1

Хайдуков С.В.

Многоцветныйцитометрический анализ для

идентификации малыхпопуляций лимфоцитовпериферической крови

условно здоровых доноров.

Кудрявцев И.В., к.б.н., Хайдуков С.В., д.б.н.

Хайдуков С.В.

Иммуннаясистема

АнтителаАГ

Иммунная система

Клеточный иммунитетГуморальный иммунитет

Стволовые клетки

B клетка предшественник

Т клетка предшественник

Зрелая T-клетка

Зрелая В-клетка

АГ

Макрофаг

Представление АГ

Интерлейкины

Интерлейкины

T хелперT регуляторныйT цитотоксический

B-клетки памяти

Плазматическая клетка

Активация B-клеток

Стимуляция Т клетокЛимфокины

Супрессия Супрессия

Стимуляция

АГ-зависимый

Т-клетки памяти

2

Хайдуков С.В.

Анализ лимфоцитовпериферической крови

Эозинофил

Лимфоцит

Моноцит

Нейтрофил

Тромбоциты

Базофил

Эритроцит

Хайдуков С.В.

Околосуточные ритмыФизический или физиологический стрессВывод: взятие крови проводить утром инатощакХранение образцаПодготовка образца т.е. при выделениеклеток на FICOLL возможны потери

Проблемы при иммунофенотипировании

3

Хайдуков С.В.

АнтикоагулянтWBC/ Дифференциальный счет K3EDTA, 1,5 +/-

0,15 мг/мл кровиИммунофенотипирование K3EDTA, Heparin

Анализ образцаWBC/Дифференциальный счет < 20 ч

Иммунофенотипирование < 30 ч

ВзятиеВзятие кровикрови длядля анализаанализа

Хайдуков С.В.

Хранение образца

Комнатная температура (18-22°C)> 37°C разрушение клеток< 22°C снижение T хелперов

Проверьте качество образцаТемпература? Гемолиз? Агрегация?

4

Хайдуков С.В.

Готовые для анализа 3-, 4- или 5-цветныенаборы антител

Панель реагентов только от одногопоставщика

Эпитопная специфичностьСоотношение белок/флуорохромПостоянная концентрация белкаОптимальная концентрация (соотношение сигнал/шум)

Подготовка образца дляанализа

Хайдуков С.В.

WBC - Автоматический дифференциальный счетМетод цельной крови/без отмывкиПрямая иммунофлуоресценция3, 4 или 5-цветный анализ10.000 - 30.000 клетокВключение контроля качества

Проверка воспроизводимостиПроверка чистоты анализаПроверка контрольных сумм

Подготовка образца и анализ

5

Хайдуков С.В.

Абсолютный счет - проблемы

Изменчивость WBC счета 2-17 %%

Изменчивость счета лимфоцитовАвтоматическое определение 2-5 %%Ручное определение 12-27 % %

⇒ Решение – абсолютный счет сиспользованием проточной цитометрии водноплатформенной системе

Хайдуков С.В.

Необходимо для стандартизациианализа иммунофенотипа пациента.

Стандартная настройка проточногоцитометра и протоколов анализа.

Стандартный набор анализируемыхмаркеров (допускается расширение панелимоноклональных антител для более полнойхарактеристики исследуемого образца).

Стандартный анализ с использованиемконтроля качества и контрольных сумм.

6

Хайдуков С.В.

Алгоритм оптимизации настройкипроточных цитометров и протоколованализа для стандартизации метода..

FL1FL1FL

2FL

2

1. Оптимизация установки дискриминатор: Оптимальное значениедискриминатора.2. Оптимизация установки и настройка каналов светорассеяния:Оптимальное размещение на гистограмме всех основных популяцийлейкоцитов периферической крови.3. Оптимизация установки и настройки каналов флуоресценции: Оптимальное напряжения на фотоэлектронных умножителях (негативныеклетки должны находиться в первой декаде гистограммы)4. Оптимизация установки и настройка компенсаций междуканалами флуоресценции: Первое и второе правило компенсации. . Взаимосвязь между усилением напряжения на ФЭУ и компенсацией. Взаимосвязь между плотностью экспрессии маркеров и компенсацией.

