he GS H pe r ox idas e ac -

t i v it y o f t he G S H S - t r a n s f e ra s e ( r e a c t i o n o ) m a y b e o f

p a r a m o u n t i m p o r t a n c e t o p r o t e c t f r o m l i p i d h y d r o p e r -

o x i d e d a m a g e t h e b i o l o g i c a l s y s t e m s t h a t h a v e n o o r

v e r y l it tl e S e - d e p e n d e n t G S H p e r o x i d a s e , e v e n t h o u g h

s u c h p r o t e c t i o n m a y n o t b e t h e p r i m a r y a c t io n o f t h i s

c l o se l y r e l a t e d g r o u p o f en zy m es .~ 2 8 I n m o u se e p i d e r -

m i s i n v i v o a n d i n v i tr o , N a 2 S e O 3 - d e p e n d e n t G S H p e r -

o x i d a s e a c t i v i ty r e p r e s e n t s a b o u t 6 5 - 7 5 % o f th e t o ta l

G S H p e r o x i d a se a c t i v i t y . 1 2 9

ree radicals in tumor initiation

A l t h o u g h i n c r e a se d f r e e r a d i c a l g e n e r a t i o n c a n l e a d

t o D N A d a m a g e a n d i s p o t e n t i a l l y c a r c i n o g e n i c , t h e

r o l e o f R O S i n t u m o r i n i t ia t io n i s n o t w e l l d o c u m e n t e d .

T r a n s i t i o n m e t a l i o n s , su c h a s i r o n , a r e i n v o l v e d i n t h e

O 2 ~ - - d ep e n d e n t f o r m a t i o n o f m o r e r e a c t i v e r a d i c a l s a n d

m a y a f f e c t t h e i n i t i a t i o n o f n e o p l a s i a . ~ 2 T h e f r e e r a d -

i c a l - g e n e r a ti n g a g e n t s B P x , l a u r y l p e r o x i d e a n d

H202

m a y b e i n a c t i v e a s sk i n t u m o r i n i t i a t o r s b e c a u se t h e

d o s e s o f p e r o x i d e s c a p a b l e o f i n d u c i n g i r r e v e rs i b l e

D N A l e s i o n s m a y b e t o o t o x i c t o p e r m i t t h e s u r v i v a l

o f a p o p u l a t i o n o f i n i t i a t e d e p i d e r m a l c e l l s l a r g e

e n o u g h t o b e p r o m o t e d . ~ 3 °

T h e e s se n t i a l s t e p i n th e p r o c e s s o f sk i n t u m o r i n i-

t i a t i o n i s t h e m e t a b o l i c a c t i v a t i o n o f D M B A b y

N A D P H - a n d c y t o c h r o m e P 4 4 8 - d e p e n d e n t T m i c r o -

s o m a l m i x e d - f u n c t i o n o x i d a s e s t h a t ar e i n d u c e d i n t h e

ep id e rm is 132,~33 and gen e ra t e h igh ly reac t ive e l ec t ro-

p h i li c d e r i v a t iv e s , w h i c h c o v a l e n t l y m o d i f y D N A a n d

o t h e r c e l l u l a r m a c r o m o l e c u l e s . 1 3 4 A se q u e n c e o f t h r e e

m o n o o x y g e n a s e - , e p o x i d e h y d r a t a s e - a n d m o n o o x y -

g e n a s e - c a t a l y z e d r e a c t i o n s a f f e c t i n g t he a n g u l a r b e n z o

r i n g a d j a c e n t t o t h e b a y r e g i o n ''1 3 5 c o n v e r t s t h e

p r o c a r c i n o g e n i c P A H p a r en t m o l e c u l e D M B A in t o

m u t a g e n i c o x i d a t i o n p r o d u c t s o f t e n c a l l e d t h e

p r o x i m a t e a n d u l t i m a t e f o rm s o f t he c a r ci n o g en :

t h e i n i t i a l n o n - K - r e g i o n e p o x i d e i s t h e n h y d r a t e d t o

g i v e a d i h y d r o d i o l , a n d f i n a l l y t h e o x i d a t i o n o f th e

d o u b l e b o n d a d j a c e n t t o t h e d i h y d r o d i o l g r o u p i n g

y i e ld s t h e b a y r e g i o n v i c in a l d i o l - e p o x i d e t h a t is

