1. INTRODUÇÃO

Com o crescente avanço tecnológico, encontra-se cada vez mais em indústrias novos equipamentos que dão resultados mais eficazes e em menor tempo. Os métodos instrumentais estão sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as mais diversas análises nas inúmeras áreas de atuação na industria química.

Um exemplo disso são os métodos espectrofotométricos, como é o caso do método em estudo, “o método do DNS”. É um método rápido e prático na determinação de açúcares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial.

No controle de qualidade envolve a caracterização das matérias primas para fins de processamento, e verificação se determinado produto está dentro dos parâmetros e padrões exigidos pela legislação. Na indústria açucareira, serve para controlar se o açúcar, a sacarose, quando hidrolisado sofreu processo de redução, que não é tão facilmente percebido no acompanhamento do processo. Também é utilizado no acompanhamento do processo de fermentação, que permite verificar as taxas de consumo de açúcar pelo microorganismo, necessário para a compreensão da cinética do processo.

2. OBJETIVOS Construir a curva padrão de glicose, plotando absorbância x

concentração e, através de regressão linear, determinar a equação da curva e o coeficiente de correlação.

Determinar também a concentração de açucares redutores numa amostra de concentração desconhecida.

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Os carboidratos, ou mais comumente, açúcares, abrangem um dos

maiores grupos de compostos orgânicos conhecidos na natureza, e juntamente com as proteínas formam os principais constituintes dos organismos vivos, além de serem a mais abundante fonte de energia para o homem. São acetais ou cetais poliidroxilicos com a fórmula empírica (CH2O)n. Os carboidratos simples mais abundantes são as pentoses e hexoses. Os açúcares possuem um ou mais átomos assimétricos de carbono, portanto podem existir na forma de estereoisômeros. Já os açucares de ocorrência natural, por exemplo, glucose, frutose e manose, pertencem as séries D (forma de isomeria ótica).

Os carboidratos tem diversas classificações, de acordo com seu tamanho, de acordo com o grupo funcional que é derivado, entre outras. As classificações podem ser: monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos.

Os monossacarídios são carboidratos simples que não podem ser hidrolisados a açucares de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdeídos) e cetoses (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o número de carbonos na cadeia.

Os oligossacarídios são polímeros compostos de resíduos de monossacrídios unidos por ligações hemiacetálicas, neste caso denominadas ligações glicosídicas, em número que variam de duas, até, aproximadamente, dez unidades. São compostos importantes na determinação de estruturas de polissacarídios.

Polissacarídios são macromoléculas facilmente encontradas na natureza e que ocorrem em quase todos organismos exercendo diversas funções. Formam-se a partir das ligações glicosídicas geralmente com mais de 10 unidades de monossacarídios ou seus derivados. As unidades monossacarídias mais decorrentes são: D-glucose, D-manose, D-frutoses, D e L-galactose, D-xilose e D-arabinose. O polissacarídios mais conhecido é o amido, que é um dos mais importantes constituintes dos alimentos.

Na indústria, bem como na natureza, existem diversas reações tanto de degradação como de formação desses açucares que são determinantes no controle de qualidade dos produtos produzidos.

Um açúcar redutor é um açúcar no qual o carbono carbonila (anomérico) não está envolvido em uma ligação glicosídica e, portanto, pode sofrer oxidação.

Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os íons férrico e cúprico. O carbono do grupo carbonila é oxidado a ácido carboxílico (LENINGHER, 1995). Todos os monossacarídeos são potencialmente redutores, devido a presença da carbonila. Outros carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores.

O método do DNS é um método onde ocorre a oxidação do grupo carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o ácido dinitro-salicílico; sal de Rochelle, (solução de tártaro de sódio de potássio) que serve para prevenir o reagente da ação do oxigênio dissolvido; fenol, que é utilizado para aumentar a quantidade de cor produzida; bissulfito, que é um estabilizante da cor obtida na presença do fenol; hidróxido de sódio, que é o redutor da ação da glicose sobre

o ácido dinitro-salicílico. Ocorre no método do DNS a seguinte reação de oxidação:

Figura 1: Reação de oxidação da carbonila pelo reagente DNS.

Ocorre neste caso a redução do 3,5-di-nitrosalicitato (de cor amarelo

forte) ácido e a oxidação do monossacarídeo, a glicose, formando o 3-amino-5-nitro-salicilato (de cor laranja-marrom forte), na proporção estequiométrica.

Portanto, pela determinação da luz absorvida a 540nm pelo 3-amino-5-nitrosalicilato, pode-se determinar a concentração de açúcar redutor presente na solução.

