3 CAP 3 EPI... · Web viewO estudo consistiu de 3 etapas de colheita de amostras de sangue (plasma) nas instituições de saúde de São Tomé e Príncipe, e realização de um inquérito

Capítulo 3

Epidemiologia Molecular da Infecção HIV-1 em STP

Epidemiologia Molecular do HIV-1 em STP

Capítulo 3 – Epidemiologia Molecular da Infecção HIV-1 em STP

3.1. Objectivos

3.1.1. Objectivos GeraisAnálise das variantes de HIV-1 presentes e da relação filogenética entre as

variantes virais identificadas em São Tomé e Príncipe (STP) e em alguns países

limítrofes da Costa Ocidental Africana.

3.1.2. Objectivos Específicos

1. Identificar as sequências parciais do gene pol de HIV-1: toda a região

codificadora da protease (1 a 99) e parte da transcriptase reversa (1 a 335)

por sequenciação directa de um grupo de amostras de plasma de pessoas

portadoras de HIV-1;

2. Determinar as prevalências dos subtipos, formas circulantes recombinantes

(CRFs, Circulant Recombinant Forms) ou únicas (URFs, Unique

Recombinant Forms) de HIV-1 presentes em São Tomé e Príncipe;

3. Analisar as relações filogenéticas entre as sequências dos vírus subtipados e

as dos países limítrofes com ligação a São Tomé e Príncipe: Angola,

Camarões, Gabão, Guiné Equatorial e Nigéria.

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3.2. IntroduçãoLocalizado na Costa Ocidental Africana, região considerada epicentro da

epidemia da infecção a HIV, no arquipélago São Tomé e Príncipe coexistem não só os

dois tipos de vírus (HIV-1 e HIV-2), com predominância para o HIV-1, grupo M,

(Robertson et al, 2000), mas também infecções duplas, com os dois vírus no mesmo

hospedeiro (Van der Sande et al, 2004). Este facto tem vindo a interferir no

diagnóstico laboratorial, nomeadamente nos testes de detecção dos anticorpos

específicos, e nos de amplificação do RNA viral.

A epidemiologia molecular do HIV-1 permite estudar os factores genéticos

virais que influenciam a infecção e sua propagação, acedendo as informações

moleculares acumuladas nos genomas dos microrganismos, que são utilizadas na

reconstrução e previsão do trajecto da infecção (Hue et al, 2005). Esta ferramenta

molecular permite estudar tanto a origem dos HIVs em diversos grupos populacionais,

como monitorizar a introdução de novas variantes num determinado país ou região.

Constitui um potencial marcador para determinar o trajecto da epidemia de HIV-1,

através de estudos das variantes genotípicas, definidas principalmente em função da

variação das sequências no gene env que codifica a glicoproteína gp120 do invólucro da

partícula viral (Robertson, et al, 2000).

3.2.1. TécnicasExistem inúmeras técnicas para subtipar e comparar os vírus a nível molecular.

A sequenciação do genoma viral completo revelou-se a mais adequada, eficaz e

definitiva para determinar o genótipo de uma nova variante viral, mas tem os

inconvenientes de ser onerosa, laboriosa, requerendo pessoal altamente qualificado e

não aplicável a estudos alargados. Contudo, dado que o genoma viral é susceptível de

ocorrência de recombinação, para minimizar esta insuficiência são utilizados com

frequência os métodos de subtipagem baseados em análise filogenética do genoma

viral, também caracterizado por custos elevados. Entretanto, métodos menos onerosos,

alternativos à subtipagem do genoma completo do HIV-1, são baseados na

sequenciação directa de pequenos fragmentos do genoma viral associada à análise

filogenética (Shafer, 2002; Eshleman et al, 2004).

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Embora relativamente menos oneroso do que os primeiros métodos acima

mencionados, o método de sequenciação directa de pequenos fragmentos do genoma

viral associado à análise filogenética também requer capacidade técnica qualificada e

não está ao alcance dos países de baixos recursos financeiros (Shafer, 2002).

Considerado um método alternativo de análise do genoma viral, tem sido amplamente

utilizado dado que apresenta elevada eficácia e capacidade na determinação dos

subtipos do HIV-1 (Peeters et al, 2003).

Com efeito, o desenvolvimento de técnicas de PCR tem facilitado a execução

de genotipagem dos genes dos HIVs, nomeadamente através dos sistemas comerciais

de genotipagem como, por exemplo, “ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System, version

2.0” (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA), que têm mostrado eficiência e

reprodutibilidade mesmo em subtipos não B, embora optimizados para os vírus do

subtipo B (Grant et al, 2003; Jagodzinski et al, 2003).

O gene pol representa uma região muito conservada do HIV-1, e codifica para

as enzimas protease (PR), transcriptase reversa (TR) e integrase (IN), sendo que a sua

amplificação por PCR (polymerase chain reaction) e sequenciação do DNA proviral

pelo kit comercial atrás referido, permite aceder à informação contida na PR e parte da

RT, o que permite não só a subtipagem mas também a identificação de mutações

associadas a resistência aos fármacos antirretrovirais (Shafer, 2002).

Neste caso, a determinação dos genótipos de HIV-1 num grupo de amostras de

plasma dos portadores da infecção por HIV-1 é realizada através da amplificação de

parte do gene pol por RT-PCR (transcrição reversa seguida de PCR), seguindo-se a

sequenciação directa de pequenos fragmentos do genoma viral. As sequências parciais

do gene pol do HIV-1 englobam as regiões codificadoras da protease (1 a 99) e de

parte da transcriptase reversa (1 a 335) (Shafer, 2002).

Assim, visando caracterizar a prevalência das variantes virais circulantes em

São Tomé e Príncipe, bem como analisar a relação filogenética entre estas e as de

alguns países limítrofes da Costa Ocidental Africana, para avaliação do perfil

epidemiológico da infecção por HIV-1, recorreu-se ao estudo de gene pol, utilizando o

kit comercial “ViroSeq HIV-1 Genotyping System, version 2.0” (Abbott Laboratories,

Abbott Park, Illinois, USA).

O processo decorre por etapas, iniciando-se com a extracção do RNA do HIV-

1 a partir de uma amostra de plasma. Posteriormente, através da reacção RT-PCR

(transcrição reversa seguida de PCR), o RNA viral é convertido em DNA

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complementar (cDNA), reacção que é catalisada pela acção da enzima transcriptase

reversa (RT). O cDNA viral obtido liga-se a uma sonda de ácido nucleíco específica

para uma determinada sequência genómica do HIV (Iweala, 2004). A cadeia híbrida

RNA-cDNA engloba parte da polimerase do HIV-1 (pol) que representa a região mais

conservada do genoma, na ORF (Open Reading Frame) na qual se localizam os genes

da protease e o da transcriptase reversa. O cDNA é amplificado por PCR em dsDNA

(DNA de cadeia dupla) seguido de sequenciação directa do DNA proviral (Eshleman

et al, 2004).

Os subtipos são obtidos através de análise das sequências nucleotídicas por

submissão destas sequências aos algorítmos bioinformáticos de subtipagem,

disponíveis na Internet, tais como HIVSeq, REGA Subtyping Tool, NCBI e jpHMM-

HIV-1 (Rhee et al, 2003, de Oliveira et al, 2005; Rozanov et al, 2004; Zhang et al,

2006). Para a comparação das sequências obtidas a partir de infectados de STP e de

outras obtidas a partir de doentes de países limítrofes disponíveis na base de dados de

Los Alamos, procedeu-se ao seu alinhamento utilizando-se o software Clustal W

(Thompson et al, 1994); para a edição das sequências foi usado o software BioEdit

(Hall, 1999) e MEGA 3.2 para a construção das árvores filogenéticas (Kumar et al,

2004).

Os vários subtipos do HIV-1 poderão influenciar a sua transmissibilidade e

imunogenecidade e este processo pode revestir-se de grande significado e impacto

biológico e epidemiológico (Robertson, et al, 2000). Contudo, até a data, não foi

demonstrado convenientemente a correlação directa da vasta diversidade viral

existente e estes processos biológicos.

Alguns estudos sugerem diferenças na transmissibilidade vertical mãe filho entre vários subtipos de HIV-1 grupo M. Assim, num estudo efectuado no Quénia, o subtipo D seria mais facilmente transmissível por esta via, enquanto o subtipo A o seria menos (Yang et al, 2003). Igualmente, um outro estudo, efectuado no Senegal, sugere que a velocidade de progressão para a SIDA seria mais elevada nos subtipos C, D e G do que no subtipo A (Kanki et al, 1999).

103


3.2.2. Epidemiologia molecular do HIV-1 em São Tomé e

PríncipeApós a detecção do primeiro caso de HIV no país não foram realizados estudos

de epidemiologia molecular, desconhecendo-se quer a origem dos vírus circulantes,

quer o momento exacto da sua introdução. O primeiro estudo de epidemiologia

molecular de HIV-1 envolvendo amostras de São Tomé e Príncipe foi realizado entre

2004 e 2007 (Bonfim et al, 2007).

Localizado perto do epicentro da epidemia da infecção por HIV-1 na costa

ocidental Africana, em São Tomé e Príncipe coexistem ambos os vírus, com

predominância para o HIV-1, do grupo M (Robertson et al, 2000). Comum aos países

de África Central e Ocidental a vasta diversidade genética do HIV-1 foi reportada por

vários investigadores que utilizam amostras destes países Africanos (Laurent et al,

2001; Peeters et al, 2003).

Não existem estudos sobre a introdução dos HIVs no arquipélago de São Tomé

e Príncipe, mas especula-se que terá sido no período pós independência, quando da

entrada dos militares de vários países com os quais o STP mantém intercâmbios. A

partir de então, assistiu-se à intensificação das relações entre as populações do

arquipélago e as de alguns países limítrofes da costa ocidental Africana, tais como

Angola, Camarões, Gabão, Guiné Equatorial e Nigéria (vide localização geográfica de

STP – Figura 1.20). Neste período foram observados movimentos populacionais dos

são-tomenses de e para os países supracitados. Também correspondeu a um aumento

considerável das ISTs (infecções sexualmente transmissíveis) como por exemplo, o

encontrado no inquérito populacional às grávidas (PNLS, 2003).

Presentemente verificam-se movimentos migratórios no sentido inverso: o

regresso a São Tomé e Príncipe dos emigrantes são-tomenses residentes nos países da

Costa Ocidental Africana, nomeadamente do Gabão, alguns dos quais em estado

terminal de SIDA (fonte de informação: Centro Hospitalar de São Tomé). O retorno

prende-se, possivelmente, com o acesso ao programa de tratamento com os

antirretrovirais (TARV), implementado no arquipélago, sob a tutela do Programa de

Luta contra a SIDA (PNLS).

A análise filogenética das sequências virais de doentes de São Tomé e Príncipe

e a sua comparação com sequências de doentes dos países atrás referidos pode

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fornecer dados complementares aos da epidemiologia, ajudando a uma melhor

compreensão da história da infecção HIV-1 em STP.

Os países da costa ocidental Africana exibem tanto características

demográficas como políticas semelhantes, com fraco empenho na implementação de

estudos epidemiológicos dos HIVs. Assim sendo, as prevalências de subtipos dos

HIVs relativamente a estes países, constantes na base de dados de Los Alamos, são

baseados em amostras de conveniência, podendo sofrer de grave viés. Porém, apesar

destas limitações, a grande variabilidade do HIV-1 identificada nestes países da costa

ocidental Africana é uma realidade inegável (McCutchan et al, 1999; Ortiz et al, 2001;

Laurent et al, 2002; Pandreia et al, 2002; Abecasis et al, 2005; Bártolo et al, 2005;

Njai et al, 2006; Garrido et al, 2008).

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3.3. Material e MétodosO estudo consistiu de 3 etapas de colheita de amostras de sangue (plasma) nas

instituições de saúde de São Tomé e Príncipe, e realização de um inquérito

epidemiológico nas populações dos dois distritos do arquipélago anteriormente

descritos no capítulo 2. Em cada etapa do estudo foram obtidos pareceres favoráveis

do Ministério da Saúde de São Tomé e Príncipe, através do Comité de Ética (estrutura

equiparada) desta instituição governamental.

3.3.1. Tipo de estudoAtendendo à baixa prevalência da infecção HIV-1 registada em São Tomé e

Príncipe em 2001 (1%), a execução deste estudo de epidemiologia molecular só foi

possível com a utilização de amostras consideradas de conveniência. A baixa

frequência de casos de infecção por HIVs registada nas instituições de saúde

justificaram as 3 estadias no país para recolha de amostras, em número suficiente para

a implementação do presente estudo. O rastreio das amostras de plasma dos infectados

com HIV-1, incluídos no presente estudo, obedeceu a critérios de anonimato, pelo que

as amostras foram recodificadas.

