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5/11/2018 3. Materiales Diluyentes Medios de Cultivo - slidepdf.com
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3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 15151515
3. MATERIALES. DILUYENTES. MEDIOS DE CULTIVO
3.1 MATERIAL Y EQUIPAMIENTO BÁSICO
A. Material de vidrio o de plástico esterilizable. Tubos de ensayo de diferentesmedidas, placas de Petri, pipetas graduadas, asa de Digralsky, matraces, erlenmeyers,
probetas, botellas con tapón de rosca, portaobjetos, portaobjetos socavados,
cubreobjetos. B. Material diverso. Asas de Kolle, gradillas, cestillos metálicos, mecheros Bunsen,
trípodes, termómetros, algodón, papel de embalaje, indicadores de pH, etc.
Fig. 3.1
C. Aparatos I. Balanzas: Granatario, de precisión y analíticas.
II. Microscopio. Microscopio óptico con objetivo de inmersiónIII. Estufa de incubación
IV. Centrifuga
V. Autoclave
VI. Espectrofotómetro
VII. pHchímetro
VIII.Agitadores
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3.2 CONDICIONES DE CRECIMIENTO
Para un buen crecimiento microbiano se tienen que cumplir una serie de requerimientos
fisicos y químicos:
a. Requerimientos Físicos: Temperatura, pH, presión osmótica.
b. Requerimientos químicos: Agua, fuentes de carbono y nitrógeno, sustancias
minerales, oxígeno y factores orgánicos de crecimiento.
3.3 DILUYENTESLas muestras problemas presentan a menudo una concentración de bacterias excesiva, que
precisa de diluciones previas, para realizar siembras que permitan lecturas dentro de la
normativa (30-300 colonias/placa petri).
La característica principal de un buen diluyente es que no produzca modificaciones
cualitativas ni cuantitativas en la flora existente, es decir, que mantenga lo más fielmente
posible la flora de la muestra, sin suprimirla ni favorecer su desarrollo.
Los diluyentes requieren por ello cumplir con determinadas exigencias de los
microorganismos, en cuanto a: pH, Isotonicidad
Diluyentes En Microbiología se utilizan varios diluyentes, habitualmente los siguientes:
Agua de triptona (Tryptone Water: TW)
Soluciones salinas
Las soluciones salinas no son medios de cultivo ya que no permiten el crecimiento de los
microorganismos. Mantienen los microorganismos en suspensión sin que disminuya su
viabilidad, debido a que son isotónicosiy tienen niveles de pH adecuados.
Para su preparación se disuelven las sales en agua destilada y se ajusta el pH con ácido
clorhídrico 0,1 N o hidróxido de sodio 0,1 N. La solución así preparada se distribuye en
recipientes adecuados y se esteriliza en autoclave.
a) Solución de Ringer 3333b) Solución salina (SS) c) Tampón fosfato (PBS)
Presión osmótica
Si ponemos en contacto a través de una membrana semipermeable (pergamino o cerámica
porosa impregnada de ferrocianuro de cobre), dos disoluciones con diferente concentraciónde soluto, el flujo de disolvente es mayor desde la disolución más diluida hacia la disolución
más concentrada. (debido al impedimento producido por las moléculas de soluto)
Se denomina osmosis al paso de disolvente a través de una membrana semipermeable.
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Llamamos presión osmótica a la presión hidrostática que es capaz de impedir el flujo neto
de disolvente hacia la disolución a través de la membrana semipermeable.
Ley de Van't Hoff : = M$R $T =
n
V $R $T
Osmosis inversa , fenómeno que se obtieneejerciendo sobre la disolución concentrada una
presión superior a la presión osmótica
(desalinización de agua, concentración de zumos
de frutas).
Osmol Presión osmótica de un mol de soluto no
disociado disuelto en 1 litro de agua a 22,4 at. de
presión y 0º C.
