Upload
alexandra-surugiu
View
533
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
UNIVERSITATEA “DUNĂREA DE JOS” DIN GALAŢIFACULTATEA:ŞTIINŢA ŞI INGINERIA PRODUSELOR
ALIMENTARESPECIALIZARE :C.E.P.A
PROIECT DE DIPLOMĂ
STUDIUL EFECTELOR DE CONTAMINARE A ALIMENTELOR CU MICOTOXINE
Coordonator ştiinţific,Prof. dr. ing. Clemansa Tofan
2008
1
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
CUPRINS
Cuprins…………………………………………………………………………..1Justificarea alegerii temei de licenţă…………………………………………….5
Introducere……………………………………………………………………....6
Partea întâi - PARTEA DOCUMENTARĂ
Capitolul 1- Micotoxinele....................................................................................7
1.1 Ce sunt micotoxinele?..................................................................................7
1.2 Principalele tipuri de micotoxine de importanţă economică........................8
1.2.1 Aflatoxinele...........................................................................................9
1.2.2 Ochratoxina A.....................................................................................13
1.2.3 Patulina................................................................................................17
1.2.4 Zearalenonă.........................................................................................18
1.2.5 Fumonisinele.......................................................................................20
1.2.6 Tricotecinele........................................................................................21
1.3 Prezenţa micotoxinelor în diverse produse alimentare...............................24
Capitolul 2- Factori care influenţează producerea micotoxinelor.....................30
2.1 Biogeneza micotoxinelor............................................................................30
2.2 Formarea micotoxinelor..............................................................................32
2.3 Influenţa factorilor extrinseci asupra apariţiei micotoxinelor.....................34
2.3.1 Temperatura...........................................................................................34
2.3.2 Umiditatea..............................................................................................37
2.3.3 Tensiunea superficială...........................................................................39
2.3.4 Presiunea osmotică................................................................................39
2.3.5 Lumina...................................................................................................40
2.3.6 Integritatea fizică a boabelor şi a învelişului
produselor vegetale.............................................................................................40
2.4 Influenţa factorilor intrinseci asupra apariţiei micotoxinelor.....................41
2.4.1 Natura substratului................................................................................ 41
2
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
2.4.2 Influenţa pH-ului asupra dezvoltării mucegaiurilor..............................42
2.4.3 Nutrienţi minerali..................................................................................43
2.4.4 Potenţialul de oxido- reducere..............................................................46
2.4.5 Bacterii..................................................................................................47
2.4.6 Microflora..............................................................................................47
2.4.7 Insectele ................................................................................................48
2.5 Descrierea mucegaiurilor cu potenţial toxicogen……………...................49
2.5.1 Principalele genuri de mucegaiuri din industria alimentară…………..48
2.5.2 Caracterizarea principalelor specii de mucegaiuri
cu potenţial toxicogen……………………………………………………….....50
2.5.2.1 Aspergillus flavus…………………………………………………52
2.5.2.2 Aspergillus nidulans………………………………………………53
2.5.2.3 Aspergillus versicolor……………………………………………..54
2.5.2.4 Aspergillus candidus………………………………………............55
2.5.2.5 Aspergillus ochraceus………………………………………..........56
2.5.2.6 Aspergillus tereus…………………………………………............57
2.5.2.7 Aspergillus fumigatus……………………………………..............58
2.5.2.8 Fusarium graminearum…………………………………………....59
2.5.2.9 Penicilium expansum……………………………………………...60
2.5.2.10 Trichotecium roseum…………………………………………….61
Capitolul 3 - Metode de limitare şi reducere a conţinutului în micotoxine a
unor produse alimentare de origine vegetală......................................................62
3.1 Strategii preventive: limitarea contaminanţilor......................................62
3.1.1 Practici recomandate înaintea recoltării............................................66
3.1.2 Practici recomandate în timpul recoltării..........................................68
3.1.3 Practici privind uscarea cerealelor....................................................69
3.1.4 Practici recomandate la depozitarea cerealelor.................................70
3.1.5 Practici recomandate în timpul transportului produselor..................71
3
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
3.1.6 Evitarea pătrunderii insectelor, păsărilor şi rozătoarelor în timpul
transportului........................................................................................................71
3.2 Strategii curative: decontaminarea..........................................................71
3.2.1 Metode fizice.....................................................................................72
3.2.1.1 Eliminarea fracţiunilor alterate.................................................72
3.2.1.2 Denaturarea toxinelor...............................................................74
3.2.2 Denaturarea chimică..........................................................................75
3.2.3 Adsorbţia toxinelor............................................................................78
3.2.4 Metode biologice de decontaminare..................................................85
Capitolul 4 - Metode de determinare a micotoxinelor....................................88
4.1 Pregătirea preliminară a
probelor............................................................88
4.1.1 Eşantionarea......................................................................................90
4.2 Metode calitative.....................................................................................95
4.2.1 Metode imunologice.........................................................................96
4.2.1.1 Testele RIA…………...............................................................97
4.2.1.2 Testele ELISA...........................................................................97
4.2.2 Metode de imunoafinitate................................................................99
4.2.2.1 Minicoloanele...........................................................................99
4.2.2.2 Coloane de imunopurificare......................................................99
4.3 Metode cantitative................................................................................100
4.3.1 Teste kit..........................................................................................100
4.3.2 Cromatografie în strat subţire (TLC).............................................100
4.3.3 HPLC(high performance liquid chromatography-
cromatografie cu lichid de înaltă performanţă).................................................101
4
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Partea a doua – PARTEA EXPERIMENTALĂ
1. Analiza microbiologică a cerealelor..........................................................103
1.1 Evaluarea calitativă.................................................................................103
2. Evidenţierea mucegaiurilor producătoare de aflatoxine............................106
3. Analiza calitativă a aflatoxinelor...............................................................108
3.1 Pregătire inocul......................................................................................108
3.2 Inoculare şi incubare..............................................................................109
3.3 Extracţie.................................................................................................109
Concluzii..........................................................................................................115Bibliografie......................................................................................................118
5
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Justificarea alegerii temei de cercetare
Micotoxinele prezente în mod natural în diverse produse alimentare constituie o
problemă serioasă de siguranţă alimentară, mai ales în anumite regiuni ale globului în care
condiţiile climatice sau standardele din agricultură sunt precare. Există dovezi convingătoare
care arată o asociere între expunerea la aflatoxine şi cancerul primar de ficat. Micotoxinele
produc pagube importante şi în zootehnie. Organizaţia pentru Alimente şi Agricultură (FAO)
estimează că pe plan mondial până la 25 % din culturile alimentare sunt semnificativ
contaminate cu micotoxine. Cele mai importante micotoxine care prezintă riscuri
semnificative pentru sănătatea omului sunt sintetizate de mucegaiurile care cresc pe cereale,
în special porumb, dar şi grâu, orz, ovăz şi orez.
Consecinţele consumului de alimente contaminate cu aflatoxină asupra sănătăţii omului
sunt estimate indirect pe baza efectului observat la animale. Susceptibilitatea omului la
aflatoxină nu este foarte bine cunoscută datorită rarităţii cazurilor. Date cu privire la doza de
risc pentru oameni au fost obţinute cu ocazia unor intoxicaţii colective izbucnite, una în India
în 1974 în cursul căreia au fost afectate aproape 400 de persoane din care o treime au murit şi
alta în Kenia în 1982, unde au fost spitalizate 20 de persoane dintre care au decedat 12.
Investigaţiile din care aceste focare de aflatoxicoză au dus la concluzia că ele s-au datorat
ingestiei repetate a unei cantităţi de 38-55 micrograme de aflatoxină/kg corp mai multe zile la
rând. Cercetările făcute de veterinari americani, sugerează că unii aditivi alimentari cum este
BHT (butil-hidroxitoluen, sau E 321) ar putea fi folosiţi în viitor ca măsură de protecţie faţă
de efectele nedorite ale alimentelor contaminate cu aflatoxină. Vivacitatea şi viteza de
răspândire în condiţiile naturale este uimitoare. De exemplu: dintr-un spor de Penicillium
aflat pe un mediu nutritiv, must de malţ cu agar, după a doua zi de la germinarea acestuia s-au
format 100.000 spori şi în următoarele 24 ore încă 2· spori. Pe un bob de grâu mucegăit cu
Penicillium verrucosum var. Cyclopium s-au numărat 25 milioane spori. O portocală
mucegăită este purtătoare a aproximativ 15 miliarde de spori.
6
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
INTRODUCERE
Dintotdeauna consumatorul a fost preocupat ca alimentele puse la dispoziţia lui să fie
sigure din punct de vedere igienico-sanitar, să nu îi provoace îmbolnăviri.
Astăzi, această cerinţă a devenit tot mai insistentă, întrucât consumul de alimente
pregătite pe scara industrială a crescut foarte mult şi deoarece, tot mai des, consumatorul află
că alimentele sunt cauza multor îmbolnăviri, uneori a unor decese, consumatorul este aşadar
vizat că nu în toate cazurile, alimentele consumate sunt de o calitate igienico-sanitară
corespunzatoare.
Contaminarea produselor cu mucegaiuri, ridică aspecte importante legate de pierderea
inocuităţii alimentului.
Atenţia deosebită acordată mucegaiurilor este datorată caracteristicilor anumitor specii
de fungi de a elabora şi elibera în aliment metaboliţi secundari numiţi micotoxine, care au o
structură chimică mai mult sau mai puţin cunoscută, dar şi capacitatea dovedită de a modifica
structuri normal biologice. Micotoxinele, ca metaboliţi ai anumitor tipuri de mucegaiuri au
astfel efecte nocive atât asupra sănătaţii omului, cât şi asupra animalului care consumă
alimente contaminate cu acestea.
Evoluţia tehnicilor de recoltare şi transformare a produselor agricole, transportul
alimentelor pe distanţe lungi şi prezentarea consumatorilor prin stocarea prelungită constituie
condiţii care dacă sunt realizate necorespunzător, devin favorabile dezvoltării
microorganismelor nedorite şi în particular, a mucegaiurilor.
Micotoxinele sunt metaboliţi ai mucegaiurilor cu o structură chimică mai mult sau mai
puţin cunoscută care au capacitatea de a modifica structuri biologice anormale, cu efecte
degradante atât la om,cât şi la animale. Aceste toxine pot fi conţinute în sporii de mucegai
sau de cele mai multe ori eliminate în substratul de creştere (aliment).
Oamenii de ştiinţă le-au descoperit la începutul anilor 1960 odată cu izbucnirea bolii
curcanilor x din Anglia. Aproape 100.000 de curcani au fost ucişi deoarece alunele pe care
le-au consumat erau contaminate cu Aspergillus flavus, un mucegai ce produce micotoxine.
7
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
PARTEA DOCUMENTARĂ
CAPITOLUL 1
Micotoxinele
1.1 Ce sunt micotoxinele?
Termenul de micotoxină vine de la cuvântul grecesc “mycos” care inseamnă “ciupercă” şi
de la cuvântul latin “toxicum” care înseamnă otravă. Ele desemnează metaboliţi secundari
secretaţi de mucegaiurile care aparţin în principal genurilor Aspergillus, Penicillium şi
Fusarium, prezente în mod natural în aerul ambient, pe pământ şi pe culturi.
Micotoxinele sunt considerate ca fiind parte din contaminanţi alimentari cei mai
semnificativi în ceea ce priveşte impactul asupra sănătăţii publice, securităţii alimentare şi
asupra economiei a numeroaselor ţări. Ele se găsesc pe o mare varietate de produse
alimentare înainte, în timpul şi după recoltă. Afectează numeroase produse agricole, anume
cereale, fructele, nucile, boabele de cafea, orezul şi plantele oleaginoase, care sunt substraturi
foarte sensibile la contaminarea cu mucegaiuri şi la producerea de micotoxine. Contaminarea
produselor de către micotoxine se realizează în cazul când întrunesc condiţiile de mediu pe
câmp pentru apariţia lor, precum şi procedee neadecvate de recoltare, de stocare şi de
transformare atunci când sunt cumulate. Prin diversitatea efectelor lor toxice şi a propietăţilor
lor sinergice, micotoxinele prezintă un risc pentru consumatorul alimentelor contaminate.
Tabel 1. Specii fungice producătoare de micotoxine
Micotoxine MucegaiuriAflatoxina B1, B2,G1,G2 Aspergillus parasiticus,Aspergillus
flavusOchratoxina A, B, C Aspergillus ochraceus,Aspergillus
carbonarius, Penicillium verrucosum Zearalenonă Fusarium roseum, Fusarium sp.Desoxinivalenol, Fusarenonă,Toxina T2
Fusarium tricinatum, Fusarium sp.
Fumonisine F. moniliforme, F. proliferatum, Fusarium sp.
Citrinina P. citrinumPatulina P. patulumAcidul penicilic A. ochraceus, A. CyclopiumMoniliformina A. proliferatum
8
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
1.2 Principalele tipuri de micotoxine de importanţă economică
Un consum de alimente contaminate cu anumite tipuri de mucegaiuri poate provoca la om
şi la animal, efecte nefavorabile pentru sănătate, de la apariţia unor forme de “hepatite
exudative”, până în prezent la consumatorii cronici a unor hepatoame (cancer hepatic).
Majoritatea micotoxinelor au capacitate cancerigenă.
Mecanismul cancerigen al acestora se manifestă prin capacitatea lor de a se fixa pe ADN, cu
producerea de alterări la acest nivel şi cu determinarea de schimbări, sub formă de mutaţii.
Din gama mare de micotoxine atenţia este îndreptată spre aflatoxine, ochratoxine,
sterigmatocistine, patulina.
Micotoxinele pot avea asupra organismului uman şi animal o serie de efecte negative
(fig. 1).
Fig. 1. Efecte toxice asociate micotoxinelor
9
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
1.2.1. Aflatoxine
După accidentele observate în 1960 în crescătoriile de curci (100.000 păsări moarte),
numeroase cercetări au fost conduse spre un grup de molecule cu înalte proprietaţi toxice:
aflatoxinele. Aflatoxinele constituie un grup de 18 compuşi cu structuri apropiate unde 4
compuşi au forme foarte frecvent întâlnite în alimente: B1, B2, G1 si G2.
Din punct de vedere chimic, aflatoxinele sunt un ansamblu dintre o cumarină şi trei
furani (figura 2). Sunt molecule cu masă moleculară mică (312 - 330 g/mol), foarte puţin
solubile. Sunt solubile în apă, insolubile în solvenţi nepolari. Foarte solubile în solvenţi
organici (cloroform şi alcool metilic), fiind uşor de extras. La lumina ultravioletă, sunt
fluorescente (albastru pentru AFB, verde pentru AFG, AFM1 prezintă o fluorescenţă
albastru-mov).
Fig. 2 Structura chimică a aflatoxinelor
10
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Sunt micotoxine produse de mucegaiuri din genul Aspergillus: Aspergillus flavus şi
Aspergillus parasiticus, mucegaiuri prezente în multe locuri şi sunt puţin exigente la creştere:
temperatura cuprinsă între 6 si 50˚C, sursa de carbon şi azot şi o valoare a aw mai mare de
80%. Din acest motiv, numeroase produse alimentare destinate consumului pot conţine
aflatoxine în cantităţi uneori importante: alune, porumb, grâu, fistic, cacao, cafea, manioc,
soia. Metabolizate de diverse enzime microzomiale, aflatoxinele sunt eliminate sub formă de
glucorani pe cale urinară, prin lapte sau bilă, dar pot apărea anumiţi derivaţi epoxidici. Fiind
electrofile, ele reacţionează la grupuri nucleofile de ADN sau de proteine. Microzomii
hepatici, conţin enzime cu înaltă activitate, capabile să oxideze numeroase substraturi
lipofile. Aceste reacţii necesită prezenţa oxigenului şi a NADPH (redus). Un atom de oxigen
este fixat pe substrat şi altul este redus în apă (NADP este oxidat). Astfel, aflatoxinele sunt
toxice pentru numeroase organisme vegetale şi animale procariote şi eucariote (alge,
ciuperci, bacterii).
Aflatoxinele au de asemenea un efect puternic teratogen şi pot provoca moartea în
câteva ore sau câteva zile , în funcţie de cantitatea de micotoxină şi sensibiltatea animalului.
Aflatoxinele au pe de altă parte un rol asupra fosforilărilor şi lipogenezei. În
concluzie, aflatoxinele sunt recunoscute ca fiind cei mai cancerigeni compuşi naturali, şi este
posibil să se obţină o relaţie liniară între incidenţa cancerului primitiv de ficat şi logaritmul
procentului de aflatoxină ingerată. Intoxicaţia acută cu aflatoxină se traduce prin moarte şi în
general cu simptome de depresie, anorexie, diaree, icter sau anemie. Mai presus de orice,
leziunile hepatice (necrozele şi cirozele) evoluează în final cu hepatome sau carcinome.
Formele cronice ale aflatoxicozelor se traduc printr-o scădere a performanţelor de creştere a
animalelor, anemie, icter lejer şi o evoluţie canceroasă în final. O doză de 0.2μg/kg timp de
470 zile declanşează un hematom la şoareci.
11
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Mecanismul acţiunii aflatoxinelor: Aflatoxina B1 pătrunde în celulă şi este fie
metabolizată de monooxigenază în reticulul endoplasmatic obţinîndu-se produşi metabolici
hidroxilaţi care sunt ulterior metabolizaţi la glucuronid şi conjugaţi sulfuraţi; fie este oxidată
obţinându-se epoxidul reactiv care este hidrolizat spontan şi se poate lega de proteine
devenind citotoxic. Epoxidul poate reacţiona cu ADN-ul sau cu proteinele, sau poate fi
transformat de o glutationă, S-transferaza la (GSH) – conjugat.
Datorită efectelor negative asupra organismului animal şi uman, limitele maxime
admise de aflatoxine în produsele alimentare sunt cuprinse între 0.05-15 (μg/kg) (tabel 2).
Aflatoxina M1În 1963 s-a demonstrat că la vite, aflatoxina B1 este absorbită cu hrana contaminată,
este metabolizată într-un derivat numit aflatoxina M1 care este regăsit în lapte. 0.5-4% de
aflatoxină B1 ingerată se regăsesc sub formă de aflatoxina M1 în lapte. Această micotoxină
păstrează , la o treaptă inferioară, importantele proprietăţi cancerigene ale aflatoxinei B1.
Astfel, efectul cumulativ legat cu ingerarea regulată a acestor toxine, face să se expună la
mari riscuri copii şi sugarii, marii consumatori de lapte şi produse lactate. Aceste riscuri sunt
cu atât mai importante deoarece aflatoxina M1 rezistă la tratamentele uzuale de conservare şi
procesare a produselor lactate. Aflatoxina M1 se regăseşte în totalitate în laptele smântânit şi
în produsele lactate (iaurt, brânză), se regăseşte foarte puţin în unt. Aceasta este legată de
prezenţa interacţiunilor hidrofobe între aflatoxina M1 şi cazeină.
12
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Tabel 2. Aflatoxine - limitele maxime admise
Produs Nivelul maxim de aflatoxina(μg/kg)B1 B1+B2+G1+G2 M1
AflatoxineArahide, nuci şi fructe uscate Arahidele, nucile şi fructele uscate şi produsele procesate din acestea, destinate consumului direct sau folosite ca ingredient alimentar
2.0 4.0 -
Arahidele supuse sortării sau altui tratament fizic,înainte de a fi consumate de către om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar
8.0 15.0 -
Nucile şi fructele uscate supuse sortării sau altui tratament fizic, înainte de a fi consumate de catre om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar
5.0 10.0 -
Cereale (inclusiv hrişca, Fagopyrum sp)Cereale (inclusiv hrişca) şi produsele procesate din acestea destinate consumului uman direct sau folosite ca ingredient alimentar
2.0 4.0 -
Cereale (inclusiv hrişca) cu excepţia porumbului, destinate sortării sau altui tratament fizic, înainte de consumul de către om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar
2.0 4.0 -
Porumbul destinat sortării sau altui tratament fizic, înainte de a fi consumat de către om sau de a fi folosit ca ingredient alimentar
5.0 10.0 -
Lapte (lapte batut, lapte pentru fabricarea produselor pe bază de lapte şi laptele tratat prin căldura, aşa cum este definit prin legislatia sanitara veterinara in vigoare
- - 0.05
Urmatoarele specii de condimente:- Capsicum spp. (fructele uscate ale acestuia, intregi sau macinate, inclusiv chilli, pudra de chilli, cayennesi paprika)- Piper spp.(fructele acestuia, inclusiv piper alb sau negru)- Myristica fragrans (nucşoara)- Zingiber officinale (ghimbir)- Curcuma longa (turmeric)
5.0 10.0 -
Alimentele pentru copii şi alimentele pe bază de cereale procesate, pentru sugari şi copii de vârstâ micâ
0.10 - -
Formulele pentru sugari şi formulele în continuare inclusiv laptele pentru sugari şi laptele în continuare
- - 0.025
Alimente cu destinaţie nutriţională specială destinate în special sugarilor
0.10 - 0.025
13
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
1.2.2. Ochratoxina A
Ochratoxina A a fost izolată pentru prima dată în 1965, de un grup de cercetători sud
africani. Din punct de vedere chimic este o moleculă de 3-metil-5 cloro-8 hidroxi-3,4
dehidroizocumarina, legată prin legatură peptidică, la nivelul grupărilor carboxil în C7, cu o
grupare aminică a L-β fenilalanina (figura 3).
Există şi alte ochratoxine ca ochratoxina B, care este derivat al ochratoxinei A şi
ochratoxina C – ester etilic. Aceste diferenţe de structură, au efecte marcante asupra
potenţialului toxic. Ochratoxina A este micotoxina cea mai toxică şi cea mai răspândită.
Ochratoxina A are o masă moleculară de 403,8 g/mol, cu un punct de topire la 90ºC,
când se cristalizează în xilen. Spectrul de adsorbţie UV variază cu pH-ul şi polaritatea
solvantului. Ochratoxina A posedă un maxim de adsorbţie de 333 nm, cu un coeficient de
extincţie molară de 5500 ml cm în metanol.
Este o micotoxină toxică, o doză de 2 ppm este suficientă pentru a opri creşterea animalului.
Este un contaminant frecvent al cerealelor, al cafelei, nucilor, fructelor uscate, piperului.
Ochratoxina A este un metabolit secundar, elaborat de diferite mucegaiuri din genurile
Aspergillus şi Penicillium. Producţia de ochratoxina A este legată de temperatura, umiditatea
mediului ambiant şi conţinutul de apă al suportului contaminant. Valorile minimale ale
umidităţii pentru producţia de ochratoxină oscilează între 0,83 şi 0,90, în funcţie de
mucegaiul studiat. Temperatura optimă pentru producţia de ochratoxină de către Aspergillus
ochraceus este de 28ºC, sinteza poate avea loc la temperaturi cuprinse între 15º si 37 ºC.
Penicillium veridicatum însă creşte într-o gamă de temperaturi care variază între 4º si 30ºC în
prezenţa unei umidităţi de 22%. În regiunile reci, ochratoxina este produsă de mucegaiuri din
14
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
genul Penicillium, iar în regiunile calde , ochratoxina este sintetizată de mucegaiuri din genul
Aspergillus .