Primou-se pela utilização de amostras de plasma sanguíneo em vez de soro ou

células dos infectados com HIV-1. Não só porque a estabilidade destas amostras à

temperatura ambiente é superior a 6 horas, mas também porque os vírus existentes no

plasma sanguíneo são fruto de actividade replicativa recente, e como tal mais

facilmente representando populações virais seleccionadas mais recentemente, por

exemplo por terapia com os antirretrovirais.

3.3.2. População e AmostrasO estudo envolveu amostras de plasma dos seropositivos para o HIV-1,

colhidas entre Abril de 2004 e Janeiro de 2007. A amostra englobou plasma dos

utentes das instituições de saúde de São Tomé (República Democrática de São Tomé e

Príncipe): Centro Hospitalar de São Tomé (CHST), integrando as enfermarias, o

serviço do Banco de Sangue e a Consulta Externa; Centro Policlínico de Água Grande

(CPAG); Posto Clínico de Mé Zóchi (PCMZ); Projecto ARV sob a tutela do Programa

Nacional de Luta contra a SIDA (através de um grupo de amostras dos doentes

submetidos a tratamentos com antirretrovirais – ARVs); Inquérito Epidemiológico

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Nacional sobre HIV e Hepatites, realizado em 2001 (cujas amostras se encontravam

em stock) e inquérito epidemiológico de 2007 (abordado no Capítulo 2). O critério de

anonimato foi preservado. Saliente-se que a baixa prevalência registada em São Tomé

e Príncipe constituiu um sério desafio, dificultando a obtenção de um número de

amostras suficientes que permitissem conclusões estatisticamente significativas.

Apesar das dificuldades, foi possível obter-se, e foram utilizadas, 93 amostras.

3.3.3. Definição das Variáveis de EstudoForam definidas algumas variáveis epidemiológicas operacionais para o

estudo, tais como “idade”, “sexo”, “data de colheita” e “código do utente”.

Consistiram variáveis facultativas “residência” e “viagem”, dada a natureza

oportunista das amostras colhidas.

3.3.4. Colheita e Processamento de AmostrasA metodologia de colheita e processamento das amostras foram as

anteriormente descritas no Capítulo 2 (2.3). O rastreio populacional decorreu na ilha

de São Tomé. Foi utilizado o teste rápido de rastreio “DetermineÔ HIV ½” (Abbott

Diagnostics, Il. USA) para todas as amostras pesquisadas, e em caso de ambiguidades

foi aplicado um segundo teste de rastreio, baseado em imunoensaio de fluorescência

“VIDAS® HIV DUO” (Bio-Mérieurx SA) executado no Laboratório de Virologia do

Hospital Egas Moniz, onde se realizou o estudo molecular das amostras.

3.3.5. GenotipagemCom o recurso ao sistema comercial “ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System”,

version 2.0 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA) foi realizada a

genotipagem do HIV-1. Este sistema foi inicialmente produzido pela Celera

Diagnostic, CA, US, e optimizado para o subtipo B. Apesar disso, o sistema provou

ser eficaz também na genotipagem de outros subtipos que não o subtipo B (Heshleman

et al, 2004). O sistema proporciona eficiência e relativa rapidez na realização da

análise, e integra reagentes para a purificação dos ácidos nucleícos e sua sequenciação.

Os resultados foram obtidos através da utilização de um sequenciador ABI PRISMTM

3100 Genetic Analyzer e analisados pelo software “ViroSeq HIV-1 Genotyping

System”, version 2.0, que permite o alinhamento dos 7 segmentos utilizados neste

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teste (Figura 3.1), numa única sequência de consenso, englobando as regiões

codificadoras do gene protease dos codões 1 a 99, e da transcriptase reversa de 1 a 335

(Heshleman et al, 2004).

3.3.5.1. Extracção do RNA viral A extracção do RNA viral foi realizada partindo de 500 a 1000 µl de amostra

de plasma, utilizando-se o kit “ViroSeq™ HIV-1 Genotyping” version 2.0 (Abbott

Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA). O primeiro passo consiste na

ultracentrifugação das amostras de plasma a 23.500 g (centrífuga - MR 23i Jouan),

durante 60 minutos, a 4ºC, para precipitar os viriões nos pellets do RNA viral

(precipitação das partículas virais). Após aspiração do sobrenadante, são adicionados

600 µl da solução de lise. Ao RNA do lisado são adicionados 600 µl de isopropanol

para sua recuperação e limpeza das impurezas nele contidas. De seguida, são

adicionados 1000 µl de etanol frio a 70% para precipitar o RNA viral (fase

considerada crítica, dado que o etanol pode precipitar as proteínas). Os excessos do

etanol são removidos e RNA libertado é diluído, segundo as cargas virais de cada

amostra. Às amostras com uma carga viral desconhecida, ou entre 2000 e 15.000

cópias/ml, adicionaram-se 50 µl do tampão de diluente. São adicionados 100 µl às que

possuíam valores iguais ou superiores a 30.000 cópias/ml. O RNA viral extraído é

conservado a -70º C em tampão de diluição.

3.3.5.2. Amplificação do gene pol de HIV-1Após a extracção, o RNA viral é convertido em cadeia híbrida RNA-cDNA

(DNA complementar) por transcrição reversa, catalisada pela acção da enzima

transcriptase reversa (RT). O cDNA é amplificado: parte do gene pol, correspondente

à região completa da protease e cerca de dois terços da transcriptase reversa. A

abertura é na ORF (Open Reading Frame) deste gene, seguindo-se aproximadamente

1,8 kilobases (kb). Uma vez obtido o cDNA viral (DNA complementar), este liga-se a

uma sonda de ácido nucleíco específica para uma determinada sequência genética do

HIV, que por sua vez interage com o seu substrato específico e cromogénico, dando

origem a um produto cuja intensidade quantifica indirectamente o RNA viral presente

na amostra (Iweala, 2004). O amplicon resultante é usado como sequência modelo

para gerar aproximadamente 1,3 kb de dados sequenciais, representando as sequências

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completas e que correspondem às seguintes posições genómicas dentro dos

nucleótidos das estirpes de referência HXB2: 2253 a 2549 para a protease e 2550 a

3554 para transcriptase reversa (Eshleman et al, 2004).

As sequências obtidas são submetidas aos algoritmos de subtipagem

disponíveis na base de dados, nos sítios da Internet, que fornecem relatórios

interpretativos com as informações, tanto sobre as variantes virais, como sobre as

mutações associadas a resistências referentes aos inibidores da protease e transcriptase

reversa do HIV-1.

3.3.5.3. RT-PCR (reacção de transcrição reversa seguida por PCR)Inicia-se com a preparação da “Master Mix RT” usando os componentes e as

respectivas proporções, considerando o volume residual para 2 amostras extras:

mistura RT (240µl), inibidor de RNAase (30µl), MuLV RT (Moloney murine

leukemia vírus) RT - 30µl e de DTT (ditiotreitol), perfazendo um volume total de 312

µl (Anexo III - Quadro 3.1). Em seguida, a “Master Mix RT” é homogeneizada por

breve agitação durante 3-5 segundos (é usada centrífuga de rotor de placa), mantendo-

se à temperatura ambiente (não ultrapassando os 30 minutos). São distribuídos 10µl de

cada amostra do RNA viral extraído, num tubo MicroAmp 0,2 ml, que é pré-aquecido

para desnaturação da estrutura secundária a 65º C durante 30 segundos no

termociclador “Perkin-Elmer 9600, USA”, seguindo-se arrefecimento a 42º C durante

5 minutos, estabelecendo a temperatura de actividade enzimática óptima. Depois disso,

o termociclador é pausado, as amostras de RNA são retiradas, adicionando-se 10µl da

“Master Mix RT” a cada tubo. Os tubos são agitados durante 3-5 segundos para

homogeneizar do seu conteúdo, e são novamente colocados no termociclador,

prosseguindo a segunda etapa da reacção RT, a 42º C por 60 minutos (transcrição

reversa), a 99º C por 5 minutos para a inactivação da enzima MuLV RT, fase em que

são produzidas as cadeias duplas do RNA-cDNA híbridos representando o gene pol do

HIV-1. Todas as amostras são mantidas a 4º C, pelo menos durante 10 minutos. No

final, as amostras de cDNA produzidas são armazenadas a -20º C até a realização do

PCR (não excedendo as 2 semanas).

109


3.3.5.4. PCR (amplificação do cDNA)Após o descongelamento dos reagentes é preparada a “Master mix PCR”, cujo

volume total é de 930µl: PCR mix - 885 µl, “AmpliTaq Gold DNA polymerase”

(Applied Biosystems, Foster City, Calif.) - 15 µl e “AmpErase UNG” (dUTP/uracil-N-

glicosilase) - 30µl (Anexo III – Quadro 3.2). A mistura de PCR é preparada, de acordo

com as proporções para as 28 amostras mais 2 relativas ao volume residual. “Master

mix PCR” é suavemente agitada durante 3-5 segundos por 5-10 segundos. A cada tubo

de reacção do passo RT são adicionados 30 µl da “Master mix PCR”, este é agitado, e

colocado no termociclador. O primeiro ciclo da reacção de PCR (ciclo 1) é destinado a

activação de “AmpErase UNG” (dUTP/uracil-N-glicosilase) e decorre a 50º C por 10

minutos (para minimizar o risco de contaminação cruzada com produtos de

amplificações anteriores) e o segundo ciclo (ciclo 2) para activação da enzima

“AmpliTaq Gold DNA polymerase” a 93º C durante 12 minutos. A desnaturação do

DNA dá-se aos 40 ciclos, a 93º C por 20 segundos, hibridação (annealing) dos primers

aos 64º C durante 45 segundos e a extensão destes aos 66º C por 3 minutos. Através do

último ciclo (1 ciclo) a 72º C em 10 minutos dá-se a extensão final dos primers. As

amostras são mantidas a 4º C, não mais de 24 horas, evitando a actividade residual do

UNG, que pode destruir o DNA amplificado (Anexo III – Quadro 3.3) (Cunningham

et al, 2001; Eshleman et al, 2004). No final, o DNA obtido é conservado a -15/-20º C

para posterior quantificação, por electroforese em gel de agarose.

3.3.5.4.1. Quantificação do DNA por ElectroforeseA determinação semi-quantitativa da concentração dos produtos de DNA

amplificados e purificados é feita em gel de 1% “SeaKem Gold” agarose (Reliant Gel

System, Cambrex, USA), frente a um marcador estandardizado. O gel de agarose é

preparado em 100 ml de TBE 1 (1x), (Tampão Tris Borato EDTA), com 1 grama de

agarose dissolvido, e incorporando 1 µl de brometo de etídio (BrEt). É utilizado um

marcador com as concentrações conhecidas das dimensões dos fragmentos de DNA,

permitindo comparação com o brilho das bandas das amostras de DNA em estudo, de

forma a se estimar o factor de diluição a ser utilizado na sequenciação. Às amostras de

DNA são adicionadas 5 µl de loading buffer (tampão), e 5 µl de azul de bromofenol.

Em seguida, são inoculados 10 µl da mistura, por poço, colocando-se em paralelo duas

concentrações relativas ao marcador de peso molecular 100 bp (DNA Mass Ladder): 3

110


µl e 6 µl. Após a aplicação das amostras e do marcador no gel, este é submetido a uma

corrente constante de 10 V/cm e 51 amperes. A electroforese decorre durante 60

minutos, tempo suficiente para a migração do azul de bromofenol no gel em 5 cm.

Depois da corrida, o gel é visualizado com o recurso a luz UV de um transiluminador.

As bandas são comparadas consoante o peso molecular do marcador e determinada a

diluição correspondente para cada amostra de DNA, que deve conter, no mínimo, a

massa de DNA equivalente a 20 ng (nanogramas) (Figura 3.1).

Figura 3.1. Peso Molecular dos DNAs por Migração em Gel de Agarose Os 3 níveis de nitidez das amostras de DNA, correspondentes às diluições 1:10, 1:4 e 1:2.

3.3.5.4.2. Purificação do DNA em Membrana “Microcon Spin

Column”Inicialmente, procede-se a filtração do dsDNA, utilizando-se as colunas

“Microcon Spin Column”. Em cada microtubo de 1,5 ml é adaptada uma coluna

“Microcon” ou “Microconcentrator” que é composta por uma membrana interna

localizada no interior das duas extremidades; translúcida e azul. A extremidade

translúcida do “Microconcentrator” é encaixada no microtubo (sem tocar na

extremidade), adicionando-se 300µl de água isenta de RNase a cada

“Microconcentrator” no topo da extremidade azul. Procedendo-se do mesmo modo,

juntam-se 50µl da amostra de DNA viral em estudo. A medida que se vai juntando a

amostra de DNA viral, esta é filtrada e as cápsulas dos microtubos são fechadas. Os

filtrados são levemente agitados e postos a centrifugar a 2700g, durante 15 minutos.