p r o b a b l y t h e 3 , 4 - d i o l 1 , 2 - o x i d e o f D M B A . 136 T h u s ,

t h e e f f i c i e n c y o f t u m o r i n i t i a t io n i n m o u se sk i n i s r e -

l a t e d b o t h to t h e d o se o f D M B A a p p l i e d a n d t o th e

e x t e n t o f i n d u c t i o n o f t h e e p i d e r m a l m i c r o s o m a l a r y l

h y d r o c a r b o n h y d r o x y l a s e ( A H H ) a c t i v i t i e s n e c e s s a r y

t o c a t a l y z e t h e f o r m a t i o n o f th e e le c t r o p h i l ic b a y r e -

g i o n d i o l e p o x i d e m u t a g e n s i n t h e p r e s e n c e o f a

N A D P H - c y t o c h r o m e P 4 4 8 e l e c t r o n t r a n s p o r t s y s -

tem . 132.133,137 142 G en et ic stu die s su gg es t tha t, in d iff er -

e n t s t r ai n s o f m i c e , h i g h A H H i n d u c i b i l i t y l e a d s to

i n c r e a se d su sc e p t i b i l i t y t o P A H - i n d u c e d t u m o r s . 1 4 3

I n a d d i t i o n t o t h e f o r m a t i o n o f e l e c t r o p h i l i c u l t i -

m a t e c a r c i n o g e n s d i r e c t l y i n d u c i n g D N A l e s i o n s , t h e

m e t a b o l i c a c t i v a t i o n / d e g r a d a t i o n o f P A H s m a y p r o -

c e e d t h r o u g h q u i n o n e d e r i v a t i v e s a n d f r e e r a d i c a l i n -

t e r m e d i a t e s , t h e r e b y p r o d u c i n g R O S t h at m a y i n d i -

r e c t l y c o n t r i b u t e t o t h e p e r s i s t e n c e o f u n r e p a i r e d

D N A d a m a g e r e su l t i n g i n i n i t i a ti o n o f t h e a f f e c t e d

cel ls .144 14s An O2 -dep ende nt m e tab ol i c pa th wa y has

b e e n d e s c r i b e d , i n w h i c h s e m i q u i n o n e i n t e r m e d i a t e s

o f P A H s p a r t i c i p a t i n g i n r e d o x c y c l e s a r e o x i d i z e d t o

q u i n o n e m e t a b o l i t e s w i t h c o n c o m i t a n t r e d u c t i v e g e n -

e r a t i o n o f 27 s u b s e q u e n t l y t r i g g e ri n g

H202

a n d . O H

fo rm at io n . ~49.150S i n c e i o n i z i n g r a d i a t i o n s a r e k n o w n t o

d a m a g e D N A e i t h e r d i r e c t l y o r i n d i r e c tl y t h r o u g h f r e e

rad ica l gen e ra t ion , ~7 i t is i n t e re s t ing to no te tha t a

s i n g le s u b t u m o r i g e n i c d o s e o f i o n i z in g r a d i a t io n s m i m -

i c s t h e i n i t i a t i n g a c t i v i t y o f D M B A i n t h e t w o - s t a g e

i n i t i a t i o n - T P A p r o m o t i o n p r o t o c o l i n m o u s e s k i n .

T

M o r e o v e r , t h e i n c r e a s e d g e n e r a t i o n o f R O S b y l eu -

k o c y t e s d u r i n g s k i n i n f l a m m a t i o n i s c le a r l y i m p l i c a te d


10/32


i n t h e m e t a b o l i c a c t i v a t i o n o f P A H s i n m o u se sk i n . 152

T h e o x i d a t i v e c h a l l e n g e p r o d u c e d b y t h e p o l y m o r -

p h o n u c l e a r ( P M N ) l e u k o c y t e s t h a t a r e r e c r u i t e d a n d

s u b s e q u e n t l y a c t i v a t e d b y t w o p r e - t r e a t m e n t s o f t h e

s k i n w i t h T P A 1 6 h b e f o r e a n d i m m e d i a t e l y p r i o r t o

i n i t i a t i o n h a s b e e n sh o w n t o e n h a n c e t h e m e t a b o l i c

a c t i v a t i o n o f t h e p e n u l t i m a t e c a r c i n o g e n b e n z o [ a ] -