Хайдуков С.В.

Второе логическоеограничение В

Алгоритм выбора зоны анализа лимфоцитов прииспользовании логических ограничений по CD45 и

морфологическим параметрам.Последовательное внесение логических ограничений в

морфологическую гистограмму I.Выделение зоны

лимфоцитов по CD45

Анализ клеток одновременнопопадающих в зоны А и В

Лимфоциты CD45bright

дуплеты

разрушенныеклетки

Первое логическоеограничение А

7

Хайдуков С.В.

FITC PE ECD (или APC) PC5 (или PerCP)

1. IgG IgG IgG CD45изотипический контроль

2. CD19 CD5 CD27 CD45В1, В2, В-клетки памяти

3. CD16 CD56 CD3 CD45T-NK-клетки и субпопуляции NK-клеток

4. CD8 CD4 CD3 CD45субпопуляции Т-клеток

5. CD4 CD25 HLA-DR CD45активированные Т хелперы

7. CD45RA CD45RO CD4 CD45наивные и активированные Т хелперы, Т-клетки памяти

8. TcR-αβ TcR-γδ CD3 CD45αβ- и γδ-Т-клетки

9. CD4 CD25 CD127 CD45регуляторные Т-клетки

Четырехцветная панель моноклональныхантител для определения иммунного статуса

Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Российский Иммунологический Журнал, 2007, 1(10), 3-4, С. 20–30.Хайдуков С.В., и др. Российский Иммунологический Журнал, 2008, 2(11), 1, С. 20–30.Хайдуков С.В., и др. Медицинская иммунология, 2008, 10(2-3), C. 113-121Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2009 Т. 11, № 2-3, стр. 227-238

Хайдуков С.В.

В-клетки

Аутореактивныйклон В клеток

CD20 может экспрессироваться внизкой плотности на Т клетках(Leandro MJ, at al., Arthritis Rheum. 2006 Sep;54(2):3062-3; Katopodis O, at al., Br J Haematol. 2003 Feb;120(3):478-81; )

CD5 на Т клетках

В-клетки

8

Хайдуков С.В.

Анализ В-клетокВ-2 (CD19+CD5-)

CD19/CD5/CD27/CD45

В-клетки памяти(CD19+CD27+CD5-)

В-1 – аутореактивныйклон (CD19+CD5+)

Хайдуков С.В.

Наивные В-клетки

≥80%

60%

СиндромШегрена

Системнаякраснаяволчанка

Норма

Плотность экспрессии CD27

В-клеткипамяти

В-клетки памяти

Анализ В-клеток - В-клетки памятиCD19/CD5/CD27/CD45

9

Хайдуков С.В.

CD19/CD5/CD27/CD45

Анализ В-клеток – B-1

Пример: Аутоиммунный тиреоидит

До терапии В процессе терапии Норма

В-1 клетки (CD19+CD5+)

Хайдуков С.В.

++++++++++++++

+++++++++++++

+?

1.Системная красная волчанка (СКВ)2.Синдром Шегрена3.Ревматоидный артрит4.Инсулин-зависимый диабет5.Аутоиммунный тиреоидит6.Миастения7.Неспецифический язвенный колит8.Аутоиммунные поражения при инфекционныхзаболеваниях (хламидиоз, синдром Рейтера, бруцеллез и др.)9.Другие заболевания, имеющие в своей основеаутоиммунные механизмы

Повышениеотносительного

уровня В1 клеток

Заболевание

Заболевания, при которых определениеотносительного уровня В-1 клетокявляется диагностически значимым.

10

Хайдуков С.В.

Анализ по зоне CD45T-NK клетки

NK-клетки

Анализ NK-клеток

1 - CD16dim-to-negCD56bright - секретируют IFN-γ и другие цитокины, имеют меньшую цитолитическую активность.

2 - CD16brightCD56dim - слабо секретируют цитокины, но обладаютвысокой цитолитической активностью.

CD16/CD56/CD3/CD45

Хайдуков С.В.