Após a primeira centrifugação, os filtros são removidos, adicionando-se 35 µl de água

sem RNase aos filtrados. Inverte-se a posição do “Microconcentrator”, adaptando a

parte azul aos novos microtubos com os filtrados de DNA que são agitados e levados a

centrifugar a 2700 g, durante 5 minutos e transferidas para novos microtubos

previamente rotulados. Procedem-se as respectivas diluições das amostras de DNA, de

111


acordo com o peso molecular. Assim, as amostras cuja massa de DNA ≥ 100 ng

correspondem à diluição 1:10 (315 µl de H2O sem RNase), entre 60-100 ng à 1:4 (105

µl) e 40-60 a 1:2 (70 µl de H2O sem RNase). No fim, apenas as amostras de DNA

purificados com massa ≥ 20 ng são diluídas para posterior sequenciação.

3.3.5.5. Sequenciação do DNASão utilizadas para a sequenciação apenas as amostras de DNA com massa ≥

20 ng. Em microplacas de sequenciação são distribuídos 8 µl de amostras de DNA

amplificadas e purificadas, por poço. Utilizam-se 7 primers diferentes: A, B, C, D, F,

G e H; 4 forward e 3, reverse (Figura 3.2). Os primers foram desenhados pelo

fabricante, e incluídos no kit com os reagentes do “Terminador Big-Dye”. É utilizado

o sequenciador “ABI Prism 3100 Genetic Analyzer” (Applied Biosystems, US)

equipado com o software de análise. As condições das reacções de sequenciação são

de 25 ciclos para a desnaturação a 96º C durante 10 segundos, a hibridação a 50º C

durante 5 segundos e a polimerização a 60º C durante 4 minutos. A reacção de

sequenciação decorre em 4-5 horas.

O sequenciador permite juntar os sete segmentos obtidos numa única

sequência, englobando as regiões codificadas do gene protease (1-99) e da

transcriptase reversa (1-335), correspondendo aproximadamente a 1,3 Kb.

Figura 3.2. Os Primers de PCR e Sequenciação usados no Sistema ViroSeqOs primers de PCR e sequenciação usados no sistema ViroSeq com relação às regiões codificadoras da protease e transcriptase reversa. As direcções dos primers de PCR representam PCR-F ou Forward e PCR-R, Reverse). Utilizaram-se os primers de sequenciação (A, B, C, D, F, G, and H). Esta sequência de consenso é comparada com a estirpe de referência do HXB2 (Kuiken et al, 2002). Para a subtipagem, recorreu-se à REGA Subtyping Tool (de Oliveira et al, 2005), disponível na internet (http://jose.med.kuleuven.be/genotypetool/html/citeHIVtool.html). A ferramenta incorpora os softwares Clustal W, PAUP, Treepuzzle e SimPlot, bem como um conjunto de sequências de referência de todos os subtipos e de 16 CRFs; a sua análise é suportada pelos valores de bootstrap gerados pelo PAUP (Neighbour-Joinning Tree) e de bootscan (SimPlot).

112

http://jose.med.kuleuven.be/genotypetool/html/citeHIVtool.html


3.3.6. Determinação do Subtipo de HIV-1

3.3.6.1. Análise Filogenética das Sequências NucleotídicasApós a correcção manual dos respectivos electroferogramas, as sequências

nucleotídicas do HIV-1 obtidas, em formato FASTA (Figura 3.3), com

aproximadamente 1302 bp, são submetidas a dois algorítmos bioinformáticos de

subtipagem, disponíveis no sítio da Universidade de Stanford: “HIV Sequence

Database” (http://www.hiv.lanl.gov/content/index) (Rhee et al, 2003) que faz apenas

um blast da sequência a estudar com as sequências disponíveis na base de dados e

“REGA HIV-1 SubtypingTool. REGA subtyping tool também está disponível nos sites

(http://jose.med.kuleuven.be/genotypetool/html/citeHIVtool.html) (de Oliveira et al,

2005) e (http://bioafrica.net/subtype.tool/). Através de um sistema automático, as

sequências são alinhadas com as de referência dos subtipos puros do HIV-1, grupo M,

e, quando necessário, das Formas Circulantes Recombinantes, conforme já referido.

Com base na semelhança do traçado similarity plotting e bootscanning (Lole et

al, 1999), usando a janela de formato 400 e nível dos 40 nucleótidos, os subtipos são

processados para cada um dos 9 subtipos puros de referência da base de dados de Los

Alamos (Rhee et al, 2006), e dos primeiros 16 CRFs na Rega Subtyping tool (de

Oliveira et al, 2005).

O REGA Subtyping tool incorpora os softwares SimPlot v3.2, PHYLIP v3.5,

PAUP ver. 4.0b10, e (Lole et al, 1999), (Paraskevis et al, 2003), (Huelsenbeck et al,

2001). Em caso de resultados discrepantes entre os dois algoritmos, ou quando não foi

possível a subtipagem por REGA Subtyping Tool, as sequências são analisadas

separadamente utilizando-se o programa de jpHMM-HIV da University of Göttingen

(Zhang et al, 2006 e Schultz et al, 2006) (http://jpmm.gobics.de/submission) para

análise de recombinação.

O programa “Jumping Profile Hidden Markov Model” (jpHMM) baseia-se no

modelo probabilístico destinado a análise de recombinação inter-subtipos de HIV-1.

De um modo geral estes softwares são baseados em modelos de comparação das

sequências dos ácidos nucleícos por alinhamentos múltiplos com base na similaridade.

Estes sistemas bioinformáticos incorporam diversos programas de software para a

realização de análise filogenética. Permitem a análise automatizada das sequências

nucleotídicas por comparação em análise filogenética com as sequências puras, de

113

http://jpmm.gobics.de/submission

http://bioafrica.net/subtype.tool/

http://jose.med.kuleuven.be/genotypetool/html/citeHIVtool.html

http://www.hiv.lanl.gov/content/index


referência, existentes nas bases de dados de “Los Alamos” ou noutros sítios da Internet

como o da National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Rozanov et al,

2004) (http://www.ncbi.ncbi.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi). Os sistemas

executam análises filogenéticas combinadas com métodos de bootscanning para a

subtipagem genética de fragmentos ou genoma completo de HIV-1 e emitem os

respectivos relatórios interpretativos.

Figura 3.3. Sequência Nucleotídica (FASTA)

O controlo de qualidade das sequências obtidas faz-se por comparação com as

de referência dos 9 subtipos do HIV-1, grupo M, publicadas na base de dados e

pesquisas de Los Alamos BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). São emitidos

relatórios com os respectivos subtipos, inter-subtipos e CRFs.

3.3.6.2. Análise dos alinhamentos múltiplos Para a construção de árvore filogenética, todas as sequências nucleótidas foram

alinhadas entre si, e com as de referência dos subtipos puros do HIV-1, grupo M e,

quando necessário, das Formas Circulantes Recombinantes

(http://www.hiv.lanl.gov/content/index), utilizando o software BioEdit, que tem

incorporado Clustal W (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).

Através de Clustal W incorporado no BioEdit, são realizados os alinhamentos

múltiplos das sequências nucleotídicas, excluem-se por completo os gaps e reduz-se o

114

http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html

http://www.hiv.lanl.gov/content/index

http://www.ncbi.ncbi.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi


tamanho das sequências (± 1200 bp) para elaboração da árvore. A árvore filogenética é

construída no programa MEGA, versão 3.1 (Kumar et al, 2004), utilizando o método

de Neighbor-Joining e o modelo de Kimura 2-parameter com 1000 réplicas de

bootstrap. Foram incluídas sequências do gene pol das estirpes de alguns países da

Costa Ocidental Africana (listagem das sequências do gene pol, obtidas do GenBank

encontra-se em anexo - Anexo III - Quadro 3.4.

3.3.7. As Variantes CRF02_AGs IdentificadasAs 38 estirpes classificadas por “REGA Subtyping Tool” como CRF02_AG no

presente estudo foram submetidas a análise filogenética. Todas as sequências foram

alinhadas com a sequência pura do subtipo B (Fr. 83.HXB2-K03455) e com a

sequência da recombinante CRF02_AG (IbNG-17756), existentes nas bases de dados

de Los Alamos (http://hiv-web.lanl.gov/) recorrendo-se ao software BioEdit.

Procedeu-se a análise das mutações associadas a resistência aos antirretrovirais, dos

polimorfismos nos sítios da PR e RT nas sequências de aminoácidos do gene pol das

variantes em estudo. Procurou-se detectar as possíveis alterações nas sequências

CRF02_AG identificadas, comparando-as com as do mesmo ancestral que foram

seleccionadas no GenBank, em relação a alguns países da Costa Ocidental Africana:

Angola, Camarões, Gabão, Guiné Equatorial, Nigéria, e outros (Lista em anexo – pág.

218), de forma a se detectar a relação de semelhança filogenética existente entre elas,

assim como possíveis alterações evolutivas do gene pol do HIV-1 nesta região

geográfica.

Constituem indicadores de transmissão da infecção no arquipélago a detecção

dos mesmos ancestrais. Relativamente às possíveis alterações nas sequências de

aminoácidos do gene pol das regiões analisadas poderão fornecer informações sobre os

aspectos associados a possível evolução do HIV-1 específica no país, ou comum a

regiões próximas a esta parte do Continente Africano. Nesta ordem de ideia foi

construída a correspondente árvore filogenética com inclusão das sequências dos

países acima mencionados. A árvore teve por base o princípio das semelhanças e

diferenças dos nucleótidos e da distribuição destes, utilizando-se o método de Kimura

2-parameter para o cálculo das distâncias. Foi averiguada a formação ou não de

clusters monofiléticos com os recombinantes dos países da Costa Ocidental Africana

acima mencionados.

115

http://hiv-web.lanl.gov/


3.3.8. Análise estatística O programa estatístico SPSS (Statistical Package for Social Science), versão

15.0, é utilizado para avaliar o significado dos resultados.

Com base nas proporções das frequências das variantes virais observadas são

calculadas as prevalências e os respectivos intervalos de confiança (IC), utilizando-se

o teste de χ2 com correcção de Yates e o nível de significância de 95%. O mesmo

critério de análise estatística serve para comparar as frequências dos subtipos, sub-

subtipos, CRFs e URFs com as variantes de referências.

116

Distribuição por Grupos Etários na amostra

3,25,4

22,6

11,8 9,7

3,2

05

10152025

7 - 12 13 - 24 25 - 34 35 - 44 45 - 54 55 - 63

Classes Etárias

Perc

enta

gem

(%)


3.4. Resultados

3.4.1. Característica da AmostraDado a prevalência da infecção em São Tomé e Príncipe ser ainda

relativamente baixa, a implementação do presente estudo só foi exequível com a

utilização de amostras consideradas de conveniência, que constituíram grande

percentagem do total de amostras.

Das 93 amostras de plasma dos portadores de HIV-1 residentes em São Tomé e

Príncipe analisadas, 31 (33%) eram do sexo masculino, 50 (54%) do feminino e 12

(13%) não possuíam informação sobre o género, facto que não é de estranhar quando

são usadas amostras de conveniência. Observou-se o predomínio do sexo feminino

(50-54%) sobre o masculino (31-33%).

Cinquenta e dois (56%) das amostras possuíam informação completa sobre as

idades e 41 (44%) não, o que constitui um viés de selecção, também frequente neste

tipo de pesquisa epidemiológica.

A idade média dos infectados era de 34,5 anos, com um mínimo de 7 e máximo

de 63 anos, e o desvio padrão (SD) foi dos 12,14 anos. A variável “Idade” foi

recodificada em 6 classes etárias: dos 7 aos 13, 14 aos 24 anos, 25 aos 34, 35 aos 44,

dos 45 aos 54 e dos 55 aos 63 constituindo respectivamente, 3 (3,2%), 4 (5,4%), 21

(22,6%), 11 (11,8%), 9 (9,7%) e 3 (3,2%) (Figura 3.4).

Figura 3.4. Distribuição por Grupos Etários na Amostra Representação gráfica dos 6 escalões etários.

117


3.4.2. Variantes do HIV-1 Circulantes em STP: prevalênciaClassificadas pelos dois algoritmos de subtipagem HIVSeq e REGA Subtyping

Tool, as 93 sequências nucleotídicas de amostras de HIV-1 colhidas em STP (Figuras

3.5a e 3.5b) da região do gene pol, apresentaram elevada diversidade genética viral.

Contudo, não foram registados vírus do subtipo B, o mais prevalente na Europa e

Estados Unidos, verificando-se serem todos os vírus dos subtipos não-B (Quadro 3.6).

Figura 3.5a. Alinhamentos Múltiplos (Sequências Nucleotídicas – região da PR) Alinhamentos Múltiplos das Sequências Nucleotídicas de STP com a de referência BHX2, mostrando a região completa da protease (1-99).

