Биокинетика

БиокинетикаБиокинетика

Чернышев Андрей ВитальевичЧернышев Андрей Витальевич((лекциилекции))

[email protected]

Некрасов Вячеслав МихайловичНекрасов Вячеслав Михайлович(семинары)(семинары)

[email protected]

р.т.: р.т.: 333-32-40333-32-40

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

Гл. 1. Введение в биокинетику

Установление количественных закономерностей биологических процессов на молекулярном уровне

Химическая кинетика - основа биокинетики

Цель:

Химические реакции

Простые (элементарные) Сложные

Мономолекулярные

Бимолекулярные

Тримолекулярные

Параллельные

Последовательные

Циклические

Смешанные

Каскадные

простые (элементарные) сложные

химические процессы

- механизм реакции(совокупность элементарных стадий )

гомогенные гетерогенные

замкнутые открытые

системы

химическая кинетика - наука о скоростях и механизмах химических превращений

kknn BBBAAA ...... 22112211

стехиометрическим уравнение:

стехиометрические коэффициенты

исходные промежуточные конечные

вещества

Скорость химической реакции

dt

dN

Vdt

dN

Vw ji

B

j

A

i

1111

dt

Bd

dt

Adw

j

j

i

i

11V = const

Элементарная реакция: w = число элементарных актов реакции в единице объема в единицу времени.

Сложная реакция: может быть введено понятие единой скорости процесса, когда концентрации промежуточных веществ пренебрежимо малы

по сравнению с концентрациями реагентов и продуктов реакции (иначе - скорость реакции по конкретному веществу).

Закон действующих масс

n

nAAATkw ...21

21

константа скорости

порядок реакции по n -му реагенту

n ...1полный порядок реакции:

RT

E

Aek

(Аррениус, 1889)

энергия активации

предэкспонент

TR

EAk

1lnln Аррениусовские координаты:

Закон действующих масс с учетом микроскопических состояний

)(...)()()(...)()( 222111222111 kkknnn jBjBjBiAiAiA

nkn

llnnjjjiii

iA

liAiAiAk

dt

dN

Vw

)(...)()(

1121

2121 2211......)(

Влияние pH на скорость химической реакции

...

...

...

2AHHAH

AHHA

A

0AkW эфф

c

b

a

k эф

ф

pH

HpH ln

Q - тепловой эффект реакции

E реагенты

продукты

экзоэргическая

эндоэргическая

эндотермическая

экзотермическая

ClHBrBrvHCl

2v

колебательный уровень:

2v

Метод графов при анализе кинетических схем

Граф – совокупность точек (вершин) и соединяющих их линий (дуг, ветвей, ребер)

dt

XdnXv i

ij

XnaXv iijij часто скорость переноса можно представить в виде:

скорость переноса:

вес ветви

j

jjii

iijj

jii

iji XnaXnavvdt

Xdn

принцип независимости элементарных стадий:

CB

BAk

k

2

1

Bkdt

dC

BkAkdt

dB

Akdt

dA

2

21

1

обратимые реакции

AB

BAk

k

1

1

BkAkdt

dA110 K

k

k

B

A

1

1равновесие:

константа равновесия

Tk

H

k

S

h

Tk

Tk

G

h

Tkk

bb

b

b

b expexpexp

Теория активированного (переходного) комплекса позволяет рассчитать константу скорости:

m

jjj

kn

iii AA

11

Теория активированного (переходного) комплекса

kT

E

n

iA

e

Z

Z

h

kTk

i

0

1

~

~

Статистические суммы:

ядэлколврп ZZZZZZ

2/3

3)3( 2 mkT

hV

Zп

2)1( 21

IkTZвр

2)2( 21

IkTZвр

3

2/32/1)3( 21

kTIIIZ CBA

вр

1

1

1

s

i

kT

h

кол

i

eZ

.. состоснэл gZ

Кинетический эксперимент Теорема Найквиста: максцифр ff 2

Планированиеэксперимента

Проведениеэксперимента

Интерпретациярезультатов

неадекватныеусловия

неадекватныйдиапазон

параметров

неадекватныйдиапазонвремени

неадекватныйметод

недостаточнаячувствительнось

метода

избыточнаячувствительнось

метода

непригодностьметода

недостаточнаяточность

регистрациипараметров

приборнаяошибка

случайнаяошибка

ошибкаметода

неадекватнаямодель

выбор слишкомпростоймодели

модель не отвечает

условиям или данным

эксперимента

выбор слишкомсложноймодели

учет не всехпараметров

арифметическаяошибка

источники ошибок:

Гл. 2.Ферментативный катализ

Схема Михаэлиса-Ментен: PEXSE k

k

k

2

1

1

ферментсубстрат

комплекс

XkkSEkdt

dX)( 211

Xkdt

dPW 2

XEE 0

constS

1exp)( 12110

0202

tKSkkkSkSK

SEkt

SK

SEktP m

mm

SK

SWW

m

m

1

21

k

kkKm

02max EkWWm

константа Михаэлиса максимальная скоростьстационарная скорость

Схема Wm Km

Некоторые кинетические схемы, приводящие к уравнению Михаэлиса

PESX

XSEk

k

2

1

2

1

PEXXSE kk

k

k

32

1

1

21

PEXXSE nkn

k

k

k

12

1

1

...1

011 ESk

032

32 Ekk

kk

1

2

0

1n

i ik

E

2

11

k

Sk

3121

31

kkkk

kk

1

221

1

1n

i ikkk

k

Определение параметров Wm и Km из экспериментальных данных

1) Метод двойных обратных координат

2) Метод Скэтчарда (Иди-Хофсти)

SW

K

WW m

m

m

111

WK

WKS

W

mm

m

11

SK

SWW

m

m

Определение концентрации активных центров:

По содержанию белка(если один активный центр)

Путем необратимого ингибирования

m

PE 0

)( 00 IEkW

1.