p y r e n e ( B P ) 7 , 8 - d i h y d r o d i o l t o g e n o t o x i c a n d c h e m -

i l u m i n e s c e n t m e t a b o l it e s th r o u g h m y e l o p e r o x i d a s e - d e -

p e n d e n t p a th w ay s.~ 5 3 T h e r e f o r e , i t i s c o n c e i v a b l e t h a t

t h e o x i d a t i v e b u r s t i n d u c e d b y t h e m e t a b o l i c a l l y s t i m -

u l a t e d l e u k o c y t e s i n f i l tr a t i n g t h e s it e s o f i n f l a m m a t i o n

i n m o u se sk i n c o u l d f a c i l i t a t e o r e n h a n c e e i t h e r d i r e c t l y

o r i n d i r e c t ly t h e t u m o r - i n i ti a t in g a c t iv i t y o f D M B A .

T h e p o s s i b l e l i n k b e t w e e n i n f l a m m a t i o n a n d c a n c e r h a s

be en re vi ew ed . ~52,~53T h e f r e e r a d i c a l s m a y a c t as t u m o r

i n i t i a t o r s b y d i r e c t d a m a g i n g i n t e r a c t i o n w i t h D N A ,

i n d i r e c t f o r m a t i o n o f c l a s t o g e n i c f a c t o r s , o r i n d u c t i o n

o f c o o x y g e n a t i o n i n c a r c i n o g e n m e t a b o l i s m .

T h e r e l e v a n c e o f a r a c h id o n i c a c i d m e t a b o l i s m t o

sk i n t u m o r i n i t i a t i o n i s su g e s t e d b y t h e f i n d i n g t h a t

P A H d i h y d r o d i o l s a r e c o o x i d i z e d t o m u t a g e n i c d e r i v -

a t ives dur ing PG b iosynthes i s .~54 '~55 PG endoperoxide

s y n t h e t a s e c o n t a in s b o t h f a t t y a ci d c y c l o o x y g e n a s e a n d

h y d r o p e r o x i d e a c t i v i t i e s , w h i c h c a t a l y z e t h e b i o s y n -

t h e s i s o f h y d r o x y e n d o p e r o x i d e s f r o m a r a c h i d o n i c

a c i d . ~56 T h e p e r o x i d a t i v e o x i d a t i o n m e d i a t e d b y t h e

e n z y m e P G H s y n t h e t a s e i n t h e p r e s e n c e o f ar a c h i d o n i c

a c i d m a y s i m u l t a n e o u s l y t r i g g e r t h e c o o x i d a t i o n o f

P A H c a r c i n o g e n s . 157 A r a c h i d o n i c a c i d t r e a t m e n t p r i o r

t o D M B A s t im u l a t e s t u m o r i n i ti a t io n , a n e f f e c t w h i c h

i s a b o l i sh e d b y t h e s i m u l t a n e o u s a d m i n i s t r a t i o n o f t h e

i n h i b i t o r o f P G sy n t h e s i s , i n d o m e t h a c i n . 154 T h e m e c h -

a n is m o f P G e n d o p e r o x i d e s y n t h e t a s e -d e p e n d e n t c o o x -

y g e n a t i o n , t h e r e f o r e , m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o le i n t h e

o x i d a t i v e a c t i v a t i o n o f c a r c i n o g e n i c m e t a b o l i t e s i n ti s -

s u e s w i t h l o w N A D P H - d e p e n d e n t m i x e d - f u n c t i o n o x -

i d a se a c t i v i t y . ~54 T h e e x c e l l e n t c o r r e l a t i o n o b s e r v e d

b e t w e e n L O z a n d d i o l - e p o x i d e f o r m a t i o n m s u g g e s t s

t h a t t h e L O z g e n e r a t e d d u r i n g a r a c h i d o n i c a c id m e -

t a b o l i s m m a y b e t h e o x i d a n t s t h a t e p o x i d i z e t h e p e -

n u l t im a t e d i h y d r o d i o l m e t a b o l i t e o f D M B A t o t h e

u l t i m a t e d i o l - e p o x i d e f o r m o f t h e c a r c i n o g e n . 1~4 H o w -

e v e r , r e c e n t s t u d i e s w i t h i so l a t e d e p i d e r m a l c e l l s su g -

g e s t t h a t t h e m a j o r so u r c e o f L Oz m a y b e li p i d

p e r o x i d a t i o n r a t h e r t h a n t h e e n z y m e s o f a r a c h i d o n i c

a c id o x y g e n a t i o n . ~4 D u r i n g m e t a b o l i c a c t i v a ti o n o f

