32246177-PENANDA-GENETIKA

5/13/2018 32246177-PENANDA-GENETIKA - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/32246177-penanda-genetika 1/48



PENGERTIAN

Merupakan karakter/senyawa/DNA yangdapat menjadi penanda suatu karakter

lain yang dicari

Kedua karakter tersebut selalu muncul

bersama-sama

Secara genetik dikendalikan oleh gen-

gen yang letaknya berdekatan / linkage

sehingga jika terjadi segregasi selalubersama-sama



KEGUNAAN

Karakter penanda memudahkan untuk

menentukan ada tidaknya karakter yang

dicari

Jika ingin mengetahui keragaman

genetika : cukup dengan mengamati

markernya

Tidak harus mengetahui gen yangmengendalikan karakter yang dicari

tidak perlu melakukan sequencing DNA



MACAM penanda genetika



A. PENANDA MORFOLOGI / VISUAL MARKERS

Misalnya : padi dengan ligula membulatselalu rasanya enak

Karakter ligula membulat dapat menjadi

penanda genetik dari karakter rasa enak Gen A : karakter ligula membulat

Gen B : rasa enak

Gena A dan B letaknya berdekatan, jikaterjadi pindah silang atau segregasiselalu bersama-sama



kelebihan dan kekurangan

kelebihan kekurangan

Mudah diamati Hanya dapat diamati

pada umur dan organtertentu

Murah dalam

penentuan

Keragaman kecil

Tidak stabil



Kriteria

Karakter penanda harus berbeda di

antara 2 induk

Karakter penanda harus diturunkan

secara nyata kepada turunannya

Harus merupakan karakter kualitatif dan

bukan kuantitatif



macam



B. PENANDA BIOKIMIA

Menggunakan isozim (enzim yang

aktivitas / substratnya sama, tetapi

mempunyai bentuk molekul yang

berbeda)

Isozim X1, X2 dst dikendalikan oleh gen

yang linkage dengan gen dari karakter

yang diamati



Isozim adalah bentuk molekuler enzimyang berbeda, tetapi mempunyai fungsiyang sama,

Isozim dibentuk oleh gen-gen yangterdapat pada lokus yang berbeda, ataupada lokus yang sama namun alel

berbeda Isozim merupakan produk langsung dari

gen, sedangkan gen tidak dipengaruhilingkungan.

Oleh karena itu isozim dapat merupakanpenanda keragaman tanaman yang cukupmeyakinkan



Perbedaan struktur protein diakibatkanoleh jenis dan urutan asam aminopenyusunnya, dan hal ini ditentukan oleh

jenis dan susunan basa nitrogen dalamDNA

Perbedaan susunan basa nitrogendianggap sebagai sifat biokimia yang

meyakinkan untuk membedakanorganisme karena susunan basa nitrogendalam DNA secara kualitatif tidakdipengaruhi oleh lingkungan



Karena perbedaan DNA dalam suatu

organisme dapat dipelajari melalui perbedaanstruktur protein atau enzim maka isozim

merupakan penanda keragaman tanaman

yang terpercaya

Setiap pita isozim biasanya :

a. diatur oleh gen tunggal

b. bersifat kodominan dalam pewarisannya,



Pemisahan molekuler isozim didasarkan

atas perbedaan ukuran, bentuk atau struktur

sekunder, berat molekul dan muatan

listriknya

Pemisahan tersebut dapat dilakukan dengan

teknik elektroforesis, yaitu prosespemisahan molekul protein pada bidang

atau medium yang dialiri arus listrik,

sehingga molekul protein akan bergerak

melalui gel, kertas atau selulosa sebagai

akibat adanya perbedaan gradien listrik



Metode ini akan memisahkan

polipeptida yang berbeda dari setiap

protein (enzim) ke dalam pola pita yang

dapat dilihat melalui pewarnaan

Kecepatan gerak / mengalir pada gel

bergantung pada BM

Perbedaan kecepatan gerakmengakibatkan pola pita yang berbeda

atau POLIMORFISME



JENIS ISOZIM

Jenis isozim yang dapat dipakai untuk

penanda genetik cukup banyak

jumlahnya.

Pada populasi kelapa, enzim PER

(peroksidase), EST (esterase) dan GOT

(glutamat oksaloasetat transferase)

menunjukkan pola pita yang beragam



Pola pita PER, EST dan ACP (acid

phosphatase) menunjukkan keragaman

pada 12 kultivar salak di Madura

Pada beberapa klon tebu terdapat

keragaman pola pita PER, GOT dan

ENP (endopeptidase); pola pita ENP

kemungkinan dapat menjadi ciri klontebu yang tahan kekeringan



kekurangan dan kelebihan

kelebihan kekuranganMempunyai keragaman yang lebih

besar dibanding penanda

morfologi

Lebih sulit dan lebih mahal

dibanding penanda morfologi

Lebih stabil dibanding penanda

morfologi

Dihasilkan oleh gen indusibel

Dihasilkan oleh organ tertentu



proses analisis isozim

Pembuatan gel poliacrylamide

Ekstraksi enzim dari organ spesifik

Pemusingan

Pengambilan supernatan

proses elektroforesis

Pewarnaan gel Fiksasi gel

Pengeringan gel



pembuatan gel

Polyacrylamide gel terdiri dari dua bagian :

a. running gel yang terletak di bagian bawah

b. spacer gel yang terletak di bagian atas

polyacrylamide gel lebih kuat jika dibandingkandengan gel pati atau agarose,

Tetapi proses pembuatan polyacrylamide gel lebih berbahaya karena menggunakan monomer

acrylamide yang sangat beracun (neurotoxin) S ample comb (sisir) yang dapat mencetak 20

sumur dipasang di dalam spacer gel.