2.

Определение имитирующей стадии:

Измерение нестационарной кинетики

Использование субстратов с различной структурой и различной реакционной способностью

1.

2.

Типичные зависимости начальной стационарной скорости реакции от концентрации субстрата

c

b

a

W0

S0

- аллостерическими эффектами

- ингибированием или активацией реакции избытком субстрата

Отклонения от Михаэлевской (а) зависимости могут быть вызваны:

Ингибирование и активация избытком субстрата

PESESSES

PEESSE

катS

катm

kK

kK

2

][][ 2ESkESkdt

dPW каткат

mK

ESES ][

SmS KK

ES

K

SESES

2

2][

][

02 ][][ EESESE

Smm KK

S

K

S

EE

20

1

Smmm KK

S

K

SK

SEES

20

1

][

SmmSm KK

S

K

SKK

ESES

20

2

2

1

][

SmmSm

катSкат

KK

S

K

SKK

SESkKkW

20

1 > 1 – активация субстратом < 1 – ингибирование субстратом

Аллостерический эффект – изменение конформации и каталитической активности в результате связывания неосновного центра

PSESESSE

ESSES

SESE

ESSE

EE

kK

K

K

K

KL

22

2

1

1

2

2

21

2

121

202

11KK

SKS

KKK

SKEkW

L

L

n

n

Ln

nL

KKS

KS

KKK

SKEkW

......11...

111

02

n центров:

SnKKWW m lg)...lg(lglg 21 - определение числасвязывающих центров

Многосубстратные реакции

Механизм тройного комплекса “Пинг-понг” механизм

PESES

SESSES

ESSE

k

K

K

21

2121

11

2

1

21

21

1

121

021

1KKSS

KS

KK

ESkSW

21

21

1

12110 ][][

KK

SES

K

ESESESESEE

21

21

1

1

0

1KK

SS

K

SE

E

PEXSSX

XESSEkK

kK

22

11

22

11

2

22

1

112211 ][][0

K

XSk

K

ESkXSkESk

dt

dX

2

2

212

121

1

1210 1][][

K

S

SKk

ESKk

K

ESEXSXESEE

2

2

212

121

1

1

0

11K

S

SKk

SKk

K

S

EE

2

2

2

1

1

1

01

11SK

kk

SK

EkW

Нестационарная кинетика ферментативных реакций

Предстационарная кинетика многостадийной реакции

PEXXSE nkn

k

k

k

k

1

2

2

1

1

...1

j

n

iiijj CXBX

dt

d

1

nn

n

ii

nnnnnn

iiiiiiii

XkdtdP

XEE

XkkXkdt

dX

XkkXkXkdt

dX

XkkXkSEkdt

dX

1

10

11

1111

1212211

...

...

01

)( AeAtXn

i

tjij

i

tAkeA

ktP n

n

i

t

i

nin

i01

11 1)(

i – собственные значения матрицы Bij Aij и A0 – константы

Релаксационная кинетика

При быстром внешнем воздействии на систему (изменение температуры, давления, пр.) время, которое нужно системе для достижения нового равновесия (или стационарного состояния), зависит от скорости химической реакции (и иногда от скорости диффузии реагентов).

EAAEk

k

1

1 резко меняется температура: T →T0 + T

меняется константа равновесия: K → K0 + K

TRT

HK

KK

20

ln

][][

11 EAkEAkdt

EAd

Кинетика перехода в новоеравновесное состояние:

)(

)(

)]([][][

tAAA

tEEE

tEAAEEA

Если отклонение от равновесия невелико:

][][][

11111 EAkAkEkAEkAEkdt

EAd

tkAkEkkAkEk

AEkAEkEA 111

111

11 exp1][

][

1111

kAkEk - время релаксации

Ингибирование ферментативных реакций

EIIEk

k

1

1

обратимые ингибиторы(пестициды, зарин, зоман, аспирин и др.)

EIIE k

необратимые ингибиторы (окись углерода, цианид-ион, анальгин и др.)

Инактивация ферментов

ik

k

a EE

1

1

активный неактивный

ia

iaa

EEE

EkEkdt

dE

0

11

111

kk

- тепловая денатурация- изменение pH - денатурирующие агенты- окисление кислородом- ультразвук- радиация

конформационные изменения

(изменение спектров поглощения и флуоресценции)

0.1-100 мс - обратимые 1-1000 мин - необратимые

1. Простейшая кинетическая схема инактивации с равновесием конформеров:

ikK EEE 21

k

K

1

2. Инактивации подвержены оба конформера:

ik

ik

K

EE

EE

EE

22

11

21

2

1

Kkk

K

21

1

3. Более общий случай для системы с участием n конформеров:

k

KKKK nn 1221 1...111

ik

nKKK EEEEE n 121 ...321

4. Диссоциативный механизм инактивации:

5. Инактивация в процессе реакции:

ikK EEE in 222

ik

ik

ik

ik

kK

EPE

ESE

ESES

EE

PEESSE

4

3

2

1

Методы дискриминации механизмов инактивации и определения кинетических характеристик реакции:

- анализ зависимости выхода продукта от концентрации фермента;

- зависимость степени конверсии субстрата от степени инактивированности фермента;

- проведение реакции при низких степенях конверсии субстрата и низких концентрациях фермента;

- проведение реакции при больших концентрациях фермента;

- предынкубация фермента с компонентами реакции;

- использование интегральных уравнений реакции.