D M B A , t h e L O z r a d i c a l s p l a y n o r o l e i n t h e f ir s t e p o x -

i d a t i o n r e a c t i o n , w h i c h i s c a t a l y z e d so l e l y b y i n d u c i b l e

m i c r o s o m a l m o n o o x y g e n a s e s . I n c o n t r a s t , b o t h L O z

a n d P 4 4 8 - d e p e n d e n t e n z y m i c r e a c t io n s m a y c o n t r i b u t e

t o t h e t e r m i n a l s t e p o f t h e p a t h w a y o f m e t a b o l i c a c t i -

v a t i o n o f th e i n i t ia t o r D M B A . T h e k i n e t i c s o f m i x e d -

f u n c t i o n o x i d a s e i n d u c t i o n o r i n h i b it i o n , D N A a d d u c t

f o r m a t i o n a n d sk i n t u m o r i n i t i a t i o n su g g e s t t h a t , i n

i n ta c t e p id e r m a l c e l ls , L O z ' - d e p e n d e n t e p o x i d a t i o n o f

d i h y d r o d i o l s t o d i o l e p o x i d e s m a y b e a n e f f e c t i v e a l -

t e r n a t i v e t o c y t o c h r o m e P 4 4 8 - d e p e n d e n t e p o x i d a t i o n

s i n c e t h e i n d u c t i o n o f t h e l a t t e r e n z y m i c p a t h w a y i s

n o t a b so l u t e l y r e q u i r e d f o r t h e m e t a b o l i c a c t i v a t i o n o f

l o w t u m o r - i n i t i a t i n g d o se s o f D M B A i n m o u se sk i n . 114

I n c o n c l u s i o n , t h e c a t al y t i c a c t io n o f m i c r o s o m a l c y -

t o c h r o m e P 4 4 8 - d e p e n d e n t m o n o o x y g e n a s e s i s n o t

e x c l u s i v e l y i n v o l v e d i n t u m o r i n i t i a t i o n . T h e t u m o r -

i n i t i a t i n g d i o l e p o x i d e s m a y b e f o r m e d a s w e l l b y o x -

i d a ti o n o f t h e p e n u l t i m a t e m e t a b o l it e s o f P A H s t h r o u g h

L O z o r o t h e r f r e e r a d i c a l s g e n e r a t e d d u r i n g l i p i d

p e r o x i d a t i o n ~59 o r t h e o x i d a t i v e b u r s t a c c o m p a n y i n g

the s t a t e o f i n f l a mm at io n , ~52~53 or b y the p e ro xida se

co m p o n en t o f P G sy nt h et as e. 154,L55.157,158

Free radicals in tumor promotion

T h e r e l a ti o n s h i p s b e t w e e n c e l l u l a r p r o o x i d a n t s t a te s

and tu m or pr om ot io n ha ve be en re vie we d. 5L~°4-~1°'16°.~61

T h e r o l e o f O z - c e n t e r e d f r e e r a d i c a l s i n t u m o r p r o -

m o t i o n i s su p p o r t e d i n d i r e c t l y b y th e o b v se r v a t i o n s th a t

1 ) t u m o r p r o m o t e r s i n c r e a se t h e g e n e r a t i o n a n d d e -

c r e a se t h e d e g r a d a t i o n o f R O S ; 2 ) c e r t a i n o r g a n i c p e r -

o x i d e s a n d f r e e r a d i c a l - g e n e r a t i n g s y s t e m s e x h i b i t

t u m o r - p r o m o t i n g a c t iv i t ie s a n d m i m i c o r e n h a n c e s o m e

o f th e m o l e c u l a r e v e n t s l i n k ed t o t u m o r p r o m o t i o n ; a n d