Figura 3.5b. Alinhamentos Múltiplos (Sequências Nucleotídicas – região da TR)Alinhamento Múltiplo das Sequências Nucleotídicas de STP com a de referência BHX2, mostrando parte da região da Transcriptase Reversa (1 -100).

118


Quadro 3.6. Variantes genéticas virais identificadas em amostras de STPOs algorítmos utilizados na subtipagem das 93 sequências estudadas.

Sequências Idades Género "HIV Seq" "REGA" "jpHMM"ST1 33 F CRF02_AG CRF02_AG A1ST2 37 M F1 FIST3 48 M A1 A (A1) A1ST4 38 M CRF02_AG CRF02_AGST5 39 F CRF02_AG/G CRF06_cpx (U_CRF06_cpx)ST6 62 F CRF02_AG CRF02_AGST7 41 M CRF02_AG CRF02_AGST8 46 M D DST9 CRF02_AG CRF02_AGST10 CRF02_AG CRF02_AGST11 44 CRF02_AG CRF02_AG*ST12 50 F C CST13 M CRF02_AG CRF02_AGST14 33 F CRF02_AG CRF02_AGST15 27 F CRF01_AE/CRF02_AG CRF02_AG* A1ST16 25 F CRF02_AG CRF02_AGST17 24 F D/F FIST18 25 F CRF02_AG CRF02_AGST19 30 F D/F FIST20 33 F D/F FIST21 36 F CRF02_AG CRF02_AG*ST22 32 F CRF02_AG CRF02_AGST23 12 M CRF01_AE/A A (A1)ST24 48 F A A (A1)ST25 23 F CRF02_AG/U* CRF02_AG (U_CRF02_AG)ST26 30 M CRF02_AG/U* CRF02_AG ( U_CRF02_AG)ST27 26 F CRF02_AG/U* CRF02_AG( U_CRF02_AG) A1GST28 M CRF02_AG* CRF02_AG (U_CRF02_AG) A1ST29 48 F A A (A1)ST30 M CRF02_AG/U* CRF02_AG*ST31 49 M CRF02_AG CRF02_AGST32 29 F C CST33 30 F A A (A1)ST34 21 F CRF02_AG CRF02_AGST35 24 F CRF02_AG CRF02_AGST36 F A A (A1)ST37 35 M CRF01_AE/A A (A1)ST38 M CRF01_AE/A A (A1)ST39 29 M CRF02_AG GST40 C CST41 F G GST42 35 F J JST43 27 G (G_U) G A1GST44 35 M CRF02_AG CRF02_AGST45 K/CRF02_AG CRF06_cpxST46 25 F CRF02_AG CRF02_AGST47 50 M D DST48 34 M A A (A1)ST49 28 M CRF02_AG CRF02_AGST50 48 M CRF02_AG CRF02_AG*ST51 34 F CRF02_AG CRF02_AGST52 36 M D NA (U_CRF05_DF?)ST53 22 F CRF02_AG CRF02_AGST54 50 F J JST55 59 M D/F F(F1)ST56 28 F CRF02_AG CRF02_AGST57 F K/CRF02_AG CRF06_cpx (U_CRF06_cpx)ST58 CRF02_AG/H HST59 M D/F F (F1)ST60 M CRF02_AG CRF02_AG* A1ST61 M CRF02_AG CRF02_AGST62 F H HST63 63 M A A (A1)ST64 F G G GST65 M CRF02_AG CRF02_AGST66 F K/CRF02_AG CRF06_cpx (U_CRF06_cpx)ST67 28 CRF02_AG CRF02_AGST68 F CRF02_AG/G CRF06_cpxST69 M CRF01_AE/A A (A1)ST70 G GST71 F G GST72 H HST73 M CRF02_AG CRF02_AGST74 F CRF02_AG CRF02_AGST75 F G GST76 7 F CRF02_AG CRF02_AGST77 F CRF02_AG CRF02_AGST78 F CRF02_AG CRF02_AGST79 F CRF01_AE/A A (A1)ST80 F D NA (D?) DST81 37 F D/F F (F1)ST82 33 F A A (A1)ST83 8 F CRF01_AE/A A (A1)ST84 CRF02_AG A/CRF02_AG A1GST85 F J JST86 M A A (A1)ST87 F D/F F (F1)ST88 F CRF02_AG/G CRF06_cpxST89 50 F CRF02_AG/G CRF06_cpx (U_CRF06_cpx) A1GST90 CRF02_AG/G CRF06_cpxST91 M J/G U_J A1CST92 M A A (A1)ST93 F J J

119

A111%

C3%

D4%

F11%

G7%

H2%

J4%CRF02_AG

38%K/CRF02_AG

3%

CRF02_AG/H1%

CRF02_AG/G5%

CRF02_AG/U4%

CRF01_AE/A6%

01AE/02AG1%

J/G1%

D/F8%


3.4.2.1. Determinação por “HIVSeq Subtyping Tool” (Stanford Database)

O HIVSeq Subtyping Tool categorizou as sequências nucleotídicas analisadas

nas seguintes variantes genéticas virais e as respectivas frequências: 35 (38%)

representam formas recombinantes CRF02_AG (Figura 3.6). Verifica-se assim que

estas são predominantes em São Tomé e Príncipe, tal como nos países limítrofes da

Costa Ocidental Africana. O subtipo A (sub-subtipo A1) representa a segunda variante

viral mais prevalente, constituindo 10 (11%) da amostra, seguindo-se a URF_D/F que

representou 7 (8%).

120


Figura 3.6. Distribuição das variantes virais de STP (HIVSeq Subtyping Tool) Os subtipos, sub-subtipos, CRFs e URFs do HIV-1, identificados em STP por HIVseq

Subtyping Tool (CRF02_AG/U foi determinada por SimPlot).

Os subtipos G e D constituíram respectivamente, 6 (7%) e 4 (4%) do estudo.

Quanto às restantes formas virais, 3 (3%) são do subtipo C, 1 (1%) do sub-subtipo F

(F1), 2 (2%) são do subtipo H, 3 (3%) pertencem ao raro subtipo J, 1 (1%) classificou-

se como uma forma recombinante J/G, 4 (4%) são CRF02_AG/U e 1 (1%)

CRF01_AE/CRF02_AG (Figura 3.6). Através deste algoritmo foi possível identificar

a grande variabilidade de HIV-1 em circulação no arquipélago de São Tomé e

Príncipe. Foram identificadas 16 variantes genéticas: 9 (56%) são estirpes

recombinantes (CRF02_AG, CRF02_AG/G, CRF02_AG/H, K/CRF02_AG,

CRF01_AE/CRF02_AG ou A1/G/A1, CRF02_AG/U, CRF01_AE/A, D/F, e J/G); 2

(13%) são sub-subtipos A (A1) e F (F1), e 5 (31%) representaram os subtipos puros

(C, D, G, H e J).

3.4.2.2. Determinação por “REGA Subtyping Tool”Quanto à subtipagem por REGA Subtyping Tool, as sequências nucleotídicas

deduzidas foram categorizadas nas seguintes variantes genéticas virais e as respectivas

prevalências: 38 (41%) CRF02_AG, 16 (17%) A (A1), 1 (1%) A/CRF02_AG, 3 (3%)

C, 2 (2%) D, 8 (9%) F (sub-subtipo F1), 7 (8%) G, 3 (3%) H, 8 (9%) CRF06_cpx, 4

(4%) J, 1 (1%) U/J e 2 (2%) não foram subtipáveis, designando-se NA (Figura 3.7).

121


Figura 3.7. Prevalência das variantes virais de São Tomé e Príncipe (REGA Subtyping Tool 2.0)

A utilização do algoritmo REGA permitiu determinar 11 variantes genéticas

virais, e 2 das sequências não foram subtipáveis (U ou NA). Das variantes genéticas

subtipadas, 4 (36%) eram estirpes recombinantes (CRF02_AG, A/CRF02_AG,

CRF06_cpx e U/J), 2 (18%) eram sub-subtipos (A1 e F1), 5 (46%) constituíram os

subtipos puros (C, D, G, H e J). O subtipo K não foi identificado nesta ferramenta de

subtipagem informática, tal como o B (Figura 3.7).

3.4.2.3. Discrepâncias Entre os Algoritmos UtilizadosA determinação dos subtipos pelos dois algorítmos acima referidos mostrou

resultados semelhantes apenas na classificação de alguns subtipos puros, como o C, D

e J (Figuras 3.6 e 3.7). Tanto os sub-subtipos A (A1) e F (F1) como os subtipos H não

foram consensuais entre ambos algorítmos. Verificou-se que o subtipo K foi detectado

por HIVSeq, apenas em recombinação com as estirpes CRF02_AGs, não tendo sido

detectado por REGA subtyping Tool (Figuras 3.6-3.7). Constatou-se existirem 37

(40%) sequências discrepantes (Quadro 3.7). No entanto, é necessário não esquecer

que o HIVSeq utiliza apenas uma BLAST search e não valida os seus resultados com

(A1)17%

C3% D

2%

(F1)9%

G8%

H3%J

4%CRF06_cpx

9%

CRF02_AG41%

A/CRF02_AG

1%

U/J1%

U2%

122


valores de boostrap, enquanto a REGA Subtyping Tool é muito mais complexa, sendo

os seus resultados suportados por valores de bootstrap e bootsacan superiores a 70%,

não podendo em rigor as duas ferramentas ser comparadas.

Entre ambos algorítmos apenas se registaram resultados totalmente

concordantes na classificação dos subtipos puros, C e J. Como esperado o subtipo G,

considerado ambíguo por representar por si só uma estirpe recombinante, apresentou

divergência, tanto como o subtipo D. Acentuadas discrepâncias são verificadas

nomeadamente nas sequências das estirpes que contêm fragmentos recombinantes. São

conhecidas as discrepâncias observadas ao nível do gene pol de HIV-1, apresentando

dissemelhanças entre (10-20% em relação a outros genes principais deste retrovírus).

Classificadas por HIVSeq como CRF01_AE/A todas as estirpes recombinantes neste

grupo foram avaliadas por REGA como A (A1), atendendo a que as CRF01_AE do

gene pol não contêm breakpoints, e as sequências puras do subtipo A são divergentes

(Quadro 3.7).

123


Quadro 3.7. Variantes discrepantes entre os algorítmos HIVSeq e REGA Variantes discrepantes entre os algorítmos HIVSeq e REGA. * - Determinação manual com o recurso ao SimPlot, versão 2.5. U – Fragmento não subtipável; NA – Não classificável.

Constatou-se que 2 (2%) das sequências no REGA subtyping Tool não foram

subtipáveis (ST52 e ST80). Contudo, as mesmas sequências foram reavaliadas pelo

mesmo algoritmo em 2008. Dadas as progressivas actualizações verificadas ao nível

do REGA subtyping Tool, as referidas sequências nucleotídicas não foram subtipáveis,

com a versão mais recente, exibindo uma região não subtipável (U), associada a um

fragmento classificado como U, e valores de bootscaning inferiores a 0,99 (Figura

3.8). ST15, ST50 e ST60 também foram difíceis de subtipar.

Sequências REGA S. Tool HIVSeqSTP23 A (A1) CRF01_AE/ASTP37 A (A1) CRF01_AE/ASTP38 A (A1) CRF01_AE/ASTP69 A (A1) CRF01_AE/ASTP79 A (A1) CRF01_AE/ASTP83 A (A1) CRF01_AE/A

ST3 A (A1) A/U*STP48 A (A1) A/U*

STP17 F1 D/FSTP19 F1 D/FSTP20 F1 D/FSTP55 F( F1) D/FSTP59 F(F1) D/FSTP81 F(F1) D/FSTP87 F1 D/F

STP11 G CRF02_AGSTP39 G CRF02_AGSTP43 G G/U*

STP5 CRF06_cpx CRF02_AG/GST45 CRF06_cpx K/CRF02_AG

STP57 CRF06_cpx K/CRF02_AGSTP66 CRF06_cpx K/CRF02_AGSTP68 CRF06_cpx CRF02_AG/GSTP88 CRF06_cpx CRF02_AG/GSTP89 CRF06_cpx CRF02_AG/GSTP90 CRF06_cpx CRF02_AG/G

STP15 CRF02_AG/* CRF01_AE/02_AGSTP50 CRF02_AG/* CRF02_AGSTP52 NA DSTP60 CRF02_AG/* CRF02_AGSTP80 NA D

STP58 H CRF02_AG/H

STP91 U*/J J/G

STP25 CRF02_AG CRF02_AG/U*STP26 CRF02_AG CRF02_AG/U*STP27 CRF02_AG CRF02_AG/U*STP30 CRF02_AG CRF02_AG/U*

124

Sequências HIVSeq REGA ST5 CRF02_AG/G CRF06_cpx

ST15 CRF01/02_AG CRF02_AG (U_CRF02_AG)ST25 CRF02_AG CRF02_AGST26 CRF02_AG CRF02_AGST27 CRF02_AG CRF02_AGST30 CRF02_AG CRF02_AGST43 G GST45 K/CRF02_AG CRF06_cpx (U_CRF06_cpx)ST50 CRF02_AG CRF02_AG (U_CRF02_AG)ST52 D NA (U_CRF05_DF)ST57 K/CRF02_AG CRF06_cpx (U_CRF06_cpx)ST58 CRF02_AG/H HST60 CRF02_AG CRF02_AG (U_CRF02_AG)ST66 K/CRF02_AG CRF06_cpx (U_CRF06_cpx)ST68 CRF02_AG/G CRF06_cpx (U_CRF06_cpx)ST80 D NA ST84 CRF02_AG A/CRF02_AGST88 CRF02_AG/G CRF06_cpxST89 CRF02_AG/G CRF06_cpxST90 CRF02_AG/G CRF06_cpx


Figura 3.8. Estirpes

ambíguas, recombinantes e não recombinantesDesempenho dos algorítmos usados na subtipagem

A ST52 apresentou uma estrutura genómica correspondente a U_CRF05_DF

em análise de recombinação, com um valor de bootscan cluster support igual a 0.793

que não foi possível subtipar (Figuras 3.8 e 3.9).