АктивированныеNK клеткиАктивированныецитотоксическиеТ клеткиПокоящиеся CD8 позитивные Тклетки

CD8/CD38/CD3/CD45

CD16+CD56+CD8dim

CD16+CD56+CD8-

CD16-CD56-CD8bright

11

Хайдуков С.В.

NK-клетки Анализ по зоне B

Анализ по зоне D

CD8/CD38/CD3/CD45

Анализ по зоне С

Хайдуков С.В.

Постоянно низкие активность и количество NK-клетокАссоциированные симптомы и рискиПатологическое состояние

Высокий риск возникновения онкологии идостаточно частые инфекционные заболевания.Повышенный риск образования лимфом.Увеличенная восприимчивость к вирусным

инфекциям.Распространение метастазов.Вероятность появления злокачественного обра-

зования выше нормального.Предшествует рецидиву.Повышенная чувствительность к вирусу Эпштейна-

Бар.Неблагоприятный прогноз.Неблагоприятный прогноз.Более высокая вероятность рецидива.Более высокая частота, серьезность и продолжи-

тельность заболевания.Более высокая частота, серьезность, и продол-

жительность заболевания.Возможно более активное течение болезни, уве-

личенная частота инфекций.

Усталость, сниженная восприимчивость, лихорадка.Повышенная утомляемость, апатичность,

увеличенная частота вирусных заболеваний.Более серьезные признаки.Неспособность справляться с ежедневными

проблемами, усталость .

Приобретенный или врожденныйиммунодефицит включая СПИД.Синдром Чедиака-Хигасси.Дефицит CD11/CD18 молекул

семейства клеточной адгезии.Онкологические заболеванияОнкологические заболевания

связанные с наследственностью.Лейкемия.Х-связанный лимфопролифератив-

ный синдром.Рак молочной железы (при диагнозе).Рак шеи и головы (до терапии).Терапия цитостатиками.Вирусная инфекция (цитомегало-

вирус, Эпштейна-Бар, герпес).Другие вирусные и бактериальные

инфекции.Аутоиммунные заболевания.

Психические расстройстваСиндром дефицита NK-клеток.

Синдром хронической усталости.

Депрессия.Хронический стресс.

По Whiteside et al., 1994

12

Хайдуков С.В.

Ассоциированные симптомы ирискиПатологическое состояние

LGL-лимфоцитоз, цитопения, спленомегалия

Встречается совместно с активнойлейкемией/лимфомой

Лимфопролиферация NK-клеток

Хроническая пролиферация большихгранулярных лимфоцитов (LGL-пролиферация

Острая пролиферация большихгранулярных лимфоцитов (LGL-пролиферация

Постоянно высокие активность иколичество NK-клеток

По Whiteside et al., 1994

Хайдуков С.В.

Т-клетки хелперы

Цитотоксические Т-клетки

CD4+CD8+ Т-клетки(вышедшие из тимусанедифференцированныеТ-клетки)

Анализ Т-клеток

Экспрессия CD8 на NK-клетках

CD8/CD4/CD3/CD45

13

Хайдуков С.В.

Т-клетки памяти. активированные Т-клетки, Treg и T17

Наивные Т клетки

CD45RA/CD45RO/CD4/CD45

Анализ Т-клеток

Хайдуков С.В.

CD45RA/CD45RO/CD4/CD45

Анализ по CD4+ и CD45+Анализ только по CD45+

Анализ Т-клеток

14

Хайдуков С.В.

?

CD8/CD4/CD3/CD45

Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2008, 10(2-3), C. 113-121

Анализ Т-клеток

Хайдуков С.В.

TcR-αβ/TcR-γδ/CD3/CD45

Анализ Т-клеток

CD3+CD8brightTcR-αβ+ Т-клетки

CD3highCD8dimTcR-γδ+ Т-клетки

15

Хайдуков С.В.