Producţia de ochratoxină A este legată de psihologia proprie a fiecărei specii de mucegai şi
de parametrii ecologici.
În Europa şi Canada, Penicilium verrucosum este considerat ca fiind principalul mucegai
producător de ochratoxina A în cereale, formându-se în general pe alimente acide.
Concentraţiile de ochratoxina A, regăsite în alimente sunt foarte variate, şi sunt cuprinse între
câteva ng/kg până la multe zeci de mg/kg.
Mucegaiurile producătoare de ochratoxina A pot produce şi alte toxine sau pot cu alte
mucegaiuri să producă toxine diferite ca citrinina sau aflatoxine. Un fenomen de sinergism cu
ochratoxina A se poate deci produce şi poate complica analiza efectelor toxice, ceea ce nu
poate fi atribuit exclusiv ochratoxinei A.
Prezenţa ochratoxinei A în alimente prezintă un pericol pentru sănătatea umană şi
animală.
Ochratoxina A, odată ingerată este absorbită parţial la nivelul stomacului prin difuzia
pasivă a formei neionizate. Totuşi, acest mecanism pasiv nu contribuie decât la absorbţia
scăzută a ochratoxinei A.
Principala cale de absorbţie este nivelul intestinal. Procentul de absorbţie al
ochratoxinei A la nivel intestinal este de 66, 56, 56 si 40% la porc, şobolan, iepure şi pui.
Este apoi distribuită la diferite organe. Urmează apoi ciclul enterohepatic. Se pot întâlni
cantităţi mici de ochratoxina A liberă în sânge. Ochratoxina A are o mare afinitate pentru
15
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
anumite proteine plasmatice de care este fixată (aproximativ 90%). Se fixează pe albumina
serică şi pe o macromoleculă serică neidentificată cu masa moleculară de 20KDa.
Fixarea ochratoxinei de aceste proteine este un fenomen saturat. Mecanismul prin care
ochratoxina A se leagă de proteine este puţin cunoscut. S-a arătat că ochratoxina A sub forma
de di-anion, este legată la nivelul a două poziţii de fixare pe albumina serică. Aceste poziţii
de fixare aparţin subunităţilor II A si II B a albuminei serice. S-a arătat de asemenea că aceste
legături pot fi deplasate prin legături anionice, ca aspartamul, fenilalanina şi anti-inflamatorii.
Această fixare întârzie transportul ochratoxinei, la nivelul diferitelor organe, şi contribuie la
dezvoltarea efectelor cronice şi toxice ale acestei toxine.
Profilul toxicogenic al ochratoxinei A variază foarte mult în funcţie de specie. La om,
calea de eliminare a ochratoxinei este încă foarte lungă, şi a fost estimată la o lună. Pe de altă
parte, eliminarea ochratoxinei A a fost descompusă în două faze: una rapidă cu o trecere a
OTA în sânge de 20 ore, şi una secundă, mult mai lentă, unde trecerea OTA în sange este de
25,5 zile. OTA este distribuită la organe, unde este metabolizată în vederea eliminării sale.
EFECTE PATOGENICE/TOXICE-OTA
Mecanismul de acţiune ipotetic al ochratoxinei A: Ochratoxina A (OTA) este transportată în
celulă prin intermediul transportorilor organici anionici multispecifici. Structura chimică a
OTA conţine o grupare izocumarinică legată de fenilalanina (PHE). Multe studii au
demonstrat faptul că OTA poate altera procesele care implică fenilalanina şi multe dintre
efectele biologice ale OTA pot fi prevenite parţial prin suplimentarea cu fenilalanina sau
substanţe analoage.
16
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Datorită efectelor negative pe care le are ochratoxina A asupra sănătăţii omului şi
animalului, limitele maxime admise în produsele alimentare sunt cuprinse între 2 – 10 ppb
(tabel 3).
Tabel 3. Limite maxime admise pentru ochratoxina AProdusul Nivelul maxim
(μg/kg sau ppb)Ochratoxina A Cereale (inclusiv orez si hrisca) şi produse cerealiere derivateCereale brute (inclusiv orez si hrisca brute) 5.0Toate produsele derivate din cereale (inclusiv produse cerealiere procesate si boabe de cereale destinate consumului uman direct)
3.0
Stafide uscate 10.0 Cafea crudă prăjită şi cafea prăjită şi măcinată cu excepţia cafelei solubile Cafea solubila (cafea instant)
5.0
10.0 Vin (vin rosu, alb roze) şi alte tipuri de vin si/sau bauturi racoritoare pe baza de must de struguri
2.0
Suc de struguri, suc de struguri ca ingredient în alte băuturi răcoritoare, inclusiv nectarul de struguri şi sucul de struguri concentrat aşa cum este reconstituit
2.0
Must de struguri şi must de struguri concentrat destinat consumului uman direct
2.0
Alimente pentru copii şi alimente pe bază de cereale procesate pentru sugari şi copii de vârstă mică
0.50
Alimente cu destinaţie nutriţională specială destinate în special 0.50
17
Ochratoxina ACH 2 N
H
CH
CO 2HO
C
OH
O
O
CH 3
ClH H
H Legare de proteine
plasmatice
ADN aduct
Afectarea proceselor care implica metabolismul fenilalaninei (PHE)
Inhibarea sintezei proteice
Inhibarea enzimelor folosind PHE ca si
substrat
Legare de proteine citosolice si organelare
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
sugarilor Cafea verde, fructe uscate altele decat stafidele, cacao şi produsele din cacao, vinurile licoroase, produsele din carne, condimentele şi lemnul dulce (Glycyrrhiza glabra)
-
1.2.3. Patulina
Este o γ lactonă nesaturată, produsă de numeroase mucegaiuri, dar cel mai frecvent
de Aspergillus clavatus, o ciupercă a microflorei granelor, Penicillium expansum, agent de
mucegăire a merelor în depozite şi Bassochlamys nivea şi Bassochlamys fulva prezente sub
forma lor imperfectă.
În alimentaţia animală, este o micotoxină foarte frecventă în furajele depozitate ude
şi în cerealele cultivate în sladarii.
Este folosită de asemenea în farmacii ca antibiotic pentru a lupta împotriva
stafilococilor, însă toxicitatea sa a dus la abandonarea acestei întrebuinţări.
Efectele patulinei se manifestă prin leziuni congestive la nivelul plămânilor, rinichilor
şi splinei, dar poate provoca o degenerescenţă de neuroni în cortexul cerebral, putând rezulta
diferite simptome nervoase (paralizii, etc.). Poate avea efecte toxice asupra globulelor albe
(leucocite), cât şi proprietăţi cancerigene.
Potrivit Monitorului oficial al României din 26 noiembrie 2006 limita maximă
admisă pentru conţinutul de patulină este de 10 μg/kg. (tabel 4).
Tabel 4. Limite maxime admise pentru conţinutul de patulină
18
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Produsul Nivelul maxim(μg/kg sau ppb)
PatulinaSuc de fructe şi nectar de fructe, în special suc de mere şi sucurile de fructe ca ingrediente pentru alte băuturi;Suc de fructe concentrat după reconstituirea conform instrucţiunilor producătorilor
50.0
Băuturi spirtoase, cidru şi alte băuturi fermentate derivate din mere sau conţinând suc de mere
50.0
Produsele solide de mere, inclusiv compot de mere, piure de mere destinat consumului direct
25.0
Suc de mere şi produse solide din mere, inclusiv compot de mere şi piure de mere pentru sugari şi copii de vârstă mică şi etichetate şi comercializate ca destinate sugarilor si copiilor de vârstă mică.Alte alimente pentru copii altele decât cele pe bază de cereale procesate
10.0
1.2.4. Zearalenonă
Poate fi produsă de diferite specii de Fusarium: Fusarium culmorum, Fusarium
graminearum şi Fusarium Crookwellense. Este un compus cristalin, de culoare albă.
A fost numită iniţial toxina F2. Condiţiile optime pentru a se produce sunt umiditate
ridicată şi temperatură scăzută.
Fig. 5. Structura chimica a zearalenonei
19
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Se prezintă ca o lactonă nesaturată a acidului β exorcilic (figura. 5). Este termostabilă
şi rezistă la o depozitare prelungită. Prin hidrogenare, se reduce funcţia cetonică în alcool
astfel încât se obţin izomerii zearalenonei: izomerul α este folosit ca stimulent de creştere
pentru ovine. Nu are efecte toxice cronice. Porcul este animalul cel mai sensibil.
Contaminarea fungică intervine pe câmp, porumbul prezentând un mucegai roşu. Dar
producţia de toxine se realizează în principal în timpul depozitarii. Nu prezintă efecte toxice
cronice.
Limita maximă admisă pentru conţinutul de zearalenonă este de 20 μg/kg (tabel 6).
Tabel 5. Limite maxime admise pentru conţinutul de zearalenonă
Produsul Nivelul maxim(μg/kg sau ppb)
ZearalenonaCereale neprocesate altele decât porumbul 100Porumbul neprocesat -Făina de cereale cu excepţia făinii de porumb 75
Făina de porumb, pudăa de porumb, srot şi ulei rafinat de porumb -Pâine, produse de patiserie, biscuitiBatoane de porumb şi cereale pentru micul dejun pe bază de porumbBatoane din alte cereale si cereale pentru micul dejun altele decât cele pe bază de porumb
50-
50
Alimente pe baza de porumb procesat pentru sugari şi copii de vârsta micăAlimente pe bază de alte tipuri de cereale pentru sugari şi copii de vârsta mică
-20
EFECTE PATOGENICE/TOXICE-ZEARALENONA
Mecanismul de acţiune al zearalenonei: Zearalenona (Z), asemenea poliestrogenilor (PE) şi
al estrogenilor din mediu (AE), traversează pasiv membrana celulară şi se leagă de receptorii
estrogeni. Complexul receptor -Z ajunge în nucleu foarte rapid unde se leagă de receptori
nucleari specifici şi generează raspunsuri estrogene prin activarea genelor: acest lucru are ca
rezultat producerea de ARN mitocondrial (mARN) care codifică în mod normal producerea
de proteine care apar în mod normal prin legarea de receptorii estrogeni.
20
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
1.2.5. Fumonisinele
Sunt produse de diferite specii de Fusarium, în special de Fusarium moniliforme.
Cele mai toxice fumonisine sunt fumonisina B1 şi fumonisina B2. Se găsesc în principal în
porumb şi produsele pe bază de porumb. Are o structură liniară din 20 atomi de carbon cu
grupări metil, hidroxil şi doi substituienţi cu masa mai mare (figura 6).
Au de asemenea o funcţie aminică primară care ii conferă o reactivitate interesantă şi
o solubilitate în mediu apos. Sunt hepatotoxice, nefrotoxice. Se găsesc de obicei în porumb,
dar şi în orez, mirodenii, bere.
Fig. 6. Structura chimică a fumonisinelor
21
Receptorestrogen
Z
mARN
ZZ
PA PE
Complex ribozomal mARN
Proteina indusă hormonal
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
EFECTE PATOGENICE/TOXICE-FUMONISINE
Consecinţe: cantitatea crescută de sfinganină a produs moartea celulei; cantitatea scăzută de
ceramidă a produs moartea celulei; a alterat semnalele transmise prin căile mediate de bază
sfingoid 1-fosfat; a alterat funcţionarea în procesele modulate de lipide, sfingomielina şi
glicosfingolipide; se observă niveluri crescute de baze sfingoide 1-fosfat în ser şi în urină.
1.2.6. Trichotecinele
Au fost asociate încă de la începutul secolului cu consumul de “ cereale ameţitoare”
(de fapt mucegăite) în Siberia, având ca simptome greaţă, vărsături, ameţeli şi tulburări
vizuale. După descoperirea lor în anul 1974, s-a putut constata că sunt responsabile de
“Aleucie Toxică Alimentară” ( descreşterea numărului de globule albe), ca o consecinţă a
consumului de cereale mucegăite. În plus s-a văzut că tricotecinele sunt capabile să inducă
reacţii chimice cu irigaţii severe, inflamaţii, descuamări ale pielii în contact cu micotoxina.
Sub acest nume, sunt cunoscute mai mult de 75 de micotoxine, produse de Fusarium, dar şi
de Tricothecium, Mycothecium.
Toxicitatea poate fi folosită ca armă clinică dar se poate folosi şi în chimioterapii
datorită efectelor benefice.
Sunt grupate în tricotecine de tip A ( Toxina T-2 si HT-2) şi de tip B (desoxinivalenolul,
nivalenolul). Sunt formate dintr-un nucleu 12, 13 epoxitricotecine, format din patru cicluri
sixterpenice cu o dublă legătură şi un epoxid stabil. Cei cinci substituienţi care pot fi inseraţi
pe acest nucleu formează 148 compuşi cunoscuţi, grupaţi în patru grupe.
22
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Grupele A şi B sunt cele mai frecvente, şi sunt caracterizate prin prezenţa sau nu a unei
funcţii atomice în poziţia C8. Au o mare stabilitate şi rezistă atât la tratamente termice cât şi
alcaline. Toxicitatea este legată de numărul radicalilor substituiţi în nucleul central. Nu se
acumulează în organism, sunt eliminate prin fecale şi urină.
Toxina T-2 este produsă de numeroase specii de Fusarium, în special de Fusarium
tricinctum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium solani şi Fusarium equiseti .
- formula brută : C24H34O9,
- masa moleculară : 466,50 g/mol,
- solubila în solvenţi organici polari ca acetona sau acetonitrilul ;
- stabila în solvenţi ca acetatul de etil.
Toxina HT-2, este produsă de numeroase specii de Fusarium, în special de Fusarium
sporotrichioides şi Fusarium poae :
- formula brută : C22H32O8,
- masa moleculară : 424,5 g/mol,
- solubilă în solvenţi organici polari,
- stabilă în diferiţi solventi ca acetatul de etil.
Desoxinivalenolul (DON), trichotecina cea mai răspândita în lume şi este produsă de
F. graminearum şi F. culmorum :
- formulă brută : C15H20O6,
- masa moleculară : 296,36 g/mol,
- solubil în etanol, metanol, acetat de etil şi apă,
- stabil în acetat de etil la -18 °C.
Dintre trichotecine, cea mai frecvent întălnită este desoxinivalenolu. Limita maximă
admisă conform Monitorului oficial al României din 26 noiembrie 2006 este de 200ppb
(tabel 6).
23
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Tabel 6. Limite maxime admise pentru conţinutul de desoxinivalenol
Produsul Nivelul maxim(μg/kg sau ppb)
Desoxinivalenol (DON)Cereale neprocesate altele decât grâul dur, ovăz şi porumb 1250Grâul dur şi ovăzul 1750Porumb neprocesat -Făina de cereale, inclusiv făina de porumb 750Pâine, produse de patiserie, biscuiţi, batoane de cereale şi cereale pentru micul dejun
500
Paste fainoase (uscate) 750Alimente pentru copii şi alimente pe baza de cereale procesate pentru sugari şi copii de vârstă mică
200
Modul de acţiune la nivel molecular al DON şi al altor tricotecene: DON pătrunde în
celulă prin difuzie şi se leagă de ribozomii activi care transmit un semnal la proteinkinazele
activate de ARN (PKR) şi la hematopoetokinaza celulară (HCK). Are loc fosforilarea
protein-kinazelor activate (MAPKS) şi se obţine activarea factorului de transcripţie având ca
rezultat efectele cronice şi imunotoxice.
EFECTE PATOGENICE/TOXICE-TRICHOTECINE
24
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
1.3 Prezenţa micotoxinelor în diverse produse alimentare
Micotoxinele în cereale
Practica a demonstrat faptul că, la depozitarea cerealelor, a produselor de măciniş şi
panificaţie apare în anumite condiţii o microfloră care favorizează creşterea mucegaiurilor şi
producerea de micotoxine. Mucegaiurile existente în depozitele de cereale se înmulţesc când
umiditatea relativă a aerului se situează între 80-85 %, iar temperatura ajunge la peste 26º C.
Produsele atacate la rândul lor devin sursa de infecţie, acumulând toxine. Aflatoxinele au fost
puse în evidenţă în pâine, produse de panificaţie, crupe de porumb şi în unele tipuri de pâine
dietetică. În cereale pe lângă ochratoxina A s-a pus în evidenţă şi alţi metaboliţi toxici ai
fungilor, cei mai mulţi din genurile Aspergillus şi Penicillium, care trec şi în produsele de
măciniş, concentraţiile cele mai mari înregistrându-se în tărâţe. Şi în făina depozitată în
condiţii de umiditate ridicată pot apărea fungi care produc micotoxine (Fusarium, Mucor,
Penicillium, Aspergillus).
Porumbul recoltându-se la o umiditate ridicată poate favoriza apariţia mucegaiurilor
(Aspergillus flavus) chiar încă din câmp.
Orezul poate fi contaminat cu micotoxine, inclusiv aflatoxine, dar prin autoclavare
aflatoxinele sunt inactivate. Micotoxinele din produsele de măciniş pot trece în pâine numai
când se folosesc materii prime puternic contaminate. Este de remarcat faptul că fermentarea
aluatului reduce în mică măsură cantitatea de aflatoxine, coacerea nu are nici un efect asupra
lor, dar adaosul în aluat de substanţe oxidante ( tipul bromaţilor) pot determina reduceri
importante în aflatoxine. Cercetările efectuate au scos în evidenţă că pentru inhibarea
dezvoltării microorganismelor în pâine se pot folosi diverşi fungistatici ca: acidul sorbic şi
palmitatul de sorboil. Pâinea de secară cu aciditate între 8.8-9.7 grade de aciditate, nu permite
aciditatea, formarea ochratoxinelor, iar pe cea de grâu se dezvoltă cantităţi mici din toate cele
4 tulpini izolate.
Micotoxinele în seminţe oleaginoase şi în ulei
Şi seminţele oleaginoase (arahidele etc.) pot fi atacate de mucegaiuri (inclusiv Aspergillus
flavus) care dau naştere aflatoxinelor; momentele critice fiind recoltarea şi depozitarea,
condiţii de climă, de păstrare etc.
25
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Umiditatea arahidelor (apa) în perioade ploioase poate ajunge la 30%; recomandându-se
uscarea imediată a acestora pentru a preveni contaminarea cu aflatoxine. La obţinerea uleiului
prin presare cantitatea mare de micotoxine rămâne în turte, numai 5% trece în ulei, respectiv
aflatoxinele din ulei reprezintă 10% din cantitatea existentă în boabe, ceea ce nu reprezintă un
pericol mare. Prin prăjire la arahide se reduce conţinutul de substanţe toxice.
Floarea soarelui respectiv seminţele sunt şi ele mediu bun pentru dezvoltarea aflatoxinelor.
Uleiul din seminţe de floarea soarelui, conţine cantităţi mici de aflatoxine, deoarece prin
procesul de rafinare, (tratare cu alcali) şi filtrare (prin plăci de celuloză-azbest) se reduce
cantitatea de toxine, iar dacă se execută decolorarea în prezenţa acidului citric detoxifierea
este mai completă.
Micotoxinele din legume şi fructe
Legumele şi fructele pot fi şi ele contaminate cu mucegaiuri care pot sintetiza micotoxine.
Astfel la morcovi Aspergillus parasilicus sintetizează Aspergillus flavus, iar pe suprafaţa
citricelor se dezvoltă Aspergillus parasilicus. Dezvoltarea mucegaiurilor pe fructe, în sucuri
formează în majoritatea cazurilor patulina, cantităţi mai mici s-au găsit în sucuri de pere,
gutui, struguri, excepţii făcând sucurile de tomate şi prune; în sucul de mere concentrat
patulina nu se reduce.
Şi pe fructele uscate se pot forma aflatoxine. Zahărul are efect de protecţie asupra
micotoxinelor, ceea ce a făcut ca patulina să existe şi în gemuri.
Micotoxine în cafea şi cacao
În cafea verde mucegăită s-a identificat Aspergillus ochraceus, iar cu frecvenţă mai mică
Aspergillus flavus şi Aspergillus versicolor; prin prăjire se distrug 75%. Boabele de cacao
conţin micotoxine, produse de Aspergillus parasilicus.
Micotoxine în băuturi fermeentate
În băuturile alcoolice au fost depistate aflatoxine, mai frecvent în cidru, prin fermentarea
pulpei. Cercetările efectuate pe 150 de probe de vin nu a evidenţiat aflatoxine. Malţificarea
necorespunzătoare a orzului poate forma aflatoxine, în bere trec 5-10% din cele existente în
malţ.
26
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Micotoxinele în carne şi preparate din carne
Micotoxinele pot infecta carnea animalelor ca urmare a ingerării de furaje mucegăite, cea
mai mare cantitate din micotoxină ochratoxină se acumulează în rinichi. Ochratoxina are o
termostabilitate ridicată; prin prăjire se reduce concentraţia de micotoxină, dar în ţesutul gras
nu se schimbă.
Preparatele din carne pot fi contaminate cu mucegaiuri din genurile: Penicillium,
Aspergillus, Fusarium. Şi salamurile fermentate-uscate pot fi contaminate cu tulpini de
Penicillium şi mai multe tulpini de Aspergillus. Dezvoltarea mucegaiurilor are loc atunci
când păstrarea produselor se face în condiţii nefrigorifice, iar pentru prevenirea dezvoltării
acestora este necesar adăugarea de sorbat de potasiu. S-a constatat că o sursă de infectare a
preparatelor de carne cu mucegaiuri o constituie şi condimentele.
Micotoxinele în lapte şi produsele lactate
Furajele cu conţinut mare de aflatoxine determină la vaci, prezenţa în lapte a unui metabolit
al aflatoxinei B1, denumit milktoxin, care este detectat chiar din primele zile de la ingerare,
declanşând o degerescenţa a celulelor ficatului. Cantitatea de toxină este mai mare în lapte
iarna faţă de primăvara. Şi în laptele praf cercetările au pus în evidenţă existenţa unui număr
mare de mucegaiuri, ca urmare a depozitărilor în condiţii necorespunzătoare. Laptele praf
contaminat cu Aspergillus versicolor produce diaree puternică, iar Penicillium ciclopium
produce simptome nervoase.
În brânzeturi micotoxinele apar ca urmare a prezenţei mucegaiurilor atât în mediul ambiant
cât şi în urma proceselor tehnologice. Absenţa microorganismelor fungice s-a constatat la
telemea şi în unele cazuri la caşcavalul tip Dobrogea. Valorile maxime de micotoxine s-au
constatat la sortimentele păstrate un timp mai îndelungat.
Cu cât consistenţa pastei este mai tare, cu atât filamentele de mucegai pătrund mai greu
în profunzime, numărul cel mai mic de mucegaiuri se înregistrează la brânzeturile opărite; în
brânzeturile topite frecvenţa aflatoxinelor este mult mai mică decât la celelalte tipuri.
Cercetările au arătat că mucegaiurile Penicillium caseicolum, Penicillium camemberti şi
Penicillium roqueforti nu formează toxine. Totuşi, cercetările întreprinse de Scott au
evidenţiat faptul că Penicillium camemberti şi Penicillium roqueforti utilizate la fabricarea
brânzeturilor sunt capabile să producă substanţe toxice (patulina, acid penicilic şi alcaloizi
toxici).