Figura 3.9. Análise de recombinação de ST52 (REGA Subtyping Tool) Sequência ST52 não foi subtipável (U_05_DF), tendo apresentado o valor de

125


bootscan cluster support igual a 0.793.Em análise parcial de pequenos segmentos dos genomas virais, utilizando-se a

janela do formato 400, e a nível dos 40 nucleótidos por SimPlot, ST80 não foi

classificável como subtipo D, apresentando um valor de bootscan cluster support igual

a 0,542 (Figura 3.10). Exibindo estruturas genómicas atípicas, as sequências ST50 e

ST60 também foram classificadas como URF_AG/U. Quanto à ST15 foi classificada

como a forma única URF, A1/G/A1 (Figura 3.11a e 3.11b).

Ao ser analisada em mais pormenor a estrutura genómica de ST15, verificou-se

que de 1 a 300bp é constituída por CRF01_AE, de 300 a 600bp exibe um ancestral A1,

dos 600 a 950 compõe-se de um segmento CRF02_AG, e, finalmente, de um segmento

do sub-subtipo A1 dos 952 a 1300bp, tendo sido classificada finalmente como

A1/G/A1. Assim, esta sequência que não tinha sido possível subtipar pelo algoritmo

REGA (Figuras 3.11a e 3.11b), apresenta uma estrutura integrando duas CRFs, à

semelhança das estirpes CRF36_cpx e CRF37_cpx, constantes na base de dados de

Los Alamos. Parece possuir mosaico semelhante à estirpe dos Camarões (AY444295)

que fora classificada como uma CRF02_AG PR/CRF02_AGRT. Este facto sugere

disseminação pelos países da Costa Ocidental Africana, na qual se localiza São Tomé

e Príncipe. Atendendo a estas dúvidas na subtipagem, a mesma sequência foi

reavaliada em 2008, em análise de bootscaning por REGA Subtyping Tool version 2:

apresentou um fragmento não definido na região da protease e o da transcriptase

reversa correspondendo a CRF02_AG (Figuras 3.10; 3.11a e 3.11b).

126


Figura 3.10. ST80 em análise de recombinação (REGA Subtyping Tool) ST80

não foi subtipável (NA), apresentando bootscan cluster support = 0,542.

127


Figura 3.11a. Análise de recombinação dos fragmentos de ST15 (REGA Tool) Determinação parcial da estirpe ST15 por REGA S. Tool

128

Sequências REGA ST11 U_CRF02_AGST15 U_CRF02_AGST25 U_CRF02_AGST26 U_CRF02_AGST27 U_CRF02_AGST28 U_CRF02_AGST30 U_CRF02_AGST50 U_CRF02_AGST60 U_CRF02_AGST84 U_CRF02_AG


Figura 3.11b. ST15 em análise de bootscaning (REGA Subtyping Tool)O genoma ST15 exibe uma estrutura recombinante, U_CRF02_AG (200 a 1100nt→G), sendo composta pelo sub-subtipo A1 (720 a > 1200 nt→A1). O valor de bootscan: 0.69.

Dadas estas discrepâncias, 10 (11%) das sequências foram assim reavaliadas

por REGA Subtyping Tool Version 2 em 2008: ST11, ST15, ST25, ST26, ST27, ST28,

ST30, ST50, ST60 e ST84. Todas apresentaram estruturas genómicas idênticas

constituídas por recombinantes com regiões não subtipáveis, associadas a um

fragmento U, U/CRF02_AG, e com valores de bootscaning inferiores a 0,99 (Figura

3.12). A mesma estrutura também foi constatada para as restantes estirpes classificadas

como CRF02_AG.

Figura 3.12. Reavaliação por REGA Subtyping Tool A reavaliação de algumas sequências difíceis de subtipar

Quatro destas, ST25, ST26 (Figuras 3.13a e 3.13b), ST27 e ST30 foram ainda

reavaliadas com o recurso ao programa SimPlot, tendo sido classificadas neste como

CRF02_AG/U. A sequência ST84 foi classificada como APR/CRF2_AGRT, com um

valor de Bootstrap igual a 100% e bootscan de 0,99 (Figuras 3.8; 3.12). Relativamente

às 4 (4%) das estirpes classificadas como CRF02_AG/G por REGA Subtyping Tool, 3

129


(3%) das quais tinham sido classificadas como KPR/CRF02_AGRT, passaram

posteriormente a CRF06_cpx; os seus genomas são constituídos por um mosaico dos

subtipos A, G, J, K. Em análise de recombinação estas estirpes foram reclassificadas

em U_CRF6_cpx, à semelhança do que se tem vindo a verificar com as estirpes

CRF02_AGs (Figura 3.14).

Figura 3.13a. ST26 em análise de bootscaning (REGA Subtyping Tool)

Figura 3.13b. ST26 em análise de bootscaning (REGA Subtyping Tool)

130


Sete (8%) das sequências (ST17, ST19, ST20, ST55, ST59, ST81 e ST87)

foram classificadas inicialmente pelo algoritmo HIVSeq como D/F, pelo REGA

Subtyping Tool como sub-subtipo F (F1). Também as estirpes CRF01_AE/A pela

classificação por HIVSeq, são re-classificadas como pertencendo ao sub-subtipo A

(A1), atendendo à ausência de breakpoints na região estudada e levando-as a

divergirem com as estirpes puras do subtipo A.

No que concerne às CRF02_AGs identificadas neste estudo, espelham o perfil

epidemiológico da infecção em São Tomé e Príncipe. Constituíram 38 (41%) da

amostra estudada, sendo também frequentes nos países limítrofes da Costa Ocidental

Africana. Observa-se que 16 (17%) das estirpes CRF02_AG integram um dos

subtipos, G, J, H, K ou U (fragmento não subtipável). O fragmento classificado como

de origem do subtipo G é problemático apresentando incongruências na sua

determinação. Alguns autores como Abecasis et al, 2007 sugerem que o subtipo G

constituinte das CRF02_AGs é, por si só, uma estirpe recombinante, o que certamente

explicaria o elevado grau de divergência que apresenta. Sugerem ainda que as estirpes

recombinantes CRF02_AG incluem outros fragmentos, e não unicamente G.

O sinal da evolução das estirpes CRF02_AGs é o facto de integrarem vários

subtipos, sub-subtipos e CRFs e URFs, o que provavelmente tem interferido com os

testes de diagnóstico do HIV-1 em São Tomé e Príncipe, e com as capacidades de

respostas dos algorítmos de subtipagem existentes nas bases de dados conhecidas.

Com efeito, de acordo com as informações incluídas na base de dados de Los Alamos,

a prevalência destas variantes ronda os 50 a 70% das estirpes circulantes nos países

situados nesta região Central Ocidental Africana. Na base de dados de Los Alamos

constatam-se que nos países limítrofes a São Tomé e Príncipe registam-se as seguintes

distribuições das CRF02_AG, com base em amostras não aleatorizadas, por isso não

necessariamente representativas das respectivas populações: 168 de 420 (40%) na

Nigéria, 43 de 109 (39%) na Guiné Equatorial, 1359 de 3602 (38%) nos Camarões, 74

de 260 (29%) no Gabão e 8 de 215 (4%) em Angola (Figuras 3.22 – 3.26).

3.4.2.4. Análise das discrepâncias com o algoritmo jpHMM-HIV-1Doze 12 (13%) das estirpes ambíguas foram reanalisadas pelo algoritmo

jpHMM-HIV (web server to detect genomic recombinations in HIV-1) da Universidade

de Göttingen, Alemanha, na tentativa de esclarecimento dos resultados das análises

genómicas dos dois algorítmos utilizados previamente no estudo. Verificaram-se

131

Sequências HIVSeq REGA jpMM-HIV-1ST1 CRF02_AG CRF02_AG A1ST15 CRF01/02_AG CRF02_AG (U_CRF02_AG) A1ST27 CRF02_AG CRF02_AG (U_CRF02_AG) A1GST28 CRF02_AG CRF02_AG (U_CRF02_AG) A1ST43 G (G_U) G A1GST60 CRF02_AG CRF02_AG (U_CRF02_AG) A1ST64 G G GST80 D NA (D) DST82 A A(A1) A1ST84 CRF02_AG A/CRF02_AG A1GST89 CRF02_AG/G CRF06_cpx A1GST91 J/G U/J A1C


novamente alguns resultados discrepantes, mas alguns foram concordantes (Figura

3.14).

Figura 3.14. Análise de

Recombinação Genómica (jpHMM-HIV-1)Embora não seja possível a comparação destas 3 ferramentas bioinformáticas de subtipagem, apenas uma sequência - ST 91 foi classificada por jpHMM-HIV-1, de forma totalmente discordante, como A1C, enquanto nos outros dois algorítmos foi classificada como recombinante J_G e U_J.

O mapeamento genómico apresentado nas Figuras 3.15 e 3.16 evidencia

diversas ambiguidades na determinação das variantes genéticas virais. Por exemplo, a

sequência ST15, que havia sido classificada como CRF01_AE/CRF02_AG (A1/G/A),

e (U_CRF02_AG), respectivamente por HIVSeq, e por REGA Subtyping Tool,

classificou-se como A1 neste último algorítmo.

132


Figura 3.15. Estrutura genómica de ST15 (REGA)Esquema de assinatura do subtipo viral, baseando-se na sequência ST15> 800bp, agrupada a um subtipo puro, CRF, ou sub-subtipo, com o valor de “bootstrap” >70%, com detecção de recombinação nos subtipos puros por análise “bootscan”, e falha na classificação como CRF ou subtipo em análise de recombinação. A cor vermelha representa parte do gene pol correspondente ao subtipo A, verde ao G, e branco à região não subtipável e/ou <70%. Retirado da base de dados de Los Alamos (de Oliveira et al, 2005).

133


Figura 3.16. Estrutura genómica da amostra ST15 (jpHMM-HIV-1)Genoma viral da estirpe ST15 determinada por jpHMM-HIV, algorítmo da Universidade de Göttingen. Adaptado de Zhang et al, 2006 e Schultz et al, 2006 (http://jpmm.gobics.de/submission).

3.4.3. Análise das Relações Filogenéticas entre os Vírus Subtipados

A árvore filogenética das estirpes identificadas construída com inclusão das

estirpes de referência do HIV-1 existentes no Genbank (Anexo III – Quadro 3.3),

mostra a formação de cluster entre as sequências identificadas neste estudo e as de

referências, e um perfil heterogéneo da infecção por HIV-1 em São Tomé Príncipe. A

infecção por HIV-1 neste país caracteriza-se por grande diversidade genética,

incluindo diversos subtipos, CRFs e URFs, sugerindo múltiplas introduções e

sugerindo a disseminação da epidemia a partir de populações dos países da Costa

Ocidental Africana (Figura 3.17).

134

http://jpmm.gobics.de/submission


Figura 3.17. Relações filogenéticas entre as sequências pol do HIV-1 dos vírus subtipados e algumas estirpes representativas das variantes seleccionadas na base de dados de Los Alamos, recombinantes ou não, do grupo M. Árvore construída com o recurso ao programa “Mega ver.3.1”, com base no Neighbor-Joinning e F84 Model, partindo de matrizes de distâncias de nucleótidos da região do genoma pesquisado. Foram incluídas 100 sequências e 823 caracteres, e inserções sem gaps. (Página 133).