El estado de la concentración salina del medio respecto a las células puede ser de tres tipos:
1. Isotónico, si las concentraciones del medio y las células son iguales. En microb. se
suele trabajar en condiciones de isotonía (300 miliósmoles j dº 10-20 % sacarosa).
2. Hipertónico, si la concentración del medio es mayor que la de las células. Los
halófilos (Staphylococcus) permiten concentraciones muy altas de NaCl. En general
los salazones son un buen método de conservación. 3. Hipotónico el medio presentan menor presión osmótica que las células. La bacterias
que pueden vivir en medios hipotónicos (acuosos), se debe a la pared rígida que
permite que el agua no penetre la bacteria.
En el mundo de las procariotas, seres ligados por completo al medio acuático, las barreras
que aíslan en cierto modo a la delgada membrana celular son:
La pared celular no es rígida (balón de fútbol). Como una pelota inchada, el
protoplasto totalmente lleno confiere rigidez a la célula. La pared celular es permeable
a sales y sustancias de bajo peso molecular.
La cápsula (en ocasiones)
La membrana citoplasmática es semipermeable y osmóticamente activa: controla la entrada y
salida de sustancias disueltas, así como la eliminación de residuos.
Si hacemos aumentar la presión osmótica exterior (medio hipertónico añadiendo + azúcar o
urea), se extrae agua de la célula y el protoplasto se encoje (plasmólisis). La célula puede
modificarse de forma irreversible.
Si el medio es hipotónico, la célula recibe agua del medio y se incha (turgencia). La célula
puede reventar.
Seres unicelulares, como los protozoos ciliados y otros muchos, presentan un conjunto de
vacuolas dilatables, que actúan regulando el nivel de agua en el citoplasma.
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Estos fenómenos osmóticos explican muchas propiedades de los seres vivos:
Las raíces absorben agua cuando las soluciones del suelo son hipotónicas respecto del
citoplasma de las células de la planta. En caso contrario, el agua sale de la planta y
esta acaba secándose.
El crecimiento rápido de las plantas se debe en gran medida a la turgencia que
provoca en sus células la entrada de agua del suelo. Las inyecciones intravenosas han de tener la misma concentración salina que el
plasma sanguíneo, pues si fueran más diluidas, podría provocarse la rotura de las
células sanguíneas.
La mayoría de las bacterias no necesitan regular su osmolaridad interna con precisión porque
están protegidas por una pared celular capaz de resistir una considerable presión osmótica
interna.
Las bacterias mantienen siempre su osmolaridad muy por encima de la del medio. Si la
presión osmótica interna desciende por debajo de la externa, el agua sale de la célula y el
volumen del citoplasma disminuye, dañándose la membrana. En las bacterias Gram positivas
esto provoca que la membrana celular se separe de la pared, se dice que la célula se ha
plasmolizado.
Las bacterias varían ampliamente en sus requerimientos osmóticos. Algunas crecen en
disoluciones muy diluidas y otras en disoluciones de elevada osmolaridad que reciben el
nombre de osmófilos.
La mayor parte de los ambientes naturales con elevada osmolaridad contienen concentraciones altas
de sales, especialmente cloruro sódico. Los microorganismos que crecen en este tipo de ambiente se
llaman halófilos.
Las bacterias se pueden dividir en 4 amplias categorías con respecto a su tolerancia a la sal:
1. no halófilos2. organismos marinos3. halófilos moderados4. halófilos extremos
Algunos halófilos, por ejemplo, Pedioccocus halophilus, pueden tolerar concentraciones elevadas de
sal en el medio de crecimiento, pero también pueden crecer en medios sin NaCl.
Otras bacterias, entre las que se incluyen las marinas y algunos halófilos moderados, así como los
halófilos extremos, requieren NaCl para el crecimiento.
pH del medio
Los iones OH-y H3O
+son los más móviles de todos, por lo que pequeñas variaciones
en su concentración tienen grandes consecuencias.