3 ) v a r i o u s a n t i o x i d a n t s a n d f r e e r a d i c a l s c a v e n g e r s i n -

h i b i t th e b i o c h e m i c a l a n d b i o l o g i c a l e f f e c t s o f t h e t u -

m o r p r o m o t e r s . T h e l a t t e r p o i n t i s d e v e l o p e d i n t h e

f o l l o w i n g s e c t io n . S i n c e t u m o r p r o m o t e r s a r e n o t m u -

t a g e n i c a n d d o n o t i n t e r a c t d i r e c t l y w i t h D N A , i t i s

p o s t u l a t e d t h a t t h e i r r e p o r t e d e f f e c t s o n a n e u p l o i d y 7 0 7 1

ch rom os om al abe r ra t io n , 69.7z-75 s i s t e r chr om at id ex-

change ,76 80 DN A s t rand bre aka ge , 81 and gen e

amplification 3°'3zSz'53 Sv a r e i n d i r e c t a n d m a y b e m e -

d i a te d t h r o u g h R O S g e n e r a t e d i n t h e T P A - t r e a t e d e p -

i d e r m a l c e l l s t h e m s e l v e s a n d / o r r e l e a s e d b y t h e

a c t i v a t e d p h a g o c y t i c c e l l s i n f i l t r a t i n g t h e sk i n d u r i n g

i n f l a m m a t i o n . T h e f a c t t h a t T P A d o e s n o t i n h i b i t

g a m m a r a d i a t i o n - i n d u c e d D N A r e p a i r i n r e s t i n g l y m -

p h o c y t e s a r g u e s a g a i n s t t h e h y p o t h e s i s t h a t t u m o r p r o -

m o t i o n i s th e r e su l t o f i m p a i r e d r e p a i r o f p o t e n t i a l l y

mutagenic l e s ions in DNA.~62

O n e o f t h e c u r r e n t h y p o t h e se s i s t h a t a n i n c r e a se d

g e n e r a t i o n o f f r e e 0 2 r a d i c a ls c o u p l e d w i t h a d e f e c t i v e

a n t i o x i d a n t p r o t e c t i v e s y s t e m c o u l d e x p l a i n s o m e o f

t h e m e c h a n i s m s o f t u m o r p r o m o t i o n a n d p r o g r e s s i o n .

A l t h o u g h d i f f e r e n t i n te r p r e t at i o n s h a v e b e e n p r o p o s e d

to exp la in these ob se rv a t ion s , ~63 the ac t iv i t i e s o f t he

d e t o x i f y i n g e n z y m e s S O D a n d C A T s e e m t o be s i g-

n i f i ca n t ly dep res sed by the tum or pro m ote r s , 164.165


11/32

Antio xidants and skin carcino genes is 387

g 2 4 0 - . . . . . .

2 2 0 , A .

e ~ 1 6 c

14C

120

I 1

|

° w

: ,= 160

BI

~ 120

m o o

s

:E . -

o

4

:~0.. .

-= 0 I 2 5 4 5

T ime hours )

Fig . 2 . T ime-response cu rves fo r the e f fec ts o f 1 M TP A on the

leve l o f hydroperox ide (A) GSH perox idase ac t iv i ty (B) and the

intracellular GSH :G SS G ratio (C) in suspensions of disrupted (A)

or intact (B,C) mouse epidermal cells freshly isolated by trypsin

digestion. '72 The to tal volu me o f the incubation mixtu re was 1 ml;

2 x 106 epiderm al cells were resuspended in 0.8 ml of mo dified

Eag le ' s H eLa ce l l med ium con ta in ing 25 mM H epes buf fe r, pH 7 .0 ,

and 10% bovine serum, and the reagents were added in a total volum e

of 0 .2 ml . Dimethy l su l fox ide (DMSO) was used as a veh ic le fo r

TPA; i t s f ina l concen t ra t ion in the med ium was 0 .5%. At the end

of each incubation period, 1 ml of 20% trichloro acetic acid (TCA )

was added to the cell-free systems and the whole acid-soluble su-

pernatant was collected by centrifugation and mixed with 0.6 ml of

ferri thiocyan ate assay reage nts? 73=74 The absorption of the red fer-

ri thiocyanate com plex formed in the presence of peroxide was mea-

sured against a reag ent blank at 480 nm in a Shimadzu-160 dou-

ble-beam spe ctropho tom eter and compare d to H202 standards. The

soluble ep iderm al extracts contain ing GSH peroxid ase activity were

prepared from the intact cells and total GSH pero xidase activ ity was

de te rmined wi th 1 .5 mM cumene hydroperox ide as desc r ibed p re -

vi ou sl y. ,29.,79-~82The en zymic de te rmina t ion o f the in t race l lu la r leve ls