ekstraksi enzim

Ekstraksi enzim dilakukan dengan

menggerus organ menggunakan

mortar dan pestle yang telah

didinginkan, kemudian ditambahdengan ekstraks buffer sebanyak 1

ml



pemusingan dan pengambilan supernatan

Hasil penggerusan dimasukkan ke dalamtabung ependorf

dipusingkan di dalam refrigerated centrifuge dengan kecepatan 15.000 rpm,pada suhu 0 rC selama 20 menit.

Supernatant yang dihasilkan dihisapdengan syringe dan disimpan dalamfreezer

Sampel yang telah siap dianalisisbersama-sama menggunakan teknikelektroforesis.



elektroforesis

Supernatant dari sampel dimasukkan kedalam sumur gel

Larutan r unning buffer dituangkan kebagian dalam bak elektroforesis di antaraplat kaca yang berhadapan sampai bagiankaca yang bertakik terendam.

Penutup bak elektroforesis dipasang dan power supply 100 mA dihidupkan.

Proses ini dihentikan bila bromophenol blue bermigrasi sampai kurang lebih 0,5cm dari dasar running gel.



pewarnaan gel

Larutan pewarna bersifat spesifik untuk

setiap jenis isozim

Pewarnaan ini dilakukan dengan

menuangkan larutan pewarna spesifik di

atas polyacrylamide gel yang telah dilepas

dari plat kaca



fiksasi

Setelah pita-pita terbentuk dengan jelas,larutan pewarna segera dibuang,

dibilas dengan aquadestilata,

gel direndam dalam larutan fiksasi.Larutan fiksasi juga spesifik tergantungpada jenis isozim

Gel yang telah difiksasi ditutup supayalarutan fiksasi tidak menguap dankemudian disimpan dalam lemaripendingin selama s 24 jam.



pengeringan gel

bertujuan agar gel dapat disimpan.

dilakukan dengan meletakkan gel diantara2 (dua) lembar kertas kaca yang telahdibasahi dengan air yang dibentangkan di

atas lempeng kaca. Gelembung air di atas gel dihilangkan

dengan bantuan penyapu gelembungsampai bersih.

Kertas kaca dijepitkan pada lempeng kacadengan menggunakan klip penjepitsecukupnya agar kertas kaca tidakmengkerut dan kemudian ditiriskan selamas 24 jam pada suhu kamar.



pengamatan

Pengamatan dilakukan pada seluruhnomor tanaman.

Dilakukan interpretasi pita-pita isozim

menjadi alel dan lokus Berdasarkan hal tsb. dapat dihitung

parameter-parameter berikut:

1. Variasi pola pita isozim pada setiap kultivar

2. Jumlah lokus dan alel setiap macamisozim pada setiap individu

3. Frekuensi alel.



C. PENANDA DNA / DNA MARKER

Merupakan sekuens DNA yang terletak

berdekatan dengan gen penyandi

karakter tertentu

Pada pindah silang selalu bersama-

sama, sering tidak berasosiasi dengan

karakter yang ditandai



aplikasi marka DNA

Mengukur perbedaan / jarak genetik

Mengukur hubungan kekerabatan

Menganalisis pola pewarisan sifat Menganalisis pola aliran gen dalam

populasi

Seleksi karakter

fingerprinting suatu individu organisme



kelebihan dan kekurangan

kelebihan kekurangan

Peluang mendapatkan sekuens

ini lebih besar dari pada isozim

dan morfologi

sulit dilakukan

Dapat diamati pada semua

organ dan semua umur

Mahal

Sangat stabil

Keragaman sangat besar



PENANDA

DNA

PCR-based

RAPD

SSR

Hybridization-based

RFLP

Mix

AFLP



RFLP : Restriction Fragmen Length

Polymorphism

RAPD : Random Amplified Polymorphic

DNA

AFLP : Amplified Fragmen Length

Polymorphsm

SSR : Simple Sequence Repeat



TUJUAN

Menemukan polimorfisme dalam

sekuens / fragmen DNA yang terpaut

dekat dengan suatu gen yang

mengendalikan suatu sifat

Polimorfisme terjadi karena adanya

variasi urutan dan atau jumlah

nukleotida DNA akibat mutasi, delesi,insersi



RAPD RFLP AFLP

dasar Amplifikasi/

PCR

Hibridisasi asam

nukleat

Amplifikasi

PCR

band Hasil

amplifikasi DNA

Hasil hibridisasi

DNA + probe

Hasil

amplifikasi

DNA

Yang dibutuhkan Primer, d-NTP Probe, enzim

restriksi

Primer, d-NTP

Prinsip Amplifikasi

DNA dengan

primer random

Restriksi

endonuklease

Restriski

endonuklease

, primer

selektif,

adaptor

Tipe polimorfisme Perubahan

basa

Perubahan basa

N

Perubahan

basa

Sifat dominan Kodominan Umumnya

dominan



prosesRAPD RFLP AFLP

Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA

PCR Restriksi dengan

enzim

Restriksi dengan enzim

Gel elektroforesis Gel elektroforesisi Penambahan adapter

pada fragmen ds dan

nukleotida selektif

Visualisasi produk

amplifikasi

Southern transfer PCR

Hibridisasi dengan

probe

Gel elektroforesis

Gel elektroforesis Visualisasi produk

amplifikasi

Visualisasi produk

amplifikasi



PRIMER / PELACAK

1. Primer random (10 nt

DNA yang mempunyai sekuens-sekuens

yang sama dengan primer dengan

arah/orientasi yang berlawanan dan jarak 2

sekuens tersebut < 3 kb dapat diamplifikasi

ACGCTCACAC -----------------CACACTCGCA

3kb

TGCGAGTGTG ----------------GTGTGAGCGT



Sekuensi primer bersifat acak, tidak

harus dengan urutan tertentu

Ratio GC/AT lebih dari 50%

Semakin pendek primer yang

digunakan, semakin banyak ukuran

potongan DNA hasil amplifikasi PCR



2. primer spesifik

Primer yang komplemen dengan

sekuens pengapit mikrosatelit

Dalam genom terdapat mikrosatelit /

sekuens berulang, yi unit ulangan dari 2-

3 basa N, diulang sampai beberapa

puluh kali, tersebar di seluruh genom

dan diapit oleh nukleotida tertentu P1 ---CACACACACACACACACACACACA ----- P2



MARKA MOLEKULER

Dapat membedakan individuhomozigot dominan danheterozigot

Penting untuk genotyping

KODOMINAN

Hanya dapat menunjukkanadanya suatu lokus,

Tidak dapat membedakan

genotipe homozigotdomainan dan heterozigot

Dapat digunakan untukpenentuan jarak genetik

DOMINAN



Dominan kodominan

Hasil Ada pita , atau

Tidak ada pita

Ada pita ± pita dengan

pola yang beda

Ada pita Jika ada sekuens

pada 2 posisi yangberlawanan arah,

dikenali oleh primer

Sejumlah sekuens

dapat dikenali oleh 1primer/enzim spesifik,

sehingga panjang

produk amplifiaksi

beda, pita beda

Tidak ada pita Karena mutasi,

sekuens yang semuladikenali primer

berubah, menjadi

tidak dikenali



kodominan

P1 (AA) P2 (aa) F1 X1 X2 X3



dominan

P1 (AA) P2 (aa) F1 (Aa) X1 X2 X3



RAPD, marka DNA berbasis PCR

Paling murah (tidak memerlukan enzim

restriksi, adapter dll

Paling mudah

Memerlukan DNA relatif sedikit (5 ± 25

ng)

Derajad polimorfisme tinggi

Menggunakan primer random



prosedur RAPD

ISOLASI DNA

DENATURASI DAN AMPLIFIKASI DNA

DENGAN PCR

GEL ELEKTROFORESIS

VISUALISASI PRODUK AMPLIFIKASI



1. isolasi DNA

Memecah dinding sel menggunakan dry-ice atau nitrogen

cair dengan blender / cawan porselin.

Merusak membran sel menggunakan detergen (CTAB :

cetyl trimetyl amonium bromide, atau SDS : sodium dodecyl

sulfat) DNA dicampur dengan larutan bufer, dan dilindungi dari

aktivitas nuklease endogen dengan menambahkan EDTA

(etylen diamine tetraacetic acid)

Campuran tersebut diemulsikan dengan kloroform / fenolagar protein terdenaturasi dan terpisah dari DNA



2. AMPLIFIKASI dengan PCR

polymerase chain reaction

Menggunakan primer (fragmen DNA ) yang telah

diketahui sekuensnya

Primer menempel pada utas tunggal DNA padabagian yang komplementer

Secara statistik setiap 1 juta bp dapat ditemukan

sekuens yang komplementer dengan primer

Banyaknya basa di antara dua tempat

menempelnya primer menentukan diamplifikasi

tidaknya suatu DNA : 5000 bp



PCR

Memperbanyak fragmen DNA tanpa

melibatkan MH

Dilakukan dalam sejumlah siklus

Dalam setiap siklus terjadi :

1. Denaturasi DNA

2. Annealing (penempelan) primer pada

setiap utas benang DNA

3. Extension (pemanjangan) DNA baru di

sebelah primer



Produk DNA dari siklus pertama menjadi

cetakan baru sehingga pada siklus

kedua terdapat 4 cetakan

Dst terjadi dengan deret ukur



Documents

32246177-PENANDA-GENETIKA