Las lesiones que aparecen a valores de pH desfavorables no se deben directamente a
la acción de los iones hidroxilo/hidronio, sino a que una concentración elevada de
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estos desplaza el equilibrio de los ácidos o bases débiles presentes en la disolución en
favor de las formas no disociadas, las moléculas de ácidos y bases (sin carga)
penetran con mucha mayor facilidad en las células que los productos de su
disociación. El succianato dibásico, el ácido cítrico tribásico, penetran tanto más
rápidamente en la célula, cuanto más bajo sea el valor del pH del medio.
a. neutrófilos la mayoría de m.o. se desarrollan óptimamente a pH 7. b. alcalófilos, algunas bacterias prefieren un medio ligeramente alcalino (nitrificantes,
rizobios, actinomicetos o bacterias degradadoras de la urea como el Proteus pH 8),
Vibrio Cholerae se desarrolla bien a pH 9. c. acidófilos
1. pocas son ácidotolerantes (lactobacillus, acetobacter,...)
2. acidófilas: Thiobacillus
Los Hongos preferentemente a pH 5,0.
Medios tamponadosEs fácil en un medio de cultivo que puedan aparecer variaciones de pH como consecuencia
de los metabolitos que se producen en la degradación de los nutrientes por parte de lasbacterias. Es típico en la fermentación glucídica que se produzca acidificación del medio, o
que se alcalinize el medio al utilizar la bacteria sales de amonio, como fuente de energía, en
la degradación proteica.
El mantenimiento de un determinado valor de pH durante el crecimiento tiene gran
importancia para los mo. que producen ácidos pero no los toleran (Lactobacilos,
Enterobacterias, muchas Pseudomonas).
a. Fosfatos inorgánicos tienen leve efecto tampón a pH >7,2 b. Carbonato de calcio en caso de producción más fuerte de ácidos c. Carbonato de sodio si no se quieren componentes insolubles
Los fosfatos son ampliamente utilizados para la preparación de medios porque son los únicos
agentes orgánicos que tienen acción amortiguadora en la escala fisiológicamente importante
en torno a la neutralidad y porque son relativamente atóxicos para los microorganismos.
Además, proporcionan una fuente de fósforo, un elemento esencial para el crecimiento.
A concentraciones elevadas el fósforo se hace inhibidor, de tal manera que la cantidad de
fosfato de amortiguación que puede ser utilizada en un medio está limitada por la tolerancia
del organismo en particular que se va a cultivar. Generalmente, pueden ser tolerados por las
bacterias y los hongos unos 5 g de fosfatos de potasio por litro de medio.
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Temperatura
1. . Cada bacteria tiene una zona de crecimiento determinada por temperaturas máxima y
mínima. Según sea el valor de la temperatura óptima se clasifican en:
a. psicrófilas o criófilas afinidad por el frío 5-25 ºC . Son organismos entre los
que predominan algunas bacterias marinas (bacterias luminiscentes) ; tienen su
tasa óptima de crecimiento por debajo de los 20 ºC. b. mesófilas crecen bien a la temperatura corporal de los mamíferos (20-42 ºC) c. termófilas afinidad por el calor (40-70ºC Bacillus stearothermophílus,
Thermoactinomyces vulgaris; Se denominan organismos termófilos extremos
a aquellos que tienen su óptimo de crecimiento por encima de los 65ºC
(Thermus aquaticus, Sulfolobus); algunos de ellos pueden crecer a
temperaturas por encima de los 70ºC (varias especies del género Bacillus y
Clostridium) o incluso por encima de los 80ºC (Sulfolobus acidocaldarius) o
incluso a 105ºC (Pyrodictium occultum, una bacteria reductora de sulfato
anaeróbica estricta).
3.4 MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Han de tener fuentes de carbono, oxígeno, hidrógeno, nitrógeno, azufre,
fósforo y en menor cantidad otros elementos, tales como hierro, magnesio, etc.
Los medios de cultivo sólidos no sólo sirven de fuente de nutrientes, sino también como
soporte físico para las bacterias, de tal forma que crezcan formando colonias y sean visibles a
simple vista.
