補足：分子量の求め方

SDS － PAGE の泳動像から分子量を推定するには？

タンパク質のバンドの移動距離を、分子量が既知のタンパク質のものと比較することで、目的のタンパク質の分子量を算出できる

同じゲルの中で既知のタンパク質（分子量マーカー）を泳動する

分子量マーカーのバンドの移動距離を測り、分子量と対応する移動距離を片対グラフにプロットする

これを検量線として目的のバンドの移動距離から分子量を求める

SDS-PAGE の分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質

タンパク質 由来 Da分子量（ ）ミオシン ウサギ骨格筋 205,000β ガラクトシダーゼ E .coli 116,000

bフォスフォリラーゼ ウサギ骨格筋 97,000- 6-フルクトース リン酸キナーゼ ウサギ骨格筋 84,000

ウシ血清アルブミン ウシ血清 66,000グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ウシ肝臓 55,000卵白アルブミン ニワトリ卵白 45,000乳酸ジヒドロゲナーゼ 豚骨格筋 36,500カーボニックアンヒドラーゼ ウシ赤血球 29,000トリオースリン酸イソメラーゼ ウサギ骨格筋 26,600トリプシンインヒビター 大豆 20,100リゾチーム 卵白 14,400α ラクトアルブミン ウシ赤血球 14,200アプロチニン ウシ肺 6,500

分子量算出の手順～バンドが綺麗に揃ったゲルの場合～

１）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの 移動距離を正確にはかる

分子量マーカー

サンプル

44.6mm

33.523.6

12 .7

6.73.6

２）片対グラフの横軸（普通目盛）に移動距離、縦軸（対数目盛）に分子量　　をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする

３）移動度－分子量標準曲線を求める

Protein (M.W.)分子量 移動距離（㎜）Phosphorylase b 97000 3.6Albumin 66000 6.7Ovalbumin 45000 12.7Carbonic anhydrase 30000 23.6Trypsin anhydrase 20100 33.5α - Lactalbumin 14400 44.6

y = 267249x- 0.7341

R2 = 0.9816

10000

100000

0 10 20 30 40 50

mm移動距離（ ）

M.W

.分

子量

（）

４）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる

５）その数値を３）で求めた標準曲線の式（ y ＝ 267249 ｘ－ 0.7341 ）に代入し　 分子量を算出する

分子量マーカー

サンプル

28.5mm

267249×28.5 － 0.7341 ＝ 22851.49

求めるタンパクの分子量

分子量算出の手順～スマイリングしたゲルや別のゲルで比較する場合～

１）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの 移動距離を正確にはかる２）レーンの同じ場所で泳動のフロントラインの移動距離を正確にはかる

分子量マーカー

サンプル

BPB

分子量マーカー

サンプル

３）フロントラインの移動距離を１として、それぞれの分子量マーカーのバン　　ドの移動距離の相対値（＝相対移動度： Rf 値）を計算する

0.25

0.67

1.0

４）片対グラフの横軸（普通目盛）にＲｆ値、縦軸（対数目盛）に分子量を とり 、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする

５） Rf 値－分子量標準曲線を求める

Protein (M.W.)分子量 Rf値Phosphorylase b 97000 0.07Albumin 66000 0.13Ovalbumin 45000 0.25Carbonic anhydrase 30000 0.47Trypsin anhydrase 20100 0.67α - Lactalbumin 14400 0.89

y = 15154x- 0.7245

R2 = 0.9813

10000

100000

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Rf値

M.W

.分

子量

（）

７）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる

８）そのサンプルが流れているレーンの同じ場所で、泳動のフロントライン　 　 の移動距離をはかる

９）フロントラインの移動距離を１として、目的のタンパク質のＲｆ値を計算し　 ５）で求めた標準曲線の式（ y=15154x － 0. 7425 ）に代入すると、分子量が　 算出できる分子量マーカ

ーサンプル

0.57

1.0

15154×0.57 － 0.7425 ＝ 22771.73

求めるタンパクの分子量

二次元電気泳動での分子量マーカーの使い方

分子量マーカーのバンド

SDS-PAGE で分子量を測定する上での注意点

・塩基性に富んだタンパク質は SDS の結合量が少なくなるため、移動度が 小さくなる＝見かけの分子量が大きくなる

・タンパク分子内に疎水性に富んだ部分が多い場合は、 SDS の結合量も　多くなり、移動度が大きくなる＝見かけの分子量が小さくなる

・糖タンパク質や酸性タンパク質は SDS の結合量が少なく、移動度も小さい　＝見かけの分子量が大きくなる

・多量体やサブユニット構造をとっているタンパク質分子では、 SDS-PAGE で わかるのはその単一ポリペプチドの分子量だけで、その分子が生体内で 機能している状態の分子量はわからない　　　　　例）　　免疫グロブリン＝重鎖 2 本と軽鎖 2 本が S-S 結合した構造をもつ

S-S 結合の切断により約 50kDa のバンドと約 22kDa のバンドがそれぞれ現れる

免疫グロブリンの構造

黄色い部分＝ Light chain 　　　　　　　　　　　　　（ L 鎖）緑色の部分＝ Heavy chain　　 　　　　　　　　　　（ H 鎖）

2 本の L 鎖と 2 本の H 鎖で構成されている

L 鎖と H 鎖、 H 鎖と H 鎖同士は S-S 結合で結ばれている