STRUCTURA MACROMOLECULELOR PROTEICE

Metode fizice de determinare a structurii macromoleculelor

Proteine - generalitati, definitie

Proteinele sunt substanţe organice macromoleculare formate din lanţuri simple sau complexe de aminoacizi;

ele sunt prezente în celulele tuturor organismelor vii în proporţie de peste 50% din greutatea uscată.

Toate proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, în care secvenţa acestora este codificată de către o genă. Fiecare proteină are secvenţa ei unică de aminoacizi, determinată de secvenţa nucleotidică a genei.

Generalitati

Biosinteza proteinelor este un proces prin care fiecare celulă îşi sintetizează proteinele proprii, prin intermediul unui proces care include multe etape, sinteza începînd cu procesul de transcripţie şi terminînd cu procesul de translaţie.

Procesul deşi similar, este diferit în funcţie de celulă: eucariotă sau procariotă.

Tipuri de proteine

În funcţie de compoziţia lor chimică ele pot fi clasificate în:

1. Holoproteine care cuprind:Proteine globulare (sferoproteine) sunt de regulă

substanţe solubile în apă sau în soluţii saline:protaminele, histonele, prolaminele, glutelinele, globulinele, albuminele.

Proteinele fibrilare (scleroproteinele) caracteristice regnului animal, cu rol de susţinere, protecţie şi rezistenţă mecanică:colagenul, cheratina şi elastina.

2. Heteroproteinele sunt proteine complexe care sunt constituite din o parte proteică şi o parte prostetică; ele cuprind:

Glicoproteine, lipoproteine si nucleoproteine.

Proteinele au masa moleculara foarte mare M> 10.000 u.a.m.

Denumire Sursa(izolata din) Masa moleculara (u.a.m).

Lactalbumină‘ lapte 17000

Gliadina grîu 27.500

Insulina pancreas 12,000

Hordeina orz 27.500

Hemoglobina globule roşii 68.000 Hemocianina moluşte(sînge) , artropode(sînge) 28 000

Miozina muşchi 85.000

Pepsină stomac 36.000 Peroxidaza rinichi 44.000

Virusul tutunului tutun 17.000.

Aminoacizii standard Din punct de vedere chimic, proteinele

sunt heteropolimeri constituiţi din 20 de aminoacizi (aşa numiţii aminoacizi standard vezi tabelul), în care grupările carboxil se pot combina cu grupările amino formînd legături peptidice. Aminoacizii standard au proprietăţi variate, proprietăţi care sunt direct responsabile de structura tridimensională a proteinei, dar şi de proprietăţile acesteia.

Denumirea  (Residue) cod 3-literecod 1 literă

codeAbundenţă />(%) E.C.

Alanină ALA A 13.0

Arginină ARG R 5.3

Asparagină ASN N 9.9

Aspartat ASP D 9.9

Cisteină CYS C 1.8

Acid glutamic GLU E 10.8

Glutamină GLN Q 10.8

Glicină GLY G 7.8

Histidină HIS H 0.7

Isoleucină ILE I 4.4

Leucină LEU L 7.8

Lizină LYS K 7.0

Metionină MET M 3.8

Fenilalanină PHE F 3.3

Prolină PRO P 4.6

Serină SER S 6.0

Treonină THR T 4.6

Triptofan TRP W 1.0

Tirosină TYR Y 2.2

Valină VAL V 6.0

Lantul polipeptidic

În lanţul polipeptidic aminoacizii formează legăturile peptidice prin cuplarea grupei carboxil cu o grupă amino;

odată legat în lanţul proteic aminoacidul se "transformă" în aminoacid "rezidual" iar atomii de carbon , azot, hidrogen şi oxigen implicaţi în legături formează "scheletul" proteinei.

Atunci cînd lanţul proteic se tremină cu o grupă carboxil poartă denumirea de carboxi terminus sau( C -terminus), în timp ce, dacă se termină cu gruparea amino, devine amino-terminus (N-terminus).

Structura primara a proteinelor si acizilor nucleici

Structura primară este dată de aminoacizii care intră în lantul proteic prin formarea legăturilor pepetidice. Legătura peptidică -CO-NH- se găseşte în acelaşi plan, iar carbonul -CH- se poate roti, putînd să apară în planuri diferite. Datorită lungimii relativ mici a catenelor laterale, ele se pot aranja de o parte şi de alta a lanţului proteic, astfel că lanţul proteic nu este ramificat.

Structura primara a proteinelor si acizilor nucleici

În proteinele naturale legătura peptidică se stabileşte între gruparea carboxilică de la C1 şi gruparea aminică de la C2, încît lanţul peptidic va fi format dintr-o succesiune de unităţi CO-NH-CH, legate cap-cap.