La diversidad metabólica de los microorganismos es enorme; por ello, la variedad de mediosde cultivo es también grande, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para
todos ellos. En el anexo I se detalla la composición de los medios de cultivo más frecuentes.
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3.5 COMPONENTES BÁSICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Agar. El agar e utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivo. El componente dominante en el agar bacteriológico es un polisacárido, al que
acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Un gel de
agar al 1-2 % en agua licúa hacia los 100 ºC y se gelifica alrededor de los 40 ºC,
dependiendo de su grado de pureza. Extractos. Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (p. ej.,
carne, hígado, cerebro, semillas) son extraídos con agua y calor, y posteriormente
concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados
son frecuentemente empleados en la confección de medios de cultivo. Ejemplos:
extracto de carne, de levadura, de malta, etc. Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y sales
minerales que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o
vegetales (soja, carne, gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos
y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Fluidos corporales. Sangre completa, plasma, o suero sanguíneo son frecuentemente
añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patógenos.
Carbohidratos. Llamados comúnmente azúcares, se utilizan para enriquecer medios,para promover el crecimiento o la pigmentación y para determinar si los organismos
pueden producir ácido y gas a partir de ellos. Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de
cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Los
microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo para su crecimiento está
próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisódicos o bipotásicos, o sustancias
como las peptonas, previenen una desviación de pH. Indicadores de pH. Indicadores ácido-base se añaden a menudo a los medios de
cultivo con objeto de detectar variaciones de pH. Agentes reductores. Se añaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de
gérmenes anaerobios. Agentes selectivos. La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo puede
convertirlo en selectivo. Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sódica,
antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente
a determinados microorganismos. 3.6 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
A) SEGÚN SU UTILIZACIÓN
Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.
Agar nutritivo, Agar PCA, Agar TSA, Medio CPS (almidón-peptona-caseína) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado tipo de
microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto. Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos
determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás. Entre los más usados destacan los
medios que se emplean para el recuento de los organismos intestinales del grupo
coliforme (Agar Mc Conkey, Medio de Endo). Otros medios seleccionan
determinado tipo de patógenos (Agar Salmonella-Shigella), Caldo de Rothe para la
detección de estreptococos de origen fecal.
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Medios diferenciales. Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades que
un determinado tipo de microorganismo posee. Se utilizan para determinar las
propiedades fisiológicas y bioquímicas de las bacterias. Son ejemplos el agar citrato
de Simmons para determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como única
fuente de carbono.
B) SEGÚN SU ESTADO FÍSICO
Sólidos: Placa de Petri. Se ven perfectamente las colonias y se puede tomar una sola
colonia con mayor facilidad que en tubo. Sufre mayor desecación y todo el
medio es aerobio. Tubo con agar inclinado. Se siembra por picadura o estría, el fondo es
anaeróbico y la superficie inclinada aeróbica. Se contamina y deseca menos
que la placa de Petri. Semisólidos
Tubo con agar recto. Se utiliza para observar la motilidad tras la siembra por
picadura. Líquidos
Tubo. Todo el medio es aeróbico debido a las corrientes de convección.
3.7 PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma liofilizada que es preciso
rehidratar. En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar
la cantidad deseada del mismo y redisolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del
fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los
componentes previamente esterilizados en autoclave.
Antes de su esterilización, los medios líquidos en caldo se distribuyen en los recipientes
adecuados (tubos o matraces); en ningún caso la altura del líquido en el recipiente debe
exceder un tercio del volumen total de este. Si es un medio sólido, habitualmente se procede a
fundir el agar en un baño María antes de esterilizarlo.
Finalizada la esterilización en el autoclave:
Los medios líquidos se dejan enfriar a temperatura ambiente.
Los medios sólidos contenidos en tubos deben inclinarse para solidificarse, adoptando
la forma de agar inclinado (pico de flauta o slant). Las placas de Petri se preparan vertiendo el medio aun fundido y estéril dentro de
ellas en un ambiente aséptico (p.ej., en la proximidad de la llama de un mechero
Bunsen).