Вирусные инфекции:ВИЧЦитомегаловирусВирус Эпштейн-БараБактериальные инфекции:Туберкулез легкихMycobacteriumЛегионеллез LegionellaТуляримия Francisella tularensisСальмонеллез SalmonellaБоррелиоз (болезнь Лайма) BorelliaАтопический дерматит (у детей)Болезнь КронаБолезнь БехчетаПервичные иммунодефицитыАтопический дерматит (у взрослых)Возрастное снижение относительногоуровня γδ-T-клеток

Повышение относительногоуровня γδ-T-клеток

Понижение относительногоуровня γδ-T-клеток

ЗаболеваниеИзменение относительногоколичества γδ-T-клеток

Изменения относительного количества γδ-T-клеток приразличных заболеваниях и патологиях.

Хайдуков С.В.

Активированные Т-клетки(ранняя активация)

Активированные Т-клетки(поздняя активация)

Анализ активированных T-клеток

16

Хайдуков С.В.

Анализ активированных Tхелперов и цитотоксических

T-клеток

Поздняяактивация

Анализ по зоне B

Активированные

Ранняяактивация

Регуляторные Т-клетки

CD4/CD25/HLA-DR/CD45

Хайдуков С.В.

РегуляторныеТ-клетки

Анализ по зоне CD3+CD4+

Анализ по зоне CD3+CD4+Анализ по зонелимфоцитов

Анализ регуляторных Т-клетокCD4/CD25/CD127/CD45

Идентификация Treg - CD3+CD4+CD25brightCD127neg

17

Хайдуков С.В.

Инверсия соотношения T4/T8 - интерпретация

Острая вирусная инфекцияХроническая вирусная инфекцияГематологические нарушенияПервичные иммунодефицитыАутоиммунные заболеванияСолидные опухоли

Хайдуков С.В.

Интервалы распределения фенотипов лимфоцитовусловно здоровых доноров (n = 362)

Тип клеток % ПК Абс.к-во кл/лЛимфоциты (CD45bright) 28 - 36 1,363-2,808 х 109

В-клетки (CD3-CD19+HLA-DR+) 7 - 17 0,111-0,376 х 109

В-1 клетки (CD19+CD5+) 0,5 - 2,1 0,022-0,115 х 109

В-2 клетки (CD19+CD5-) 6,5 - 14,9 0,081-0,323 х 109

В клетки памяти (CD19+CD5-CD27+) 1,8 - 6,8 0,012-0,040 х 109

NK (LGL) (CD3-CD16+CD56+CD8+) 8 - 17 0,123-0,369 х 109

NK цитолитические (от общих NK-клеток) 2,5 - 6,2 0,003 - 0,022 х 109

NK цитокин-продуцирующие (от общих NK-клеток) 93,7 - 97,5 0,081-0,323 х 109

Т-клетки (CD3+CD19-) 61 - 85 0,946-2,079 х 109

Т хелперы (CD3+CD4+) 35 - 55 0,576-1,336 х 109

Т цитотоксические (CD3+CD8+) 19 - 35 0,372-0,974 х 109

Т хелперы активированные/памяти (CD4+CD45R0+) 5 - 25 0,068-0,702 х 109

Т хелперы наивные (CD4+CD45RА+) 20 - 40 0,272-1,123 х 109

αβ-Т клетки (CD3+αβ-ТсR+γδ-ТcR-) 60,8 - 80,2 0,924-1,964 х 109

γδ-Т клетки (CD3+γδ-ТcR+αβ-ТсR- ) 1,8 - 7,4 0,022-0,115 х 109

Т-NK клетки (CD16+CD56+CD3+) 0,5 - 6 0,007-0,165 х 109

Т клетки актив. (HLA-DR+CD25+) 0,5 - 6 0,007-0,165 х 109

Регуляторные Т-клетки (CD4+CD25brightCD127neg) 0,6 - 3,19 0,009-0,078 х 109

Индекс соотношения (Тх/Тц) 1,5 - 2,6

Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2009, Т. 11, № 2-3, стр. 227-238

18

Хайдуков С.В.

EPICS® XL-MCL

Cytomics® FC500

Хайдуков С.В.

19

Хайдуков С.В.

СПАСИБО ЗАВНИМАНИЕ