Полиферментные системы. Сопряженные ферментные реакции

PSS EE 2121

22

22

22

22

11

112

SK

SV

dt

dP

SK

SV

SK

SV

dt

dS

m

m

m

m

m

m

избыток S1 :t

SK

SV

SK

SVdS

S

m

m

m

m

2

022

22

11

11

2

tVWW

V

K

S

WV

KVS m

m

mm

mm21

1

2

2

2

12

222 11ln

11

111 SK

SVW

m

m

0111

2

2

2

W

V

K

S m

m 11

2

22

W

VK

Sm

m

V2m>>W1 : tK

V

W

V

K

S

K

S

m

mm

mm 2

2

1

2

2

2

2

2 1ln

S2/K2m<<1 :

m

m

m K

S

W

V

K

S

2

2

1

2

2

21ln

tK

V

m

m m

m

eWV

KtS 2

2

1)( 12

22

1)( 2

2

12

21

tK

V

m

m m

m

eWV

KtWtP

m

m

V

K

2

2

PSSS nEn

EE ...2121

Рассмотрим общий случай

в условиях бимолекулярного режима (Si << Kim) и малой

степени конверсии субстрата в конечный продукт (P << S1+S2+…+Sn):

021

1

212

11

...

0

...

0

SPSSS

Wdt

dP

WWdt

dS

WWdt

dS

Wdt

dS

n

n

nnn

iim

iimi SK

SVW

iim

iimni

iim

iim

SK

SVWW

SK

SV

стационар:

nm

nnmni

im

iim

K

SVWW

K

SVбимолекулярный режим (Si << Kim):

Тогда при малой степени конверсии субстрата в конечный продукт (P << S1+S2+…+Sn):

n

iim

im

nm

nmn

n

i

i V

K

K

VSSS

11

0

n

iim

imnm

nmn

V

KV

SKS

1

0

n

iim

imnm

nnm

V

K

S

K

SV

dt

dP

1

0

лимитирующая стадия: наибольшее (лимитирующее) влияние на общую скорость процесса оказывают ферменты, имеющие наименьший параметр Vim/Kim.

Кинетика действия ферментов в открытых системах

обмен компонента с окружающей средой:-все живые организмы; -технологических процессы в промышленности.

Типы открытых систем: -по субстрату-по продуктам

Типы реакторов:-идеального перемешивания-идеального вытеснения-мембранный

обменреакция dt

dS

dt

dS

dt

dS

SK

SEkW

dt

dS

m

катE

реакция

0

Jdivdt

dS

обмен

SDvSJ

D – коэффициент диффузииv – скорость ламинарного потока

Реактор идеального вытеснения

0

dx

dSv

SK

SV

dt

dS

m

mв стационаре:

SK

SV

dx

dSv

m

m

x

vK

VSxS

m

mexp)( 0

Реактор идеального перемешивания

PV

Q

SK

SV

dt

dP

SK

SVSS

V

Q

dt

dS

m

m

m

m0

Гл. 3. Молекулярная рецепция

Рецепторы – химические соединения на поверхности или внутри клеток, посредством которых происходит распознавание веществ (лигандов) и формирование клеточного ответа.

Лиганды – химические вещества, способные реагировать с рецепторами.

LRRLk

k

1

1][

][11 LRkLRk

dt

LRd

Если L >> R: tkLk

k

kL

RLLR 101

1

10

00 exp1][

- изотерма Ленгмюра (сорбции)

][

][][

0

1

1

LRLRRL

LRRL

kk

K

L

LRLR

KR

K

][][

110 - уравнение Скэтчарда

рецепторы

- белки, различающиеся разными участками или третичной структурой;

- трансмембранные белки;

- образуют четвертичную структуру с углеводами, гликопротеидами, фосфолипидами мембран;

- в процессе функционирования может меняться третичная и четвертичная структуры (конформация рецептора, структура и состав связанных с ним молекул) и сам рецептор (фосфорилирование и дефосфорилировать и др.);

- центры связывания лигандов: COOH-группы дикарбоновых кислот, NH2-группы диаминовых кослот, OH-группы гидроксиаминокислот, SH-группы цистеина, гидрофобные участки аминокислот и др.; - участвует несколько активных участков связывающего центра;

- большая степень сродства к лигандам, чем у ферментов к субстратам.

лиганды

- различное химическое строение (белковые, пептидные и др.)

Лиганды:

Агонисты – связываясь с рецепторами, активно вызывают биологический ответ клетки (стимулируют клеточные функции).

Антагонисты – не вызывают активного клеточного ответа, препятствуют связыванию агонистов с рецепторами (угнетают кл. функции).

Принцип структурной комплиментарности (“ключ-замок”)

Проведение и усиление рецепторного сигнала:

- максимальный биологический ответ клетки наблюдался даже тогда, когда лишь незначительная часть рецепторов связана с лигандами;

- кривая зависимости биологического ответа клетки от концентрации добавленного лиганда во многих случаях имеет сложный колоколообразный вид;

- различие механизма действия агонистов и антагонистов рецепторов одного типа.

Вторичные мессенджеры – внутриклеточные молекулы, осуществляющие сопряжение рецепторов с внутриклеточными эфферентными системами (ферментами, ионными каналами, геномом и т.д.).

Первичными мессенджерами раньше называли лиганды, так как многие из лигандов осуществляют сопряжение эндокринных желез с эфферентными клетками.

Классификация рецепторов по их сопряжению со вторичными мессенджерами:

- рецепторы-ионные каналы (несколько глобул интегральных белков на мембране, в неактивном состоянии рецептора ионный канал закрыт);

- рецепторы, сопряженные с ферментами (одна из глобул белка-рецептора обладает каталитической активностью, образование лиганд-рецепторного комплекса приводит к изменению каталитической активности);

- рецепторы сопряженные с G-белками (рецепторная молекула сопряжена в с внутриклеточной стороны с особым ГТФ-связывающим белком, - G-белком, - через G-белок рецепторы могут менять активность внутриклеточных ферментативных систем и вызывать открытие ионных каналов).