135


ST76 CRF02 AG ST77 CRF02 AG


ST35 CRF02 AG 132554Angola

ST26 CRF02 AG Ref.02 AG.NG.x.IBNG.L39106

AM113750.1 GAB ST18 CRF02 AG ST28 CRF02 AG ST7 CRF02 AG ST13 CRF02 AG


ST6 CRF02 AG ST84 A/CRF02 AG

68209Angola ST51 CRF02 AG

ST15 CRF02 AG Ref.02 AG.CM.AY444295

ST34 CRF02 AG 02 AGCM9797CMP807


ST61 CRF02 AG Ref.02 AG.CM.99.pBD6 15.AY271690

FJ481706.1 EG ST30 CRF02 AG ST74 CRF02 AG

ST4 CRF02 AG FJ481701.1 EG


ST46 CRF02 AG 165056Angola

ST44 CRF02 AG ST31 CRF02 AG Ref.G.KE.93.HH8793 12 1.AF061641 Ref.G.PT.x.PT2695.AY612637 ST41 G ST71 G

ST75 G ST70 G

Ref.G.NG.92.92NG083.U88826 ST82 A1

ST86 A1 ST24 A1 ST38 A1

ST69 A1 ST79 A1

ST37 A1 Ref.A1.KE.94.Q23 17.AF004885 Ref.A1.UG.92.92UG037.AB253429 A1.SE.94.SE7253 Ref.F1.BR.93.93BR020 1.AF005494

ST55 F1 ST20 FI

ST2 F1 ST17 F1 ST19 F1

ST81 F1 ST59 F1

ST87 F1 ST5 CRF06 cpx

ST66 CRF06 cpx ST8 D

ST47 D Ref.D.CM.01.01CM 4412HAL.AY371157

Ref.D.CD.83.ELI.K03454 05 DF.BE.x.VI1310

Ref.D.TZ.01.A280.AY253311 Ref.D.UG.94.94UG114.U88824

Ref.K.CD.97.EQTB11C.AJ249235 Ref.K.CM.96.MP535.AJ249239 Ref.B.FR.83.HXB2 LAI IIIB BRU.K03455

Ref.B.US.98.1058 11.AY331295 Ref.F2.CM.02.02CM 0016BBY.AY371158

Ref.F2.CM.95.MP257.AJ249237 ST12 C

Ref.C.ZA.04.SK164B1.AY772699 ST32 C Ref.C.IN.95.95IN21068.AF067155

Ref.C.BR.92.BR025 d.U52953 ST58 H

ST62 H ST72 H

Ref.H.BE.93.VI991.AF190127 Ref.H.CF.90.056.AF005496

ST91 U J 11 cpx.GR.x.GR17

Ref.J.SE.94.SE7022.AF082395 Ref.J.CD.97.J 97DC KTB147.EF614151

ST54 J ST42 J ST85 J

N.CM.97.YBF106 N.CM.02.DJO0131

O.CM.98.98CMU2901 O.SN.99.SEMP130099

99

7978

98

76

85

90

98

91

86

71

75

94

86

95

96

81

93

90

7093

99

83

85

93

93

86

72

74

71

91

0.02136

ST7

6 C

RF0

2 A

GS

T77

CR

F02

AG

ST1

4 C

RF0

2 A

GS

T21

CR

F02

AG

ST35

CR

F02

AG13

2554

Ango

la

ST34 CRF02 AG

02 AGCM9797CMP807

ST9 CRF02 AG

ST73 CRF02 AG

ST61 CRF02 AGRef.02 AG.CM.99.pBD6 15.AY271690

FJ481706.1 EGST30 CRF02 AGST74 CRF02 AGST4 CRF02 AGFJ481701.1 EGST45 CRF02 AG

ST24 A1

ST38 A1

ST69 A

1S

T79 A1

ST37 A

1R

ef. A1.K

E.94. Q

23 17. AF004885

Ref.A

1.UG

.92.92UG

037.AB

253429A

1.SE

.94.SE

7253

Ref

.F1.

BR

.93.

93B

R02

0 1.

AF0

0549

4

ST55

F1

ST20

FI

ST2

F1

Ref.K.CD.97.EQTB11C.AJ249235

Ref.K.CM.96.MP535.AJ249239

Ref.B.FR.83.HXB2 LAI IIIB BRU.K03455Ref.B.US.98.1058 11.AY331295

Ref.F2.CM.02.02CM 0016BBY.AY371158Ref.F2.CM.95.MP257.AJ249237ST12 C

Ref.C.ZA.04.SK164B1.AY772699ST32 C

Ref.C.IN.95.95IN21068.AF067155

Ref.C.BR.92.BR025 d.U52953

ST58 H

O.SN

.99.SEMP1300

0.02

vv


Figura 3.18. Árvore circular das sequências do gene pol do HIV-1 identificados em STP e estirpes de referência. Tendência da infecção por HIV-1 em São Tomé e Príncipe (sequências do gene pol). Relações filogenéticas entre as sequências pol do HIV-1 dos vírus subtipados e os seleccionados na base de dados de Los Alamos, usando os grupos N e O como outgroup.

137


3.4.3. Análise das relações filogenéticas entre as CRF02_AGs identificadas em STP e as de alguns países da Costa Ocidental Africana: Angola, Camarões, Gabão, Guiné Equatorial, e Nigéria

A listagem das sequências do gene pol dos países com ligação ao arquipélago

de São Tomé e Príncipe, extraídas do GenBank, está representada no Anexo III -

Quadro 3.4. As 38 sequências nucleotídicas dos fragmentos de gene pol determinados

por PCR e sequenciação directa do DNA foram classificadas com base no algoritmo

REGA Subtyping Tool.

Construída com utilização do programa de software MEGA 3.1 utilizando-se o

de modelo Neighbor-Joinning, pelo método de Kimura 2-parameter, a árvore

filogenética proporcionou indicações sobre as relações entre as 38 CRF02_AG

identificadas no estudo por “REGA Subtyping Tool” e as dos países limítrofes da Costa

Ocidental Africana, tais como Angola, Gabão, Guiné Equatorial, Camarões, Nigéria e

outros países (Figuras 3.18, 3.19 - 3.21a,b). Verificou-se que grande parte das

recombinantes CRF02_AG em estudo, colhidas entre 2001 e 2007, apresentaram

discrepância dos breakpoints, formando cluster monofilético com as demais estirpes

CRF02_AG dos países da Costa Ocidental Africana, sugerindo efeito fundador e

evolução viral no país. São localizadas na árvore como outgroup relativamente às dos

países vizinhos. Este grupo de estirpes não apresenta ancestral comum com as demais

estirpes assim classificadas. Contudo, algumas estirpes em estudo, que tinham sido

difíceis de classificar, agruparam-se com as restantes estirpes de fora de São Tomé e

Príncipe, sugerindo transmissão a partir daqueles países. Além disto, a análise dos

aminoácidos destas estirpes apontam divergências na região da protease, nas posições

PR 3 e 37, podendo também expressar evolução deste gene e transmissão regional.

A amostra ST15 apresenta um ancestral evolutivo comum com o da estirpe de

referência dos Camarões, AY444295. Este facto sugere disseminação regional, ou seja

entre os países da África Ocidental e Central. Pelo contrário, foi verificada a não

formação de grupos entre o conjunto maioritário das estirpes CRF02_AG são-

tomenses e as CRF02_AG dos países da Costa Ocidental Africana, nos breakpoints.

138


Figura 3.19. Relações filogenéticas entre as sequências do gene pol do HIV-1 das estirpes CRF02_AG de origem são-tomense, e estirpes representativas de recombinantes CRF02_AG do grupo M, nomeadamente as de referência - 02AGNGL39106 (Nigéria) e subtipo B (BHXB2- França) como outgroup. É baseada no modelo Neighbor-Joinning partindo de matrizes de distâncias de nucleótidos da região do genoma pesquisado (MEGA 3.1). O dendograma representa 0.5% de variabilidade, e os números nos nós assinalam valores de bootstrap superiores a 70%.

ST61 CRF02 AG

ST73 CRF02 AG

ST9 CRF02 AG

ST34 CRF02 AG

ST10 CRF02 AG

ST7 CRF02 AG

ST13 CRF02 AG

ST74 CRF02 AG

ST28 CRF02 AG

ST78 CRF02 AG

ST49 CRF02 AG

ST56 CRF02 AG

ST51 CRF02 AG

ST53 CRF02 AG

ST44 CRF02 AG

ST15 CRF02 AG

STF18 CRF02 AG

ST26 CRF02 AG

ST1 CRF02-AG

ST6 CRF02 AG

ST21 CRF02 AG

ST25 CRF02 AG

ST14 CRF02 AG

ST76 CRF02 AG

ST77 CRF02 AG

Ref.02 AG.NG.x.IBNG.L39106

ST22 CRF02 AG

ST46 CRF02 AG

ST65 CRF02 AG

ST4 CRF02 AG

Ref.B.FR.83.HXB2 LAI IIIB BRU.K03455

93

76

99

98

95

78

97

0.005

139


Figura 3.20a. Relações filogenéticas das sequências do gene pol do HIV-1 provenientes de residentes em STP e várias estirpes de subtipos e sub-subtipos do grupo M, seleccionados aleatoriamente da base de dados de Los Alamos, mostram formação de cluster monofilético da maioria das estirpes CRF02_AG de STP, com possível efeito fundador e transmissão de âmbito local. Algumas das CRF02_AG de STP formam cluster com sequências de países limítrofes, sugerindo possível introdução a partir da costa Ocidental Africana (Angola, Camarões e Nigeria).

ST76 02AG ST77 02AG

ST14 02AG ST6 02AG

132554Angola Ref.02 AG.NG.x.IBNG.L39106

ST16 02AG ST35 02AG

ST22 02AG ST46 02AG

ST30 02AG ST74 02AG

ST7 02AG ST13 02AG

ST10 02AG ST34 02AG

ST51 02AG ST53 02AG

ST18 02AG ST28 02AG

68209Angola ST78 02AG

ST49 02AG ST56 02AG

ST4 02AG 165056Angola

ST9 02AG Ref.02 AG.CM.99.pBD6 15.AY271690

ST61 02AG ST73 02AG

ST44 02AG ST67 02AG

ST60 02AG ST15 02AG

Ref. 02 AG.CM. AY444295 Ref.G.BE.96.DRCBL.AF084936

Ref.G.PT.x.PT2695.AY612637 Ref.G.KE.93.HH8793 12 1.AF061641

Ref.G.NG.92.92NG083.U88826 Ref.A2.CD.97.97CDKTB48.AF286238

Ref.A2.CY.94.94CY017 41.AF286237 Ref.A1.AU.03.PS1044 Day0.DQ676872

Ref.A1.RW.92.92RW008.AB253421 Ref.A1.KE.94.Q23 17.AF004885

Ref.A1.UG.92.92UG037.AB253429 Ref.C.BR.92.BR025 d.U52953

Ref.C.IN.95.95IN21068.AF067155 Ref.C.ZA.04.SK164B1.AY772699

Ref.C.ET.86.ETH2220.U46016 Ref.H.BE.93.VI991.AF190127

Ref.H.BE.93.VI997.AF190128 Ref.H.CF.90.056.AF005496

Ref.J.CD.97.J 97DC KTB147.EF614151 Ref.J.SE.93.SE7887.AF082394

Ref.J.SE.94.SE7022.AF082395 Ref.B.FR.83.HXB2 LAI IIIB BRU.K03455

Ref.B.TH.90.BK132.AY173951 Ref.B.NL.00.671 00T36.AY423387

Ref.B.US.98.1058 11.AY331295 Ref.D.CM.01.01CM 4412HAL.AY371157

Ref.D.CD.83.ELI.K03454 Ref.D.TZ.01.A280.AY253311

Ref.D.UG.94.94UG114.U88824 Ref.K.CD.97.EQTB11C.AJ249235

Ref.K.CM.96.MP535.AJ249239 Ref.F1.BE.93.VI850.AF077336

Ref.F1.BR.93.93BR020 1.AF005494 Ref.F1.FI.93.FIN9363.AF075703

Ref.F1.FR.96.MP411.AJ249238 Ref.F2.CM.02.02CM 0016BBY.AY371158

Ref.F2.CM.97.CM53657.AF377956 Ref.F2.CM.95.MP255.AJ249236

Ref.F2.CM.95.MP257.AJ249237

99 99

99

70

98

70

99

99

98

99

99

93

95

82

82

72

99

88

98

71

99

71

98

90

99

97

98

74

91

0.005

140


Figura 3.20.b. Relações filogenéticas entre as sequências do gene pol de HIV-1 das estirpes CRF02_AG de origem são-tomense e outras seleccionadas aleatoriamente da base de dados de Los Alamos (subtipos, sub-subtipos e recombinantes do grupo M), mostrando o efeito fundador, particularmente evidente na árvore radial, e formação de cluster. A árvore foi construída com o recurso ao Mega 3.1, com base no modelo Neighbor-Joinning e Kimura 2-parameter, partindo de matrizes de distâncias de nucleótidos da região do genoma pesquisado. Foram incluídas 62 sequências e 901 caracteres incluindo inserções, e sem gaps.