27
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Conform Ordinului nr. 1050/97/1145/505/2005 sunt admise urmatoarele limite
maxime pentru aflatoxine in produse, care sunt prezentate in tabelul de mai jos.
Tabel 7. Nivel maxim admis pentru aflatoxine conform Ordin nr.
1050/97/1145/505/2005
Nr. crt. Produs Nivel maxim de aflatoxină(µg/kg = ppb)
B1 B1+B2+G1+G2 M1
1 Arahide, nuci şi fructe uscate şi produse procesate din acestea destinate consumului
uman direct sau folosite ca ingredient alimentar
2 4 -
2 Arahide supuse sortării sau altui tratament fizic, înainte de a fi consumate de către om sau de a fi folosite ca ingredient alimentar
8 15 -
3 Nuci şi fructe uscate supuse sortării sau altui tratament fizic înainte de a fi folosite ca
ingredient alimentar
5 10 -
4 Cereale (inclusiv hrişcă, Fagopyrum sp.) şi produse procesate din acestea destinate consumului uman direct sau folosite ca
ingredient alimentar
2 4 -
5 Cereale (inclusiv hrişcă, Fagopyrum sp.) cu excepţia porumbului, destinate sortării sau altui tratament fizic, înainte de consumul
uman sau ca ingredient alimentar
2 4 -
6 Porumb destinat sortării sau altui tratament fizic, înainte de a fi consumat de către om sau
de a fi folosit ca ingredient alimentar
5 10 -
7 Lapte (lapte brut, lapte pentru fabricarea produselor pe bază de lapte şi lapte tratat prin
căldură, aşa cum este definit prin legislaţia sanitar-veterinară în vigoare)
- - 0,05
8 Condimente (piper, nucşoară, ghimbir, turmeric, chilli, pudră de chilli, paprika)
5 10 -
9 Alimente pentru copii şi alimente pe bază de cereale procesate, pentru sugari şi copii de
vârstă mică
0,10 - -
10 Alimente cu destinaţie nutritională specială, pentru sugari
0,10 - 0,025
28
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Datorită faptului că micotoxine se găsesc în unele produse alimentare, pentru a proteja
sănătatea consumatorilor într-o serie de ţări s-au luat măsuri de limitare a cantităţii de
micotoxine.
Tabel 8. Limita concentraţiei admisibile (LCA) de aflatoxine în diferite ţări
Nr crt Ţara Produse alimentare LCA Mg/kg
aflatoxină
1 Belgia Toate produsele alimentare 40
2 Brazilia Unt de cocos (export), făina din arahide 50
3 Canada Nuci, produse cu nuci, unt de cocos, alune comestibile şi derivate 15
4 Danemarca Produse importate de U.E, produse din
Brazilia (arahide si făina de arahide).
5-10
5 Franţa Toate produsele alimentare (admite limitele impuse de U.E) 5-10
6 Italia Arahide din import (si derivatele de prelucrare). 50
7 India Făina de arahide 30
8 Israel Toate produsele alimentare 20
9 Japonia Toate produsele alimentare 10
10 Anglia Arahide 50
11 Polonia Toate produsele alimentare 5
12 Suedia Toate produsele alimentare 5-10
13 Germania Toate produsele alimentare 5-10
14 S.U.A Arahide de consum şi alte alimente 20
15 România Produse alimentare 5
Micotoxinele în preparatele enzimatice fungice
O preocupare importantă a cercetării ştiinţifice actuale o constituie şi problema folosirii
preparatelor enzimatice în industria alimentară, ca urmare a eficienţei economice, reducerii
timpului de fabricaţie şi a consumurilor specifice, îmbunătăţirii calităţii produselor.
29
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Acestea în majoritatea cazurilor fiind de natură fungică s-a ridicat problema verificării
inocuităţii lor, deoarece în condiţii de cultură există posibilitatea dezvoltării de micotoxine.
Părerile specialiştilor în această direcţie sunt contradictorii, deoarece mucegaiurile
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, etc, produc toxine doar în anumite condiţii de cultură.
De remarcat este faptul că la preparatele obţinute, la aceleaşi mucegaiuri apar diferenţe de
toxicitate.
Preparatele enzimatice nepurificate care sunt obţinute din aspergili pot să ducă la apariţia
unor dereglări profunde, datorită includerii unor metaboliţi toxici (aflatoxine, ochratoxine,
acid aspergilic etc). În urma analizării preparatelor enzimatice din Rhizopus s-a constatat
acţiunea lor negativă asupra organismului animal, ceea ce a determinat scoaterea acestora din
fabricaţie. S-au izolat două micotoxine în preparatele pectolitice obţinute din Sclerotinina
sclerotium şi care au acţiune toxică asupra ficatului, dar şi un posibil efect cancerigen
(tabel 9)
Tabel 9. Posibilităţi de reducere a conţinutului de micotoxine în prod. alim.
Nr.crt.
Metoda aplicată Efecte
1. Prevenirea dezvoltării
mucegaiurilor toxicogene
Reducerea dezvoltării mucegaiurilor toxicogene
2. Procedee prin extracţie cu
solvenţi organici
Aflatoxinele se dizolvă în aceştia
30
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
CAPITOLUL 2
Factori care influenţează producerea micotoxinelor
Micotoxinele sunt metaboliţi secundari produşi de mucegaiuri aparţinând în principal
genurilor Aspergillus, Penicillium şi Fusarium.
În condiţii nefavorabile de temperatură şi umiditate, mucegaiurile care contamineaza
alimentele au capacitatea de a elabora metaboliţi toxicogeni. Prin consumul de nutreţuri
contaminate cu micotoxine, acestea sunt preluate de animal care le poate metaboliza doar
partţal. De la animal, micotoxinele ajung la om prin consumul de carne, în care micotoxinele
sunt cumulate, prin consumul de ouă, lapte şi produse lactate, în care micotoxinele sunt
excretate. Acestea devin alimente nocive pentru om, adica îţi pierd inocuitatea.
Condiţiile de toxicogeneză sunt în general mai restrictive decât cele necesare creşterii
mucegaiurilor.
2.1 Biogeneza micotoxinelor
Formarea micotoxinelor poate avea loc la toate stadiile din câmp şi până la
comercializarea produselor pentru consumul animal şi uman.
Natura micotoxinelor produse şi care contaminează alimentele depinde de speciile
fungice, de condiţiile ecologice şi de stabilitatea acestor toxine în mediu alimentar.
Micotoxinele nu contituie o clasă chimică. Sunt metaboliţi secundari care nu joacă un rol
evident în economia microorganismelor:
în comparaţie cu metabolismul primar care este cu temeinicie acelaşi pentru toate
fiinţele vii, metabolismul secundar depinde de speciile considerate, în acest caz,
susele;
metabolismul secundar, foarte important la mucegaiuri, aduce o mare diversitate de
molecule, din care micotoxinele;
metaboliţii secundari sunt foarte adesea elaboraţi de familia de produşi chimici
vecini, din punct de vedere toxicologic, aceasta explică în parte că pentru aceeaşi doză de
toxină, efectele sunt foarte grave şi mai puţin specificate în intoxicaţiile naturale faţă de
intoxicaţiile experimentale efectuate cu o micotoxină pură.
31
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Natura produselor care se acumulează în aval, depinde de caracterele individuale ale
suselor şi de condiţiile de mediu.
La ora actuală se cunosc în jur de 200 de specii de mucegaiuri care au capacitatea de a
forma micotoxine.
Fig. 7. Biosinteza micotoxinelor
Originea chimică a micotoxinelor este foarte diversă, unele derivă din aminoacizi
(alcaloizii de ergot, acidul aspartic, acidul ciclopiazolic, slaframina, glioxina, roquefortin,
sporodesina), altele sunt policetoacizii ( aflatoxinele, ochratoxina, patulina, citrinina, acidul
penicilic, sterigmatocistina, zeararlenona), iar altele sunt derivaţi terpenici ( fusarenona,
desoxinivalenolul, varidina, toxina T-2).
Micotoxinele se formează la finalul fazei exponenţiale şi începutul fazei staţionare a
creşterii mucegaiului (figura. 8).
Fig. 8 Fazele de creştere fungică şi localizarea sintezei micotoxinelor
2.2 Formarea micotoxinelor
32
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Formarea micotoxinelor pe produsele alimentare presupune parcurgerea următoarelor etape:
2.2.1. Infestarea cu mucegai – este favorizată de temperaturi ridicate şi de umiditatea
redusă a solului
2.2.2 Colonizarea –favorizată de atacul de insecte:
- distrugerea barierelor fizice facilitează raspândirea infecţiei pe produs;
- distrugerea pericardului favorizează infecţia interiorului boabelor;
- descreşterea umidităţii boabelor ÷35%;
2.2.3. Producerea de micotoxine –favorizată de:
- temperaturi ridicate;
- precipitaţii reduse-stres hidric al plantelor;
- alţi factori limitativi ai plantelor cu boabe în curs de formare;
- prolina, factor, semnal de stres în plante induce sinteza toxinelor în tulpinele
toxicogene;
33
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Creşterea microbiană şi producţia de toxine este influenţată de numeroşi factori (fig. 9).
Este important să cunoaştem modul în care aceşti factori influenţează calitativ şi cantitativ,
dezvoltarea microorganismelor şi producţia de toxine pentru a putea stabili condiţiile optime
de depozitare a cerealelor.
Fig. 9. Factori care favorizeaza creşterea fungica şi producţia de toxine
.
Pentru a întelege modul în care celula microbiană reacţionează la condiţiile mediului
ambient, diferiţi factori au fost împarţiţi arbitrar în trei mari grupe, cu precizia că în condiţiile
naturale, bioefectul acestora poate fi cumulativ sau sinergic:
Factori extrinseci sunt factorii exogeni, ai mediului natural/industrial: temperatura,
umezeala relativă a aerului, concentraţia de oxigen, radiaţii, factori mecanici,
factori chimici, ş.a.
34
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Factori intrinseci sunt factori dependenţi de natura alimentului care influenţează
creşterea şi activitatea culturilor starter dar şi de natura alterării specifice a
produselor alimentare-compoziţia chimică şi concentraţia în nutrienţi, pH, rH,
structura anatomică, substanţe chimice .
Factori impliciţi sunt factori biologici determinaţi de relaţiile ce se pot stabili între
diferitele grupe de microorganisme care alcătuiesc microbiota alimentului
respectiv.
2.3 Influenţa factorilor extrinseci asupra apariţiei micotoxinelor
2.3.1 Temperatura
Temperatura are influenţă asupra speciei de mucegai, dar şi asupra produselor de
metabolism.
Procesele metabolice se desfăşoară în limite stricte de temperatură, specifice fiecărui
microorganism. Acest factor poate favoriza sau inhiba dezvoltarea microorganismelor, iar în
anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora. Efectul temperaturii asupra
dezvoltării microorganismelor se datoreşte influenţei pe care aceasta o exercită asupra:
- stării de agregare a apei, în funcţie de care se măreşte sau se micşorează disponibilitatea
apei;
- vitezei reacţiilor enzimatice;
- plasticităţii membranei celulare şi citoplasmei;
- macromoleculele pe care le pot denatura;
Mucegaiurile se dezvoltă la temperaturi diferite. Există pentru fiecare specie, un grad de
temperatură la care dezvoltarea se face cu cea mai mare intensitate. Această temperatură se
numeşte temperatura optimă de dezvoltare. Deasupra şi sub temperatura optimă, dezvoltarea
mucegaiurilor slăbeşte, şi când atinge un anumit punct, superior sau inferior, încetează de a se
mai dezvolta chiar dacă mediul nutritiv ramâne acelaşi.
Temperatura superioară optimului, la care se mai poate observa o foarte slabă dezvoltare
a mucegaiurilor, se numeşte temperatura maximă iar cea inferioară, temperatura minimă de
dezvoltare. Când temperatura se ridică deasupra maximului de temperatură, mucegaiul este
distrus. Dacă temperatura scade sub minimul de temperatură, mucegaiul nu este distrus ci se
găseşte într-o stare de viaţă foarte lentă, favorabilă conservării.
35
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Temperatura optimă pentru creşterea mucegaiurilor este cuprinsă între 25-30ºC iar limita
maximă este de 40-45ºC (tab.10). Există totuşi mucegaiuri care se pot dezvolta fără probleme
la temperaturi de 55ºC Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, dar şi mucegaiuri care sunt
capabile să se dezvolte la temperaturi de 0ºC, Penicillium cyclopium.
Tabel 10. Temperaturi minime necesare pentru dezvoltarea unor mucegaiuri şi
pentru producţia de micotoxine.
Mucegai ºC Micotoxina ºC
Aspergillus flavus 10 Aflatoxine 10
Aspergillus clavatus 10 Patulina 12
Aspergillus ochraceus 10-12 Ochratoxina 12
Penicillium expansum 0 Patulina 0-24
Penicillium cyclopium 0 Ochratoxina 0-24
Penicillium cyclopium 0 Acid penicilic 4
Fusarium roseum 15 Zearalenona 10
Se observă că sunt unele situaţii în care există o apropiere între temperatura minimă
necesară pentru creşterea mucegaiului şi cea la care are loc producerea de micotoxine. Există
totuşi unele excepţii când temperatura de dezvoltare a mucegaiului este cuprinsă între
6°-45ºC cu un optim la 37ºC iar producţia de micotoxine are loc într-un interval de
temperatură cuprins între 11°-36ºC cu un maxim la 30ºC.
Fusarium roseum (producător de zearalenonă) se dezvoltă bine între 24-27ºC, iar
producţia de micotoxine are loc la temperaturi cuprinse între 10-12ºC. Totuşi, sunt varietăţi
ale lui Fusarium roseum, ca Fusarium roseum „gibbsosum” şi Fusarium roseum
„semitectum” care au capacitatea de a produce în orz la 25ºC, cantităţi de zearalenonă
echivalente cu producţia de micotoxină la temperatura de 10ºC. Plecând de la aceste
temperaturi minime necesare pentru creşterea anumitor mucegaiuri, putem spune că sunt
condiţii optime pentru o creştere şi proliferare fungică la o valoare optimă mai mare de 0.75,
o temperatură mai mare 20ºC şi o umiditate a substratului de 14%.
Mucegaiurile se împart în linii mari, după temperatura de dezvoltare în: mezofile, termofile,
termotolerante si psichrofile. Majoritatea mucegaiurilor sunt mezofile.
36
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Tabel nr.11 Exigenţele termice pentru dezvoltarea mucegaiurilor
Mezofile Temperatura
Maxim <50ºC
Minim >0ºC
Optim 15-30ºC
Termofile
Maxim 50ºC
Minim 20ºC
Termotolerante
Maxim 50ºC
Minim >0ºC
Optim 15-40ºC
Psihrofile
Maxim 20ºC
Minim <50ºC
Optim 0-17ºC
La temperaturi foarte joase, de până la -19ºC, mucegaiurile nu sunt omorâte, sporii lor
supravieţuiesc şi rămân apţi germinării atunci când se întorc în condiţii normale. Această
mare stabilitate a mucegaiurilor la temperaturi joase permite în micotecă conservarea uşoară
surselor prin tehnici de liofilizare.
În atmosfera cu temperaturi ridicate, tunelele de uscare a alimentelor tocate, se observă o
microfloră fungică foarte abundentă în care domină speciile termofile sau termorezistente ca:
Aspergillus flavus şi Aspergillus fumigatus. Rhiyopus pusillus, izolat în diverse substraturi
(cacao, cereale, boabe de muştar), este capabil să se dezvolte până la 57ºC. Fără să crească,
poate avea spori care să supravieţuiască la temperaturi foarte ridicate, şi de asemenea, acest
şoc termic stimulează după acea germinare; este cazul ascosporilor de B. Fulva, un
contaminant al sucului de fructe şi ascosporii de Neurospora crasă care se găseşte în lemnul
ars şi în brutării, tubul germinativ dezvoltându-se după expunerea timp de 5-20 minute la
temperaturi mai mari de 100ºC.
37
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
2.3.2 Umiditatea
Cantitatea de apă existentă în mediul ambiant şi în substraturi este unul din factorii
importanţi pentru dezvoltarea mucegaiurilor şi pentru producţia de micotoxine.
În atmosferă există o umezeală relativă de 70-90% şi prin păstrarea alimentelor, în timp, în
funcţie de temperatură şi compoziţia produsului are loc o absorbţie a vaporilor de apă din aer,
instalându-se o stare de echilibru, cu creşterea cantităţii de apă liberă şi a indicelui de
activitate a apei. Este ştiut faptul că mucegaiurile apar după o creştere accidentală a
umidităţii. Însă, nu doar cantitatea de apă influenţează ci şi forma de prezentare a acesteia
(liberă sau legată).
Apa liberă este apa din interiorul celulelor şi poate fi eliminată fără a interveni în
procesele vitale.
Apa legată face parte integrată din celule. Pentru germinare, sporii de mucegai au nevoie
ca apă să se găsească în formă liberă.
Există două unităţi relaţionate cu cantitatea de apă:
umiditate relativă de echilibru (HRE): este cantitatea de apă care dispun
microorganismele, fiind echilibrul între conţinutul de apă liberă al produsului şi vaporii de
apă existenţi în mediul ambient. Se exprimă în procente şi variază de la un produs la altul în
funcţie de conţinutul acestuia în glucide sau materie grasă.
apa disponibilă sau activitatea apei (aw) este relaţia existentă între apa liberă din
alimente şi capacitatea microorganismelor pentru proliferare. Activitatea apei ne indică care
este cantitatea de apă disponibilă pentru dezvoltarea microorganismelor.
aw se exprimă ca relaţia existentă între tensiunea vaporilor de apă în substratul (P) şi apa
pură (Po), la aceeaşi temperatură, (aw =P/Po). Dacă umiditatea alimentului este în echilibru
cu umiditatea relativă de echilibru a atmosferei, aw este numeric echivalentă cu aceasta (aw =
HRE/100).
Valorile aw la diverse grupe de mucegaiuri variază în funcţie de temperatură şi substrat.
Comportamentul diferit al mucegaiurilor în funcţie de exigenţa lor faţă de valoarea aw, face
ca aceasta să se împartă în:
specii xerofile la care germinarea sporilor este posibilă la o valoare a aw mai
mică de 80%, în special specii din genul Aspergillus repens, Aspergillus
glaucus, Aspergillus versicolor, Aspergillus flavus, Aspergillus nidulans;
21212
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
specii mezofile cu o exigenţă la apa cuprinsă între 80-90% Penicillium
cyclopium, Penicillium expansum, Alternaria, Cladosporium cladosporioides;
specii hidrofile (superioare 90%) Epicoccum nigrum, Fusarium ssp, Mucorales;
Tabel 12. Valori ale aw necesare pentru dezvoltarea unor mucegaiuri şi pentru
producţia de micotoxine
Mucegai aw Micotoxină aw
Aspergillus flavus 0.78 Aflatoxine 0.83
Aspergillus parasiticus 0.70 Aflatoxine 0.80
Penicillium expansum 0.85 Patulina 0.99
Penicillium patulum 0.83 Patulina 0.95
Aspergillus clavutus 0.85 Patulina 0.99
Aspergillus achraceus 0.77 Ochratoxine 0.88
Aspergillus ochraceus 0.77 Acid penicilic 0.90
Penicillium cyclopium 0.82 Ochratoxine 0.90
Penicillium viridicatum 0.83 Ochratoxine 0.90
Penicillium citrinum 0.80 Citrina 0.88
Penicillium martensii 0.79 Acid penicilic 0.99
Se observă că majoritatea mucegaiurilor se dezvoltă plecând de la valori ale aw-0.7. În
general sunt rare cazurile în care anumite mucegaiuri germinează la valori ale aw cuprinse
între 0.6 şi 0.7. Totuşi producţia de micotoxine este nulă sau foarte scăzută la valori ale aw
mai mici de 0.85, iar creşterea mucegaiurilor toxicogene se poate realiza într-un interval al
aw cuprins între 0.70-0.85.
31213
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
2.3.3 Tensiunea superficială
Microorganismele sunt influenţate de tensiunea superficială a mediului în care se găsesc.
Substanţele care coboară tensiunea superficială întârzie sau împiedică dezvoltarea
mucegaiurilor, aceste substanţe pot să aibă, de asemenea, influenţă asupra morfologiei şi
sporulării.
2.3.4 Presiunea osmotică
Presiunea osmotică poate provoca modificări bruşte ale structurii celulare (plasmoliza,
turgescenţa) şi modificări ale morfologiei microorganismelor.
41214
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Mucegaiurile sunt microorganisme osmofile (se pot dezvolta pe medii cu presiune
osmotică mare) şi din acest motiv, ele pot altera produsele alimentare care conţin o cantitate
mare de zahăr (miere, dulceaţă, etc.). Ele se pot dezvolta pe produse care conţin max. 70%
zahăr.
2.3.5 Lumina
Acţiunea luminii depinde de specia microorganismelor. În general se poate spune că
lumina este dăunătoare mucegaiurilor. Acţiunea vătămătoare a luminii creşte cu scăderea
luminii de undă a razelor luminoase. Din spectrul luminos cele mai vătămătoare sunt razele
violete, iar din spectrul invizibil, radiaţiile ultraviolete. Acţiunea dăunătoare a razelor
ultraviolete depinde de intensitatea şi durata lor de acţiune asupra mucegaiurilor, acestea
putând fi împiedicate sau oprite din activitatea lor, ori complet distruse.
Când acţiunea luminii se exercită asupra unei culturi şi nu numai asupra unui singur
microorganism, se deosebeşte alături de acţiunea directă, şi acţiunea indirectă asupra
mediului de cultură. Astfel, în mediile de cultură care au fost expuse la lumină solară sau la
radiaţiile UV, s-a găsit întotdeauna apă oxigenată, rezultată din oxidarea apei, oxidare
produsă de raze, care constituie un toxic pentru microorganism. Prin urmare, acţiunea luminii
asupra microorganismului, se exercită fie direct, asupra celulei însăşi, fie indirect, prin
producerea apei oxigenate.
2.3.6 Integritatea fizică a boabelor şi învelişului produselor vegetale
Factorul acesta asigură calitatea produselor în timpul conservării şi face mai dificil
atacul mucegaiurilor.
Produsele cerealiere sunt protejate de mediul exterior, de tegumente care sunt o barieră
foarte eficace împotriva penetrării microorganismelor. Această eficacitate scade după
recoltare, deoarece anvelopa protectoare este eliminată sau lezată. Structura internă
reprezentată de pereţii celulozici, diminuează înmulţirea şi deci proliferarea germenilor în
masa produselor alimentare. Microorganismele emit astfel în mediul exterior hidrolaze care le
permit să treacă această barieră.
Structura şi starea fizico-chimică a materiei are un rol important asupra creşterii
germenilor.
51215
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Tegumentele intacte ale boabelor îngreunează accesul mucegaiului. Boabele sfărâmate
sunt mai susceptibile invaziei şi creşterii fungice decât boabele întregi deoarece partea internă
a bobului este cea mai vulnerabilă la acţiunea mucegaiurilor datorită compoziţiei chimice a
acestuia.