Structura secundara

Structura secundară se referă la forma şi la lungimea lanţurilor polipeptidice,ulata a structurii locale stabilizata prin legăturile de hidrogen. Cele mai întîlnite tipuri de structura secundară sunt alpha helixul şi lanţurile beta.

Elicea alpha se formează prin rotaţia unui lanţ polipeptidic în jurul propriei axe

Imaginea alfa helixurilor mioglobinei, a cărei structură a fost determinată de către Max Perutz şi Sir John Cowdery Kendrew în 1958 folosind cristalografia cu raze X

Structura secundara

Aminoacizii au un comportament diferit vis-a-vis de posibilitatea formării structurii secundare.

Prolina şi glicina sunt cunoscuţi ca aşa numiţii " helix breakers"(spărgători de helix), deoarece afectează configuraţia scheletului proteic; ambii aminoacizi au abilităţi conformaţionale neobişnuite şi de regulă se găsesc în colţurile scheletului proteic.

Aminoacizii care preferă să adopte conformaţia helixului proteic fac parte din aşa numita serie MALEK

( codurile formate din 1 literă a aminoacizilor): metionină, alanină, leucină, acid glutamic şi lizina);

Prin contrast aminoacizii aromatici (triptofanul, tirosina şi fenilalanina, dar şi aminoacizii cu legare prin carbonul beta (izoleucina, valina şi treonina, adoptă configuraţia β.

Structura tertiara

Prin intermediul cristalografiei cu raze X s-a dovedit faptul că macromoleculele proteice au o conformaţie tridrimensională , realizată de obicei prin intermediul cuplării mai multor lanţuri polipeptidice scurte între ele, cuplare care duce la formarea fibrelor proteice;

legăturile intercatenare pot fi principale sau secundare.

Structura tertiara: legaturi intercatenare

Legături de hidrogen - sunt legături coordinativ heteropolare care se stabilesc cu uşurinţă între gruparea carbonil C=O (electronegativă) şi gruparea NH- (electropozitivă), din 2 lanţuri polipeptidice alăturate, sau între gruparea -OH şi azotul iminic =NH.

Legăturile de hidrogen se pot stabili şi între catenele laterale care au grupări carboxil, hidroxil, amino sau tiolice. Din punct de vedere energetic legătura de hidrogen nu este puternică dar datorită răspîndirii relativ uniforme de-a lungul scheletului proteic oferă proteinei stabilitatea necesară.

Legăturile de hidrogen au lungimea cuprinsă între 2,7-3,1A şi energia de 3-7 Kcal/mol .

Structura tertiara: legaturi intercatenare Legături disulfidice- foarte puternice,50-100kcal/mol şi au

un rol foarte important în stabilizarea arhitecturii spaţiale a moleculei proteice. Legătura este rezistentă la hidroliză, însă se poate desface iar prin reducere formează tioli (SH), iar prin oxidare formează acizi.În general legătura sulfidică se întîlneşte la proteinele transformate, care au o rezistenţă mecanică mare.

Structura tertiara: legaturi intercatenare

În afară de aceste legături se mai pot stabili : legături ionice (stabilite de obicei între grupările aminice şi cele carboxilice ionizate),

legături de tip van der Waals (legături electrostatice slabe care se stabilesc între radicalii hidrofobi),

legături fosfodiesterice (între 2 resturi de serină şi acid fosforic)

legături eterice (stabilite la nivelul aminoacizilor cu grupări hidroxilice.

Structura cuaternara

Se referă la modul in care se unesc subunităţile proteice.Enzimele care catalizează asamblarea acestor subunităţi poartă denumirea de holoenzime.

Proteine care au structura cuaternară :hemoglobina, ADN

polimeraza şi canalele ionice, dar şi nucleozomi şi nanotubuli, care sunt complexe multiproteice.

Fragmentele proteice pot suferi transformări în structura cuaternară, transformări care se reflectă fie în structurile individuale fie în reorientările fiecărei subunităţi proteice.

Numărul subunităţilor oligomerice sunt denumite prin adăugarea sufix-ului -mer (grecescul pentru subunitate), precedat de numele subunităţii.

1 = monomer 2 = dimer 3 = trimer 4 = tetramer

Structura cuaternara

Vedere 3 D a hemoglobinei cu cele 4 subunităţi (2roşu şi 2galben), iar unitatea hemică verde. Numele de hemoglobină este format din hem şi globină, denumire ce denotă faptul că hemoglobina are la bază proteine globulare cuplate cu o grupare hem

Cristalografia cu raze X- metoda de determinare a structurii proteinelor si acizilor nucleici

Generalitati

Cristalografia cu raze X

Este o metoda de determinare a structurii si ordinii atomilor dintr-un cristal utilizand un fascicol de raze X care care dupa ce loveste cristalul este imprastiat in diferite directii.