Caldos y medios sólidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperaturaambiente. No obstante, para reducir su deshidratación es mejor conservarlo a 4 ºC,
en posición invertida y envueltas en bolsas de plástico microporoso.
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3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 23232323
Fig. 3.1
Caducidad. Los medios de cultivo preparados y almacenados adecuadamente, tienen por
regla general, las siguientes caducidades:
Placa Petri: 2,5 meses
Tubos: 6 meses
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PRACTICA 3.1 IDENTIFICACIÓN DE NUTRIENTES:
A) RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO.Los glúcidos (Hidratos de carbono) se clasifican en tres grupos:
Monosacáridos: Glucosa, Fructosa, Galactosa.
Disacáridos: Maltosa, Sacarosa, Lactosa.Polisacáridos: Almidón, Celulosa
Monosacáridos. Identificación con Reactivo de Fehling.
El reactivo de Fehling está formado por dos soluciones:
A) solución sulfato de cobre y
B) solución de NaOH y tartrato de sodio y potasio
Al mezclar las dos disoluciones se forma hidróxido de cobre (II) de color azul intenso e
insoluble, que no precipita sin embargo ya que forma un ion complejo con la sal orgánica.
Al adicionar el licor de Fehling a un compuesto reductor (glucosa) el Cu2+
pasa a Cu+, que en
medio básico da un precipitado de color pardo-rojizo.Polisacáridos. Identificación con Lugol (reactivo específico para almidón). El Lugol es una
solución que da una coloración azul violeta específica con el almidón.
Procedimiento: Marcar cada par de tubos como "A - B".
2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de glucosa
2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de fructosa
tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de maltosa
2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de sacarosa
2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de lactosa
2 tubos de ensayo con 5 ml. cada uno de disolución de almidón
Añadir a los tubos "B" 2 ml de reactivo de Fehling (recién preparado).
Observar resultados a los 2 min. y cada 5 min.durante la ½ hora siguiente
Añadir a los tubos "A" unas gotas de disolución de Lugol. Agitar.
Observar los cambios producidos y anotar los resultados.
Hidrólisis del almidónLa enzima amilasa, presente en la saliva, actúa sobre el polisacárido almidón,
hidrolizando el enlace O-glicosídico, que se transforma en glucosa.
Procedimiento:Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo numerados del 1 al 4.
Añadir en cada tubo 5 ml. de una solución diluida de almidón.A los tubos 3 y 4 añadir una pequeña cantidad de saliva (aprox. 1 ml.).
Colocar los tubos 3 y 4 al baño maría ( aprox. a 37 ºC) durante 15 min.
Realizar la prueba de Fehling sobre los tubos 1 y 3
Realizar la prueba del Lugol sobre los tubos 2 y 4.
Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones
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Hidrólisis de la sacarosaEl ácido clorhídrico permite romper el enlace o-glicosídico. La hidrólisis de la
sacarosa descompone el disacárido en los dos monosacáridos glucosa y fructosa.
Procedimiento:Poner en dos tubos de ensayo numerados 5 ml. de solución de sacarosa
Añadir 10 gotas de HCl 10% en el tubo nº 1. Calentar suavemente a la llama delmechero durante un par de minutos. Dejar enfriar.
Realizar la Prueba de Fehling en ambos tubos calentandolos 5 min. al baño maría.
Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones
B) RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS.
Identificación con Sudán III ( colorante específico para grasas, que se manifiesta en la
aparición de un color naranja caraterístico).
Procedimiento: Numerar 10 tubos de ensayo
Añadir 2 ml de agua en los tubo nº 1-2Añadir 2 ml de disolución de glucosa en el tubo nº 3-4
Añadir 2 ml de aceites diversos en los tubos nº 5-6, 7-8, 9-10.
Añadir 5 gotas de Sudan III en cada uno de los tubos impares. Observar la coloración.