G-белок сопряженные рецепторы

- семь раз пронизывает цитоплазматическую мембрану;- NH2-конец располагается внеклеточно;- три внутриклеточных и три внеклеточных “петли”;- лиганды обычно связывает вторая внеклеточная петля;- оканчивается внутри клетки гидрофильным COOH-концом;- третья внутриклеточная петля и COOH-конец осуществляют сопряжение с G-белком.

- состоит из двух субъединиц: и ;- -субъединица связывает ГТФ;- - субъединица осуществляет крепление G-белка к цитолазматической мембране;- -субъединица связывается с COOH концом и третьей петлей рецептора;- - субъединица связывается только с COOH-концом.

G-белок

1) Gs-белки (s-субъединица, стимулируют АТФ→цАМФ, ингибируют Ca2+ каналы);

2) Gi-белки (ингибируют АТФ→цАМФ);

3) Go-белки (угнетают потенциал-зависимые Ca2+ каналы, стимулируют К+ каналы);

4) др.

Схема функционирования G-сопряженного рецептора:

ГДФGГДФG

ГДФGGГДФG

EГДФGEГДФG

PEГДФGEГТФG

цАМФАТФ

EГТФGEГТФG

GГТФGRLГТФGRL

ГТФGRLГТФGRL

GRLGRL

RLRL

RLLR

EГТФG

клазааденилатци

aa

aa

aa

ai

ii

][

][][

][][

][][

][][

][

10-100 G-белков

10-100 молекул цАМФ

усиление в 100-10000 раз!

х

цАМФ

в 104-108 раз!!

Механизмы внутриклеточного проведения и усиления рецепторного сигнала

...322

211

1

2

1

EPS

EPS

EPS

ERL

E

E

E

теоретический коэффициент усиления: 1012-1040 !

однако:ограниченная концентрация субстратов

концентрация вторичных мессенджеров ~ 10-2M

концентрация LR комплексов: 10-12-10-9 М

реальный коэфф. усиления: 107-1010

Инактивация рецепторного сигнала

I. Уменьшение концентрации LR комплексов:

а) Диссоциация LR (напр. из-за уменьшения концентрации лигандов в растворе вследствии разрушения лиганда ферментами).

б) Повышение константы скорости диссоциации лиганд-рецепторного комплекса (активация рецептора).

в) Изменение концентрации свободных или связанных рецепторов на мембране (эндоцитоз и экзоцитоз).

II. Инактивация сопряжения LR комплеска с ферментами:

а) Самоинактивация -субъединицы G-белка (ГТФ-азная активность -субъединицы).

б) Десенситизация ферментной системы (процессы фосфорилирования-дефосфорилирования, метилирования-деметилирования рецептора, G-белков, ферментов и т.д.).

III. Инактивация фермента, синтезирующего ключевые регуляторы клеточного ответа (напр. инактивация вторичным мессенджером – арахидоновой кислотой – ферментов синтеза эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов, липоксинов)

IV. Взаимодействие лиганда с различными типами рецепторов: 1) стимулирует 2) ингибирует 3) не влияет

Дискриминация моделей

1) Ингибиторование рецепторов (использование конкурентных антагонистов).

2) Ингибирование мембранного транспорта (разрушение клеток).

3) Уменьшение мембранного транспорта пептидных фрагментов.

4) Уменьшение эндоцитоза (мембранные стабилизаторы).

5) Увеличение проницаемости мембран (пермиолизаторы).

6) Использование димеров лигандов (димеры труднее диффундируют).

7) Использование ингибиторов макроэргов (уменьшение скорости энергозависимых процессов транспорта и деградации ферментов).

8) Ингибирование ферментов (уменьшение скорости деградации лигандов).

9) Добавление ионов металлов (меняют аффинность рецепторов).

10) Изменение pH, ионной силы, температуры (транспорт, деградация, связывание и пр.).

Диффузия рецепторов

трехмерная - внутриклеточные

двухмерная -поверхностные

Связываение нескольких молекул лиганда с одним рецептором

...2RLLRL

RLLR

сродство меняется – кооперативное связывание

возрастает – положительная убывает - отрицательная

RLRnL nK сильно выраженная положительная кооперативность

][][][

101 RLkRLRLkdt

RLdnn

nn tkLk

KL

RLRL n

n

n

n 110 exp1][

избыток лиганда:

Координаты Хилла

KLnRLR

RL

n

n logloglog0

LRLR

RL

n

n log;log0

Тангенс угла наклона () связан со степенью коопретивности: > 1 положительная кооперативность, < 1 отрицательная коперативность, = 1 отсутствие кооперативности.

Координаты Бьеррума

y

yKL

1logloglog

Ly

Ly

log;log

log;

LK

L

R

LRy

0

][

Число перегибов равно числу типов мест связывания.Абцисса точки перегиба равна логарифму константы диссоциации.

степень насыщения

RLLRLL

RLLRLL

RLLRLL

RLLRLL

RLRL

RLRL

2222

2121

1212

1111

22

11

1) Конкуренция за места связывания: а) неконкурентное (разные места связывания); б) конкурентное (одно место связывания); в) бесконкурентное (лиганд L2 связывается с L1R комплексом).

2) Изменение аффинности рецепторов: а) без изменения аффинности (L1R и R имеют одинаковую аффинность к

L2); б) с изменением аффинности.

3) Наличие взаимодействия между лигандами: а) без взаимодействия L1 и L2; б) с взаимодействием.

Феномен колебаний рецепторного связывания 1991 г.

RXXR

RLLR

XK

K1

- периодические (период порядка 10 минут)- апериодические

wtXBX sin0модулятор

[RL] (t)

Возможным источником колебаний может быть соотношение ГТФ / ГДФ, возникающее при гликолитических колебаниях.