2.4 Influenţa factorilor intrinseci asupra aparţiei micotoxinelor
2.4.1 Natura substratului
În general, substratul optim este cel glucidic. Mucegaiurile nu sunt exigente din punct de
nutriţional, ele hrănindu-se cu micro şi macro elementele care există în substratul unde se
dezvoltă.
Aflatoxina este secretată în special pe amidon, iar zearenona se formează pe un substrat
celulozic.
61216
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
2.4.2 Influenţa pH-ului asupra dezvoltării mucegaiurilor
Acţiunea pH-ului asupra creşterii microorganismelor se situează la trei nivele:
mediu
permeabilitatea membranei
activitatea metabolică
Disponibilitatea anumitor nutrienţi în mediul de cultură este modificată prin echilibrul
ionic. La pH acid, ionii de magneziu formează compuşi insolubili, la pH bazic, zincul, calciul
şi ionii ferici sunt complexaţi. Sub această formă aceşti ioni indispensabili ca şi cofactori ai
enzimelor sunt dificil de folosit.
Permeabilitatea membranelor este în egală măsură afectată de variaţiile de concentraţii în
ioni de şi . În mediul acid pearmeazele cationice sunt saturate în ioni de hidrogen,
ceea ce limitează sau anulează transportul acţiunilor indispensabili. În mediul alcalin ionii
hidroxil care saturează membrana impiedică transferul de anioni indispensabili.
Reacţiile enzimatice au un optim de creştere. Totuşi variaţiile de pH citoplasmatic vor
stabili o încetinire a activităţii enzimatice şi creşterii. Enzimele nu au toate acelaşi
comportament în funcţie de pH, hidrolazele extracelulare fiind mai sensibile decât enzimele
citoplasmatice.
Citoplasma este de asemenea protejată de schimbul limită de pH extracelular. Membrana
citoplasmatică este puţin permeabilă la molecule foarte ionizate în general şi la ioni de în
particular, şi citoplasma are funcţie tampon foarte eficace pe de altă parte.
Acţiunea pH-ului este legată de conservatorii sau inhibitorii familiei acizilor organici,
acizi slabi. Mucegaiurile suportă un interval mare de valori ale pH-ului 2.5-7.5, suportând
mai bine un mediu acid decât unul alcalin. Este bine de specificat faptul că mucegaiurile pot
modifica pH-ul, folosind ca sursă acizii organici ai alimentelor.
Keller SE au studiat efectul pH-ului asupra producţiei de fumonisine B1 de către
Fusarium proliferatum în mediul lichid limitat în azot. Au dedus că există un prag care separă
două compartimente fiziologice. La un pH mai mare de 5, Fusarium proliferatum se dezvoltă
normal şi produce puţine toxine, în timp ce la un pH mai mic de 5, creşterea este mai puţin
importantă, iar producţia de toxine este superioară.
71217
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
2.4.3 Nutrienţi minerali
Microorganismele, pentru dezvoltare au nevoie de apă, o sursă de energie, de azot, de
săruri minerale şi eventual de oxigen şi/sau factori de creştere. Microorganismele care se
întâlnesc pe produsele alimentare sunt chimio-organotrofe şi folosesc mai degrabă hidraţii de
carbon ca sursă de energie decât acizii graşi sau substanţele azotoase. Monomerii sau
moleculele mici sunt încorporate în citoplasmă prin transport membranar, polimerii trebuie să
fie însă hidrolizaţi în prealabil.
Produsele alimentare conţin în general toţi nutrienţii necesari dezvoltării
microorganismelor, dar diferenţele de compoziţie observate au un efect selectiv asupra florei
microbiene.
Sunt în relaţie cu compoziţia substratului, fierul şi zincul, fiind elementele cele mai
importante pentru creşterea fungică. Lipsa anumitor elemente are ca rezultat o creştere
fungică foarte scăzută.
Nutriţia mucegaiurilor
Prin analiza chimică s-a stabilit că celula conţine următoarele elemente: C, N, O, H, P, S,
Si, Cl, K, Ca, Mg, Fe, Na precum şi urme de Mn, Al, Zn, B. Cele mai frecvente elemente
sunt: N, C, H, O, P, S, K, Mg şi uneori Fe, respectiv Mn. Primele opt elemente sunt cu
siguranţă absolut indispensabile vieţii microorganismelor. Folosirea dar nu şi indispensabile
sunt: Na, Ca, Mn, Cl, Si, etc. Calciul este la puţine specii de microbiene.
Proporţia acestor elemente, indispensabile sau utile de asemenea este deosebită. Unele se
găsesc în cantitate mult mai mare decât altele. Cele dintâi servesc ca bază pentru formarea
ţesuturilor microorganismelor (membrana, protoplasma, nucleu) şi din această cauză au fost
numite elemente plastice, spre deosebire de celelalte, care se găsesc în cantităţi foarte mici
sau în urme şi care au fost numite elemente catalitice sau fiziologice servind ca activatori. În
această categorie intră Fe, Mn, care măresc activitatea oxidazelor, sau Ca care joacă rol în
nutriţia azotată şi în transformarea substanţelor azotate prin microorganismelor fixatoare de
azot. Elementele catalitice au fost studiate amănunţite de Gabriel Bertrand, care le-a denumit
şi elemente oligodinamice.
Pentru procurarea acestor elemente indispensabile sau numai utile, microorganismele au
nevoie de diferite substanţe din care să işi procure elementele necesare. Nu orice substanţă,
însă, care conţine aceste elemente, poate servi ca aliment pentru ele.
81218
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Se dă numele de aliment, sau poate servi ca aliment orice substanţă de la care un
microorganism dat poate căpăta elementele şi energia necesară organizării sale fară a mai
utiliza căldura solară.
Descompunerile produse de microorganisme trebuie să aibă loc cu degajare de căldură
pentru a le furniza energia de care au nevoie. De obicei, în transformările microbiene, rămâne
puţină căldură care ridică temperatura mediului. Descompunerile microbiene endoterme nu
sunt posibile decât dacă alături se produce un fenomen exoterm, care să dea căldura
disponibilă. În orice caz, bilanţul caloriferic şi ansamblul reacţiilor trebuie să fie exoterm.
Alimentele absorbite de microorganisme sunt utilizate pentru înlocuirea produselor de
dezasimilare şi pentru formarea de noi substanţe necesare creşterii şi dezvoltării vieţii lor.
Toate modificările interne sau externe ale celulelor, reacţiile fizico-chimice, funcţiunile
biologice şi de reproducere, sunt strâns legate de transformările pe care le suferă alimentele
absorbite. Dintre elemente, unele ca protidele, aminoacizi şi sărurile amoniacale, furnizează
alimentele azotoase necesare sintezei substanţei vii. Altele ca glucidele iau de asemenea parte
la formarea protoplasmei şi nucleului, dar în primul rând sunt alimente producătoare de
energie; prin descompunere, ele pun în libertate căldura necesară reacţiilor endoterme. Din
această cauză aceste alimente s-au numit alimente energetice.
Valoarea alimentară a unui element oarecare este reprezentată prin raportul P/ , în care
P este greutatea culturii obţinute în mediu complet şi greutatea culturii lipsită de elementul
căruia i se determină valoarea alimentară. Cele mai interesante studii au fost făcute cu
mucegaiul Aspergillus niger. Începutul acestor studii datează de acum 70 ani servind şi astăzi
în introducerea fundamentală în fiziologia microorganismelor.
Raulin, un elev al lui Pasteur, a alcătuit un mediu de cultură format din compuşi chimici
bine definiţi (acid tartric, zahăr şi săruri minerale) care să ofere posibilitatea maximă de
dezvoltare a acestui microorganism.
Mediul lui Raulin cuprinde următoarele substanţe:
- Apa 1500 - carbonat de magneziu 0,4 g
- Zahăr 70 g - sulfat de amoniu 0,25 g
- Acid tartaric 4 g - sulfat de zinc 0,07 g
- Nitrat de amoniu 4 g
- Fosfat de amoniu 0.6 g - sulfat de fier 0.07 g
- Carbonat de potasiu 0.6 g - silicat de potasiu 0,07 g
91219
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Reacţia acestui mediu este acidă. Pentru a realiza maximum de dezvoltare a mucegaiului,
trebuie ca însămânţarea să se facă în strat subţire în condiţii aerobe, iar cultura să fie ţinută la
37ºC, într-o atmosferă umedă. După 24 ore de la însămânţare, suprafaţa lichidului se acoperă
cu o membrană albicioasă care se îngroaşă repede, se încreţeşte şi a patra zi capătă la
suprafaţă o culoare neagră, datorită formării sporilor.
Pentru evaluarea greutăţii recoltei, după trei zile de la cultivare se culege tot miceliul, se
stoarce, se usucă şi se cântăreşte. După alte trei zile se procedează la fel cu noua recoltă care
s-a mai format şi care este ultima. Cantitatea totală de miceliu din cele două recolte este de
25 g.
Alimente minerale
Eliminând pe rând fiecare element mineral din lichidul Raulin, se poate determina
importanţa pe care o au în dezvoltarea culturilor sau utilitatea lor specifică.
Utilitatea specifică a unui element este raportul dintre greutatea microorganismului şi a
elementului considerat sau mai bine zis creşterea greutăţii realizate pentru fiecare unitate din
greutatea elementului adăugat. De exemplu pentru greutatea recoltei de 22.5 g s-au
întrebuinţat 0 mg oxid de zinc- utilitatea specifică=225000/40=562.
Prin suprimarea acidului fosforic, recolta scade la 1/182; a magneziului, la 1/91; a
potasiului, la 1/25; a acidului sulfuric, la 1/25, etc. Aceste rezultate sunt identice cu cele ce
s-ar obţine de la o plantă superioară cultivată în condiţii experimentale identice. Cu totul
altfel se prezintă în cazul celorlalte elemente.
Dacă se suprimă zincul, recolta scade la 1/10, iar prin suprimarea fierului la 1/2.
Cum se poate explica rolul acestor elemente, care se găsesc în cantităţi infinitezimale în
mediul de cultură şi care totuşi au o acţiune asa de importantă?
Dacă se reconstituie mediilor elementele respective de care sunt lipsite, la zinc, recolta
revine la normal, pe când prin adăugarea fierului nu-şi mai revine.
Raulin a dedus prin urmare că zincul este aliment, în timp ce fierul nu este. Fierul nu poate
fi considerat decât un antidot care neutralizeză anumite toxine excretate chiar de Aspergillus
şi care sunt vătămătoare dezvoltării sale.
După Javilier, culturile de Aspergillus în mediul lui Raulin, libere de zinc, nu ating, după 4
zile de dezvoltare, decât 0.37 din greutatea realizată în condiţii normale; condiţiile continuă
să apară mai departe. Pe lângă aceasta, 60% din zahăr, în absenţa zincului, ramâne neutilizat.
1012110
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Dacă se adaugă zinc 1/10000000 în raport cu mediul, se ajunge la recolta normală tip, tot
zahărul fiind consumat. Zincul favorează de asemenea şi fixarea siliciului, fierul şi
manganului de către Aspergillus, fiind însă lipsit de efect asupra fixării magneziului, sulfului
şi azotului. Chiar el este fixat în întregime de mucegai, cu condiţia să nu depăşească
cantitatea de 1/250000 în raport cu mediul.
După cum unele doze foarte mici de substanţe minerale sunt indispensabile creşterii
microorganismelor, tot aşa altele devin vătămătoare, chiar în doze extrem de mici. Astfel,
suplimatul împiedică germinarea sporilor în doza de 1/500000, iar azotul de argint în doza de
1/1600000. De asemenea dozele: de zinc 1/25000, de clorură de platin 1/8000, de sublimat
1/51200, de sulfat de cupru 1/2400 şi de nitrat de argint 1/1600000 sunt toxice. Sensibilitatea
aspergillului faţă de sărurile de argint este aşa de mare încât acesta nu se poate dezvolta sub
nici o formă în vase din acest metal.
Alimente hidrocarbonate
După modul cum îşi procură azotul şi carbonul, microorganismele au fost împărţite în două
grupe: autrotofe şi heterotrofe
Microorganismele autrotofe fiind dotate cu pigmenţi ca şi plantele verzi îşi procură
carbonul din bioxid de carbon.
Microorganismele heterotrofe, fiind lipsite de clorofilă, nu-şi pot procura carbonul din
atmosferă ci trebuie să-l obţină din diferite substanţe, în special din hidraţii de carbon.
Este evidentă necesitatea exigenţei unui criteriu după care unele microorganisme pot prefera
un aliment sau altul. Unul din criteriile cele mai des întâlnite este şi acela al configuraţiei
sterice a moleculei organice. Astfel, mucegaiul Penicillium glaucum atacă de obicei, din
acidul tartric inactiv, enantiomorful dextrogir, lasând direct pe cel levogir.
Acelaşi lucru îl face şi Aspergillus niger. De asemenea, din cei doi acizi lactici, Penicillium
glaucum preferă enantionul levogir celui dextrogir.
2.4.4 Potenţialul de oxido- reducere (O 2 /CO 2 )
Acţiunea oxigenului asupra metabolismului microbian se poate manifesta în trei moduri:
- modificarea potenţialului de oxido-reducere. Prezenţa O2 dizolvat indică un potenţial
redox pozitiv, absenţa sa însă în medii organice bogate în compuşi reducători acizi organici,
radicali SH (zaharuri reducătoare) se traduce prin potenţial negativ.
- acceptul final al electronilor pentru aerobioza strictă şi facultativă;
1112111
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
- agenţi ai stresului oxidativ prin intermediul formelor sale active (peroxid sau
superoxid);
Oxigenul poate fi procurat de microorganisme din aer, din apa cum şi din diferite
substanţe care îl conţin. Rolul principal însă în nutriţie şi în funcţiunea celulei microbiene îl
joacă oxigenul din aer şi cel din compuşii organici.
Majoritatea mucegaiurilor sunt aerobe şi din acest motiv au nevoie de O 2 pentru a creşte
şi pentru reacţiile lor metabolice. O lipsă parţială de O2, condiţionează creşterea
mucegaiurilor, iar lipsa acestuia duce la moartea acestora. Este cazul lui Penicillium, care
poate suporta şi condiţii extreme.
O diminuare a concentraţiei în O2 şi o creştere a concentraţiei de CO2, provoacă o
scădere a toxicogenezei, mai importantă decât creşterea.
În cazul fumonisinei B1, în condiţii de O2 scăzut, creşterea mucegaiului va fi scăzută,
consumul de glucoză va fi important şi producţia de micotoxină va fi nulă.
2.4.5 Bacteriile
Barrios si col. (1996) au arătat că inocularea bacteriilor lactice cu trei zile înaintea
inoculării lui Aspergillus parasiticus provoacă o diminuare a creşterii şi producţiei de
micotoxine. Acest fenomen are un efect de competiţie pentru substrat şi pH.
2.4.6 Microflora
Aziz N.H. si col. (1997a şi1997b) au studiat efectul microflorei netoxice a porumbului în
producţia de aflatoxine de către Aspergillus flavus. Au arătat că Tricoderma viride inhibă
creşterea mucegaiului şi reduce sau anulează producţia de aflatoxină B1 chiar dacă boabele
de porumb au fost sau nu sterilizate. Dacă inocularea lui Tricoderma viride este ulterioară
inoculării lui Aspergillus, nivelul de aflatoxină B1 se diminuiază semnificativ. Această
diminuare atinge cam 31%.
Efectul microflorei acţionează asupra acumulării toxinelor. În termen ecologic, există o
competiţie pentru substraturi: doar sursele foarte competitive şi care posedă un vast spectru
de substraturi metabolizabile se dezvoltă. În plus, anumite surse pot degrada micotoxinele.
Un efect inhibitor al microflorei spontane a fost de asemenea demonstrat de O’Neil K.si col.
(1996).
1212112
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Analizând producţia de trichotecine şi zearalenonă de Fusarium culmorum pe porumb, ei au
arătat ca pe boabele sterilizate prin încălzire sau radiaţii, cantitatea de micotoxină este
superioară faţă de cea prezentă pe grânele nesterilizate.
Această diferenţă apare deoarece în primul caz substratul este lipsit de microorganisme, flora
spontană fiind prezentă în cel de al doilea caz.
Marin si col. (1998) au studiat influenţa unei flore competitive în creşterea şi producţia
de fumonisine de către Fusarium moniliforme şi Fusarium proliferatum. La o temperatură de
15-25ºC şi o valoare a aw de 0.98, colonizarea mediului de către cele 2 specii de Fusarium
este mult mai mică decât Aspergillus flavus şi Aspergillus ochraceus, dar în acelaşi timp,
producţia de fumonisine este stimulată de aceste două mucegaiuri.
2.4.7 Insectele
Insectele intervin indirect în producţia de micotoxine, ele fiind vectorii sporilor. În plus,
insectele pătrund în zonele interioare ale grânelor prin rănile pe care le produc. Contaminarea
după recoltare a alunelor şi porumbului cu Aspergillus flavus este corelată cu un atac al
insectele. Acestea pot fi prezente în spaţiile de depozitare creând o contaminare importantă şi
în consecinţă constituie o cauză a prezenţei micotoxinelor.
Rodiquez de Bosque a arătat că 2 factori sunt în relaţie cu creşterea aflatoxinelor în
porumb: semănatul târziu şi pagubele cauzate de insecte.
1312113
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
2.5 Descrierea mucegaiurilor cu potenţial toxicogen
2.5.1 Principalele genuri de mucegaiuri din industria alimentară
Genurile şi speciile de mucegaiuri cu incidenţă în industria alimentară (microbiota utilă
şi de alterare), sunt grupate în diviziunile Zygomycota (Zygomycetes), Ascomycota
(Ascomycetes) şi Deuteromycota (Deteromycetes) (Gueguen, M. 1994).
Din diviziunea Zygomyceta, pentru industria alimentară, prezintă interes mucegaiurile din
ordinul Mucorales: familia Mucoraceae, (genurile: Mucor, Rhizopus şi Absidia) şi familia
Thamnidiaceae (genul Thamnidium). Acestea sunt denumite mucegaiuri inferioare şi au thal
septat monocelular coenocitic (miceliu neseptat, ramificat aerian şi imersat în substrat). Ele
sunt uşor identificate prin caracterele morfologice ale aparatului reproducător pe cale
asexuată, când sporii se formează în interiorul unui sporange terminal (sporocist) purtat de un
sporangiofor (sporangistofor), care poate să se prelungească sau nu în interiorul sporangelui
cu o columelă.
Reproducerea pe cale sexuată se realizează prin zigospori. Unele specii sunt
heterothalice, în timp ce pentru altele stadiul de zigospori este necunoscut.
Genul Rhizomucor a fost creat cu puţin timp în urmă şi cuprinde speciile termofile ale
genului Mucor (Rhizomucor pusillus) ce prezintă stoloni şi rhizoizi.
Studii efectuate de Kirk (1986) şi Cannon (1988) privind nomenclatura genurilor din
ordinal Mucorales. Au relevat ca genurile Mucor şi Rhizopus nu trebuie considerate ca genuri
separate. Dacă codul de nomenclatură botanică ar fi fost riguros aplicat genul Mucor ar fi
trebuit unit cu Rhizopus, iar anumite specii din genul Rhizopus regrupate în gen Ascophora.
Totuşi, luând în considerare importanţa economică a mucegaiurilor din cele două genuri
Mucor şi Rhizopus, ele continuă să fie acceptate în vechea formă (Scriban.r,s.a 1993)
În diviziunea Ascomycota, sunt incluse mucegaiuri superioare cu miceliu septat care se
reproduc pe cale sexuată prin ascospori ce se formează în asce închise în formaţiuni specifice
numite: Chleistothecium (Ploctomycetes) şi Perithecium (Pyrenomycetes-genurile Eurotiul şi
Byssochlomys). Unele mucegaiuri din această diviziune pot prezenta şi reproducere asexuată
şi în acest caz ele se regăsesc şi în Deuteromycota, dar cu altă denumire.
1412114
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Deuteromycota include mucegaiurile superioare cu thal septat care se reproduc numai pe
cale asexuată, denumite fungi imperfecţi. Capacitatea de reproducere pe cale asexuată a fost
pierdută în cursul evoluţiei acestor mucegaiuri. Sporii formaţi prin reproducere asexuată se
numesc conidiospori (conidii). Diferitele moduri de formare a conidiosporilor sunt utilizate
drept criterii de identificare a mucegaiurilor din această subdiviziune. Pentru industria
alimentară prezintă interes mucegaiurile din clasa Hyphomycetes, ce dispun de o diversitate
metabolică deosebită. Aici sunt incluse principalele genuri cu aplicaţii în procesele
biotehnologice, dar şi agenţi de alterare ai produselor alimentare.
2.5.2 Caracterizarea principalelor specii de mucegaiuri cu potenţial toxicogen
Intervenţia nefastă a ciupercilor filamentoase în industria alimentară este întâlnită la mai
multe niveluri. Cerealele pot fi contaminate cu mucegaiuri în plin câmp şi în timpul
depozitării.
Mucegaiurile care se dezvoltă pe câmp ca şi cele care se dezvoltă pe materiale de
putrefacţie necesită o umiditate ridicată (20-25%) pentru creşterea lor (Hesseltine, 1976), în
timp ce mucegaiurile de depozitare sunt capabile să crească pe un strat cu un conţinut de
umiditate de 10-18% (Lillehoj & Elling, 1983).
Speciile cu activitate fitopatogenă sunt foarte periculoase pentru producţia materiilor
prime alimentare brute. Mucegaiurile saprofite contaminează alimentele şi degradează din
punct de vedere calitativ. Anumite specii sunt toxicogene şi eliberează în aliment micotoxine
care reprezintă un grav pericol din punct de vedere sanitar.
1512115
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Tabel 13. Principalele mucegaiuri care se gasesc în diferite alimente
Mucegai Toxina Produs
Aspergillus Aflatoxina, sterigmatocistina ochratoxina A Porumb,arahide,orez,fasole,lapte
preparate din carne
Fusarium Fusarine,Moniliformine,
Tricotecine,Zearalenona,Fumonisine
Grâu, porumb,orz,orez,secară,nuci
Penicillium Patulina,citrinina,ochratoxina A Fructe şi sucuri de
fructe,grâu,orez,brânză,nuci
Alternaria Alternariol,Acid tenuazonic Fructe,legume şi produse derivate,mere
şi roşii
Claviceps Ergot Grâu,secara şi orez
Toxicogeneza cum s-ar numi condiţiile de sinteză şi elaborare a micotoxinelor, este un
fenomen de mare complexitate. Condiţiile optime de toxicogeneză depind de o combinaţie de
factori: temperatura, umiditatea şi nivelul de oxigenare a substratului.
Expresia „specie toxicogenă” poate fi interpretată în funcţie de mecanismul care dă
naştere apariţiei toxinelor:
- fie substanţa este un metabolit secundar, propiu sursei fungice considerate, este
cazul majorităţii micotoxinelor secretate de ciuperci în timpul depozitării produselor
alimentare. Rezultă astfel o mare diversitate de familii chimice: derivaţii ai acizilor aminici:
acidul aspergilic, roquefortine şi derivaţi ai terpenelor: DON, tricotecine;
- fie mucegaiul poate transforma un substrat netoxic într-un produs toxic prin
bioconversie; este cazul acidului cumaric prezent în cantitaţi mici în sulfină, care poate fi
transformat în dicumarol, un puternic anticoagulant pentru diferite mucegaiuri;
- fie mucegaiul parazit poate provoacă o deviaţie a metabolismului normal al plantei,
consecinţă a formării produşilor toxici care nu există în plantele sănătoase.