A árvore da Figura 3.17 evidencia múltiplas introduções virais no arquipélago,

com a formação de clusters entre as estirpes recombinantes ou não, de STP, e várias

outras isoladas em diversas partes do Mundo. Verifica-se a disseminação entre os

países da Costa Ocidental Africana, tais como Angola, Gabão, Camarões, Nigéria,

Senegal, Burquina-Faso, evidenciando a ocorrência de transmissão regional da

infecção por HIV-1 nesta zona Africana (Figura 3.17-3.21).

Classificadas como CRF02_AG por REGA Subtyping Tool, as estirpes de São

Tomé e Príncipe (azul na Fig. 3.21a) e um grupo de sequências de diversas variantes

virais seleccionadas do GenBank/NCBI, e da base de dados de Los Alamos,

evidenciam formação de cluster monofilético, constituindo clones específicos do país

e efeito fundador, associado a transmissão de âmbito local (U_CRF0_AG e

A_CRF02_AG) (Figura 3.21a). Estas estirpes não foram antes descritas.

Ref.02 AG.CM.99.pBD6 15.AY271690 ST59 F1

0.02

141

ST61 02AG ST73 02AG ST9 02AG

ST34 02AG ST7 02AG

ST13 02 AG ST78 02AG

ST1 02-AG ST49 02 AG ST56 02AG

ST28 02AG ST25 02AG

ST35 02AG ST6 02AG

ST21 02 AG ST14 02AG

ST76 02AG ST77 02AG

ST74 02AG ST4 02AG



ST15 02AG 14 BG.ES.99.X397

G.KE.93.HH8793 12 1 G.NG.92.92NG083

G.SE.93.SE6165 A2.CY.94.94CY017 41 A2.CD.97.97CDKTB48

16A2D.KR.97.97KR004 01 AE.TH.90.CM240

15 01B.TH.99.99TH MU2079 A1.UG.98.98UG57136

A1.KE.94.Q23 17 A1.SE.94.SE7253

A1.UG.92.92UG037 18 cpx.CM.97.CM53379

06 cpx.AU.96.BFP90 04 cpx.CY.94.CY032

D.TZ.01.A280 D.UG.94.94UG114

19 cpx.CU.99.CU38 D.CM.01.01CM 4412HAL

D.CD.83.ELI 10 CD.TZ.96.96TZ BF061

B.FR.83.HXB2 LAI IIIB BRU B.TH.90.BK132

B.NL.00.671 00T36 B.US.98.1058 11

03 AB.RU.97.KAL153 2 F2.CM.95.MP255

F2.CM.95.MP257 F2.CM.02.02CM 0016BBY

F2.CM.97.CM53657 05 DF.BE.x.VI1310

F1.FR.96.MP411 12 BF.AR.99.ARMA159

F1.BR.93.93BR020 1 F1.FI.93.FIN9363

F1.BE.93.VI850 09 cpx.GH.96.96GH2911

K.CD.97.EQTB11C K.CM.96.MP535

C.ET.86.ETH2220 C.BR.92.BR025 d

07 BC.CN.97.CN54 C.ZA.04.SK164B1 C.IN.95.95IN21068 08 BC.CN.97.97CNGX 6F

H.BE.93.VI991 H.CF.90.056

H.BE.93.VI997 J.SE.94.SE7022

11 cpx.GR.x.GR17 13 cpx.CM.96.1849

N.CM.97.YBF106 N.CM.02.DJO0131

O.BE.87.ANT70 O.CM.98.98CMU2901

O.SN.99.SEMP1300

99

99

99

99

99

99

99

99

99

98

98

82 96

95

95

84

94

85 93

74

92

91

86

84

81

99

71

76

99 78

0.02


142


Figura 3.21a. Árvore com os recombinantes CRF02_AG de São Tomé e Príncipe (azul) e outras variantes seleccionadas de base de dados de Los Alamos. Relações filogenéticas entre as sequências CRF02_AG de STP, e estirpes dos subtipos puros, e recombinantes do grupo M, utilizando-se sequências de referência dos grupos O e N dos Camarões como outgroup. A árvore foi construída no MEGA 3.1 com base no modelo Neighbor-Joinning partindo de matrizes de distâncias de nucleótidos da região do genoma pesquisado. Os 2% representam a variabilidade, e os números nos nós assinalam valores de bootstrap> a 70%.

143


Figura 3.21b. Relações filogenéticas entre as sequências CRF02_AG de STP e as de alguns países da costa ocidental Africana. A árvore mostra claramente interligação entre as estirpes CRF02_AG de STP (ST_02AG) e as do continente (Angola, Gabão, Camarões, Nigéria, e Guiné Equatorial).

3.5. Discussão

ST76 02AG ST77 02AG

ST14 02AG ST6 02AG

132554.Ang ST16 02AG

ST35 02AG ST18 02AG

ST28 02AG ST49 02AG

ST56 02AG ST51 02AG

ST53 02AG AM113750.1GAB

ST30 02AG ST74 02AG

ST65 02AG ST67 02AG

Ref.02 AG.NG.x.IBNG.L39106 ST4 02AG

ST22 02AG ST46 02AG

ST7 02AG ST13 02AG

ST10 02AG FJ481701.1 EG

ST34 02AG 02AGCM9797CMP807

ST15 02AG Ref. 02AG.CMAY444295

ST44 02AG ST60 02AG

68209.Ang ST78 02AG

FJ481706.1 EG 165056.Ang

ST9 02AG Ref.02AG.CM.99.pBD6 15.AY271690

ST61 02AG ST73 02AG

99

99

99

72 96

86

98

96

97

77

88

0.002

144


São Tomé e Príncipe, embora localizado perto do epicentro da infecção por

HIV-1, tem registado baixos valores de prevalência (vide capítulo 2). Porém, teme-se

um incremento marcado da infecção nas próximas décadas, dada a situação económica

degradada do país, sobretudo a pobreza feminina, e certa poligamia, aliados a

carências de programas de prevenção e vigilância epidemiológica das infecções a

HIVs e de outras ISTs.

Através da epidemiologia molecular do HIV-1 são estudados factores genéticos

virais que poderão influenciar a infecção e a sua epidemiologia. Assim, utilizando os

préstimos desta ferramenta pode-se tentar deduzir a origem dos HIVs em diversos

grupos populacionais, detectar e monitorizar a introdução de novas variantes num país

ou numa determinada região, contribuindo para melhor compreensão da biologia do

HIV-1, sua transmissão, história natural e classificação genética (Robertson et al,

2000).

Este é o primeiro estudo de epidemiologia molecular de HIV-1 oficialmente

realizado com amostras de São Tomé e Príncipe. O estudo envolveu amostras dos

seropositivos para os anticorpos específicos do HIV-1, que utilizaram diversas

instituições de saúde do país, dos 7 aos 63 anos e de ambos os sexos. Teve como

propósito identificar e conhecer a prevalência das variantes virais circulantes em São

Tomé e Príncipe (e também avaliar as resistências aos antirretrovirais – capítulo 4).

O gene pol constituiu o alvo deste estudo uma vez que constitui uma região

muito conservada do vírus, e codifica as enzimas protease (PR), transcriptase reversa

(RT) e integrase (IN). A RT tem constituído o alvo principal da terapêutica

antirretroviral. A amplificação do gene pol permite aceder as informações contidas nos

genes e relativas tanto aos subtipos como às mutações associadas a resistência aos

fármacos antirretrovirais. Assim, permite ser melhor caracterizada a extensão da

epidemia no país, e serem esclarecidas as fontes comuns de infecção. Este é um dado

relevante para o estabelecimento das estratégias de prevenção e controlo da infecção,

mais apropriadas às características epidemiológicas do país.

Partindo de amostras de plasma colhidas aos seropositivos são-tomenses que

ocorrem às diversas instituições de saúde do país, foi amplificado o gene pol do HIV-

1. O processo de genotipagem consistiu de extracção do RNA, que é convertido em

cDNA pela reacção transcriptase reversa, seguida de PCR (RT-PCR). O cDNA obtido

é amplificado em DNA de cadeia dupla, seguindo-se a sequenciação directa (Marlowe

et al, 2000). As sequências nucleotídicas obtidas são submetidas a análise filogenética:

145


por submissão destas em formato FASTA a algoritmos bioinformáticos existentes nas

bases de dados, e análise dos alinhamentos múltiplos, de forma a serem detectadas as

semelhanças e dissemelhanças, para a determinação dos ancestrais comuns entre as

sequências das estirpes identificadas.

Este tipo de teste é relativamente moroso e considerado um teste complexo,

devido a dificuldades de interpretação dos dados. Não obstante as reavaliações

frequentes, o processo de genotipagem de subtipos não-B apresenta ainda

incongruências entre os vários algoritmos na interpretação dos resultados,

possivelmente por sua optimização ter sido originalmente efectuada para os vírus do

subtipo B. Por outro lado tem-se vindo a verificar melhoria destes algoritmos. Uma

limitação considerada relevante refere-se ao facto do teste só ser exequível para os

infectados com carga viral superior a 500-1000 cópias por mililitro.

Foram utilizados os algoritmos de subtipagem dos sítios de Internet: HIVSeq

database (Rhee et al, 2003) e REGA subtyping tool (de Oliveira et al, 2005). Em casos

de ambiguidades, as sequências nucleotídicas foram analisadas com um software

adicional SimPlot (Ray, 1999), com o algoritmo jpHMM-HIV, do sítio da

Universidade de Göttingen (Zhang et al, 2006; Schultz et al, 2006). Todos estes

algoritmos apresentaram discrepâncias, quer em si próprios, quer uns com os outros.

Este facto, que pode comprometer o processo de subtipagem, é sobretudo devido à

crescente prevalência de cada vez mais variantes genéticas virais novas.

O algoritmo HIVSeq (Rhee et al, 2003) registou grande variabilidade viral em

São Tomé e Príncipe, com diversas variantes genéticas, nomeadamente subtipos e

recombinantes (CRF02_AG, CRF02_AG/A, CRF02_AG/G, CRF02_AG/H,

K/CRF02_AG, CRF01_AE/CRF02_AG (ou A1/G ou A1/G/A1), A/U, G/U e J/G).

Apenas registou presença do subtipo K em recombinação com CRF02_AG (Figuras

3.6-3.7), enquanto tanto REGA subtyping Tool (de Oliveira et al, 2005) como jpHMM-

HIV (Zhang et al, 2006 e Schultz et al, 2006) não o puderam detectar.

O resultado de submissão das sequências ao algoritmo REGA subtyping Tool

(de Oliveira et al, 2005) classificou 4 variantes recombinantes (CRF02_AG,

A/CRF02_AG, CRF06_cpx e J_U) (Figura 3.7). Os resultados de ambos algoritmos

foram sobreponíveis apenas em relação aos subtipos puros C, D e J. Verificaram-se

resultados discrepantes entre os algoritmos ao nível da análise de recombinantes. Em

análise de recombinantes, todas as estirpes CRF01_AE/A do gene pol identificadas

146


por HIVSeq (Rhee et al, 2003) foram classificadas como sub-subtipo A (A1) pelo

REGA subtyping Tool (de Oliveira et al, 2005).

Um dos pontos de concordância entre os algoritmos foi a existência de elevada

diversidade genética viral no país. Também concordaram na completa ausência de

vírus do subtipo B, que é predominante nos países da Europa, Américas e Austrália. O

subtipo B representa 10-12% dos casos de infecção por HIV no mundo (Hemelaar et

al, 2006). De acordo com alguns estudos tem-se verificado relativa diminuição da

prevalência dos subtipos B, em detrimento dos subtipos não-B (Spira et al, 2003).

Estes factos poderão dificultar o Sistema Nacional de Saúde de São Tomé e Príncipe,

quer ao nível de diagnóstico, quer para o estabelecimento de protocolos relacionados

com a terapêutica aos antirretrovirais, dado tanto os testes diagnósticos como os ARVs

terem sido optimizados para o subtipo B. Saliente-se ainda que as discrepâncias entre

os algorítmos de subtipagem são a nível de pormenor, particularmente na constituição

de recombinantes. Não se verificou qualquer amostra ser classificada como subtipo

puro num algorítmo e como outro subtipo puro diferente no outro. Assim, pode-se

interpretar este facto como dificuldades destes algorítmos (que são apenas ferramentas

automáticas, é bom não esquecer) em classificar fragmentos de genoma, ou

combinações de fragmentos de genoma, que são novos.