Учет функции распределения клеток по количеству рецепторов на мембране

,NC,NCA

,yxC,yxCA

,yxCx,yCA

Nk

Nk

yxk

yxk

yxk

yxk

011

...

2211

11

1,11

,02

1,11

2,22

,1

1,12

x y

tyxСyxktAyxkdt

tdA

tyxСyxktyxСyxk

tyxСtAyxktyxСtAyxkdt

tyxdС

),,(),()(),()(

...

),1,1()1,1(),,(),(

),,()(),(),1,1()()1,1(),,(

21

22

11

fxkyxk ),(1

x y

dxdytyxCyxktAyxkdt

tdA

tyxCyxkyx

tyxCyxkyx

tAt

tyxC

),,(),()(),()(

),,(),(),,(),()(),,(

21

21

bykyxk ),(2

00 IItItB

00 AAtBtA

tBktItAkdt

tdAdf

tAAk

tAAk

f

f

eAA

AA

eAA

AAAA

tA12

12

20

10

20

1021

1

00002

A

k

k

k

kAIAA

f

d

f

d

CkkAkykxAyC

kykxAxC

tC

dfdfdf

CkkAd

dC

kxAkyd

dy

kxAkyd

dxd

dt

df

fd

fd

τ

τ

τ

1τ

метод характеристик:

0

3

0

12

1

exp

1

dwkkwAf

faC

dwwfkaaf

x

xay

t

df

d

0,y,xCtft,y,xC

t

df

t

d

t

d

dwkkwAtf

tfxdwwfkyxy

dwwfkyxtfxx

0

0

0

exp

1

(функция остается самоподобной)

Учет функции распределения по константам реакции

dKeK

dN K

KK

R

22

2

2

)(

2

1

число рецепторов с афинностью K на клетке

fk

kk

ffk dke

kdN ff

ff

f

22

2

2

)(

2

1

dk

kk

ddk dke

kdN dd

dd

d

22

2

2

)(

2

1

Гл. 4.Клеточный рост

М - фаза(митоз)деление клетки

G1 - фаза

S - фазасинтез и удвоение ДНК

G2 - фаза

Клеточный цикл:

1 час (эмбриональные и микробные клетки)~10 лет (гепатоциты, нейроны).

Культивирование клеток -> изучение клеточного цикла in vitro(культуры, линии клеток).

Фазы роста: 1) индукционный (лаг-фаза) – адаптация клеток к среде, перестройка их метаболизма;2) экспоненциальный рост (много митозов);3) линейный рост (мало митозов);4) замедление роста;5) стационарная фаза;6) отмирание культуры.

Причины замедления роста – истощение субстрата, накопление токсических продуктов и др.

Экспоненциальная фаза роста

Ndt

dN

PNNS

NSSN

m

SK

2

Предположим, что скорость роста лимитируется одним субстратом S:

NK

NSNNSN

Sc ][

SK

SN

K

SNNS

S

c

S ][

SK

SNNS

dt

dN

S

cmm

с

][ SK

S

S

m

удельная скорость роста:

(уравнение Моно) Типичные значения: m ~ 10-2 ÷ 10-5 c-1,

KS ~ 10-2 ÷ 10-8 M.

tсс eNN 0

Многосубстратные процессы

пример (M. thermoautotrophicum): OHCHCOH 2422 24

возможные механизмы:

PNNSS

NSSSNS

NSNS

митоз

K

K

221

2121

11

2

1

21

21

2

21SS

KK

S

Km

тройной комплекс

PNXS

XSXS

PXNS

NSNS

митоз

K

K

22

22

1

11

2

1

2

2

1

11S

K

S

Km

пинг-понг

Ингибирование и активация клеточного роста

Классификация:

По “мишени”:

а) ингибиторы, действующие на ДНК (налидиксоновая кислота),б) ингибиторы, действующие на РНК (актиномицин),в) ингибиторы синтеза белка (хлорамфеникол, эритромицин, тетрациклин),г) ингибиторы синтеза клеточной стенки (пенициллин),д) мембраноактивные вещества (толуол, хлороформ),е) ингибиторы энергетических процессов (2,4 - динитрофенол),ж) ингибиторы лимитирующего фермента.

По кинетике действия:

а) необратимые,б) обратимые.

ингибирование субстратом

PRNRNS

RNSRNS

RNSSNR

NRRN

PNNS

NSSN

m

R

S

R

m

S

K

K

K

K

2

2 SRRSRS KK

NSR

K

RNSNRS

K

SNR

KK

NRS

][

][][

RSRS

SRSc

KKSRN

KRN

KSN

N

KSNR

KNR

KNS

NNRSNRNSNN

][][][][

RRS

Rmc

c

K

SR

K

RSK

SK

RN

dt

dN

1

RRS

Rm

K

SR

K

RSK

SK

R

1

Влияние pH

- на субстрат (аминокислоты);

- на ферменты клетки.

inexin HH

dt

dH

Кинетика переноса ионов водорода через мембрану клетки:

inex HHВ условиях равновесия:

Замедление скорости роста

Лимитирование по субстрату

dt

dNN

dt

dSYS (линейная связь)

SY

NNSS 0

0

S

S

m

Y

NNS

KN

dt

dN

00

1

tSY

NNSY

NSY

KY

N

N

NSY

KYm

S

S

S

SS

S

SS

0

00

00000lnln1

mSt NSYN 0предел роста:

- интегральное уравнение Моно

Ингибирование избытком субстрата

NX

XSSX

XNS

m

i

S

K

K

2

SiSiSc KK

SNS

K

SNN

K

XS

K

SNNXSXNN

SiS

c

KK

S

K

S

NN

2

1

iS

cm

S

mm

c

K

SSK

SN

K

SNX

dt

dN2

Ингибирование субстратом в условиях истощения по субстрату

S

iS

m

Y

NNSS

K

SSK

SN

dt

dN

00

2

tNNYKN

NN

S

K

N

N

K

S

S

Km

Sim

S

i

S

0

0

0

0

0

11lnln1

Ингибирование продуктами

NPPN

PNX

XNS

i

m

S

K

K

2iS

c K

NP

K

SNNNPXNN ][

dt

dN

dt

dPY c

P 00 ccP NNPPY

P

cc

i

SS

cm

Smm

c

Y

NNP

K

KSK

SN

K

SNX

dt

dN

00

t

SK

SNN

SKKY

K

N

N

SKKY

KNPY

S

mcc

SiP

S

c

c

SiP

ScP

0

0

00 ln1

Период индукции

1) Трансформация предсубстрата в субстрат:

SS k 0 Skdt

dS0 tkeSS 010

1ln

1ln

00

a

a

a

a

ka

t

N

N mm 01

S

Ka S

am

S

Ss K

S

kS

K 0

001lnпериод индукции:

2) Адаптация:

NNN k 20 NNM

NNkdt

dN

Nkdt

Nd

0

0tkeNN 0

0

tkt ek

Ne

k

NkM 0

0

0

0

00

0

1ln1

km

maпериод индукции:

3) Расход ингибитора роста:

NINI k 0 Ikdt

dI0 tkeII 0

0

tk

ie

K

IN

dt

dN001

0

0

kK

I

ii период индукции:

Старение клеток и апоптоз

Апоптоз – “программируемое” старение и гибель клеток.

Некроз – гибель случайная или под действием внешних токсинов.

1961 г., Л. Хейфлик: предел клеточного деления для фибробластов человека (50 делений).

- бактериальные клетки и клетки одноклеточных организмов делятся бесконечно;

- клетки многоклеточных организмов имеют предел деления.

Концепция “программируемого” старения:ДНК полимераза не способна реплицировать “хвосты” 3’ конца матрицы ДНК (несколько нуклеотидов на 3’ конце). Для предотвращения укорачивания ДНК фермент теломераза синтезирует на концах ядерной ДНК многократно повторяемый гексануклеотид TTAGGG (теломера). Таким образом, для преодоления укорачивания генома и старения клетка должна активировать теромеразный ген и экспрессировать большое количество теломеразы.

Удельная скорость клеточного роста в экспоненциальной фазе

PS

ДНКSS RE

Предположения:

- скорость синтеза ДНК пропорциональна концентрации S’ и характеризуется константой скорости R;

- скорость биосинтеза лимитирующего фермента и белков репликационного комплекса намного выше скорости синтеза ДНК, так что можно считать E=const.

SSK

ESk

dt

dS

SДНКdt

d

RS

кат

R

0

dt

SdSK

ESkS

S

кат

R

1

В квазистационаре:

tSK

ESktДНК

S

кат

R

R

)]([

RS

кат

R

R

SK

ESkB

ESk

BSK

катR

SRR

R

2ln

время репликации

базовое количество ДНК

Многостадийность клеточного цикла

aR

время репликации нахождения в других фазах клеточного цикла

время удвоения:

a

катR

SR

ESk

BSK

SK

S

наблS

m

EkB

Ek

катaR

катm

1

2ln

BEk

KK

R

Rкатa

SнаблS

1

уравнение Моно

R

катR

Ra Ek

B

Микробы:

Многоклеточные: Ra a

m

2ln Rкатa

RSнаблS Ek

BKK

Старение клетки в процессе роста

Инактивация ключевых ферментативных систем:

- репликационного комплекса,- лимитирующего фермента.

RiR

i

EE

EE

EE

ДНКSS RR )(

t

tRR

RS

кат

R

eEtE

et

StSK

StEk

dt

Sd

StДНКdt

d

0)(

)0()(

)()(

)(][

)(

)(

tSK

StEkS

RS

кат

В квазистационаре: 0

dt

Sd

t

S

кат eSK

SEkДНК

dt

d

0][

)1()]([ 0 tev

tДНК

SK

SEkv

S

кат

0

0

)1(0 Rev

B

01ln

1

v

BR

01ln

2ln2ln

v

BR

1

B

EkK

Sкат

Sкр

пороговая концентрация S

Кинетические модели апоптоза

1) Прогрессирующая некомпетентность:

ai

aaaa

Ndt

dN

NNtdt

dN)(

способные к делению клетки

ia NNN

aaNdt

dN

0dt

dNaВозможна ситуация: (максимальное количество некомпетентных клеток)

S

mS

S

mm

Y

NtNSK

Y

NtNS

00

00

)(

)(

Если a дается уравнением Моно, то:

m

SSm

KSYNtN 00)(

tm - время достижения максимума по Na

m

Sm

KtS )(

1) начальный период:

ama ,

tNN amaa ,0 exp

tNN am

am

ai

,,

0 exp

tNN am

am

aam

,

,

0, exp

tNN maa exp,

2) режим истощения субстрата (на больших временах):

2) Запрограммируемый отказ

- потеря чувствительности клеток к ростовым факторам среды (т.е. уменьшением числа рецепторов R на клетке)

tt eeAtR )(

R0

Предположим, что скорость деления клеток пропорциональна числу рецепторов на мембране:

aa NtR

dt

dN)(0

t

aa dttRNN

0

00 )(exp

tANN aa exp1exp 00Если >>

Модель “хищник-жертва”

2212

2111

NNNdt

dN

NNaNdt

dN

жертва хищник

Существует стационарное состояние:

0

0

2

1

dt

dNdt

dN

aN

N

ст

ст

2

1

Фазовый портрет (связь между N1 и N2):