1612116
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
2.5.2.1 Aspergillus flavus
Caractere coloniale
Colonia pe mediul solid se dezvoltă rapid, 50-70 mm este plană, densă, catifelată, de
culoare, alb-gălbuie; la maturitate, odată cu dezvoltarea uniformă a conidioforilor, culoarea
devine galben-verzui spre galben brun. Reversul coloniei se colorează în galben spre brun.
Aspect microscopic
Conidioforii sunt lungi, cu înălţimi cuprinse între 400-1000 µm şi diametrul de 3-13 µm,
pereţii sunt groşi, cu aspect rugos incolori. Vezicula are formă alungită la început, apoi capătă
formă sferică cu diametrul de 20-40 µm şi este fertilă pe ¾ din suprafaţă. Pe veziculă se pot
dezvolta direct fialide, fie metule cu fialide egale în dimensiuni. Fialidele, aranjate într-un
singur strat măsoară (10-15)x(3-5) µm; cele aranjate în straturi duble au înălţimi egale, de
7-10 µm şi cu diametrul de 3-4 µm pentru cele secundare.
Răspândire şi rol
Este răspândită în natură şi poate fi izolat de pe seminţe de porumb, orz, alune, orez,
cartofi, mazăre, mere, făinuri, lapte praf. Aspergillus flavus are o afinitate deosebită pentru
alune şi seminţe oleaginoase. În condiţii necorespunzătoare de păstrare, ca urmare a
contaminării înainte de recoltare, se poate produce mucegăirea masivă a boabelor de porumb,
alune, seminţe oleaginoase cu importante pierderi economice. Aspergillus flavus creşte
într-un domeniu larg de temperatură (12-48ºC). Valoarea minimă de aw 0.78 la 33ºC, valoarea
optimă de pH = 7.5. Conidiosporii au rezistenţă termică redusă cu D60 = 1 minut. Poate
produce micotoxine cu denumirea generică de aflatoxine.
1712117
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
2.5.2.2 Aspergillus nidulans
Caractere coloniale
Colonia este catifelată de culoare verde-verde închis cu formare în centru de peritheci de
culoare alb- gălbui. Reversul coloniei apare de culoare roşu purpuriu.
Aspect microscopic
Conodioforii sunt sinuoşi de culoare brună, cu lungime 6-100 µm şi diametrul 2.5-3 µm,
capul conidial este columnar, cu dimensiuni (40-80)x(25-30) µm. Vezicula este
semisferică, cu diametrul de 8-10µm. Fialidele biseriate se dezvoltă în partea superioară a
veziculei. Fialidele primare ca şi cele secundare sunt scurte şi au dimensiunile (5-6)x(2-3)
µm. Fialosporii sunt globoşi, cu suprafaţa rugoasă şi dimetrul 3-3.5 µm. La maturitate, prin
dezintegrare se formează asci, cu câte opt ascospori lenticulari, cu pereţi netezi, cu două
inele situate central, de culoare roşie şi dimensiuni 3.5-4.5 µm.
Răspândire şi rol
Se întâlnesc în sol, resturi vegetale, diferite seminţe depozitate, pe pâine. Poate elabora
toxina sterigmatocystina (nidulina).
1812118
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
4.2.2 Aspergillus versicolor
Caractere coloniale Colonia se dezvoltă lent şi are un aspect compact, catifelat. Zona centrală a coloniei este
mai înaltă şi poate prezenta la margini striaţiuni radiale. La maturitate, colonia prezintă o
culoare gălbui-verde ca mazărea şi o bordură albă îngustă, revers se colorează în galben
portocaliu spre roşu.
Aspect microscopic
Capul conidial este semisferic, radial cu diametrul 100-200 µm. Conidioforii sunt
relativ lungi, cu dimensiuni (500-600)x(4-8) µm, sunt netezi, incolori, iar la maturitate se
colorează în gălbui. Vezicula este semisferică sau elipsoidală, fertile pe 1/2 sau 2/3 din
suprafaţă şi are diametrul cuprins între 12-20 µm. Fialidele sunt biseriate aproximativ egale,
cele primare au dimensiuni cuprinse între (7-10)x(3-4) µm, iar cele secundare au dimensiuni
de (5-10)x(2-2.5) µm. Fialosporii sunt globoşi cu suprafaţa fin rugoasă şi cu dimensiuni de
3.5-5 µm.
Răspândire şi rol
Este întalnit în sol, pe resturi vegetale în descompunere, cereale, făinuri, furaje, seminţe
oleaginoase, produse insilozate, produce micotoxina sterigmatocystina cu efect hepatotoxic.
1912119
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
4.2.3 Aspergillus candidus
Caractere coloniale
Formează colonii catifelat-pâsloase de culoare alb-albastru-cenuşiu spre verde şi
înălţime de 3 mm. Colonia prezintă circumferinţe radiale şi margine albă cu revers incolor,
brun la maturitate.
Aspect microbiologic
Conidioforii au înălţime de 1.3 mm, diametrul 20-30 µm, sunt netezi şi hialini. La
capătul superior prezintă o veziculă clavată alungită ( ca o măciuca) cu dimensiunea (200-
300)x(40-60) µm. Fialidele uniseriate, care acoperă toată suprafaţa veziculei măsoară (2.5-
3.5)x(2-3) µm, cu dimensiuni mai mari la baza şi apexul veziculei fialosporii sunt elipsoidali
netezi, cu dimensiuni (2.5-3)x(3.5-4.5) µm.
Răspândire şi rol
Este o specie întâlnită în sol, pe părţi ale plantelor în stadiul de putrezire. A fost izolat
de pe diverse seminţe (porumb germinat, carne, fructe). Poate produce micotoxina patulina.
2012120
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
4.2.5 Aspergillus ochraceus
Caractere coloniale Colonia are diametrul de 3-5 cm, prezintă zone concentrice şi exudate. Are culoare
galben-portocalie spre roşu, aspect granulat.
Aspect microscopic Conidioforii cu lungimi variabile şi diametrul de până la 10µm, au suprafaţa fin rugoasă
şi sunt coloraţi în galben. Capul conidial este de formă sferică şi la maturitate se separă în
două sau mai multe grupări compacte. Vezicula este globoasă sau elipsoidală, fertile pe
întreaga suprafaţă. Fialidele sunt biseriate: fialidele primare cu lungimi variabile cuprinse
între 15-30 µm, iar cele secundare au dimensiuni între (7-10)x(1.5-2.5) µm. Fialosporii sunt
sferici, elipsoidali, cu suprafaţa alb rugoasă şi diametrul între 3.5-5 µm. Produce rar scleroţi
ovali, de culoare galben -brun.
Răspândire şi rol Este frecvent întalnit în sol, pe resturi vegetale, boabe de orez, porumb, seminţe
oleaginoase, furaje, produse alimentare. În condiţii de facultativ anaerobioza la fermentarea
boabelor de cafea este responsabil pentru formarea unui miros plăcut. Dintre micotoxinele
elaborate în condiţii favorabile de sporulare fac parte: ochratoxina, aflatoxine şi acidul
penicilic. Prin consum de produse mucegăite se produce hepatotoxicoze la animale.
2112121
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
4.2.6 Aspergillus tereus
Caractere coloniale Colonia apare cu perimetru circular, aspect catifelat şi uneori prezintă zone radiale. Culoarea coloniei variază, de la centru spre periferie, de la cafeniu-brun la bej, reversul este gălbui spre brun. Uneori elaborează un exudat de culoare portocalie.
Aspect microscopic Conidioforii sunt scurţi, drepţi sau curbaţi cu lungimi egale şi dimensiuni între (100-250)x(4.5-5.5) µm, incolori, cu pereţi netezi capul conidial, este columnar, lung până la 500 µm şi diametrul 10-16 µm. Fialidele sunt biseriate şi se dezvoltă pe 1/2 max 2/3 din suprafaţa veziculei. Fialidele primare au dimensiuni cuprinse între (5-7.2)x(2-2.5) µm, iar cele secundare (5.5-7.50)x(1.5-2) µm. Fialosporii sunt de formă globoasă, cu suprafaţa netedă, diametrul cuprins între (1.8-3.5) µm dispuşi în lanţuri lungi.
Răspândire şi rol Poate fi izolat de pe furaje, seminţe, cereale depozitate. Este termofil şi are viteza rapidă de creştere chiar la 37°C, fiind frecvent întâlnit în zona tropicală şi temperată. Poate produce acizi organici: succinic, oxalic, enzime proteolitice. Are potenţial toxicogen produce micotoxine: citrinina şi patulina.
2212122
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
4.2.7 Aspergillus fumigatus
Caractere coloniale
Pe Agar Czaper-Dox, după incubare de 7 zile la 25ºC, coloniile au dimensiuni de circa
4-5 cm, culoare albastră-verzui şi aspect pulverulent datorită sporulării intense.
Aspect microscopic
La stereolupă, se disting destul de facil capetele aspergilare cu aspect columnar. Hifele
sunt septate şi dau naştere unor conidiofori a căror extremite distală se termină printr-o
veziculă cu aspect clavat, de 20-30 µm diametru. Vezicula este tapetată în jumătatea
superioară cu un singur rând de celule de culoare verzuie, cu dimensiuni de (6-8)x(2-3) µm
- fialidele, care vor genera lanţurile de conidii. Conidiile au formă sferică sau subsferică,
aspect verucos şi diametru 2.5-3 µm.
Răspîndire şi rol
Aspergillus fumigatus este un fung filamentos ubicuitar, saprobiot în sol, unde joacă un
rol important în reciclarea carbonului şi azotului din resturile vegetale. Fiind un fung
contaminant, el se izolează destul de frecvent din aerul ambiant, din apă şi de pe diverse
suprafeţe, inclusiv din clinici şi spitale. Din prelevatele clinice, izolarea sa este destul de
facilă, prin utilizarea mediilor uzuale de cultivare.
2312123
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
4.2.8 Fusarium graminearum
Caractere morfologice
Colonia dezvoltată pe mediu selectiv are un aspect pâslos, dens şi se extinde rapid în
placă. Culoarea este roz-cenuşiu spre auriu-brun. Reversul este colorat în portocaliu-brun cu
nuanţe mai deschise spre margine.
Aspect microscopic
În preparat microscopic se pot observa:
- macroconidii- se formează pe conidiofori simpli sau ramificaţi de obicei în mănunchi,
care au formă falcată sau fusiformă, cu 5 septuri, cu dimensiuni ce variază între (30-62)x(3.0-
4.5)µm. Nu formează microconidii.
- chlamidosporii- sunt mono sau pluricelulari, de obicei globoşi, care se formează
intercalar, de-a lungul hifelor sau la nivelul macroconidiilor, sunt netezi sau rugoşi, hialini
sau de culoare brun-pal, cu dimensiuni de (10-12)µm.
Răspândire şi rol
Se dezvoltă optim la 24-26°C, pH 6.7-7.2. Este răspândit în natură şi este fitopatogen al
gramineelor (putrezirea în coroană la plante de grâu şi porumb). Poate să paraziteze şi alte
plante (mazăre, cartofi, banane). Poate elabora micotoxine de tipul scirpene (zearalenone)
prin ingerarea produselor mucegăite se pot produce gastroenterotoxicoze la porcine ovine şi
cai.
2412124
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
4.2.9 Penicillium expansum
Caractere coloniale
Formează colonii cu diametrul de 30-40 mm de culoare verde-albăstrui cu aspect
catifelat. În zona centrală si cea marginală, colonia are aspect floconos. Formează în timp
inele circadiene, în care, sunt zone cu miceliu înalt care alternează cu zone cu miceliu scund.
Reversul este colorat în brun -închis sau portocaliu-brun. Produce exudat incolor sau brun
portocaliu foarte deschis şi un pigment solubil portocaliu-brun.
Aspect microscopic
Conidioforii au pereţi netezi, cu lungimi de 200-500µm şi poartă penicili terverticilaţi.
Prezintă fialide fie cu formă de fiolă, fie cu formă cilindrică, cu dimensiuni de (8-ll)x
(2-2.5)µm. Formează conidii elipsoidale cu pereţi netezi cu dimensiuni de (3-4)x(2.5-
3.5)µm.
Răspândire şi rol
Este un mucegai psihrofil (poate creşte la 6°C, creşte viguros la 0°C). Se dezvoltă optim
la 28°C. Temperatura maximă de dezvoltare este de 35°C. Necesită pentru germinare un aw
de 0.82-0.83. Nu necesită prezenţa unor cantităţi mari de O2 pentru a se dezvolta. Este
prezentată în mod frecvent la mere şi pere la care produce putrezirea brună. A fost izolat şi de
pe căpşuni şi tomate. Apare pe cereale mai puţin frecvent decât alte specii ale genului. Foarte
răspândit pe alimente cum sunt carnea şi produsele din carne. Produce micotoxine de tipul
patulinei şi citrininei.
2512125
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
4.2.10 Trichotecium roseum
Caractere coloniale
Formează colonii cu diametrul de 50-60 mm, pufoase, cu miceliu colorat în roz, roz
portocaliu. Reversul este colorat similar, mai puţin intens sau cu nuanţe de brun.
Aspect microscopic
Prezintă conidiofori lungi, neramificati septaţi care poartă la capăt conidii ce se
formează una peste alta şi sunt dispuse de o parte şi de alta a conidioforului formând lanţuri
în V. Conidiile au forma elipsoidală până la pirinformă, prezintă un singur sept transversal,
au pereţi subţiri, netezi şi dimensiuni de (16-20)x(8-12) µm. Prima conidie formată rămâne
verticală în timp ce celelalte, care se formează sub ea, sunt înclinate alternativ spre dreapta şi
spre stânga.
Răspândire şi rol
Se dezvoltă în intervalul de temperatură cuprins între 15-35°C, cu un optim la 25°C şi
până la o valoare a aw de 0.9. Este foarte răspândit în natură, în special pe lemnul care
putrezeşte. A fost izolat de pe cereale diverse specii de alune, fasole si carne, dar nu este
considerat agent de alterare a produselor alimentare. A fost deasemenea izolat de pe pereţii
pivniţelor. Produce micotoxina denumită tricotecină.
2612126
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
CAPITOLUL 3
Metode de limitare şi reducere a conţinutului în micotoxine a unor produse
alimentare de origine vegetala
Prezenţa micotoxinelor, pune o problemă de securitate sanitară a alimentelor. Punerea la
punct a tratamentelor industriale pentru decontaminarea şi detoxifierea produselor alimentare
contaminate a devenit un obiectiv major pentru securitatea sanitară a alimentelor. Înaintea
folosirii procedeelor decontaminare, modul de strategie constă în observarea practicilor care
permit limitarea contaminanţilor. Stăpânirea etapelor înainte de recoltare, în timpul recoltării
şi în timpul depozitării permite prevenirea contaminării, factorii de mediu fiind determinaţi
pentru a preveni contaminarea cu mucegaiuri şi micotoxinelor lor.
3.1 Strategii preventive: limitarea contaminanţilor
Punerea la punct a unui plan de control şi analiza a punctelor critice (HACCP-Hazard
Analysis Critical Control Point).
Sistemul HACCP, o metodă pentru protecţia igienicob - sanitară a alimentelor, este unul
dintre diferitele procedee propuse pentru a garanta producere igienico- sanitară a alimentelor
care a întrunit sufragiile majorităţi organismelor internaţionale în domeniu. Sistemul HACCP
face posibilă prevenirea contaminărilor şi/sau reducerea la un nivel acceptabil a potenţialelor
riscuri inerente procesului productive sau produsului finit.
Este greşit să se considere că sistemul HACCP reprezintă o metodă care determină
eliminarea în totalitate a riscurilor pentru obţinerea de alimente sigure; sistemul HACCP
acceptă şi posibilitatea de a reduce riscurile la un nivel acceptabil. Acest aspect reprezintă o
noutate introdusă de sistemul HACCP, care obligă la o respectare riguroasă a principiilor
preventive conţinute de el; nerespectarea acestor principii în oricare dintre fazele procesului
de producţie pune în pericol întreg sistemul.
2712127
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Principiile sistemului HACCP sunt esenţiale. În 1993, Comisia Codex Alimentarius şi
apoi OMS (Organizaţia Mondială a Sănătaţii) în 1995, au pus bazele teoretice ale controlului
prin intermediul sistemului HACCP, enunţând următoarele principii:
Identificarea riscurilor asociate cu producerea alimentelor în toate fazele fluxului
tehnologic, evaluarea lor comparativă şi a nocivităţii faţă de consummator, descriind
şi măsurile de control sau de prevenire;
Identificarea pe fluxul tehnologic a punctelor critice de control care, menţinute sub
control, sunt în măsură să prevină, să elimine sau să reducă până la limite acceptabile
riscul;
Stabilirea limitelor critice care nu trebuie depăşite pentru a ne asigura că punctul critic
este sub control;
Proiectarea de eventuale acţiuni corective, în cazul în care monitorizarea indică faptul
că un anumit punct critic de control nu mai este sub control;
Proiectarea procedurilor pentru a verifica dacă întreg sistemul HACCP îndeplineşte
obiectivele fixate;
Documentarea tuturor procedurilor adoptatea pentru realizarea planului HACCP.
Aplicarea sistemului HACCP presupune parcurgerea logică a 12 etape specifice unui
plan de lucru HACCP, caracteristic pentru fiecare proces şi/sau produs analizat:
definirea scopului;
constituirea şi organizarea echipei HACCP;
descrierea produsului şi identificarea utilizării intenţionate;
elaborarea diagramei de flux tehnologic;
identificarea pericolelor potenţiale;
evaluarea riscurilor potenţiale;
determinarea punctelor critice de control;
stabilirea limitelor critice;
stabilirea sistemului de monitorizare;
stabilirea acţiunilor corective;
stabilirea procedurilor de verificare;
stabilirea documentaţiei şi a înregistrărilor.
Demersul este bazat pe dezvoltarea unei strategii de prevenire, de control, de bune practice
industriale şi control al calităţii la toate etapele producţiei. Presupune punerea în evidenţă a
2812128
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
punctelor de risc, ca şi a punctelor critice, punerea la punct a soluţiilor finale de luptă, ca şi
dezvoltarea metodelor de verificare.
Ropkins şi Beck (2003) au propus un plan HACCP pentru limitarea contaminării cu
compuşi organici a produselor alimentare în timpul perioadei de depozitare, transformare şi
distribuţie. Procedurile operaţionale standard sunt definite şi trebuie respectate în fiecare
etapă. Pentru a asigura calităţii sanitare în timpul depozitării, trebuie ca spaţiile de depozitare
să fie dotate cu instalaţii conforme şi proprii.
Contaminarea externă prin aer şi apă, trebuie să fie supravegheată. Din practicile care
trebuie respectare pentru limitarea contaminării alimentelor amintim: curăţarea
echipamentelor, o bună igienă personală şi purtarea îmbrăcămintei de securitate. Pentru
fiecare produs, echipa HACCP trebuie să studieze dacă micotoxinele care constituie un
pericol pentru sănătate sunt susceptibile de a fi prezente şi dacă da, care sunt acelea.
Eliminarea completă a micotoxinelor din alimente contaminate nu se poate realiza la ora
actuală, obiectivul fiind acela de a reduce la minim apariţia acestor toxine prin bune practice
agricole. Principiile pentru prevenirea şi reducerea micotoxinelor diferă în funcţie de cultură,
climat şi practice agricole locale. Este important ca producătorii să considere că bunele
practice agricole (BPA) reprezintă primul mod de a lupta împotriva contaminării cerealelor
cu micotoxine, apoi aplicarea bunelor practice de fabricaţie (BPF), depozitarea, transformarea
şi distribuţia cerealelor destinate alimentaţiei umane şi animale. Elaborarea codurilor de
folosire naţionale fondate pe principii generale şi reducerea codurilor specifice pentru
anumite specii de cereale va ameliora aplicabilitatea acestor principii, în particular pentru
culture ca porumbul.
Aceste principii descriu factorii care favorizează infectarea, dezvoltarea şi producţia de
toxine în culture cerealiere la nivelul expoatării ca şi metodele de luptă împotriva acestor
toxine. Trebuie subliniat că strategia trebuie aplicată atât în timpul semănării, cât şi în timpul
recoltării şi după recoltare, dar va depinde de cultura, condiţiile climatice şi va trebui să se
ţină cont de specificitatea locală a culturilor şi modul de producţie în vigoare în fiecare ţară
sau regiune. În consecinţă, toate intervenţiile în lanţul de aprovizionare vor trebui aplicate, la
intervale regulate, evaluarea riscurilor, luarea măsurilor pentru prevenirea sau reducerea la
minimum a contaminării cu mucegaiuri fiind de asemenea obligatorie.
Aceste evaluări care ţin cont de tipul de cultură considerată (grâu, porumb, etc.), se arată
a fi foarte utile.
2912129
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Calea de transmitere a infecţiei şi dinamica formării toxinelor diferă de la o cultură la alta şi
sunt influenţate de factori agricoli. Sistemele de cultură în care este inclus porumbul în rotaţie
prezintă un risc ridicat. Grâul şi alte cereale produse în acelaşi sistem de cultură în rotaţie sau
în apropierea acestuia trebuie să facă de asemenea obiectul unei gestionări şi a unei inspecţii
riguroase.
Contaminarea cerealelor cu mucegaiuri se datorează acţiunii mai multor factori. Bunele
practice nu permit controlarea tuturor factorilor, de exemplu, condiţiile climatice.
Parametrii agroclimatici care favorizează producţia de micotoxine sunt:
incidenţa infecţiei cu fungi potenţial toxigeni a porumbului (procente);
severitatea contaminării cu aflatoxina Bl (ng/g);
media temperaturii minime din august;
media umidităţii maxime din iulie;
numărul săptămânilor din timpul perioadei de vegetaţie în care media temperaturii
maxime săptămânale a depăşit 32°C;
media temperaturii maxime din iulie;
media umidităţii minime din iulie;
numărul de săptămâni din timpul perioadei de vegetaţie în care media săptămânala a
umidităţii maxime a depăşit 90%;
variabila compensatorie indicând localităţile cu 0-5 săptămâni în care temperatura
săptămânala maxima a depăşit 32°C;
variabila compensatorie indicând localitatea cu 11-15 săptămâni în care temperatura
săptămânala maxima a depăşit 32°C;
constanta funcţiei lineare;
numărul de săptămâni din timpul perioadei de vegetaţie în care media săptămânală a
umidităţii maxime a depăşit 90%;
numărul de săptămâni din timpul perioadei de vegetaţie în care media săptămânală a
temperaturii maxime a depăşit 38°C;
numărul de săptămâni din timpul perioadei de vegetaţie în care media săptămânală a
temperaturii minime a depăşit 21°C;
numărul de săptămâni din timpul perioadei de vegetaţie în care media săptămânală a
umidităţii minime a depăşit 55 %.