Masurand unghiul de difractie si intensitatea fascicollor rezultante, poate fi obtinuta o imagine tridimensionala a densitatii electronice a cristalului.

Cu ajutorul acestei imagini se pote determina pozitia fiecarui atom in cristal si a legaturilor chimice dintre atomi.

Fenomenul de difractie poate fi explicat cu ajutorul principiului lui Hygens din optica ondulatorie.

Difractia undelor- definitie

Difractia undelor consta in ocolirea de catre unda a obstacolelor, atunci cand dimensiunile acestora sunt comparabile ca ordin de marime cu lungimea de unda a radiatiilor (a undei). Schimbarea directiei de propagare a undei se numeste in acest caz difractie.

Cristalele Cristalele sunt structuri regulate care se repeta pe

cele trei directii in spatiu.Atomii au pozitii fixe in aceste structuri.

Prin difractie cu raze X s–a demonstrat ca simetria hexagonala a unui cristal de gheata rezulta din aranjamentul tetraedric al legaturilor de hidrogen dintre moleculele de apa.

Principiul fizic al difractiei

Atomii cristalului sunt aranjati regulat in plane paralele situate la distanta d unul de celalalt.

d= constanta retelei. Razele X pot fi utilizate in

experiente de difractie pentru ca lungimea lor de unda este de acelasi ordin de marime cu distanta dintre planele unui cristal

(1-100 Å )

Relatia lui Bragg: Difractia are loc in conditii optime si prezinta maxime de intensitate daca diferenta de drum optic este un multiplu al lungimii de unda a radiatiei X utilizata.

nd sin2

Exemplu- grafitul si diamantul

Chiar daca diamantul si grafititul au aceeasi compozitie chimica, fiind ambele carbon pur, cristalografia cu raze X a evidentiat o aranjare diferita a atomilor in spatiu, ceea ce le ofera proprietati diferite.

In diamant, atomii de carbon sunt dispusi tetraedral si legati prin legaturi covalente simple, facandu-l foarte rezistent in toate directiile. In contrast, grafitul este alcatuit din foi (paturi) suprapuse in care atomii de carbon sunt dispusi hexagonal prin legaturi delocalizate in raport 4/3. Nu exista legaturi covalente intre paturi, deci grafitul este usor de separat in bucati plate.

Realizari importante in domeniul biologiei si farmaciei

Cristalografia cu raze X a fost utilizata cu succes in cazul moleculelor biologice incepand cu dr. Dorothy Crowfoot Hodgkin, care a elucidat structura colesterolului (1937), vitaminei B12 (1945), penicillinei (1954), pentru care a primit premiul Nobel in Chimie in anul 1964. Apoi, in 1969, ea a descoperit structura insulinei, pentru care a lucrat peste 30 de ani.

Structura penicilinei: galben-carbon, verde-hidrogen, alb-oxigen, rosu-sulf, albastru-azot.

Diagrama tip panglici pentru mioglobina- sunt colorate lanturile alpha helix. In acesta structura intra mii de atomi, dar diagrama prezinta doar lantul polimeric incepand cu capatul N-terminus (albastru) pana la C-terminus (rosu).

Procedee experimentale

In difractia cu raze X se utilizeaza trei procedee experimentale:

1. Metoda Laue: asupra unui monocristal este trimis un fascicol de raze X cu spectru continuu, iar maximele de iterferenta obtinute in urma difractiei se formeaza numai pentru unghiuri de incidenta si lungimi de unda care satisfac relatia lui Bragg si sunt inregistrate pe o placa fotografica sau pe computer. Din distributia spatiala a maximelor de de interferenta se poate deduce tipul cristalografic caruia ii apartine substanta studiata.

Procedee experimentale

2. Metoda cristalului rotitor: cristalul asupra caruia se proiecteaza un fascicol de raze X este rotit in jurul unei axe, difractia se produce numai pentru pozitii care satisfac relatia Bragg.

Procedee experimentale

3. Metoda Debye-Scherrer (a pulberilor): proba continand substanta sub forma de pulbere policristalina este de forma cilindrica si asezata pe axul unei camere cilindrice, iar asupra ei este proiectat fascicolul monocromatic de raze X. In pulberea supusa analizei se vor gasi si cristale care satisfac relatia Bragg. In urma difractiei, pe o placa fotografica fixata pe peretii camerei cilindrice, se vor obtine maxime de difractie sub forma de linii, iar din distributia lor se poate determina constanta de difractie a retelei cristaline.

Dispozitivul practic se numeste goniometru.