4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor

8/18/2019 4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor

1/32

Plasmid, vektor, enzim

restriksi, kloning gen

Dalam bioteknologi, teknik yang digunakan sering

disebut dengan Teknologi DNA rekombinan

Teknologi DNA rekombinan merupakan teknologiuntuk memasukkan fragmen DNA asing ke dalam

suatu jasad hidup (sel mikroba, sel tumbuhan danhewan)


2/32

Teknologi rekombinan DNA memerlukan

bahan dan teknik, sbb.:

. !umber DNA: berasal dari jasad donor (DNA hasil ekstraksi),DNA hasil sintesa (diantaranya dengan tehnik "#$), dan atau%DNA (yg berasal dari m$NA yg diisolasi dari jaringan organ

tertentu)

&. en'im : restriksi endonuklease dan ligase

. ektor : plasmid, *irus dan bakteriofag

+. Teknik pemasukan hibrid DNA serta teknik seleksi keberadaanhibrid di dalam sel inang


3/32

1. Sumber DNA


4/32

1. Sintesa DNA dapat terjadi se%ara alami di dalam tubuh mahluk hidup atau

dilakukan se%ara sintetis (molekul DNA buatan).

Di dalam tubuh mahluk hidup, molekul DNA disintesa melalui proses

replikasi DNA

&. DNA juga bisa dibuat dengan menggunakan tehnik

polymerase %hain rea%tion ("#$). Dengan tehnik ini DNA disintesis se%ara

en'imatik menggunakan mesin thermocycler yang dapat mengubah suhureaksi pemanasan (heating ) dan pendinginan (cooling ) se%ara %epat untuk

memungkinkan terjadinya denaturasi dan renaturasi DNA untuk terjadinya

proses replikasi DNA.

. DNA juga bisa dibuat dengan menggunakan $NA sebagai template.$eaksi en'imatik dengan template $NA dan menggunakan tehnik "#$

menghasilkan DNA yang disebut %omplementary DNA (%DNA)

http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_replicationhttp://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reactionhttp://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reactionhttp://en.wikipedia.org/wiki/DNA_replication


5/32


6/32

2. ENZYE


7/32

T!"e ## restri$tion

endonu$lease%#lea*es DNA at a spe%ifi% base

seuen%e

DNA ligase%

-inds two DNA mole%ules orfragments


8/32

DNA "ol!merase #%

ills single/stranded gaps in duple0

DNA by stepwise addition ofnu%leotides to 1 ends

2remo*es $NA primer

&everse Trans$ri"tase%

3akes a DNA %opy of an $NAmole%ule


9/32

Pol!nu$leotide 'inase%

Adds a phosphate to the 41/56 endof a polynu%leotide, to label it or

permit ligation.

Terminal trans(erase%

Adds homopolymer tails to the 1/

56 ends of a linear duple0


10/32

Alkaline ")os")atase%

$emo*es terminal phosphates

from the 41 end, the 1 end, orboth.


11/32

E*onu$lease ###%

$emo*es nu%leotide residues fromthe 1 ends of a DNA strand

+a$terio")age lamda-e*onu$lease%

$emo*es nu%leotides from the 41

ends of a duple0 to e0pose 1

single/stranded ends


12/32

&estri$tion enz!mes

$estri%tion en'ymes are DNA$uttingenz!mes found in ba%teria (and

har*ested from them for use). -e%ausethey %ut within the mole%ule, they are

often %alled restri$tion endonu$leases.


13/32

$estri%tion en'ymes are en'ymes isolatedfrom ba%teria that re%ogni'e spe%ifi%seuen%es in DNA and then %ut the DNA toprodu%e fragments, %alled restri%tion

fragments. $estri%tion en'ymes play a *eryimportant role in the %onstru%tion ofre%ombinant DNA mole%ules, as is done ingene %loning e0periments. Another

appli%ation of restri%tion en'ymes is to mapthe lo%ations of restri%tion sites in DNA.