Também para cada tipo de amostra deve se levantar uma curva padrão do açúcar em estudo, por exemplo, se a amostra analisada contém frutose, devemos fazer a curva padrão para a frutose, dentro de um determinado intervalo de concentração, e respeitando a Lei de Beer.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais Utilizados:

Tubos de ensaio;

Pipetas graduadas de 1mL e 10mL;

Pipeta volumétrica de 1mL;

Pipetador;

Água destilada;

Solução padrão de glicose;

Reagente DNS;

Banho Maria;

Estante para tubos de ensaio;

Becker;

Espectrofotômetro. 4.2 Metodologia:

Preparo da Curva Padrão:

Separou-se 5 tubos de ensaio, numerando-os de acordo com as diluições;

Adicionou-se a cada tubo a amostra de glicose padrão visando as seguintes concentrações: 1g/L, 0,8g/L, 0,6g/L, 0,4g/L e 0,2g/L, ou seja, adicionou-se 1mL, 0,8mL, 0,6mL, 0,4mL e 0,2 mL de amostra padrão de glicose;

Completou-se o volume dos tubos, com H2O, a 1mL: 0mL no 1º tubo; 0,2mL no 2º; 0,4mL no 3º; 0,6mL no 4º e 0,8mL no último;

Adicionou-se em seguida 0,5mL do reagente DNS em cada tubo de ensaio;

Levou-se os 5 tubos ao banho Maria durante 5 minutos e a temperatura de 100ºC;

Após o tempo decorrido, interrompeu-se a reação colocando os tubos num banho de água fria;

Adicionou-se a cada tubo 8,5mL de água destilada para elevar o volume a 10mL;

Levou-se os tubos ao espectrofotômetro, e leu se os valores em %Transmitância, no comprimento de onda de 540nm (λ=540nm) devidamente calibrado o espectro e com o auxilio de uma cubeta;

Construiu-se a curva com o auxilio do Excel. Preparo do Branco e da Amostra: Branco: Utilizou-se 1mL de água como amostra em lugar da solução de glicose e adicionou-se 0,5mL do reagente DNS e levou-se ao banho Maria juntamente com os tubos da curva padrão, e em seguida também foi resfriada em água fria e elevado seu volume com água destilada a 10mL.

Amostra Desconhecida: Utilizou-se 1mL de amostra convenientemente diluída, e adicionou-se 0,5mL do reagente DNS e levou-se ao banho Maria juntamente com os tubos da curva padrão, e em seguida também foi resfriada em água fria e elevado seu volume com água destilada a 10mL.

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES Curva padrão de glicose: Na tabela 1 abaixo estão listados os dados obtidos durante a prática:

[Conc] (g/L) %T Abs

1 13,7 0,863279

0,8 19,9 0,701147

0,6 32 0,49485

0,4 46,8 0,329754

0,2 78,9 0,102923

Tabela 1: Dados obtidos durante a construção da curva padrão. Onde: [Conc]: é a concentração das amostras padrão nos tubos de ensaio; %T: é a transmitância lida no espectrofotômetro; Abs: é a absorbância calculada a partir dos dados de transmitância; Para se construir a curva padrão de glicose, deve se plotar os dados

de Abs x [Conc]. Para isso é necessário se usar da lei de Beer para fazer a transformação de %T em Abs, e isto pode ser descrito pela equação 1 abaixo:

TAbs %log2 (1)

O gráfico 1 abaixo demonstra a equação obtida pela plotagem dos

dados, e o seu coeficiente de correlação linear:

Curva Padrão de Glicose y = 0,8966x - 0,033

R2 = 0,994

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

[Conc] g/L

Ab

s

Gráfico 1: Curva padrão de glicose. A partir da equação 2 obtida no gráfico, podemos calcular a

concentração da amostra desconhecida. Entretanto precisa-se avaliar se a

leitura de %T da amostra desconhecida necessita descontar o valor obtido no branco ou não.

Como o espectro foi calibrado com o branco, e não com água não é necessário fazer esse desconto pois a leitura é feita diretamente. Essa técnica causa mais erros, no entanto é mais direta.

Abaixo na tabela 2 estão os valores lidos para o branco e para a amostra desconhecida.

[Conc] (g/L) %T Abs

BRANCO 0 100 0

AMOSTRA ? 21,9 0,659556

Tabela 2: Dados obtidos durante as leituras do branco e da amostra. Através da equação 1 o valor de transmitância lido da amostra é

convertido em absorbância. O valor encontrado para a absorbância foi tabelado conforme descrito na tabela 2 acima.

Com este valor podemos então pela equação 2 obtida no gráfico encontrar o valor da amostra desconhecida.

772425,0

033,08966,0659556,0

033,08966,0

x

x

xy

Onde: x: é o valor da concentração em g/L; y: é o valor da absorbância; Isto indica que a concentração encontrada da amostra desconhecida é

de aproximadamente 0,77g/L de glicose.

6. CONCLUSÃO

Devido à prática realizada em laboratório percebemos que o método do

DNS é uma medida rápida e eficaz. A concentração encontrada na amostra desconhecida foi de 0,77g/L, e pode-se provar que este é um valor bastante confiável visto que o coeficiente de correlação linear foi de 0,994.