În plus, nu toţi factorii au aceeaşi importanţă şi aceşti factori diferiţi pot de asemenea
antrena o contaminare cu micotoxine. În consecinţă, este important să se adopte o strategie
3012130
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
integrată ţinând cont de toţi factorii de risc. În particular, trebuie să se evite acumularea
diferiţilor factori de risc în funcţie de interacţiunile lor posibile.
Este de asemenea primordial să se ţină cont de rezultatele obţinute în anii precedenţi în
materie de prevenire şi formare a mucegaiuri lor şi micotoxinelor pentru ai exploata în
vederea definirii măsurilor care trebuie luate pentru a preveni formarea micotoxinelor în
următorii ani.
Principiile prezentate mai sus duc la principalii factori de care trebuie să se ţină cont în
lupta împotriva contaminării cu micotoxine în câmp; rotirea culturilor, gestionarea solului,
alegerea speciile sau hibrizilor şi folosirea adecvată a fungicidelor. În ceea ce priveşte
gestionarea riscurilor, legată de contaminarea cu micotoxine, aplicarea bunelor practici
agricole, descrise de un comitet de experţi FAO/WHO în 2000, poate permite limitarea pe cât
posibil contaminarea cu micotoxine.
3.1.1 Practici recomandate înaintea recoltării
ROTIREA CULTURILOR
Rotirea culturilor constituie în general un mod eficace de a reduce riscul contaminării în
funcţie de sursaa fungică şi specia cultivată. Este foarte eficientă pentru a reduce
contaminarea cerealelor de iarna în particular. Culturile care nu sunt contaminate de specii de
Fusarium, care afectează în general cerealele, precum cartofii, trifoiul, lucerna sau alte
legume, trebuie să fie cultivate prin rotaţie pentru a reduce contaminarea câmpului. Cerealele
cu bobul mic, cum ar fi grâul, trebuie să fie semănate numai după o evaluare a riscurilor de
infecţie cu mucegaiuri.
Interacţiunea semnificativă descoperită între cultura precedentă şi gestionarea solului a
pus în evidenţă importanţa rămăşiţelor de la cultura gazdă în ciclul vieţii patogenilor. S-a
constat că, conţinutul în desoxinivalenol este mult mai mare în cazul cultivării grâului după o
cultură contaminată cu ssp de Fusarium, decât porumbul sau alte cereale.
ALEGEREA SPECIILOR SAU A HIBRIZILOR
3112131
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Se recomandă să se aleagă hibrizi sau specii mai bine adaptate la natura solului, sau la
condiţiile climatice şi la practicile agricole uzuale. Acest lucru reduce stresul vegetalelor şi va
proteja mai mult cultura împotriva unei infecţii fungice. Se recomandă să se folosească, când
există, specii de seminţe selecţionate pentru rezistenţa la mucegaiuri sau insecte parazite.
Alegerea speciilor pentru rezistenţa lor la infestarea cu mucegaiuri se face ţinând cont şi de
riscul infestării.
PLANIFICAREA CULTURILOR
Pe cât este posibil, culturile trebuie să fie planificate pentru a evita condiţiile climatice
care prelungesc coacerea în câmp înainte de recoltare. Uscarea trebuie de asemenea
considerată ca fiind un factor de risc în cazul contaminării cu mucegaiuri. Trebuie să se evite
plantarea apropiată a plantelor. Din acest motiv se recomandă respectarea spaţiilor între
rânduri şi între plante. Informaţia referitoare la aceste spaţii poate fi furnizată de producătorii
de seminţe.
GESTIONAREA SOLULUI ŞI A CULTURILOR
La cultivare, trebuie să se ţină cont de riscurile eroziunii şi de buna gestionare a solului.
Toate practicile agricole distrug sau ascund reziduurile culturilor infectate, aratul permiţând
după toate aparenţele reducerea contaminării culturii următoare cu mucegaiuri. Pământul
trebuie semănat astfel încât să se lase o suprafaţă de semănat rugoasă, o zonă de semănat
grosieră, pentru a favoriza infiltrarea apei şi reducerea la minimum a riscului de eroziune a
solului şi nutrienţilor săi. Se recomandă pe cât posibil pregătirea suprafeţelor destinate
semanării prin arare, înlăturarea speciilor rămase pe câmp de la cultura precedentă, precum şi
înlăturarea tijelor şi a altor rămăşiţe vegetale care pot servi ca substrat pentru dezvoltarea
mucegaiurilor producătoare de micotoxine. În zonele care sunt expuse eroziunii, practicile de
lucru pot fi cuplate cu cele de conservare. O atenţie deosebită trebuie acordată gestionării
reziduurilor recoltei susceptibile de a favoriza contaminarea culturii următoare cu
mucegaiuri; aceste reziduuri trebuie să fie sfărâmate cât de fin posibil şi încorporate în sol
astfel încât să se faciliteze descompunerea lor.
Trebuie să se evite pe cât posibil stresul plantelor. Există numeroşi factori de stres: seceta,
frigul, carenţele în nutrienţi şi reacţiile nedorite între materialele folosite pentru cultură.
3212132
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Referitor la măsurile luate pentru a evita stresul plantelor, de exemplu irigaţiiile, trebuie să se
reducă la minim riscul ulterior de infestare fungică prin evitarea irigării prin stropire în timpul
dezvoltării organelor florale.
Irigarea este o metodă valabilă pentru reducerea stresului cauzat plantelor în anumite condiţii
de creştere. Un aport optim de nutrienţi este esenţial pentru a evita o „slăbiciune" a plantei,
susceptibilă favorizării unei infestări cu mucegaiuri. Trebuie să se asigure un aport în
nutrienţi specifici plantei.
Tratamentele seminţelor cu fungicide sunt eficace împotriva numeroaselor tipuri de
seminţe. Este recomandat să se aplice măsuri de prevenire, pe cât posibil, pentru a reduce la
minimum infestările fungice şi pagubele cauzate de insecte şi să se folosească, dacă e nevoie,
insecticide şi fungicide agreate si omologate pentru lupta împotriva mucegaiurilor. Dacă este
inoportună folosirea pesticidelor, cum este cazul agriculturii biologice, trebuie să se facă apel
la practici adecvate. Trebuie subliniat că aplicarea fungicidelor în timp util este crucială
pentru lupta împotriva infestărilor fungice. Aceste tratamente trebuie să se bazeze pe
informaţii meteorologice şi/sau anchete asupra recoltelor. Infestarea se derulează de obicei în
timpul înfloririi, ceea ce înseamnă că micotoxinele pot fi produse. Dacă o infestare fungică
este descoperită ulterior în cultură, trebuie să se ţină cont de manipularea produselor, de
amestecarea şi folosirea cerealelor.
Specii de mucegaiuri cu potenţial toxicogen au fost izolate pe un număr mare de ierburi şi
specii de ierburi cu frunzele late. S-a arătat că o densitate ridicată de ierburi implică o
infestare mare cu mucegaiuri. Ierburile prezente în culturi trebuie să fie combătute prin
mijloace mecanice sau prin ierbicide omologate sau alte practici de înlăturare.
S-a stabilit că „culcarea la pământ" a plantelor are un efect semnificativ asupra cantităţii
de micotoxine în cereale. În consecinţă, plantele culcate la pamânt trebuie evitate în timpul
recoltării, în special daca ele sunt umede şi prezintă primele semne ale germinării. Pentru a
evita „culcarea la pământ" a culturilor, se recomandă folosirea judicioasă a îngrăsămintelor şi
aplicarea regulatorilor de creştere. Trebuie să se evite scurtarea excesivă a tijelor.
3.1.2 Practici recomandate în timpul recoltării
Evaluarea calităţii cerealelor înaintea recoltării, ţinând cont de limitele unei eşantionări
reprezentative şi o analiză rapidă pe teren. Separarea, dacă este posibilă, a cerealelor pe baza
3312133
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
exigenţelor calităţii pieţei - de exemplu - pentru producţia de pâine sau hrană pentru animale -
şi calitatea culturii vechi - umedă, curată sau uscată.
Recoltarea să se facă pe cât posibil atunci când conţinutul de apă al plantei să fie adecvat.
Întârzierea recoltării cerealelor deja contaminate cu mucegaiuri poate provoca o creştere
sensibilă a conţinutului de micotoxine în cultură. Trebuie să se ţină cont de posibilitatea
uscării în cazul în care cultura nu poate fi recoltată în condiţii optime de conţinut de apă.
Înainte de recoltare trebuie să se verifice dacă echipamentul care va fi folosit la recoltare şi
depozitare este în stare bună. O defecţiune în această perioadă critică poate dăuna calităţii
cerealelor şi favoriza formarea micotoxinelor. Trebuie de asemenea verificat şi etalonat
echipamentul necesar pentru măsurarea conţinutului de apă. Trebuie să se evite pe cât posibil
sfărâmarea mecanică a cerealelor şi contactul cu solul în timpul recoltării. Cerealele cu boabe
zbârcite şi mici pot prezenta mai multe micotoxine decât cele cu dimensiune normală. Este
posibilă reducerea conţinutului de micotoxine prin eliminarea boabelor zbârcite prin reglare
corectă a combinei sau printr-o triere post- recoltare pentru a elimina boabele stricate şi alte
particule străine.
3.1.3 Practici recomandate privind uscarea cerealelor
Trebuie să se determine conţinutul de apă al culturii înaintea recoltării sau imediat după
recoltare. Eşantioanele prelevate în acest scop trebuie să fie cât mai reprezentative. Se
recomandă pe cât posibil uscarea cerealelor pentru a atinge conţinutul de apă recomandat
pentru depozitare. În cazul cerealelor umede care trebuie să fie uscate, se va reduce la
minimum perioada cuprinsă între recoltare şi uscare. În consecinţă, va trebui, în anumite
cazuri, să se planifice recoltarea în funcţie de capacitatea de uscare.
Cerealele trebuie să fie uscate astfel încât conţinutul în apă să fie inferior celui care va
permite dezvoltarea mucegaiurilor în timpul depozitarii. O activitate a apei inferioară valorii
de 0,65 corespunde în general unui conţinut în apă mai mic de 15%. Trebuie să se stabilească
valori precise ale conţinutului de apă, ţinând cont de condiţiile locale de depozitare. Este o
necesitate pentru prevenirea dezvoltării unui anumit număr de specii fungice care se pot găsi
în cereale înaintea uscării.
Dacă cerealele umede trebuie să fie depozitate fară să fie uscate, mucegaiurile se vor
dezvolta în câteva zile şi vor provoca reîncălzirea lor.
Cerealele trebuie să fie uscate astfel încât să se reducă la minimum pagubele cauzate de
dezvoltarea mucegaiurilor. Aerarea cerealelor umede poate evita supraîncălzirea înaintea
3412134
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
uscării. Evitarea pe cât posibil a amestecării loturilor de cereale care prezintă riscuri diferite
de contaminare.
Pentru a reduce variaţia conţinutului de apă în lot, cerealele se pot transfera în altă
instalaţie sau în alt depozit după uscare.
3.1.4 Practici recomandate la depozitarea cerealelor
Pentru mărfurile ambalate trebuie să se asigure că sacii sunt curaţi şi uscaţi şi sunt aşezaţi
pe paleţi sau au intercalat între ei un strat impermeabil.
Aerarea pe cât posibil a cerealelor, prin trecerea circulară a aerului în zone de depozitare
pentru a menţine o temperatură apropiată şi uniforma în toate aceste zone. Controlul regulat
al conţinutului de apă şi temperatura cerealelor depozitate în timpul depozitării este necesară.
Un miros neplăcut poate arăta că boabele sunt încinse, în cazul în care locul depozitării este
închis, lipsit de ventilaţie.
Măsurarea temperaturii cerealelor depozitate la intervale determinate în timpul
depozitarii. O creştere a temperaturii poate indica o dezvoltare microbiana şi/sau o infestare
cu insecte. Separarea părţilor aparent infestate şi prelevarea de eşantioane pentru analiză.
Scăderea temperaturii cerealelor rămase şi aerarea este o metodă eficientă pentru a împiedica
dezvoltarea mucegaiurilor. Evitarea folosirii cerealelor contaminate pentru producţia de
alimente destinate consumului uman şi animal.
Folosirea metodelor de întreţinere dupa reducerea la minimum a prezenţei insectelor şi
formarea mucegaiurilor în depozite. Folosirea insecticidelor şi fungicidelor agreate sau altor
metode adaptate. Alegerea produselor chimice care nu influenţează calitatea cerealelor şi
folosirea acestora în cantităţi prescrise.
Folosirea unui agent de conservare agreat (de exemplu acizi organici - acidul propionic)
poate avea efecte benefice pentru cerealele destinate alimentaţiei animale. Acidul propionic şi
sărurile sale sunt fungistatice şi sunt uneori folosite pentru conservarea cerealelor recoltate
umede, evitând pe cât posibil incingerea sau mucegăirea înaintea aplicării tratamentului.
Aceste produse trebuie să fie aplicate rapid cu ajutorul echipamentelor adecvate astfel încât
să se obţină o repartiţie uniformă în tot lotul tratat. Daca cerealele sunt tratate după o perioadă
de depozitare umedă, prezenţa agentului de conservare nu constituie o garanţie a
necontaminării.
3.1.5 Practici recomandate în timpul transportului produselor35121
35
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Maşinile destinate transportului cerealelor trebuie să fie uscate şi lipsite de mucegaiuri
vizibile, insecte şi alte materiale contaminate. Dacă este necesar, trebuie să se cureţe şi
dezinfecteze înainte şi după folosire, fiind adaptate destinaţiei prevăzute. Folosirea
fumigatelor şi ierbicidelor omologate poate fi util. Se vor proteja cerealele, în timpul
transportului, de umezeală. Se vor evita fluctuaţiile de temperatură şi intervenţiile care ar
putea provoca o condensare a suprafeţei cerealelor, ceea ce va conduce la o creştere localizata
a nivelului umidităţii care va favoriza dezvoltarea mucegaiurilor şi formarea micotoxinelor.
3.1.6 Evitarea pătrunderii insectelor, pasărilor si rozătoarelor în timpul transportului.
Totuşi, aplicarea practicilor agricole nu este suficientă pentru a împiedica contaminarea.
Strategiile de decontaminare sunt dezvoltate pentru a face faţă acestei probleme.
3.2. Strategii curative: decontaminarea
Jemmali (1979) şi Park si col. (1988) au propus criterii specifice pentru validarea
procedurilor de decontaminare a micotoxinelor în produsele alimentare. Pentru a fi considerat
eficace, acest procedeu trebuie să răspundă următoarelor exigente:
o trebuie să inactiveze, distrugă sau să elimine toxina;
o nu trebuie să genereze sau să lase reziduuri toxice în produs;
o trebuie să menţină calităţile nutritive ale alimentului;
o trebuie să fie acceptabil pentru alimentaţia umană şi animală;
o nu trebuie să modifice în mod semnificativ proprietăţile tehnologice
o ale produsului;
o trebuie să distrugă dacă este posibil sporii şi mucegaiurile;
O altă strategie constă în limitarea efectelor toxice ale micotoxinelor prin ingerarea de
agenţi chelaţi ai toxinei ca aluminosilicaţii de sodiu sau calciu hidrataţi, sau cu ajutorul aditivilor
alimentari (vitamine, aspartam, melatonine, piroxicam sau acid lactic şi acid ascorbis),
contribuind la protecţia parţială a organismului faţă de toxicitatea micotoxinelor.
3.2.1. Metode fizice
3612136
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Metodele fizice pot fi clasificate în două categorii:
metode care conduc la eliminarea fracţiunilor alterate;
metode care produc denaturarea toxinelor.
Rezultatele obţinute în funcţie de tipul de aliment şi de toxinele în cauză sunt prezentate în
tabelul 7.
3.2.1.1 Eliminarea fracţiunilor alterate
Pentru eliminarea părtilor alterate de materie prima se intervine cu diferite metode de
curăţire sau separare. Aceste metode, uneori foarte simple prezintă un interes evident în cazul
contaminărilor localizate sau când distribuţia toxinei în produs este eterogenă.
a) Curăţirea
O simplă triere manuală a produselor contaminate cu mucegaiuri permite o diminuare
însemnată a conţinutului de toxină. Această triere poate fi mărită dacă se realizează în mod
electronic. Plutirea şi segregarea prin densitate a cerealelor contaminate cu mucegaiuri permit
reducerea conţinutului mediu de micotoxină cu peste 90%; 95% din aflatoxine sunt localizate
în boabele care plutesc pe apă. Cernerea porumbului contaminat cu fumonisine permite
reducerea conţinutului de toxine, boabele sparte conţin de 10 ori mai multe micotoxine decât
boabele intacte. Curăţarea, polizarea şi aspirarea boabelor de grâu, permit o eliminare parţială
a desoxinivalenolului, 60-80% rămânând totuşi în făină
b) Măcinarea fină, înmuiere şi separare
Studii efectuate pentru porumb au arătat că măcinarea fină a acestuia permite separarea
diferitelor fracţiuni a căror nivel de contaminare cu toxine este variabil.
În timpul unei măcinări umede, aflatoxina B1 se regăseşte în principal în apa de înmuiere
a porumbului (39-42%) şi în fibre (30-38%), restul fiind repartizat în gluten (13-17%),
germeni (6-10%) şi amidon (1%).
Zearalenona este concentrată în gluten (49-56%) şi în substanţele solubile (17-26%), dar
este absentă în amidon. Substanţele solubile zdrobite conţin de patru ori mai multă
zearalenonă decât originalele şi fracţiunile de gluten. Totuşi, aceste fracţiuni reprezintă
14-19% din porumb, reprezentând 72-75% din părţile contaminate cu zearalenonă.
3712137
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Fumonisinele se concentrează în apa de înmuiere. Pentru porumbul puţin contaminat,
(1.0pg/kg), nici o fracţiune nu a putut fi detectată în fracţiunile tratate.
Pentru porumbul foarte contaminat (13.9mg/kg), o parte din toxină este regăsită în apa de
înmuiere şi de tratament, alte fracţiuni contaminate se găsesc în ordine descrescătoare în:
gluten >fibre>germen.
În ceea ce priveşte desoxinivalenolul, marea parte a toxinei se găseşte în apa de înmuiere,
deşi cantităţi măsurabile rămân în amidon. La fel s-a arătat că 67% din toxina T-2 este
eliminată prin apa de înmuiere şi de tratament.
În sfârşit, 43% din ochratoxina A se regăseşte în apa de tratament a porumbului şi în
substanţele solubile de tratament ulterior, 4% în germen şi 51% în crupe.
Nivelul de contaminare al diferitelor fracţiuni de porumb este diferit dacă măcinarea se
realizează uscat. Aflatoxinele se regăsesc concentrate în fracţiunile „germen" şi „înveliş".
Crupele şi făina (produse principale) care nu conţin decât puţină materie grasă, conţin doar
6-10% din cantitatea de aflatoxine. Aflatoxina B1 se găseşte de asemenea în partea periferică
a boabelor de grâu tari. În ceea ce priveşte zearalenona, toate fracţiunile uscate conţin
micotoxine, doar 3-10% pot fi eliminate prin măcinare uscată. Pentru aflatoxine nivelul cel
mai ridicat se regăseşte în fracţiunile cu cantităţi mari de materii grase.
În concluzie, eliminarea fracţiunilor alterate trebuie să fie preconizată de fiecare dată
când este posibilă. Eficacitatea sa este legată de natura invaziei fungice (contaminare de
suprafaţă sau de profunzime) şi de caracteristicile toxinelor (concentraţia aflatoxinelor în
fracţiunile bogate în grăsimi, concentraţia fumonisinelor hidrosolubile în apa de înmuiere).
Dacă echipamentul de separare este standardizat, anumite metode pot prezenta interes în
tratamentul anumitor materii prime (cernerea porumbului de exemplu în vederea diminuării
nivelului contaminării cu fumonisine).
Tabel 14. Compararea eficienţei metodelor fizice de decontaminare
Metoda Produs Toxina Eficienţa
3812138
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Curăţire şi eliminareTriere electronica/manuala arahide aflatoxine ++
Plutire şi separare(densitate)
arahide, porumb aflatoxine +++
Cernere porumb fumonisine +++Curăţire şi polizare grâu deoxinivalenol -Măcinare si separare
Măcinare umeda porumb aflatoxine +/-zearalenone +/-
Înmuiere porumb fumonisine ++grâu deoxinivalenol ++porumb ochratoxina A ++
Măcinare uscata porumb aflatoxine +/-zearalenona +/-
Tratamente termiceCăldura umedă toate produsele aflatoxine + sau -
porumb fumonisine + sau -Prăjire toate produsele aflatoxine + sau -Căldura uscata făina ochratoxine ++ Căldura toate produsele tricotecene -Iradiere toate produsele aflatoxine -
+++ : eliminarea sau denaturare mai mult de 90%; ++: eliminare sau denaturare cuprinsă între
70-90%;+ : eliminare sau denaturare cuprinsă între 50-70%; -: eliminare în anumite fracţiuni;
+ sau: eliminare moderată, variabila dupa tratamentul efectuat.
3.2.1.2 Denaturarea toxinelor
Denaturarea prin tratament fizic a micotoxinelor presupune intervenirea mecanismelor de
degradare complexă bazată pe o deshidratare a micotoxinelor sau intervenţia reacţiilor
radicale. Aceste metode prezintă doua inconveniente majore:
lasă produse de degradare în materia primă. Toxicitatea acestor reziduuri trebuie să
fie evaluată;
tratamentul alimentelor poate modifica mult valoarea nutritivă.
Tratamente termice
3912139
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Aflatoxinele sunt rezistente la degradare termica şi nu sunt distruse cu apa clocotită, prin
autoclavare sau prin numeroase procedee termice de transformare a alimentelor. Mai mult de
50% din conţinutul de aflatoxine sunt regăsite în alimente după gătirea orezului. Aflatoxina
Bl rezistă la căldură, iar aflatoxina Ml rezistă la pasteurizare. Diferitele tehnici de prăjire a
cafelei, porumbului sau arahidelor permit o diminuare parţială a conţinutului de aflatoxine în
produsele finite. Fumonisinele sunt de asemenea considerate ca fiind rezistente la căldură.
Ochratoxina A este sensibilă la tratamentele termice, mai ales în cazul în care acestea se
fac în lipsa apei. Încălzirea făinii la 250°C timp de 40 minute, permite o reducere cu 76% a
nivelului de contaminare, 62% din conţinutul de ochratoxina A dispare în timpul preparării
biscuiţilor, chiar dacă micotoxina nu este degradată în timpul fabricării pâinii.
Desoxinivalenolul este cel mai stabil la tratamentele termice decât toate micotoxinele
testate.
Iradiere
Efectele radiaţiilor asupra micotoxinelor sunt puţin cunoscute. O iradiere de 2.5 Mrad nu
degradează aflatoxinele într-un aliment pe bază de alune, în timp ce expunerea la UV a
uleiului de arahide sau cocos contaminat artificial va permite reducerea conţinutului de
aflatoxine. Aceste efecte sunt mai puţin importante în cazul unei contaminări naturale a
alimentelor.
Aplicarea unei doze de raze X asupra unui aliment pentru a distruge aflatoxinele are ca
efect distrugerea alimentului.