w h e r e a s c e r t a i n c l a s s e s o f r e a c t i v e 0 2 i n h i b i t o r s i n -

c l u d in g C A T a n d v a r i o u s S O D - m i m i c k i n g c o m p o u n d s

g e n e r a l l y i n h i b i t s o m e o f th e b i o c h e m i c a l a n d b i o l o g -

i c a l e f f e c t s o f t h e t u m o r p r o m o t e r s . 99'166-169 R e c e n t l y ,

w e h a v e e s t a b l i s h e d t h e s e q u e n t i a l r e l a t i o n s h i p s b e -

t w e e n t h e e f f e c t s o f T P A o n h y d r o p e r o x i d e f o r m a t i o n ,

G S H p e r o x i d a s e a c t i v i t y an d t h e i n t r a c e l l u l a r ra t i o o f

r e d u c e d g l u t a t h i o n e ( G S H ) : o x i d i z e d g l u t a t h i o n e

( G S S G ) .

O u r c u r r e n t s t u d i e s i n d i c a t e t h a t T P A r a p i d l y s t i m -

u l a te s h y d r o p e r o x i d e p r o d u c t i o n i n i n t a c t e p i d e r m a l

c e l l a n d c e i l - f r e e s y s t e m s i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o r

a b s e n c e o f e n z y m i c a n d n o n e n z y m i c g e n e r a t o r s o f

R OS. 170 171 E p i d e r m a l c e l l s ( 2 x 106 c e l l s / m l ) f r e s h l y

i s o l a t e d f r o m m o u s e s k i n b y t r y p s i n d i g e s t i o n 172 w e r e

d i s r u p t e d b y s o n i c a t i o n a n d i n c u b a t e d f o r v a r i o u s p e -

r i o d s o f t i m e i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f 1 k tM T P A

( F i g . 2 A ) . T h e h y d r o p e r o x i d e c o n t e n t s o f t h e a c i d -

s o l u b l e s u p e r n a t a n t s c o l l e c t e d a t t h e e n d o f t h e i n c u -

b a t i o n w e r e a s s a y e d a t a c i d p H b y a m o d i f i c a t i o n 173 o f

t h e f e r r i t h i o c y a n a t e m e t h o d . 174 I n t h i s T P A - s t i m u l a t e d

e p i d e r m a l s y s t e m , t h e s te a d y - s t a t e l e v e l o f h y d r o p e r -

o x i d e s i n c r e a s e s r a p i d l y a n d s t e a d i l y f o r a b o u t 2 h a n d

r e m a i n s a t 2 2 4 % o f th e b a s a l l e v e l u p t o 4 . 5 h ( F i g .

2 A ) . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 5 h i n t h e p r e s e n c e o f 1 M

c o n c e n t r a t io n s o f D M B A , T P A , p h o r b o l - 1 2 , 1 3 -d i d e -

c a n o a t e , M E Z , p h o r b o l - 1 2 , 1 3 - d i b e n z o a te , 4 - 0 - m e t h y l

T P A , p h o r b o i a n d E P P , t h e l e v e l s o f h y d r o p e r o x i d e s

a r e , r e s p e c t i v e l y , 2 3 5 , 2 2 4 , 1 8 6 , 17 5 , 1 6 2 , 1 3 7 , 1 0 2 ,

a n d 9 8 % o f th e c o n t r o l l e v e l , s u g g e s t i n g t h at t h e h y-

d r o p e r o x i d e - i n d u c i n g a c t i v i t i e s o f t h e s e a g e n t s c o r r e -

l a te w i th t h e ir t u m o r - p r o m o t i n g o r c a r c i n o g e n i c a c -

t i v i t i e s . 170.171 A l t h o u g h t h e t i m e - c o u r s e a n d m a g n i t u d e

o f t h e h y d r o p e r o x i d e r e s p o n s e t o T P A a r e i d e n t i c a l ,

t h e v a l u e s o f th e b a sa l a n d T P A - s t i m u l a t e d l e v e l s o f

h y d r o p e r o x i d e s m e a s u r e d i n s u s p e n s i o n s o f i n t ac t e p -

i d e r m a l c e l l s a re a b o u t 5 0 % s m a l l e r t h a n t h o s e o b t a i n e d

w i t h t he e p i d e r m a l c e l l - f r e e s y s t e m . S i m i l a r r e s u lt s