1

11

стN

Nn

2

22

стN

Nn

212

121

1

1

nndt

dn

nnadt

dn 12

21

1

2

1

1

nna

nn

dn

dn

1

1

12

2

2 11dn

an

ndn

n

n

consten

en

a

nn

21

21

фазовый портретколебательной траектории

Средняя численность популяции равна стационарной численности

T

dtnan

dn

0

21

1 1 201 )(ln0 naTaTtnT

12 n

11 n

Ассоциации микроорганизмов

симбиоза до антагонизма

Пример: ассоциация двух микроорганизмов M1 и M2

PSS MM 2121

dt

dM

Ydt

dP

dt

dM

Ydt

dM

Ydt

dS

dt

dM

Ydt

dS

SK

MS

dt

dM

SK

MS

dt

dM

P

PS

S

2

122

11

22

2222

11

1111

2

12

1

1

11

1

Гл. 5.Мембранный транспорт

Мембраны: - kлеточные - внутриклеточные

Строение мембраны: - липиды и белки, билипидный слой (гидрофобная часть внутри) - мембранные поры: диаметр 8÷14 А длина (толщина мембраны) ~160 А - разность электрических потенциалов внутренней и внешней поверхности (сказывается на транспорте ионов).

Виды мембранного транспорта: - пассивная диффузия (по градиенту химического или электрохимического потенциала); - облегченная диффузия (обратимое взаимодействие с переносчиком); - активный транспорт (против градиента); - транслокация групп (изменение вещества при транспорте, переносчик-фермент).

Пассивный транспорт

0

ii Jdiv

t

С

iii

iii CDRT

FzCDJ

число Фарадея

заряд (целое число, в единицах электронов) i-го иона

потенциал электрического поля в мембране

i

iiCzF

dx

dDC

RT

Fz

dx

dCDJ

Одномерный случай:

xdx

d

в линейном

приближении:

xDC

RT

Fz

dx

dCDJ

e

i

C

C

x

dC

xDC

RT

FzJ

Ddxx

0

RT

zF

RT

zF

ie

exRT

eCCFzD

J

1

x

uRT

x

Dp

Коэффициент проницаемости:

подвижность

RT

zF

ie eCC

ie CCpJ

i

e

e

i

Cl

Cl

H

H

Если молекула не заряжена:

В равновесии (J = 0): (уравнение Нерста)

Доннаново равновесие

Активный ионный транспорт

модель K+-Na+ насоса

Na-конформер

К-конформер

)(

)(

)(

)(

.)..(

.)..(

3

3

3

3

2

2

1

1

KтранспортпассивныйKK

NaтранспортпассивныйNaNa

белкамолекулыпереворотФNaEФNaE

белкамолекулыпереворотKEKE

мембрповвнешннаNaФKEФNaEK

мембрповвнутрнаKАДФФNaEАТФKENa

eJ

i

eJ

i

ek

k

i

ek

k

i

eek

k

ee

iik

k

ii

K

Na

Реакционная схема(учитывая кооперативный эффект и наличие пассивной диффузии)

модель Ca2+ насоса

Напишите реакционную схему(учитывая кооперативный эффект и наличие пассивной диффузии)

Высокая селективность ионных каналов к определенному типу ионов

93.0

Na

Li

p

p16.04

Na

NH

p

p09.0

Na

K

p

p

3.2

K

Tl

p

p13.04

K

NH

p

p01.0

K

Na

p

p

натриевый канал:

калиевый канал:

Гл. 6.Эндоцитоз

Ранняя эндосома

Пузырек с гидролазами Поздняя эндосома

лизосома

Возврат рецепторав плазмалемму

Возврат рецептора м-6-ф в АГ

- распознавание целевой мембраны транспортным пузырьком

1

3

32

21

LАГ

LL

LL

LLA

AA

e

i

ie

Пиноцитоз Фагоцитоз

1

3

32

21

LАГ

LL

LL

LLAR

ARAR

ARRA

e

i

ie

ee

первичная лизосома

вторичная лизосома

остаточное тельце:- внутри клетки- снаружи клетки

аппарат Гольджи

Сообщество микробных популяцийв реакторе идеального перемешивания

m

kkkjkjj

j

iii

mjxaDAAdt

dA

niDAxdt

dx

1

0 ,1

,1

Популяции микробов

Контролирующие рост факторы

0jA ij xA ,

Существует стационарное состояние:

xFAA

DA

0

dtdVD / dtdVD /

Распределение микробовпо скорости роста и возрасту

s0 1

с точностью до обозначенийэквивалентно:

рост

возраст

xFAA

DA

0

Матричный анализ стационарного состояния

nmA

Am

ii

i

1

0

OCA

A ˆˆ0

xFAA

DA

0

xCAA

ABA

ˆ

0ˆ

0

xCBABAB ˆˆˆˆ 0

BC

- размера [n × m]

- размера [m × n]

xCBAB ˆˆˆ 0

01 ˆˆˆ ABCBx

01

0 ˆˆˆˆ ABCBCAA

BCBCEA

AY ˆˆˆˆˆˆ 1

0

размера [m × m]

nmIspmCBCBspmBCBCspEspYsp

ˆˆˆˆˆˆˆˆˆˆˆ 11

Квантование !