O método do DNS é considerado um método barato e conveniente, entretanto a sua especificidade é baixa, podendo haver muitos interferentes durante a identificação da reação. Desta forma é necessário para cada análise construir uma curva padrão para poder minimizar estes possíveis interferentes.

7. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA BOBIO, Paulo A.; BOBIO, Florinda O. Introdução a Química de

Alimentos. São Paulo: Editora Livraria Varela, 2003; LEHNINGER, Albert L. Bioquímica; São Paulo: Editora Edgard Blucher

LTDA,1976 ; OLIVEIRA, Eduardo Augusto de. Controle de qualidade em

refrigerante. Londrina, 2007. Disponível em: <http://www2.uel.br/pos/engproducao/arquivos/Eduardo_Oliveira.pdf> acesso em 26 mar. 2010.

PERRY, R. H. ; GREEN, D. W. . Perry’s Chemical Engeneering

Handbook. 6 Ed. . Editora McGraw Hill. 1984; SKOOG & WEST. Princípios de Análise Instrumental. New York:

Editora Holt Reinhardt Winston, 1971.

ANEXO 1

Perguntas relacionadas ao Artigo Científico: 2- a. Açúcar invertido é uma mistura de açucares em solução,

constituída principalmente de glicose, frutose e sacarose. Esta reação pode ser

catalisada por enzimas, por ácidos ou por resinas trocadoras de cátions. Essas

propriedades tem como vantagem a contribuição no aumento do valor de

xaropes, para uso em vários produtos alimentícios, sobretudo na industria de

refrigerantes.

b. Para a produção do açúcar invertido, dois métodos de inversão de

sacarose podem ser usados: a hidrólise enzimática, catalisada pela enzima

invertase e a hidrólise ácida, catalisada por um ácido. A acidez gerada na

hidrólise ácida pode ser devido à ação direta de um ácido (hidrólise

homogênea) ou através da liberação de H+ da resina catiônica (hidrólise

heterogênea). O meio ácido promovido pela resina catiônica pode causar perde

de açúcar por degradação do mesmo, levando à formação do hidroximetil

furfural (HMF) com conseqüente desenvolvimento de cor do xarope. Isso pode

ser minimizado se o tempo de residência do xarope na coluna e a temperatura

do processo se mantiverem baixas.

A inversão do açúcar provoca a quebra da sacarose em dois açúcares que formam a sua molécula: glicose e frutose. A fórmula da reação química é a seguinte:

C12H22O11 (sacarose) + H2O (água) = C6H12O6 (glicose) + C6H12O6 (frutose).

O termo invertido decorre de uma característica física da sacarose, que se altera nesse processo: originalmente, um raio de luz polarizada que incide sobre a sacarose gira para a direita. Após o processamento de inversão, a luz desvia para a esquerda.

Para obtenção de um xarope invertido de elevada qualidade, deve haver uma etapa de descoloração e outra de inversão, usando como variáveis a concentração de sacarose, o fluxo através da coluna de resina de troca-iônica e a temperatura do processo.

Esquema do sistema de descoloração

Esquema do sistema na inversão do xarope

c. Concordamos com a expressão usada na equação três para o

cálculo da concentração de açúcar, pois podemos usar a massa específica da

solução como forma de simplificação na equação, já que a concentração em

graus brix é P/P. Assim chegamos na dimensão desejada concentração da

amostra diluída (g/ml).

d. .....

e. A dosagem de sacarose, frutose e glicose foi feita por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), equipado com detector de

ultra-violeta (Waters 486) a 280nm. 15µL das amostras foram eluídos através

de uma coluna C-18 de 250 x 4,6mm 5µ utilizando como eluente uma mistura

de água: metanol 90:10 a 1,0 mL/min. O sistema de integração usado foi o

Milenium®. Esta técnica cromatográfica utiliza a fase móvel à alta pressão.

Através das altas pressões se consegue uma redução do diâmetro das

partículas da fase estacionária, encontrada no interior da coluna

cromatográfica.

O uso de partículas menores (na ordem de 5,0 µm) no recheio da coluna

implica em uma área superficial, o sítio de adsorção, maior (geralmente da

ordem de centenas de metros quadrados por grama de fase estacionária), o

que resulta em uma separação mais eficiente dos componentes da amostra.

Essa "miniaturização" das partículas da coluna possibilita o uso de colunas

menores, volumes menores de amostras e um gasto menor de fase móvel.

Com isso, em cromatografia líquida de alta eficiência trabalha-se na faixa dos

microlitros (µL).

CLAE, em inglês: High Performance/Pressure Liquide Chromatography,

HPLC

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

RELATÓRIO TÉCNICO CIENTÍFICO

Disciplina de Bioquímica Industrial Professor André Burkert

Determinação de Açúcares Redutores pelo método do DNS

Ana Carolina Butzke – 40726 Caroline Lindemann – 40755 Thiago Carvalho – 41400 Vanessa Wendt Schmidt – 40748

Rio Grande, Abril de 2010