Añadir 5 gotas de tinta roja en cada uno de los tubos pares. Observar la coloración.
Añadir 1 ml. de agua a los tubos de aceite, agitar fuertemente y dejar reposar.
Observar carácter hidrófilo/lipófilo del Sudán III.
Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones.
C) RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS.
Prueba del biuret .Reactivo específico para proteínas. Al mezclar una proteína con un álcali
concentrado y algunas gotas de sulfato de cobre(II) diluido se produce un color violeta-
rosáceo, debido al grupo - CO·NH- (enlace peptídico).
Prueba xantoproteica. Las proteínas tienen en su estructura aminoácidos aromáticos que
tratados con HNO3, dan un compuesto de color amarillo (compuestos aromáticos
nitrados) que al añadir un álcali da color anaranjado oscuro.
Procedimiento:Numerar 4 tubos de ensayo y añadir:
Tubo nº 1, 3 ml. dº al 50% de clara de huevo y 10 gotas de ácido nítrico concentrado.
Agitar para evitar la coagulación de la parte superior.
Tubo nº 2, 3 ml. de disolución de clara de huevo. Añadir reactivo de Biuret: 2 ml.disolución A y 4-5 gotas solución B.
Tubo nº 3, 2 ml de solución de sacarosa y 10 gotas de ácido nítrico concentrado.
Tubo nº 4, 2 ml de solución de sacarosa Añadir reactivo de Biuret: 2 ml. disolución A
y 4-5 gotas solución B.
Calentar al baño maría 5 min. los tubos 1 y 3. Enfriar y alcalinizar el medio con gotas
de NaOH 20 % (controlar el pH con papel indicador).
Observar los resultados y anotarlos en una tabla. Conclusiones
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3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 26262626
Reacción de los aminoácidos azufrados
Se separa mediante un álcali, el azufre presente en los aminoácidos azufrados. El
acetato de plomo precipita el azufre en forma de sulfuro de plomo de color negro.
Procedimiento
Poner en el tubo de ensayo 3 cc. de clara de huevo.Añadir 2 cc. de solución de NaOH 20%.
Añadir 10 gotas de solución de acetato de plomo al 5 %
Calentar el tubo hasta ebullición
Coagulación de proteínas
Colocar en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de clara de huevo.
Añadir 5 gotas de ácido acético y calentar el tubo a la llama del mechero
Observar los resultados
Residuos: Reactivo de Fehling Bidón D Aceite Bidón aceites Lugol Fregadero Proteínas Fregadero
PRÁCTICA 3.2 MODIFICACIÓN DE LAS CONDICIONES DE CRECIMIENTO(Escherichia. coli, Staphylococcus epidermidis, Saccharomyces cerevisiae)
A) Efecto del pH sobre los microorganismos.
a) Preparar caldo TSB (artesano y sin tamponar) a pH1
4, 5, 7, 10. Distribuir y esterilizar:
- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB a pH 4
- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB a pH 5
- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB (comercial) a pH 7
- 3 tubos con 10 ml. caldo TSB a pH 10
- 1 tubo control de TSB sin inocular
Sembrar con asa de Kolle de cada cultivo dispuesto al efecto. Incubar 48 h. a 37 ºC.
(Saccharomyces a 27 ºC). Recoger los datos (claro, algo turbio, turbio, muy turbio) en un
cuadrante. Enumerar las conclusiones que se deriven de los resultados obtenidos.
B) Efecto de la presión osmótica sobre los microorganismos a. Preparar tubos inclinados con 10 ml. de agar TSA(máximo pico de flauta)
3 tubos de TSA
3 tubos de TSA con un 5% de NaCl.
3 tubos de TSA con un 10% de NaCl. 3 tubos de TSA con un 15% de NaCl.
1 tubo control de TSA sin inocular
Esterilizar y sembrar en estría con asa de Kolle un inóculo de cada una de los dos cultivos
puros dispuestos al efecto. Incubar 48 h. a 37 ºC (Saccharomyces a 27 ºC).