следствие

популяций

факторов

Гемолиз в изотоническом хлориде аммония

H2O+NH4Cl

Осмотические и буферныесвойства эритроцита

Мембранный транспорт

Динамика разрушения мембраныпри ее растяжении

Составные части общей модели:

+

+

Механизм проникновения NH4Cl в эритроцит

NH3

H+

NH+4

Cl-

NH3

NH+4

H+

OH-

H2O

Band 3

NH4Cl

Hb

Hb-

Band 3HCO-

3

Cl-

CO2CO2

H2CO3

Изменение pHin

+ Цикл Якобса-Стюарта + Цикл Якобса-Стюарта ((Jacobs-Stewart cycleJacobs-Stewart cycle))

inink

k

ininin

outoutk

k

outoutk

k

inink

k

inin

outoutk

k

outoutk

k

inink

k

inin

BClBClCl

BHCOBHCOBHCOBHCO

BClBClBClBCl

2

3333

7

7

6

6

5

5

4

4

3

3

2

2

1

1

Пинг-понг механизм работы Пинг-понг механизм работы band 3band 3

ininK

ininin

outoutK

outoutk

k

ininK

inin

outoutK

outoutk

k

ininK

inin

BClBClCl

BHCOBHCOBHCOBHCO

BClBClBClBCl

2

3333

7

6

5

54

3

2

21

Лимитирующая стадия – транслокация band 3

Три стадии гемолиза

0303

0

1 0.00110.00719 0.0238084.1 wwwww

w HbNaHCOHbNaHCOV

V

1. Быстрое увеличение (на ~20%) начального объема (< 0.2 сек) - релаксация клетки в новой среде:

2. Медленное дальнейшее увеличение объема до сферы (> 10 сек):

31

2141 /

/GVV

GGGVV

dt

d

wwww

aww NVHbNaHCO

BNaHCOG

103

183

4 ][549.0][693.0162

10][

0031 )]([0.00261][0.09077][0.063471883.5 ww inClHbNaHCOG

0032 )]([0.0032][0.01643][0.0041155.64 ww inClHbNaHCOG

0033 )]([0.00097][0.00805][0.013249641.0 ww inClHbNaHCOG

3. Растяжение сферической клетки со спонтанным разрывом (> 10 сек):

tn

tndt

d /exp/ 2/1

0 0

0

S

SSKS

напряженность мембранывремя жизни мембраныконцентрация клеток

Функция распределения эритроцитов

5

1

51 ,...,

i

ixLxxF

2

2

2

lnlnexp

2

1

i

ii

ii

i

x

xxL

00 ,,,,5,...,1; cccS

i HbVBK

ix

Параметры:

Функция распределения:

где логнормальная функция:

32 , tt

Время сферизацииВремя жизни сферы

Монте-Карло алгоритммоделирования динамики функций распределения

сферизованныхэритроцитов

32 , ttF

Динамика метаболизмав эритроците человека

Ист

ор

ия

мо

дел

ир

ов

ани

я

1989

1974

Palsson et al. (1989)

m

j

ijiji vVVCdtd

1

Аб

бр

еви

атур

а м

етаб

ол

ито

в э

ри

тро

ци

та

Аб

бр

еви

атур

а м

етаб

ол

ито

в э

ри

тро

ци

та

Кр

атко

е о

пи

сан

ие

мет

або

ли

зма

эри

тро

ци

та

Основные ограничения:

1) Электронейтральность

2) Баланс осмотического давления

n

i

iiCz

1

0

n

i

osmiiCRT

1

mMinHbHbHbHb20258.00645.01

7.892

6.691

2211

10

10

1/41/236.15

pH

pH

Hb

b

b

bbbbz

(буферные свойства)

Трансмебранный K+/Na+ обмен

pumpKleakin

pumpNaleakin

vvKdtd

vvNadtd

2

3

,

,

exexinexex

exexm

ATPpumppump

inXm

in

exXm

exXm

inexXdfacilitatefusionelectrodifXleak

KBKkkkkBBNaBKKBBB

KBKV

KATP

ATPv

RTFr

rXK

rX

XK

Xv

r

XrXrzkvvv

2

2

131221

3

3

2

221

2

2

,

,,,2

2

,

//1/2

2/2/

/exp

1ln

Трансмебранный Cl-/HCO3- обмен

wHCO

wHCOHCOex

wHCO

wHCOHCOin

wCl

wClClex

wCl

wClClin

HCOexexHCOininHCOout

ClininClexexClin

exHCOKexHCOW

f

inHCOKinHCOW

f

exClKexClW

f

inClKinClW

f

fBfBJ

fBfBJ

)]([)]([

)]([)]([

)]([)]([

)]([)]([

33

333,

33

333,

,

,

3,3,3,

,,,

3,3,,,

3,,3,,,,

3

HCOexHCOinClexClin

HCOexClinHCOinClexinClClin

outHCO

inCl

inex

ffff

ffff

B

Jj

JJ

BBB

HCOHCO

HHCOCOH

COHOHCO

233

332

3222

Кинетика гликолиза

HKDPGHKMgHKDPGHKMgHKPG

HKMgHKMgATPHK

HKMgHK

HK

HKMgATPHK

HKHK

KK

DPGMg

K

DPG

K

Mg

K

PG

K

Mg

K

MgATPN

K

Mg

v

v

K

MgATP

N

vv

HKHexakinase

,3,2,,3,2,,6

,,

,,1max

,2max

,

,1max

3,23,2155.1

6

11

1

:,

4,6

4,

4,

4,

,0

,,6

max,

/61/1

/1/11

66

:,

PFKPFPFKAMP

PFKMgPFKATPPFKPFK

PFKMgATPPFKPFPFK

PFKPFK

KPFKAMP

KMgKATPLN

MgATPKPFKMgATPPF

N

vv

PFKctokinasePhosphofru

4,

4,

4,

,0

,,

max,

/1/1

/11

:,

PKFDPPKPEP

PKATPPKPK

PKMgADPPKPEPPK

PKPK

KFDPKPEP

KATPLN

MgATPKPEPKMgADPPEP

N

vv

PKkinasePyrivate

Сравнение модели с экспериментом

Ср

авн

ени

е м

од

ели

с э

ксп

ери

мен

том

Предсказания модели

Documents

Биокинетика