În concluzie denaturarea fizica a toxinelor nu poate fi propusă ca o metodă sistematică
de decontaminare. Amintim totuşi că diferite tratamente (termice în special) sunt aplicate
materiei prime sau alimentelor în timpul păstrării sau fabricării. Aceste tratamente pot
diminua parţial toxicitatea alimentelor produse, dar nu trebuie considerate în nici un caz ca
fiind tehnici de „asanare" a materiei prime contaminate.
3.2.2. Denaturare chimică
O modificare a structurii micotoxinelor poate fi efectuată prin diferite tipuri de reacţii
chimice (hidroliza epoxizilor şi esterilor, oxidări). Metoda folosită este obligatoriu specifică
structurii compusului degradat, şi pentru aceeaşi familie de micotoxine.
Efectele diferitelor tratamente chimice ale alimentelor conform toxinelor în cauză sunt
prezentate în tabelul 15.
4012140
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Tabel 15. Compararea metodelor chimice de decontaminare
Metoda Toxina Eficienţa Acizi si baze Amoniacare aflatoxine +++
fumonisine ? Nixtamalizare aflatoxine + şi?
fumonisine ? Nixtamalizare+H2O2 fumonisine ?
Oxidanţi si redactori Apa oxigenată aflatoxine + Bisulfiti aflatoxine +Glucoză, fructoză fumonisine +
+++: denaturare şi diminuare importantă a toxicităţii; +: efect benefic;
-: efect nefast; ?: denaturare farà modificarea toxicităţii.
3.2.2.1 Acizi si baze
Aflatoxinele pot fi degradate în mediu foarte acid sau foarte alcalin, dar timpul necesar
acestei degradări face inaplicabilă folosirea directă a acizilor sau bazelor pe alimente.
O decontaminare eficientă poate fi obţinută prin asociere cu presiunea, temperatura şi
compuşi alcalini. Aceste tehnici au fost perfecţionate şi sunt cunoscute astăzi sub denumirea
de amoniacare şi nixtamalizare.
Amoniacarea porumbului, arahidelor şi altor materii prime este larg utilizată pentru a
diminua conţinutul în aflatoxine din alimente. Este o metodă eficace de decontaminare a
hranei animaliere, folosită dupa mulţi ani în Statele Unite, în Franţa, Sudan, Brazilia, Mexic
şi în Africa de Sud. O utilizare simultană a temperaturilor înalte şi a presiunilor înalte face
metoda mult mai eficace.
Tratamentul cu amoniac la presiuni atmosferice şi la temperatura mediului ambiant
reduce conţinutul în fumonisine din materialul de cultură, dar nu reduce toxicitatea unui
produs atunci când este administrat pe cale orală la şoareci. O reducere de 79% a conţinutului
de fumonisine în porumb poate fi observată după un tratament de amoniacare la presiune
înaltă şi temperatura mediului ambiant urmat de un tratament la presiune joasă şi temperatură
înaltă.
Nixtamalizare sau tratament alcalin la căldura, utilizat la elaborarea pesmetului de
porumb, reduce semnificativ conţinutul de aflatoxine. Totuşi studii ulterioare au arătat că o
parte din aflatoxine sunt regenerate în timpul acidifierii produselor.
4112141
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Deşi nixtamalizarea reduce conţinutul de fumonisine Bl din alimente prin hidroliza
micotoxinelor, toxicitatea lor nu este diminuată. Această tehnică nu este deci o strategie
valabilă de detoxifiere a fumonisinelor. A fost propusă o metodă de nixtamalizare modificată,
prin adăugare de peroxid de hidrogen şi bicarbonat de sodiu. Folosirea pe alimente
contaminate, conduce la o reducere cu 40% a mortalităţii creveţilor de mare (prin comparare
cu alimentele tratate fără adăugare de peroxid de hidrogen şi bicarbonat de sodiu). Trecerea
în mediu acid sau alcalin nu conduce la accelerarea degradării micotoxinelor. Patulina va fi
astfel mult mai sensibilă în mediu acid decât în condiţii de pH apropiat de valori ale
neutralităţii.
3.2.2.2 Oxidanţi şi reducatori
Am amintit deja că adăugarea peroxidului de hidrogen la o metodă de nixtamalizare
clasică ameliorează eficacitatea lor în denaturarea fumonisinelor.
Folosirea peroxidului de hidrogen a fost propus pentru denaturarea aflatoxinei Ml.
Degradarea toxinei este accelerată prin adăugare de riboflavine care vor cataliza formarea
oxigenului reactiv plecând de la peroxidul de hidrogen.
Bisulfitul de sodiu sau de potasiu permit o degradare parţială a aflatoxinelor 50% din
toxinele din soluţie apoasă la un pH de 5.5 vor fi degradate după 150 ore în prezenţa a 3000
ppm bisulfit. Timpul necesar acestei degradări scade prin creşterea temperaturii. Efectul
bisulfitului va fi obţinut şi pe porumb contaminat. O diminuare a toxicităţii in vitro a
aflatoxinelor B1 va fi observată când se încălzesc în prezenţa glucozei şi fructozei.
Oxidanţii şi reducătorii folosiţi singuri nu prezintă un interes scăzut în contaminarea
alimentelor cu micotoxine. Folosirea reducătorilor poate fi eficace în alte circumstanţe cum ar
fi contaminarea sucului de mere cu patulina. Această micotoxină este astfel degradată cu
ajutorul dioxidului de sulf.
O soluţie cu 2000 ppm dioxid de sulf permite distrugerea a 90% din patulina din sucul
de fructe (concentraţia iniţială de 15 ppm).
Acidul ascorbic accelerează degradarea patulinei şi acidului penicilic din sucul de mere.
Cu ajutorul vitaminei C (5%) la un suc de mere contaminat (300 ppb) va permite o reducere a
nivelului de contaminare cu aproximativ 80%, după 15 zile de conservare la 4°C.
3.2.3. Adsorbţia toxinelor
4212142
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Imobilizarea unui xenobiotic prin legătura noncovalentă a adsorbanţilor constituie o
metoda de „decontaminare" din ce în ce mai mult folosite când micotoxinele sunt prezente în
alimente.
Această tehnică poate fi performantă pentru anumite toxine sub rezerva alegerii
apropiate a adsorbantului. Termenul de adsorbţie a toxinelor poate avea de asemenea o
eficienţă foarte scăzută când este folosit în alimentaţia animală pentru alte motive:
proprietăţile fluidifiante ale argilelor, efectele benefice ale anumitor adsorbanţi, obişnuinţa,
din motive comerciale.
Obiectivele sunt precizarea interesului pe care îi pot avea adsorbanţii în folosirea lor cu
materii prime contaminate cu micotoxine.
3.2.3.1 Argilele
Termenul de argilă corespunde compuşilor formaţi din silicaţi lamelari, mai mult sau mai
puţin hidrataţi, provenite din alterarea silicaţilor cu structura tridimensională. Când aluminiul
este prezent aceşti compuşi sunt numiţi aluminosilicati. Absorbţia puternică a aflatoxinelor de
aceşti compuşi, asociată cu o diminuare netă a toxicităţii alimentelor contaminate este după
toate aparenţele originea argumentului actual pentru adsorbanţi.
Efectele benefice ale argilelor în alimentaţia animală în absenţa contaminării cu
micotoxine, au fost foarte mult studiate. Aceşti compuşi interferă cu absorbţia
oligoelementelor, efectele nefaste fiind de asemenea raportate.
Aluminosilicaţii de sodium şi de calciu hidratat
Cele mai cunoscute sunt „HSCAS" (aluminosilicaţii de sodiu şi calciu hidratat).
Aluminosilicaţii de sodiu şi de calciu (tabel 16) constituie clasa de alunimosilicaţi foarte
studiaţi pentru proprietăţile sale adsorbante. Aceşti compuşi fac parte din familia zeolitelor
având un deficit în sarcina pozitivă, constituind excelenţi adsorbanţi de cationi.
Aluminosilicaţii prezintă remarcabile proprietăţi adsorbante vis-a vis de aflatoxine,
complexul format fiind stabil pentru un gram de pH activ de 2.5-10. Aflatoxinele astfel
adsorbite sunt imobilizate, mai puţin de 10% pot fi extrase cu solvenţi organici. Această
adsorbţie este un proces care se realizează rapid şi intens. 1 mg de HCSAS poate fixa mai
mult de 200 nmoli AFB1. Această puternică fixare explică faptul că sunt necesare cantităţi
4312143
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
foarte mici de HCSAS în alimente pentru a diminua efectele negative ale aflatoxinelor. Este
acompaniat de o diminuare a conţinutului de A FM 1 în lapte.
Proprietăţile adsorbante ale HCSAS au fost testate şi pentru alte micotoxine. Rezultatele
obţinute vis-a vis de zearalenonă sau ochratoxina A sunt parţiale, iar în ceea ce priveşte
tricotecinele rezultatele sunt înşelătoare.
Tabel 16. Formule brute ale HSCA
Nume FormuleMezolita Na2Ca2A16Si9O30-8H2OStilbita NaCa2 A15 Si 13 036-14H20Tomsonita NaCa2A15Si5O20-6H2OGmelinite (Na2,Ca)A12Si4012-6H20Heulandite (Ca,Na)2.3Al3(Al,Si)2Sii3036-12H20
Zeolitele
Zeolitele sunt substanţe cristalizate cu o structură formată din tetraede interconectate de
SiO4 şi AlO4. Pentru a face parte din familia zeolitelor, aluminosilicaţii trebuie să respecte
proporţia de 0.5 între (Si+Al)/O. Tetraedrul aluminosilicaţilor este încărcat negativ, lăsând un
spaţiu mare între molecule, izolând cationi (de obicei şi/sau ). În zeolitele folosite
ca absorbant spaţiile libere sunt interconectate, formând un spaţiu mare capabil să adsoarbă
compuşi cu masă mai mare decât sodiu sau calciu. Pe de altă parte, aceşti compuşi se
deshidratează şi hidratează foarte uşor, modificându-şi astfel structura.
În ceea ce priveşte adsorbţia micotoxinelor, efectele zeolitelor au fost testate în prezenţa
aflatoxinelor. Adsorbţia AFB în soluţie în diferite medii a fost în jur de 60% in vitro. Această
adsorbţie, deşi inferioară în prezenţa compuşilor azotaţi, va diminua toxicitatea alimentelor
care conţin 2.5 ppm aflatoxine.
Originea zeolitei este fundamentală. Un studiu comparativ între 5 forme arată diferenţe
de protecţie, importanţa toxicităţii alimentelor contaminate cu aflatoxine la pui.
Zeolitele sunt sintetizate, în special de sodiu, devenind mai active.
Adăugarea de 5% zeolit anionic de sinteză într-un aliment care conţine 250 ppm
zearalenonă previne efectele toxinei la şobolani (câştig în greutate). Nu a fost observată nici o
protecţie cu zeolit cationic de sinteză. Originea zeolitelor folosite nu este menţionată iar
4412144
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
nivelul de contaminare cu zearalenonă este ridicat, făcând aceste rezultate dificil de exploatat
în practică.
Bentonitele
Bentonita este o argilă, formată prin îmbătrânirea cenuşelor vulcanice. Termenul de
bentonită regrupează deci diferite produse cu aceeaşi origine dar cu compoziţie diferită.
Compuse din aluminiu şi siliciu fac parte din marea categorie a aluminosilocaţilor. Unele sunt
bogate în sodiu altele în calciu, potasiu sau magneziu: toate conţin oligoelemente şi urme de
metale toxice (tabel 17). Originea bentonitei va fi foarte importantă însă în capacitatea de a
adsorbi toxinele.
Bentonita de sodiu este cel mai mult folosită în alimentaţia animală. Având în vedere
marea sa suprafaţă internă, acest compus adsoarbe în jur de 6-7 ori greutatea sa în apă.
Capacitatea sa de schimb cationic este în jur de 80-85 meq/100g.
Utilizările bentonitei sunt multiple. În alimentaţia animală este folosită în principal
pentru proprietăţile sale:
agent de legătură în alimente (peleţi), nivelul său de încorporare variază
între 1.5-3%;
agent anti-aglomerant în forme, pentru a evita formarea bulgarilor;
adsorbant al apei pentru a reduce pierderile de apă din depozite;
sursa de oligo-elemente, în principal seleniu şi magneziu.
În terapie, bentonita a fost folosită ca adsorbant în tratamentul de intoxicare. Proprietăţile
sale adsorbante vis-a vis de aflatoxine au fost explorate:
In vitro, 2% bentonită adsoarbe între 94-100% AFB1 (400pg) soluţie în tampon fosfat la
pH 4,5. Capacitatea adsorbantă variază în funcţie de natura bentonitei folosită. O extracţie cu
cloroform a complexelor formate furnizează un procent de recuperare care variază între
5-25%. În lapte, 2% bentonită adsoarbe 80% din doza de AFB1 (3-6ppb).
Procente de adsorbţie similare sunt observate la pH 2, şi pe amestec biologic complex
reprezentativ de lichide intestinale. Studii făcute pe alimente mucegăite arată că 10%
bentonită adsoarbe 70% din AFB 1 prezentă (44.6ppb).
In vivo, cu ajutorul bentonitei de sodiu, toxicitatea aflatoxinelor din alimentele
contaminate scade . Un nivel de încorporare de 5% prezintă efecte optime. O protecţie vis-a -
4512145
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
vis de efectele teratogene ale aflatoxinelor a fost observată la şobolani. Pentru bentonite, ca şi
pentru alte argile, nu sunt inhibate toate efectele negative ale aflatoxinelor.
Efectele bentonitei au fost de asemenea testate şi pentru toxicitatea toxinei T-2. La
şobolani, acţiunea negativă a acestei micotoxine este diminuată prin administrarea bentonitei
în alimentul contaminat cu 3 ppb toxina T-2. Efectul protector al bentonitei este mult
diminuat când nivelul de încorporare în raţie depăşeşte 5-10%. Efectul benefic poate fi
asociat cu o adsorbţie a toxinei, dar şi unei modificări a vitezei de tranzit intestinal. Nicele
foarte ridicate de încorporare face aceste rezultate dificil de aplicat în cazul alimentaţiei
animale.
Bentonita (2-5%) nu a avut nici un efect asupra toxicităţii zearalenonei (3 ppm) şi
nivalenolului (11.5 ppm) la porc. Nivelurile mari de contaminare cu toxine (zearalenona
3 ppm şi nivalenol 11.5 ppm) poate satura proprietăţile adsorbante ale bentonitei.
Proprietăţile adsorbante vis-a vis de ochratoxina A sunt variabile în funcţie de pH; insuficient
totuşi în toate cazurile pentru diminuarea concentraţiilor plasmatice în toxină.
Montmorrilonita permite, în soluţie de 2%, o adsorbţie de 95% din conţinutul de AFBI
prezent într-o soluţie tampon fosfat la pH de 6,5. O extracţie cu cloroform a complexelor
formate furnizează un procentaj de recuperare care variază între 10-57%. Rezultate similare
sunt obţinute în mediu lichid unde compoziţia este asemănătoare cu cea a lichidelor
intestinale. Echilibrul este atins după o oră, iar complexul format este stabil pentru un pH
cuprins între 2,5-7. Un gram montmorrilonită permite adsorbţia a mai mult de un miligram
aflatoxine.
Tabel 17. Compoziţia tipică a unei bentonite
Element Procentaj Impurităţi ProcentajSi02 60-65% Umiditate 5-10%AI2O3 15-20% Pietriş < 1%Fe203 <5% Arsenic 0.1-10 ppmMgO <5% Cadmiu 0.1-10 ppmNa20 < 5% Cupru 0.1-10 ppm
4612146
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
CaO > 1% Mercur 0.1-10 ppmK20 > 1% Plumb 0.1-10 ppmTi02 > 1% Zinc 0.1-10 ppm
Alţi filosilicaţi
Kalinul ( A12Si205(OH)4) sau silicatul de aluminiu este un fílosilicat folosit în tratarea
ulcerelor gastrice; este de asemenea dotat şi cu proprietăţi adsorbante. In vitro, concentraţia
de 2% permite adsorbţia de 87% din conţinutul de AFBI (8 ppm) prezent într-o soluţie
tampon fosfat (6.5). Totuşi, adsorbită este uşor reversibilă, aproximativ 77% din toxina
rămâne extractibilă cu cloroform. Permite de asemenea decontaminarea arahidelor şi previne
efectele toxinei la şobolani în cazul unei contaminări a alimentelor de 5 ppm AFB1 ( adaos de
0.2-1% kaolin) Acest efect devine insuficient dacă nivelul de contaminare este mult mai mare
(20 ppm).
Sepiolita ((MgO)2(Si02)3, 2H20 sau silicatul de magneziu este de asemenea un filosilocat.
Folosind 2% sepiolită se poate adsorbi peste 87% din conţinutul de AFB1 (8 ppm) prezent
într-o soluţie tampon fosfat (pH 6,5). Această adsorbţie este reversibilă, peste 77% din toxină
rămânând extractibilă cu cloroform. Se explică astfel efectele protectoare ale sepolitelor 0.5%
în aliment vis-a- vis de toxicitatea AFB1 (800 ppm) la porc.
Carbonul activ este o pudră neagră nehidrolizabilă, obţinută prin piroliza diferitelor
tipuri de materii organice. Carbonul activ este folosit in vivo pentru adsorbţia toxicilor şi
toxinelor la om şi animal. Capacităţile sale adsorbante variază în funcţie de porozitatea sa
( suprafaţa de contact) şi de mediul în care se regăseşte ( apos, concentraţia în materie
organică şi sare, pH.). Adsorbţia specifică variază între 500 /g - 3500 /g. Carbonul
activ este foarte des folosit în cazul separării micotoxinelor în vederea dozării lor. Este folosit
în vederea unei decontaminări a alimentelor lichide, în special a sucului de mere.
Persistenţa unei coloraţii cafenii închise în produsul tratat face dificilă folosirea lui in
alimentaţia umana. Datorita prezentei sale sub forma de pudra si puterea de colorare,
folosirea în alimentaţia umană este de asemenea delicată. Folosirea carbonului în extracţia
micotoxinelor ca şi frecvenţa utilizării în tratamentul intoxicaţiilor acute explică totuşi
utilizarea sa experimentală mai mult decât în cazul decontaminării.
4712147
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Capacitatea adsorbantă a carbonului activ vis-a vis de aflatoxine a fost pusă în evidenţă
totuşi. 100 mg carbon sunt capabile sa adsoarbă 1 mg toxină în prezenţa a 2% serumalbumina
bovina şi 0.5% ulei de porumb, la pH 7. Complexul format este stabil, şi protejează
toxicitatea AFB1: diminuarea semnelor hepatotoxice (mărcări plasmatice şi leziuni hepatice),
creşterea procentajului de supravieţuire, creşterea eliminării micotoxinelor şi metaboliţilor lor
prin excreţii fecale. Aceste efecte au fost observate mai bine în cazul intoxicaţiilor acute
decât în cazul celor cronice, la animalele nerumegatoare şi la pasări. Totuşi semnele unei
aflatoxicoze nu au putut fi evitate, ceea ce sugerează că folosirea carbonului activ este
insuficientă pentru a garanta salubritatea alimentelor contaminate cu aflatoxine.
Efectele benefice ale carbonului „ super activ" (capacitate mare de adsorbţie) au fost
puse în evidenţă în cazul administrării toxinei T-2. O creştere a procentului de supravieţuire a
fost observată în cazul administrării unei doze letale la şobolani. Acest efect a fost parţial
observat la administrarea micotoxinelor, poate fi legată de adsorbţia moleculeor şi
metaboliţilor săi eliminaţi prin excreţii biliare. Este acompaniată de o diminuare a semnelor
de necroză tisulară. Efectele protectoare pot fi mărite prin administrarea concomitentă a
corticoidelor. Carbonul activ permite o adsorbţie a toxinei aplicată pe o piele lezată. Totuşi,
protecţia legată de administrarea carbonului activ (0,5 % de aliment), la puii care primesc un
aliment contaminat cu 6 ppm toxina T-2 nu este dovedită.
În ceea ce priveşte ochratoxina A, carbonul activ este un adsorbant eficace in vitro, el nu
este capabil însă să diminueze toxicitatea micotoxinei in vivo la pui. Acest efect poate fi
consecutiv la o diminuare a capacităţii adsorbante a carbonului în alimente, în raport cu
conţinutul lor ridicat în substanţe organice. Un net efect protector a fost observat în cazul
administrării unor doze mari de carbon în aliment (5-10%) contaminate cu ochratoxina A
(1 ppm), fiind însoţit totuşi de o diminuare a concentraţiilor plasmatice în vitamina E.
3.2.3.2 Răşinile
Răşinile sunt polimeri de sinteză formaţi din cerpetene macromoleculare tridimensionale
prezentând grupări active susceptibile fixării de compuşi organici sau minerali prin legături
cu energie scăzută. Răşinile curente sunt răşinile schimbătoare de cationi de tipul R-SO 3;
R-PO3 ; R-COO şi răşini schimbătoare de anioni de tipul [R-N(CH3)3] . Aceşti compuşi 48121
48
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
sunt folosiţi în separarea micotoxinelor în vederea dozării ulterioare. Răşinile schimbătoare
de anioni sunt folosite pentru proprietăţile lor adsorbante in vivo. Colestiramina este folosită
în tratamentul hipercolesterolemiei. Proprietăţile sale adsorbante sunt testate in vitro pe
zearalenona (concentraţia de 1%). 1 g colestiramina este capabilă să adsoarbă peste 2 ng
toxine în mediu cu compoziţie apropiată de conţinutul gastric sau intestinal. La şobolani,
folosirea unui nivel de 5% în aliment va diminua nivelul de reziduuri prezente în ficat şi
rinichi. La şoareci, răşina (2.5% în aliment) va duce la creşterea greutăţii corporale dupa
îngerarea unui aliment contaminat cu 6 ppm zearalenonă.
Proprietăţile adsorbante ale colestiraminei au pus în evidenţă administraţia ochratoxinei
A. La şobolani, răşina (2% din aliment) va fi susceptibilă de diminuarea concentraţiilor
plasmatice în OTA ( încorporată în aliment în concentraţie de 1 ppm), de o creştere a
eliminării prin excreţie fecală şi diminuare prin excreţie urinară. Aceste efecte sunt mai puţin
marcante pentru un aliment bogat în lipide saturate, ceea ce corespunde unei diminuări a
ciclului enterohepatic al toxinei. Fixarea ochratoxinei A pe răşini va fi în competiţie cu
sărurile biliare, cu o mare afinitate. Această fixare va fi acompaniată de o diminuare a
neprotoxicităţii ochratoxinei A la şobolani.
Astfel, colestiramina prezintă proprietăţi adsorbante interesante vis-a vis de
micotoxinele anionice.
Proprietăţile adsorbante ale polimerilor divinil - benzen - stiren, altă răşină capabilă să
fixeze anioni, a fost testată. În vivo, adăugarea acestui adsorbant în hrana şobolanilor (5%)
modifică toxicocinetica zearalenonei administrată pe cale orală a dozei de 100 mg/kg, şi
diminuarea efectelor negative a alimentelor contaminate cu 3 ppm toxina T-2 administrată
timp de 2 săptămâni. Rezultatele obţinute în acest ultim experiment sunt asemănătoare cu
cele obţinute cu bentonită, dar superioare celor obţinute cu o răşină schimbătoare de cationi.
