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Determinação de proteína bruta
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DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA
BRUTA
Determinação de proteína bruta
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1. Proteínas
Grego "proteios": ocupar o primeiro lugar (o mais importante)
Contém: C (50 - 55%) H (6 - 8%) O (20 - 24%) N (15 - 18%) S (0,2 - 0,3%)
MS do corpo animal - até 70% é proteína
Polímeros de aminoácidos
Determinação de proteína bruta
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COOH
H2N
1. Proteínas Grupo carboxílico
Grupo amina
Cadeia lateral Carbono a
Determinação de proteína bruta
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Aminoácidos: 20 diferentes
Essenciais e não essenciais
Diferenciam-se pelo radical "R"
1. Proteínas
Determinação de proteína bruta
5(grupo R hidrofóbico)
1. Proteínas Aminoácidos apolares
Determinação de proteína bruta
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Aminoácidos polares sem carga
1. Proteínas
(grupo R hidrofílico)
Determinação de proteína bruta
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Aminoácidos polares com carga positiva
1. Proteínas
Aminoácidos básicos - aceptores de prótons.
Determinação de proteína bruta
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Aminoácidos polares com carga negativa
1. Proteínas
Aminoácidos ácidos - doadores de prótons
Determinação de proteína bruta
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Aminoácidos aromáticos
1. Proteínas
Determinação de proteína bruta
10Ligação peptídica
1. Proteínas
Determinação de proteína bruta
11Polipeptídeo
1. Proteínas
Determinação de proteína bruta
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1. Proteínas
Determinação de proteína bruta
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1. Proteínas
Determinação de proteína bruta
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Funções biológicas compreendem:
Estrutural (tecidos - queratina, colágeno)
Catálise (enzimas - amilase, hexoquinase...)
Transporte (hemoglobina, calbindina)
Hormônios (insulina; GRH...)
Proteção (anticorpos; imunoglobulinas)
Armazenamento (ferritina)
Nutricional (caseína; ovoalbumina)
1. Proteínas
Determinação de proteína bruta
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Vegetais sintetizam suas proteínas (por isso
fazemos adubação nitrogenada!)
Animais precisam ingerir proteínas
Ruminantes convertem N inorgânico em
proteína (graças à simbiose microbiana)
Valor biológico (perfil de aminoácidos)
1. Proteínas
Determinação de proteína bruta
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2. ANÁLISE DE PROTEÍNAS
Determinação de nitrogênio total (Kjeldahl)
Método do biureto (nome dado à estrutura originada a partir da
decomposição da ureia, quando essa é submetida a uma temperatura de ˜
180oC / presença de ligações peptídicas)
Absorção no Ultra-violeta (devido Trp e Tyr)
Presença de grupos amino livres
Capacidade de ligação com corantes (Bradford)
Presença de AA aromáticos (fluorescência)
Determinação de proteína bruta
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3. "Proteína bruta" - Método de Kjeldahl
Soma de todo nitrogênio presente na amostra
proteína verdadeira
aminoácidos
amidas
ácidos nucléicos
uréia
amônia
outros
Determinação de proteína bruta
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COMPONENTES DO ALIMENTO Análises Laboratoriais
A
L
I
M
E
N
T
O
NITROGÊNIO NÃO PROTEICO
PROTEÍNA
NÃO PAREDE
PAREDE CELULAR
COMPOSTOS NITROGENADOS
CARBOIDRATOS
MATERIA SECA
AGUA
LIGNINA
TANINOS
MATERIA ORGANICA
COMPOSTOS FENÓLICOS
SIMPLES
COMPOSTOS
LIPIDEOS
LIPOSSOLÚVEIS
VITAMINAS
HIDROSSOLÚVEIS
MATERIA INORGANICA
NÃO ESSENCIAIS
MACRO
MICRO
ESSENCIAIS
Estufa, MS
PROTEÍNA BRUTA (PB) Todo conteúdo de nitrogênio: uréia, aminas, aminoácidos, proteína
100 - PB - EE - FDN - MM Usualmente calculada: glucose, pectina, amido, outros açucares
Fibra Detergente Neutro FDN
Hemicelulose Celulose Lignina FDA
Não analisado rotineiramente
EXTRATO ETÉREO (EE) Triglicerídeos, ácidos graxos, fosfolipídios, ceras, pigmentos, etc.
Não analisado rotineiramente
CINZAS (Matéria Mineral) todos os minerais, sílica, etc. Mufla a 550 C.
Determinação de proteína bruta
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Descobriu método rápido para se
determinar o valor nitrogenado dos
alimentos (1883)
Johan Gustav Kjeldahl Químico dinamarquês
História... 1849-1900História... 1849-1900
3. "Proteína bruta" - Método de Kjeldahl
Determinação de proteína bruta
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Proposto por J. G. Kjeldahl (1883)
Proteína da dieta= PB (único valor analisado e
constatado!)