As inferências filogenéticas das sequências nucleotídicas do gene pol,

relativamente à análise de subtipos e recombinantes apontam para um perfil de

infecção heterogénea em São Tomé e Príncipe, com predominância de estirpes

recombinantes CRF02_AG, 35 (38%) no “HIVSeq” e 38 (41%) no REGA subtyping

Tool, tal como nos países limítrofes da costa Ocidental Africana, nomeadamente

Nigéria (Howard et al, 1994; McCutchan et al, 1999; Peeters et al, 2000b), Camarões

(Carr et al, 1998; 2001; Mboudjeka et al, 1999; Burda et al, 2004), Gabão (Pandreia et

al, 2002) e Guiné Equatorial (Ortiz et al, 2001), com excepção de Angola, que

apresenta baixa prevalência deste recombinante (Abecasis et al, 2005; Bártolo et al,

2005; Garrido et al, 2008) (Figuras 3.22-3.26). No total, das 93 sequências do gene pol

do HIV-1 analisadas, 64 (70%) no “HIVSeq” e 67 (73%) no REGA subtyping Tool,

foram classificadas como subtipos A, G ou um dos seus recombinantes. Com efeito, os

estudos conduzidos com amostras de determinados países de África, confirmam a

predominância destas formas virais e seus recombinantes nas regiões Central e

Ocidental do Continente Africano (Laurent & Delaporte, 2001; Laurent et al, 2002;

Peeters, 2003; Toni et al 2005; Pandrea et al, 2005; Njai et al, 2006). Note-se que as

147


variantes virais CRFs têm os segmentos do genoma derivados de dois ou mais

subtipos. Os subtipos C, A e CRF02_AG representam aproximadamente 75% das

estimadas 14.000 novas infecções por dia no mundo (Heeney et al, 2006).

148


Figura 3.22 Variantes genéticas do HIV-1 em Angola.O gráfico mostra as variantes genéticas do HIV-1 em Angola, quer das formas recombinantes como não recombinantes (Adaptado da Base de Dados de Los Alamos, 2008 - http://www.hiv.lanl.gov/).

149

http://www.hiv.lanl.gov/


Figura 3.23. Variantes genéticas do HIV nos Camarões.O gráfico mostra as percentagens das variantes genéticas do HIV-1 nos Camarões, quer das formas recombinantes como não recombinantes. As variantes pertencem ao grupo M, e O pertence ao grupo O, também presente nos Camarões (Adaptado da Base de Dados de Los Alamos, 2008 - http://www.hiv.lanl.gov/ ).

150



Figura 3.24. Variantes genéticas do HIV-1 do Gabão.O gráfico mostra as percentagens das variantes genéticas do HIV-1 no Gabão, quer das formas recombinantes como não recombinantes. As variantes pertencem ao grupo M, e O pertence ao grupo O, que também co-circula neste país (Adaptado da Base de Dados de Los Alamos, 2008 - http://www.hiv.lanl.gov/ ).

151



Figura 3.25. Variantes genéticas do HIV-1 da Guiné Equatorial. O gráfico mostra as variantes genéticas do HIV-1 na Guiné Equatorial, quer recombinantes quer não recombinantes. As variantes pertencem ao grupo M, e o O representa o grupo O, que co-circula neste país (Adaptado da Base de Dados de Los Alamos, 2008 - http://www.hiv.lanl.gov/ ).

Figura 3.26. Variantes genéticas do HIV-1 da Nigéria.O gráfico mostra as variantes genéticas do HIV-1 na Nigéria, quer recombinantes quer não recombinantes (Adaptado da Base de Dados de Los Alamos, 2008 - http://www.hiv.lanl.gov/ ).

152




Saliente-se que a variante CRF02_AG, cuja estirpe de referência é a IbNg, da

Nigéria, é a forma recombinante dos subtipos A e G mais prevalente na África Central

e Ocidental (Figura 1.13). Esta variante viral representa 50-70% das estirpes em

circulação nesta região (Peeters, 2000; Carr et al, 2001). O primeiro exão do rev, e os

genes gag e vpr são do subtipo A, enquanto os outros genes são quimeras A/G.

Encontraram-se novos tipos de recombinantes A/G, exibindo diferentes pontos de

recombinação em relação à estirpe padrão IbNg, tendo sido nomeadamente

identificados nos Camarões (Carr et al, 2001) e em emigrantes africanos residentes na

Holanda (Cornelissen et al, 2000). Num estudo recente, os autores tentaram

demonstrar que o subtipo G é ele próprio um recombinante, e não um subtipo puro

(Abecasis et al, 2007). No presente estudo, foi detectada recombinação da estirpe

CRF02_AG, com vários subtipos, sub-subtipos, CRFs e URFs, produzindo

recombinantes considerados de 2ª geração, tal como se verifica com CRF09_cpx

(McCutchan et al, 2004; Brodine et al, 2003), CRF36_cpx (Powell et al, 2007b) e

CRF37_cpx (Powell et al, 2007a). Verifica-se que uma pequena percentagem de

CRF02_AG integra subtipos, sub-subtipos e mesmo CRFs pertencentes a uma nova

geração, revelando por si só um processo evolutivo baseado em recombinações, tal

como A/CRF02_AG, K/CRF02_AG, CRF02_AG/G, CRF02_AG/H, CRF02_AG/U,

CRF01_AE/CRF02_AG e CRF01_AE/A. À excepção da CRF01_AE/CRF02_AG e

CRF01_AE/A, estas foram inicialmente classificadas pelo REGA Subtyping Tool

como CRF06_cpx, e após reavaliação por uma versão actualizada deste algoritmo em

Junho de 2008, mostraram diferenças na constituição genómicas, integrando na sua

constituição um fragmento U_CRF06_cpx (Figura 3.8).

A estirpe recombinante CRF09_cpx, de origem Senegalesa, integra para além

da CRF02_AG, o subtipo A e um fragmento não subtipável, U (McCutchan, 2000;

McCutchan et al , 2004 ; Brodine et al, 2003). Um cenário semelhante se constata com

a estirpe recombinante CRF30_0206, que inclui tanto o CRF02_AG como CRF06_cpx

(Montavon et al, 2002). As duas estirpes recentemente identificadas, anteriormente

referidas, constituem evidência do processo de integração e evolução das estirpes

CRF02_AG: CRF36_cpx (A, G, CRF01_AE, CRF02_AG) e CRF37_cpx (A, G,

CRF01_AE, CRF02_AG, U) (Powell et al, 2007a,b). Assim, nas últimas décadas tem-

se vindo a registar um processo de diversificação de vírus recombinantes, incluindo

subtipos, inter-subtipos e as CRFs, exibindo complexos genomas em mosaicos, facto

que evidência acentuado incremento das infecções por formas recombinantes ou

153

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=17725418&dopt=Abstract

http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/%20http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15320986

http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/%20http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15320986



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Retrieve&list_uids=14600525&dopt=Citation


superinfecções com vírus de subtipo/formas recombinantes diferentes na pandemia da

SIDA, também se detectando este facto em São Tomé e Príncipe.

Nos Camarões, país em que são frequentes não só os vírus do grupo M, mas

também, do grupo O, uma equipa de investigadores avaliou os desempenhos dos testes

de diagnóstico de HIVs licenciados pela FDA através de rastreio das 240 amostras de

plasma dos dadores, utilizando tanto os testes rápidos de rastreio como os de

amplificação dos ácidos nucleícos para determinação dos subtipos. Concluíram que

nas amostras de plasma o HIV-1 é detectado na grande maioria, mas não em todos, dos

testes licenciados por FDA, mas o antigénio p24 não foi detectado em nenhuma das

amostras. Verificaram ainda que alguns testes baseados na amplificação de ácido

nucleíco não detectaram uma parte de amostras com serologia reactiva, ainda que

pequena (Lee et al, 2006). Situações semelhantes têm sido suspeitas em São Tomé e

Príncipe, dada a grande predominância de estirpes recombinantes. Caracterizadas pela

associação no seu genoma de fragmentos de dois subtipos, A e G, as estirpes

recombinantes CRF02_AG identificadas em São Tomé e Príncipe exibem uma

recombinação específica, integrando genomas virais de quase todas variantes

detectadas até a presente data, constituindo evidência de um processo de evolução

rápida, como se tem vindo a constatar com outras estirpes do HIV-1, grupo M.

Também a estirpe CRF02_AG (ST15) apresentou estrutura genómica de difícil

classificação, desde CRF02_AG e U_CRF02_AG pelo REGA Subtyping Tool,

CRF02_AG/CRF01_AE pelo HIVSeq, com o recurso ao software SimPlot foi

classificada como URF_A1/G/A, e finalmente pelo jpHMM-HIV-1 da Universidade de

Göttingen como A1 (Figuras 3.11a-b; 3.15 e 3.16).

Em análise de recombinantes, as estirpes CRF02_AGs identificadas formam

cluster monofilético com baixa percentagem de variação das posições polimórficas.

Uma estirpe CRF02_AG, nomeadamente a ST15 exibe características semelhantes às

da variante viral de referência, AY444295, identificada nos Camarões e classificada

como uma CRF02_AG, sugerindo múltiplas introduções de infecção no país, podendo

ter originado um cluster de transmissão local. Saliente-se que a sequência ST15

pertence a uma pessoa do sexo feminino, com cerca dos 34 anos, cuja profissão é

“Caixeiro-viajante”, tendo frequentado os países da Costa Ocidental Africana,

nomeadamente Gabão e Camarões.

154

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&val=38231459


A análise dos aminoácidos das formas genéticas CRF02_AG mostrou

divergências em alguns aminoácidos (PR 3 e 37) em relação a outras formas genéticas

virais semelhantes estudadas no Continente, sugerindo a possibilidade de evolução

específica do vírus em São Tomé e Príncipe, e sendo necessária a implementação de

estudos adicionais neste âmbito com um número significativo de sequências destas

formas genéticas virais. Estudos adicionais poderão confirmar ou infirmar esta

hipótese. Por outro lado, ao serem comparadas as variantes de HIV-1 detectadas neste

estudo de investigação, com as dos países com ligação a São Tomé e Príncipe, tais

como Angola, Gabão, Guiné Equatorial, Camarões e Nigéria, verificou-se grande

proximidade e mesmo a formação dos clusters monofiléticos entre elas. Estas relações

filogenéticas sugerem que as variantes virais do HIV-1 são disseminadas dos países da

Costa Ocidental Africana para o arquipélago, e talvez vice-versa, constatando-se nelas

os mesmos ancestrais evolutivos.

O conhecimento das variantes do HIV-1 circulantes permite contextualizar a

monitorização das mutações de resistências, em função da introdução da terapêutica

com os ARVs. E ao serem conhecidas as variantes genéticas do HIV-1 em circulação

no país, abre-se uma janela de oportunidade para a selecção das estirpes genéticas a

integrarem as hipotéticas vacinas para a população são-tomense.

155


3.6. ConclusõesFoi constatada uma grande diversidade genética do HIV-1, grupo M, num

pequeno país, cuja população rondava os 140.000 habitantes em 2001. Este facto

sugere várias introduções independentes.

Tal como nos países limítrofes, verificou-se existir predominância da variante

recombinante CRF02_AG em STP, sugerindo disseminação regional. A presença de

uma estirpe são-tomenses semelhantes à de origem Camaronesa (AY444295) concorda

com esta interpretação. A estirpe AY444295 apresenta semelhanças com as ST15, não

obstante as discrepâncias apresentadas pelos algorítmos de subtipagem utilizados no

presente estudo de investigação.

Foi elevada a diversidade genética do HIV-1 em circulação, em STP, o que

também constituirá um obstáculo à adopção de vacinas eficazes de uso global, quando,

e se, forem produzidas. Do mesmo modo levanta a questão da fiabilidade dos testes de

HIV-1 em uso no país. Questão que se prende com a optimização dos testes para os

subtipos não-B, é prioritária para os países, como STP, onde a maioria dos isolados de

HIV-1 são de grupo M não-B, não se excluindo a hipótese – apesar de extremamente

baixa - de existirem em circulação vírus dos grupos N e O. Estes subtipos e formas

genéticas virais emergentes poderão causar cross linked antigenic reaction,

apresentando resultados inconclusivos dos testes de screening para HIV-1, quase todos

optimizados para estirpes do subtipo B.

As inferências filogenéticas sugerem que as variantes virais do HIV-1 são

disseminadas dos países da Costa Ocidental Africana para o arquipélago e vice-versa,

constatando-se nelas os mesmos ancestrais evolutivos. As formas recombinantes

CRF02_AG apresentaram divergências nalguns aminoácidos (PRO 3 e 37) em relação

a outras formas semelhantes estudadas no continente, o que pode apontar para a

possibilidade de evolução específica do vírus no próprio arquipélago. Outros estudos

serão necessários para confirmar ou infirmar esta hipótese.

156


157

Documents

3 CAP 3 EPI... · Web viewO estudo consistiu de 3 etapas de colheita de amostras de sangue (plasma) nas instituições de saúde de São Tomé e Príncipe, e realização de um inquérito