w e r e o b t a i n e d , b u t a t a m u c h l o w e r l e v e l , u s i n g t h e 4-

a m i n o a n t i p y r i n e / p h e n o l r e a g e n t an d ho r s e r a d i s h p e r -

o f GSH and G SSG w as pe r fo rmed in samples d epro te in ized in 5%

TC A/ 0.01 N H CI. ,79-,82 Hyd roperoxid e le vel was expressed as n mol

H202/2 × 106 disrupted c ell s/m l, GSH peroxidase activity as ,umol

of NAD PH ox id ized in 1 min / 2 × 106 ce l l s and the leve ls o f GSH

and GSSG as ng /2 x 106 cells . Blank reactions with enzyme source,

g lu ta th ione , o r hydroperox ide samples rep laced by buf fe r were sub-

stracted from the data. Results are expressed at each point as % of

the basa l leve l o f H~O2, GSH perox idase ac t iv i ty o r GS H:G SSG

ratio in cells incubated in the absence of TPA . Each poin t in the

graph is the mean value ± SD of 6 replications from 2 different

exper imen ts . The mean va lues o f the basal leve ls o f hydroperox ides

(8.6 +- 0.4 nm ol H202/ml; 100 --- 5%), the basal G SH perox idase

ac t iv i t ie s (0 .167 ± 0 .014 k~mol o f NA DPH ox id ized /mi n /2 x 106

cells; 100 --- 8%) and the basal G SH :G SS G ratios (24.3 --- 1 .8;

100 --- 7%) at eac h point in control incubations hav e been indicated

by the hatched areas.


12/32


o x i d a s e , a n e n z y m i c a s s a y p e r f o r m e d a t p h y s i o l o g i c a l

p H a n d w h i c h i s sp e c i f i c f o r H 20 2 175 177 I n o t h e r i n

v i v o e x p e r i m e n t s , g r o u p s o f m i c e r e c e i v e d e i t h e r ac e -

t o n e , 1 , o r 2 t o p i c a l a p p l i c a t i o n s o f 8 . 5 n m o l o f T P A

at 24 h in t e rva l and we re k i l l ed i 2 h a f t e r the l a s t TPA

t r e a t m e n t . W h e n i n c u b a t e d i n v i t r o i n t h e p r e se n c e o r

a b s e n c e o f 5 m M N A N 3 , t h e l e v e ls o f h y d r o p e r o x i d e s

i n t h e h o m o g e n a t e s p r e p a r e d f r o m t h e sk i n s t r e a t e d

o n c e o r t w i c e w i t h T P A w e r e 1 . 5 - a n d 3 - f o l d h i g h e r ,

r e sp e c t i v e l y , t h a n t h e c o n t r o l le v e l s in th e h o m o g e n a t e s

f r o m t h e sk i n s t r e a t e d w i t h a c e t o n e o n l y . 171 P h a g o c y t i c

c e l l s m a y c o n t r i b u t e t o t h e H 2 0 2 r e sp o n se s i n t h e h o -

m o g e n a t e s p r e p a r e d f r o m s k in s p r e t r e at e d w i t h T P A o r

D M B A i n v i v o . T h e f a c t t h a t s i m i l a r H 2 0 2 r e sp o n se s

a r e d e t e c t e d i n e p i d e r m a l c e l l s a n d h o m o g e n a t e s ,

w h i c h a r e i s o l a t e d o r p r e p a r e d f r o m n o n - t r e a te d s k i n s

and then incuba ted d i rec t ly w i th TPA or DMBA,~7° '~7~

su g g e s t s t h a t t h e i n c r e a s i n g l e v e l s o f

H2 2

a r e g e n e r -

a t e d l a r g e l y b y t h e T P A - a n d D M B A - t r e a t e d k e r a t i n o -

c y t e s a n d c a n n o t r e f l e c t e n t i r e l y t he o x i d a t i v e b u r s t o f

a c t i v a t e d l e u k o c y t e s i n f i l t r a t i n g t h e sk i n . I n d e e d , t h e

k e r a t i n o c y t e s m a y b e t h e m a j o r so u r c e o f H 2 02 i n t h e

ep id er m is . ~TX

T h e s e q u e n t i a l a n d d o s e - d e p e n d e n t

Documents

24 Antioxidants and Multistage Carcinogenesis in Mouse Skin