Recoger los datos (claro, algo turbio, turbio, muy turbio) en un cuadrante. Enumerar las
conclusiones que se deriven de los resultados obtenidos.
1Para preparar los caldos a pH 4, 5, 10 utilizar disoluciones tampón 4, 5, 10 respectivamente.
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3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 27272727
DILUCIONES
Diluir una solución consiste en disminuir la concentración de soluto de la misma añadiendo
disolvente (diluyente). Es necesario diluir las muestras para obtener concentracionesadecuadas a las técnicas de recuento de microorganismos.
Si tomamos 1 ml de una solución (agua de pozo, carne en agua de peptona, NaOH 5%, etc...)
y le añadimos 4 ml de diluyente (agua destilada, solución Ringer, agua de peptona, ...)
podemos decir que hemos realizado una dilución:
15 (numerador = nº partes solución inicial, denominador = nº partes solución final)
1:4 (partes de solución inicial: partes de diluyente)
al 20 % (partes de solución inicial en 100 partes de solución final.
15 $ 100 = 20%
) diluir la solución 5 veces (nº de veces que aumenta el volumen de la disolución inicial.
Es el inverso del factor de dilución15 )
Diluciones.
Se cumple en diluciones sucesivas que: c2 = c1 ·1d1
1d2
$ $ $ siendo:
c2 = concentración final de la disolución
c1 = concentración inicial de la disolución1d = factores de dilución
Preparación de diluciones.
Para preparar una dilución1d por cada unidad de volumen de solución inicial añadiremos (d-
1) unidades de volumen de diluyente. Ej. Para hacer una dilución 1/5 de una solución inicial,
deberemos añadir a cada ml de soluto 4 ml de diluyente
Diluciones decimales
1/10 (10-1
) ----> 1 ml de solución inicial/10 ml disolución final.
Para diluciones decimales añadiremos 1 ml de soluto a 9 ml de diluyente (factor de dilución
1/10).
Banco de diluciones
Es la preparación de una serie de diluciones de una determinada sustancia a partir de una
solución madre o solución inicial. Las sucesivas diluciones tienen una concentración cada
vez menor.
5/11/2018 3. Materiales Diluyentes Medios de Cultivo - slidepdf.com
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3 - MATERIALES, DILUYENTES, MEDIOS DE CULTIVO 28282828
Problema nº 1: Explicar qué volúmenes de diluyente se necesitarían para preparar las
siguientes diluciones (se parte de 10 ml. de disolución inicial).
Diluir una solución 1/4 Diluir al 5%
Diluir una solución 1:4 Diluir una solución 10 veces
Problema nº 2: Calcular la concentración de una dilución obtenida a partir de una solución inicial al 10 % y que se ha diluido al 1/10.
Problema nº3: Calcular la concentración de una dilución obtenida a partir de una solución inicial de glucosa 5 g/l y que se ha diluido primero al 1/10 y la solución obtenida se vuelve a
diluir al 1/5. ¿Cuál será el fáctor de dilución total?
Problema nº 4: Cuántos ml de agua destilada hemos de añadir a 1 ml de una solución inicial
para hacer una dilución decimal (1/10). Y para una dilución decimal de 10 ml .
Problema nº 5: Si tenemos 0,3 ml de una solución salina al 5% y añadimos 4,7 ml de agua
destilada, que concentración tendrá la solución resultante.
Problema nº 6. Partiendo de una solución madre de NaCl de concentración 9 g NaCl/l,
efectuar un banco de diluciones con 3 tubos que contiene cada uno de ellos 8 ml de agua
destilada y siendo los sucesivos factores de dilución 1/5. Describe como realizarías la
operación y cuál sería la concentración final en g/l, y el factor de dilución total.
Problema nº 7: Expresar de otra forma las siguientes diluciones:
diluir n veces % 1/d 1:x
50%
1/10
1:1
25%
1/5
diluir 4 veces