14/32


15/32


16/32

-erbagai endonuklease restriksi serta spesifitasnya

3ikrobe 7n'im !isi pemotongan

Bacillus amylotiquefaciens 6 Bam68 9 9AT####TA9 9

Brevibacterium albidium Bal 8 T99 ##A

A## 99T

Escherichia coli $ Eco$8 9 AATT#

#TTAA 9

Haemophillus algyptus Hal 88 "u 9#9# "y

"y #9#9 "u

Haemophillus aegyptius Hae 888 99 ##

## 99

Haemophillus influenzae Hind 88 9T"y "uA#

#A"u "yT9

Haemophillus paraingfluenza Hpa88 ## 99

99 ##


17/32

/. 0ET&


18/32

; ektor adalah replikon yang akan melakukan replikasi DNA didalam sel atau membawa gen asing ke dalam resipien, atau3olekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraanyang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalamsel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresifragmen DNA asing tersebut.

; ektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot :khususnya 7. %oli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid, dan

fasmid.

; ektor A#s dan 7ps dapat digunakan pada khamir.

; ektor yang dapat digunakan pada sel inang eukariot :

"lasmid Ti, ba%ulo*irus, !+<


19/32

!yarat/syarat ektor:

. 6arus mampu melakukan replikasi se%ara mandiridi dalam sel inang (plasmid, bakteriofag seperti faglamda E-coli dan *irus

&. 6arus ada %ara tertentu untuk masuknya *ektorDNA ke dalam sel

. 6arus dapat diketahui dg mudah keberadaanya di

dalam sel

+. 6arus aman untuk digunakan


20/32

"=A!38D3olekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang dapat

melakukan replikasi sendiri."lasmid tersebar luas diantara organisme prokariot dengan

ukuran yang ber*ariasi dari sekitar kb hingga lebih

; !alah satu %ontoh plasmid buatan yang banyak digunakan

dalam kloning gen adalah p-$&&.>rutan basa lengkapnyatelah ditentukan sehingga baik tempat marker maupun

pengenalan restriksinya juga telah diketahui.


21/32


22/32


23/32

!ebagai *ektor kloning, plasmid harus memenuhi

!yarat

. 3empunyai ukuran relatif ke%il bila dibandingkan

dengan pori dinding sel inang sehingga dapatdengan mudah melintasinya,

&. 3empunyai sekurang/kurangnya dua gen markeryang dapat menandai masuk tidaknya plasmid kedalam sel inang,

. 3empunyai tempat pengenalan restriksi sekurang/kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat

digunakan sebagai tempat penyisipan fragmenDNA, dan

+. 3empunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapatmelakukan replikasi di dalam sel


24/32


25/32

$epli%ation of "lasmid


26/32

#loning


27/32

Plasmid Ti Agroba$terium tume(a$iens

; !uatu bakteri, yaitu Agroba%terium tumefa%iens, yangmembawa plasmid berukuran &


28/32


29/32

-akteriofag; Adalah *irus yang sel inangnya berupa bakteri.

;Dengan daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenikbakteriofag dapat digunakan sebagai *ektor %loning pada selinang bakteri

;-akteriofag merupakan *irus kompleks yang menginfeksi bakteri7. %oli.

;DNA yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasilinier untai ganda dengan panjang +@,4 kb.

;3asing/masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal sepanjang& pb yang komplementer satu sama lain sehingga

memungkinkan DNA untuk berubah konformasinya menjadisirkuler.

;Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnya kedua untai tunggalsepanjang & pb tersebut dinamakan kos.


30/32

Trans(er 3en "ada +akteri

Trans(ormasi; "roses perpindahan genetik dimana sel resipien

membutuhkan molekul DNA bebas (DNA yg

berada di luar sel dan sudah dimurnikan).

; Transformasi dapat terjadi se%ara alami atau di

laboratorium.

; "ada prinsipnya transfer sel bakteri akan terjadi

apabila sel resipien mampu menerima DNAasing dari sel donor. ?eadaan ini disebut

kompeten


31/32


32/32

T&ANS4E& 3EN 'E TANAAN

Documents

4. DNA REKOMBINAN (1) Enzim Restriksi, Vektor