PB = %N x 6,25
Assume que toda proteína tem 16% de nitrogênio (100/16 = 6,25)
PB = N protéico + N não protéico (aminoácidos, amônia, amidas, ácidos nucléicos,
peptídeos...)
3. "Proteína bruta" - Método de Kjeldahl
Determinação de proteína bruta
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AMOSTRA FATOR
Fator geral 6,25
Gelatina 5,55
Ovos 6,68
Produtos lácteos 6,38
Soja 6,25
Farinha de trigo 5,70
Arroz 5,95
Carnes 6,25
3. "Proteína bruta" - Método de Kjeldahl
Determinação de proteína bruta
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Vantagens do método de Kjeldahl
aplicável a todos os tipos de alimentos simples relativamente barato boa precisão (é oficial)
Desvantagens
mede N total (protéico ou não) biureto é mais preciso demorado usa reagentes corrosivos
3. "Proteína bruta" - Método de Kjeldahl
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos
Passo 1: Digestão da amostra
Passo 2: Destilação da amostra
Passo 3: titulação da amostra
Determinação de proteína bruta
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1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
4. Princípios e procedimentos
Determinação de proteína bruta
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1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Proteínas e outros compostos nitrogenados são decompostos na presença do ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, a quente, com produção de sulfato de amônio (NH4)2SO4 + SO2 + CO2 + H2O
+ (H2SO4) (NH4)2SO4 + SO2 + CO2 + H2O
Matéria orgânica
(contendo N)
CUSO4 + K2SO4
▲
Sulfato de amônio
4. Princípios e procedimentos
Determinação de proteína bruta
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Sulfato de potássio (K2SO4) ou
de sódio é adicionado, a fim de
aumentar o ponto de ebulição do
ácido sulfúrico de 337ºC para
mais de 400ºC, tornando a
digestão rápida
Outros compostos como sulfato de cobre (CuSO4), mercúrio e
selênio são catalisadores -
auxiliam na digestão da matéria
orgânica
1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
4. Princípios e procedimentos
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos
1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos
1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos
1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos
1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos
1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos
1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 1ª ETAPA: DIGESTÃO DA AMOSTRA
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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O nitrogênio capturado na forma de
sulfato de amônio, na presença da
solução concentrada de hidróxido de
sódio, dá origem ao hidróxido de amônio que libera amônia (NH3) na forma de
vapor a qual é condensada sobre a
solução de ácido bórico.
4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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(NH4)2SO4 + 2NaOH
▲
2NH4OH
2NH4OH + Na2SO4
2NH3 + 2H2O
2NH3 + 2H3BO3 2NH4H2BO3 Borato de
amônio
Sulfato de
amônio
Hidróxido de
sódio
Hidróxido de
amônio
Sulfato de sódio
Hidróxido de
amônio
Amônia
Amônia Ácido bórico
▲
4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 2ª ETAPA: DIGESTÃO DA DESTILAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 3ª ETAPA: DIGESTÃO DA TITULAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 3ª ETAPA: DIGESTÃO DA TITULAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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O borato de amônio é titulado em ácido clorídrico (HCl) de concentração conhecida até a "viragem" da cor rosa, gerando cloreto de amônio mais ácido bórico
Em função do volume de ácido clorídrico (HCl) consumido, e conhecendo sua normalidade, é então possível calcular a concentração de nitrogênio captada a partir da amostra
NH4H2BO3 + HCl NH4Cl + H3BO3 Borato
de amônio
Ácido clorídrico
Cloreto de
amônio
Ácido bórico
4. Princípios e procedimentos 3ª ETAPA: DIGESTÃO DA TITULAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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O princípio é da equivalência entre o conteúdo de N na amostra que está na forma de borato de amônio e a quantidade de HCl necessária para converter todo o N para a forma de cloreto de amônio
Se calcularmos quantos Eqg de HCL forma necessários para reagir com o NH4
+, considerando
que a proporção é de 1:1, poderemos saber quanto de NH4
+ estava contido na amostra
4. Princípios e procedimentos 3ª ETAPA: DIGESTÃO DA TITULAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 3ª ETAPA: DIGESTÃO DA TITULAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 3ª ETAPA: DIGESTÃO DA TITULAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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4. Princípios e procedimentos 3ª ETAPA: DIGESTÃO DA TITULAÇÃO
Determinação de proteína bruta
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Eqg: peso atômico em gramas
Eqg N = 14 gramas
Normalidade (N): Eqg / 1000 mL
Solução 1N de nitrogênio = 14/1000 mL
Cada mL de solução 1 N = 0,014 g de nitrogênio
Cada mL de solução 0,1 N = 0,0014 g de nitrogênio
N x V = N' x V'
5. Cálculos
Determinação de proteína bruta
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1 Eqg de HCl 1 Eqg de N
1 mL de HCl 0,1N 0,0014 g de nitrogênio
Vol de HCl 0,1 N X g de nitrogênio
X = (0,0014 g x Vol HCl 0,1 N) / 1
5. Cálculos
Determinação de proteína bruta
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% PB = % N x 6,25
5. Cálculos