Polivinilpirolidonele folosite într-un nivel de 0.2% în aliment, vor fi incapabile să
protejeze efectele toxice ale desoxinivalenolului la porc.
Folosirea concentraţiei de 0,3% în aliment, va diminua toxicitatea aflatoxinelor la pui
(2,5 ppm un amestec care conţine mai mult de 80% AFB1 administrat timp de 3 săptămâni).
3.2.4. Metode biologice de decontaminare
4912149
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Se încearcă degradarea în mediu natural a micotoxinelor cu microorganisme sau enzime.
Identificarea potenţialului de degradare cu microorgansime este prima etapă de dezvoltare a
procedeelor. Această activitate de decontaminare trebuie să poată fi transferată pe produsele
contaminate cu micotoxine.
Prin „decontaminare biologică" se întelege transformarea enzimatică a micotoxinei într-un
compus mai puţin toxic.
„Diluarea" nivelului de contaminare cu micotoxine, prin amestecarea unui lot sănătos şi un
lot contaminat este o practică interzisă în Europa (reglementată prin CE N°466/2001) dar,
înainte era totuşi o metodă frecvent folosită.
Degradarea ochratoxinei A prin metode biologice a fost pusă în evidenţă în timpul
procesului de insilozare. Ochratoxina A prezentă în orz poate fi degradată de flora microbiană
existentă. OTA poate fi degradată de asemenea de bacteriile prezente în rumenul vacilor, ceea
ce face ca aceste animale să fie mult mai rezistente la micotoxine decât animalele
monogastrice. Ochratoxina A este hidrolizata în α ochratoxina şi fenilalanina sau este
esterificată în ochratoxina A.
Eubacterium BBSH 797, bacterie izolată din rumen a fost caracterizată de Schtzmayr si
col (2005) pentru potenţialul sau de degradare a ochratoxinei A în α-ochratoxina. Capacitatea
de degradare a ochratoxinei A n α-ochratoxina cu Acinobacter calcoaceticus, izolat de
asemenea din rumen, a fost pusă în evidenţă in vitro pe mediu sintetic la 25-30°C (Hwang şi
Dranghen, 1994).
Enzimele naturale au de asemenea capacitatea de a degrada ochratoxina A. Degradarea
ochratoxinei A în diverse produse neidentificate, a fost pusă în evidenţă în suspensii de celule
de grâu, orz sau porumb. Aceste transformări enzimatice cuprind reacţii de hidroliză, de
metilare care contribuie uneori la pierderea potenţialului toxic al moleculelor ( Ruhland si
col, 1994, 1996a şi 1996b).
O lipază, izolată plecând de la Aspergillus niger degradează ochratoxina A în α-
ochratoxina (Stander si col. 2000).
Alte activităţi enzimatice cât şi alte microorganisme au fost caracterizate pentru potenţialul
lor de degradare a ochratoxinei A.
Ochratoxina este degradată de surse de Rhizopus stolonifer şi Rhizopus microsporus cu o
eficacitate care poate atinge 96% pe grâul umed (Varga si col, 2005).
Rhizopus stolonifer este un patogen ai plantelor care contaminează dupa recoltare.
5012150
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Speciile Rhizopus sunt principalele ciuperci izolate în zycomycose; cu toate acestea Rhizopus
stolonifer, este rar menţionat ca patogen uman. Se propune folosirea acestor surse pentru
decontaminarea cerealelor.
Caracterizarea potenţialului de degradare ai ochratoxinei A de anumite microorganisme
care aparţin florei microbiene naturale a alimentului contaminat prezintă un interes mult mai
mare decât caracterizarea activităţilor enzimatice. Sursele de mucegaiuri, izolate plecând de
la ciorchinele de strugure, sunt capabile se degradeze ochratoxina A până la un nivel mai
mare de 80% pe mediu sintetic. (Abrunhosa si col, 2002).
Două căi de degradare diferite au fost puse în evidenţă în funcţie de specie, implicând
activitatea carboxipeptidazei, conducând la transformarea ochratoxinei A în α-ochratoxina. În
plus, această capacitate de degradare a ochratoxinei A a fost identificată în sursele
ochratoxicogene şi în sursele netoxicogene. Aceste surse aparţin florei microbiene naturale a
strugurelui. Folosirea surselor netoxicogene pentru eliminarea ochratoxinei A din struguri
poate fi luată în considerare.
Bacteriile lactice şi drojdiile intervin în procedeele de fermentaţie agroalimentară,
prezentant potenţial pentru decontaminarea micotoxinelor din produsele alimentare (Shetty si
Jespersen, 2005).
Degradarea ochratoxinei A din lapte a fost pusă în evidenţă de bacteriile din iaurt;
Lactobacilius, Streptococcus si Bifidobacterium (Skrinjar si col, 1996). Sacharomyces
cerevisiae, are capacitatea de a elimina ochratoxina A.
Adsorbţia micotoxinelor de drojdii a fost pusă în evidenţă prin folosirea unui amestec de
drojdii sterile şi reziduuri ale fermentaţiei berii: mecanismul dispariţiei ochratoxinei A in
vitro presupune adsorbţa micotoxinei pe peretele drojdiei (Grunkemerer, 1990). Eliminarea
ochratoxinei cu ajutorul drojdiilor este superioară atunci când drojdiile folosite sunt moarte,
atingând aproximativ 90%. Acest lucru confirmă ipoteza potrivit căreia, eliminarea
ochratoxinei A este rezultatul unui fenomen de adsorbţie, în care, volumul de celulă joacă un
rol în capacitatea de eliminare (Bejaouii si col, 2004).
În plus, folosirea acestor drojdii vii, sau moarte, nu atrage modificări ale calităţii vinului.
Acest procedeu poate fi considerat ca fiind promotor pentru decontaminarea ochratoxinei A
din vin. Fermentaţia alcoolică cu Sacharomyces cerevisiae cu must contaminat cu
desoxinivalenol şi zearalenonă a arătat rezultate după 7-9 zile de fermentare,
desoxinivalenolul a fost stabil. Din conţinutul iniţial de zearalenonă, 69% a fost convertită în
5112151
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
β-zearalenol, 8,1% în α-zearalenol. Marea parte a metabolizării zearalenonei s-a produs după
1-2 zile de fermentaţie.
Folosirea fibrelor vegetale - capabile de a adsorbi imobilizarea micotoxinelor în tractul
gastro-intestinal este de asemenea o metodă biologică folosită la decontaminare.
Activităţile enzimatice au fost identificate pentru degradarea ochratoxinei dar punerea la
punct ca procedee de decontaminare, rămâne să fie rezolvată. Potenţialul de degradare a
micotoxinelor cu microorgansime prezentă în mod natural în siloz sau în produsele
alimentare, prezintă un interes pentru a reduce expunerea animalului şi omului la aceste
toxine. Totuşi, la ora actuală, nici un procedeu nu este pus la punct.
CAPITOLUL 4
Metode de determinare a micotoxinelor
5212152
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
4.1 Pregătirea preliminară a probelor
Micotoxinele prezintă un real pericol atât pentru animale cât şi pentru om, şi este
obligatoriu ca manipularea probelor să se facă cu grijă şi să se lucreze în condiţii care să
împiedice contaminarea materialelor şi a atmosferei.
În plus, anumite mucegaiuri care produc aceste substanţe sunt ele însuşi toxice: este
exemplul lui Aspergillus flavus şi Aspergillus parasiticus pentru care s-au diagnosticat trei
tipuri de simptome la om: infecţie, alergie şi toxicoză. Infecţia reprezintă o invazie a
ţesuturilor vii în timp ce alergia este o manifestare de hipersensibilitate la o antigenă fungică.
Toxicozele sunt maladii rezultate în urma expunerii, în general prin ingerare, prin inhalare
sau prin contact direct, la micotoxine produse de mucegaiuri. Trebuie să se insiste asupra
faptului că atmosfera este un bun vector de contaminare cu micotoxine. Securitatea trebuie sa
fie maximă.
Personalul din laborator trebuie să fie familiarizat cu reglementările privind securitatea.
Mai mult, un control medical al pesonalului este recomandat şi trebuie să se realizeze un set
complet de analize la sânge. Gestionarea riscurilor de laborator trebuie să cuprindă trei
puncte:
1. identificarea sursei periculoase şi a efectelor posibile asupra sănătaţii în cazul
nefolosirii echipamentului adecvat;.
2. punerea la punct a metodelor de manipulare a toxinelor şi microorganismelor;
3. înţelegerea sensului responsabilităţii pentru a permite aplicarea măsurilor de
securitate
Manipularea mucegaiurilor
Culturile trebuie să fie păstrate în eprubete, plăci Petri. Pentru manipularea eşantioanelor
se recomandă să se lucreze în cabine securizate biologic. Pentru protecţie, personalul trebuie
să poarte în permanenţă sorţ, mănuşi şi mască.
5312153
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Manipularea produselor mucegăite
Produsele mucegăite nu trebuie să fie manipulate niciodată fără mănuşi şi analizele se
vor face în aşa fel încât să se evite pe cât posibil inhalarea particulelor toxice.
Analiza eşantioanelor test
Securitatea manipulării este foarte importantă în timpul acestei operaţii. Este
primordială minimizarea contaminării atmosferice cu vapori toxici si particule de praf.
Contactul direct cu toxinele pure sau în soluţie trebuie să fie evitat prin folosirea
echipamentului de pipetare mecanic. Toate suprafeţele de lucru ca şi echipamentele folosite
în timpul extracţiei trebuie să fie obligatoriu decontaminate după utilizare.
Hranirea animalelor cu alimente contaminate
Când animalele de laborator sunt hrănite cu alimente care conţin toxine trebuie să se
poarte în orice moment echipamentul de protecţie. Alimentele trebuie să fie corect etichetate
şi depozitate cu grijă pentru a evita confuziile.
Decontaminarea laboratorului
Sticlăria de laborator şi suprafeţele care au intrat în contact cu toxinele sunt spălate cu
NaClO 0,5%. Carcasele în care au fost ţinute animalele de laborator sunt incinerate.
4.1.1, Eşantionarea
Studii au arătat că peste 90% din erorile de cuantificare a micotoxinelor se datorează
eşantionării necorespunzătoare; trebuie deci să ne asigurăm că eşantioanele prelevate pentru a
fi analizate sunt reprezentative.
Este important deci să se prezinte un plan de eşantionare care să facă parte din reglementările
privind controlul contaminării cu micotoxine. În ultimii ani, o atenţie deosebită a fost
5412154
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
acordată ameliorării şi asigurării calităţii analizelor făcute pentru identificarea
contaminanţilor din produsele din alimentaţia umană şi animală. Pentru stabilirea normelor
comerciale, contaminanţii trebuie să fie corect identificaţi si cantităţile determinate să fie
scăzute. Micotoxinele nu fac excepţie de la aceste reguli şi analiza lor prezintă dificultăţi
particulare în ceea ce priveşte obţinerea eşantioanelor reprezentative iar analiza trebuie să
permită identificarea nivelurilor scăzute de micotoxine (sub 500 ppm).
Eşantionarea constitue o etapă crucială în determinarea conţinutului de micotoxine
dintr-un lot de produse alimentare. Deoarece cantitatea de micotoxină nu este proporţională
cu cantitatea de mucegaiuri prezentă, sunt foarte rar distribuite uniform în eşantion. Contrar
metodelor analitice, sistemele de eşantionare nu pot face obiectul încercărilor
interlaboratoriale şi în general, un plan de eşantionare este propus pe baza unui studiu statistic
al repartiţiei toxinelor măsurate, apoi el este adoptat în mod oficial.
Publicaţia colectivă a UNDP si FAO a definit clar procedurile de eşantionare pentru
diferite micotoxine. Se ţine cont de tipul produsului şi de dimensiunea lotului. În fiecare caz,
numărul minim de subeşantioane prelevate este precizat, ca şi dimensiunea unitară minimă a
fiecăruia dintre ele. În plus, cantitatea subesantionului prelevat pentru analiză şi modul în
care este prelevat sunt specificate. Comisia europeana a editat o directivă în care se specifică
metodele analitice de eşantionare pentru controlul oficial la nivelul anumitor contaminanţi în
produsele alimentare. Procedura de eşantionare poate fi rezumata intr-o secvenţa de şapte
etape, indicate în figura nr.10
Figura 10. Etapele eşantionării
Scopul eşantionării
Identificarea punctelor de eşantionare
5512155
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Identificarea loturilor
Alegerea metodei de eşantionare
Prelevarea eşantioanelor
Prepararea eşantionului
Condiţionarea eşantionului
Înainte de toate, trebuie să se determine cu precizie scopul eşantionării si apoi se
identifică punctele de eşantionare. Modul de eşantionare diferă în funcţie de modul în care
produsele sunt depozitate în vrac sau în ambalaje (saci, cutii metalice, butelii). Odată ce
modul de condiţionare a fost determinat, trebuie să se localizeze cu precizie, punctele de
eşantionare. A treia etapă constă în identificarea loturilor care trebuie să fie reprezentativă
pentru sistemul analizat. Nu trebuie omisă metoda de eşantionare care trebuie să fie cât mai
apropiată de analiza noastră, se disting trei tipuri de metode:
Eşantionare uniformă
În acest caz, se prelevează o cantitate mică de probă din fiecare porţie. În acest tip de
eşantionare, cantitatea prelevată este testată. Eşantioanele trebuie sa fie deci reduse; această
procedură este numită divizare şi este realizată de un divizor care prelevează o fracţiune
identică din fiecare eşantion în parte.
Eşantionare selectivă
5612156
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Acest tip de eşantionare presupune prelevarea părţilor cele mai susceptibile a fi
contaminate din lot. Această tehnică se aplică de exemplu în cazul unui lot de cereale unde
investigaţia se va face doar pe grânele care prezintă un stadiu avansat de mucegăire.
Eşantionare aleatorie
Acest tip de eşantionare se efectuează în cazul în care e nevoie de multe eşantioane,
de calitate diferită, care provin dintr-un lot neuniform. La această tehnică, numărul
eşantioanelor, cantităţile lor totale şi perioada de prelevare nu sunt determinate înainte de
eşantionare. Eşantionarea strict aleatorie este complicată, şi se face apel la tehnicile complexe
de prelevare aleatorie. Prelevarea eşantionului reprezentativ pentru lot este următoarea etapă
a eşantionării. Cea de-a şasea etapă constă în prepararea eşantionului, mai bine spus,
separarea eşantionului de impurităţile de dimensiuni mari pe care le conţine. Ultima etapă
presupune condiţionarea eşantionului în vederea determinărilor. În mod frecvent,
eşantioanele reprezentative cântăresc între 3 şi douăzeci kilograme.
4.1.1.1 Variante de eşantionare, de pregătire a eşantionului şi analitice
Se poate spune că etapa de eşantionare este de obicei sursa cea mai mare de erori în
secvenţa analitica, mai bine spus în secvenţa de eşantionare, prepararea eşantionului şi
analizei. Varianta( ), exprimată de reprezentativitatea eşantionului trebuie să fie cât se
poate de scăzută, sau cel mult egală cu suma variantelor de eşantionare (Ss2), de preparare a
eşantionului (Ssp2) şi de analiză (Sa
2):
St - Ss + SSp + Sa
Determinarea acestor variante se poate face în manieră empirică plecând de la formule
stabilite în prealabil. De exemplu, în cazul arahidelor, Whitaker şi colaboratorii săi au stabilit
următoarele relaţii:
Ss2= (49,0546*ML
U955 - 0,39 ML1,7867) /Ws
Unde Ss este varianta eşantionării
ML este concentraţia în aflatoxină în lot în ppb
Ws este masa de arahide în eşantion in kg
Ssp2= (0,978 MS
1J867-0,0178 Ms1'9339)/Wsp
Unde Ssp2 este varianta de preparare a eşantionului
5712157
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Ms este concentraţia în aflatoxine în eşantion în ppb
Wsp este masa de arahide măcinată în subeşantion în kg
Sa2= (l/na)*(0,00482 MSS
1J518)
Unde Sa2 este varianta analitică pentru analiza HPLC
na- este numărul de analize repetate
Mss este concentraţia de aflatoxină în subeşantion în ppb.
4.1.1.2. Conceptul şi evaluarea unui plan de eşantionare
Factorii următori sunt esenţiali în stabilirea unui plan de eşantionare:
- tipul de marfă
- concentraţia maximă în toxine permisă în lot
- concentraţia maximă permisă în eşantion (concentraţia critică)
- dimensiunea eşantionului
- numărul subeşantioanelor;
- numărul eşantioanelor;
- metoda de obţinere a eşantionului;
- metoda analitică;
Trebuie să se ştie că există două tipuri de riscuri legate de planul de eşantionare: riscul
producătorului (Producer Risk, PR), care este acela de a respinge un lot sigur, şi cel al
consumatorului (Consumer Risk, CR), care este acela de a accepta un lot contaminat. După
determinarea părţii relative a fiecăruia dintre cele două riscuri se poate construi o curbă unică
numită curba caracteristică de operare (Operating Characteristic curve, OC curve) care pe
abscisă are reprezentată probabilitatea [P(M)] că planul de eşantionare să accepte un lot în
funcţie de concentraţia în aflatoxina M în lot. Forma acestei curbe va fi influenţată de
următorii parametri:
• concentraţia critică permisă în eşantion;
• mărimea eşantionului;
5812158
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
• mărimea subeşantionului şi gradul de fragmentare;
• metoda analitică (tipul si numărul analizelor).
Probabilitatea că un lot să fíe acceptat se poate exprima astfel: P(M)=p(X<Xc/M)
Unde X este concentraţia în toxină a eşantionului
Xc este concentraţia critică a eşantionului
M este concentraţia în aflatoxina a lotului.
Pentru analiza micotoxinelor, se vor prelua câte 4 eşantioane identice cantitativ:
- primul pentru analiza propriu-zisă;
- două pentru eventualele analize complementare;
- ultima este păstrată ca referinţă
Dupa principiul Gafta Rules, dacă cantitatea de micotoxină găsită în prima probă este mai
mare de 50% faţă de limita autorizată, cea de-a doua analiză va fi efectuată pe cel deal doilea
eşantion. Dacă rezultatele furnizate de această dată sunt inferioare limitelor, atunci, lotul va fi
acceptat. Dacă ce-a de a doua analiză prezintă valori mai mari decât normele tolerate dar
inferioare primei probe, se va realiza o nouă analiză pe cel de al treilea eşantion. Dacă
rezultatele celei de a treia analiză sunt conforme cu normele în vigoare, lotul este acceptat,
dacă nu este respins.
Metodele care permit evidenţierea micotoxinelor în produsele alimentare sunt scindate în
două categorii calitative şi cantitative menţionând în egală măsura şi „testele kit" care permit
analiza pe teren şi furnizează date referitoare la prezenţa sau absenţa contaminanţilor, dar
trebuie să fie confirmată de o analiză complementară de laborator.
Cele din urmă, reprezintă un protocol recunoscut şi normalizat de AOAC (Association of
Official Analytical Chemist). Totuşi, înainte de a fi normalizat, un protocol de analiză
propus de un laborator trebuie să fie validat prin teste iterlaboratoriale, organizate după
normele ISO 43.
Diferitele metode de referinţă se pot clasa după principiul lor fundamnental de
funcţionare în tehnici fizico-chimice sau imunochimice; totuşi noi le vom împărţi în funcţie
de performanţa lor, în tehnici calitative: minicoloanele, coloanele de imunoafinitate, testul
ELISA (poate fi considerat şi test cantitativ); şi tehnici calitative: cromatografie în strat
5912159
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
subţire (TLC), cromatografie gazoasă (CG) şi cromatografie lichidă de înaltă rezoluţie
(HPLC).
4.2. Metode calitative
În această secţiune vom trata metodele care în general sunt folosite ca metode rapide de
detecţie a micotoxinelor.
Aceste metode sunt folosite ca etape prealabile de purificare a micotoxinelor. După cum
ştim, metodele calitative folosesc fluorometria cu lumina UV pentru a determina concentraţia
molară a soluţiei. Pentru interpretarea corectă a măsurilor realizate, ne vom folosi de două
legi care descriu absorbţia luminii de materie:
Legea lui Lambert: A = log
Legea lui Beer : A=εCd
Unde: A = absorbanţa sau densitatea optică a soluţiei;
I = intensitatea luminii emise
Io = intensitatea luminii transmise
C = concentraţia substanţei absorbante
ε = coeficeintul de extincţie al substanţei absorbante
În practică, în cazul unui spectofotometru UV cu un fascicol, scala absorbanţei este adusă la
zero cu un solvant folosit ca martor. Celula care conţine soluţia de analizat este apoi plasată
în spectrofotometru şi citirea poate începe. Fiecare micotoxină are o valoare a absorbanţei
bine specificată.
Tabel 19. : Parametri spectrofotometrici pentru diferite micotoxine
Micotoxina Masa Solvant Absorbantamoleculara max (nm)
Aflatoxina B 312 Benzen :acetonitril (98 :2) v/v 353Aflatoxina Bl 312 Chloroform 353Aflatoxina B2 314 Benzen :acetonitril (98 :2) v/v 355Aflatoxina Gl 328 Benzen :acetonitril (98 :2) v/v 355
Aflatoxina 62 330 Benzen .acetonitri! (98 :2) v/v 357Aflatoxina Ml 328 Chloroform 357Ochratoxina A 403 Benzen :acid acetic (99 :1) v/v 333Ochratoxina B 369 Benzen :acid acetic (99 :1) v/v 320
Ochratoxina A etil ester 431 Benzen :acid acetic (99 :1) v/v 333
6012160
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Ochratoxina B etil ester 397 Benzen :acid acetic (99 :1) v/v 320Patulina 154 Etanol absolut 276Patulina 154 Metanol 275
Sterigmatocistina 324 Benzen 325Citrinina 259 Chloroform 322
Zearalenona 318 Etanol 236Zearalenona 318 Etanol 274Zearalenona 318 Etanol 316
4.2.1. Metode imunologice
Testele imunologice constituie astăzi metodele rapide de detecţie a aflatoxinelor şi a altor
micotoxine în alimente. Anticorpii policloni şi monocloni folosiţi sunt agenţii de legătură
folosiţi. Se ştie că micotoxinele sunt molecule non antigene cu masa moleculară mică,
anticorpii policloni sunt produşi indirect prin răspunsul imunitar al animalelor la un complex
micotoxină-proteină. Raportul molecular micotoxină-proteină este foarte important pentru
intensitatea răspunsului imunitar. Poziţia şi tipul de legătură între toxină şi proteină sunt de
asemenea critice. Anticorpii monocloni sunt secretaţi prin fusiunea celulelor în splina
şoarecilor şi legarea celulelor miceliene datorită polietilen glicolului. Imunogeneza este
administrată prin injectări repetate de cantităţi mici de proteină (40-300 μg).
Recunoaşterea imunologică este bazată pe complementarismul spaţial al grupelor specifice al
antigenelor cu cei doi anticorpi. Anticorpii sunt reactivul cheie în testul immunologic şi
trebuie să fie obligatoriu corect preparat şi caracterizat. Caracteristicile utile pentru
selecţionarea unui anticorp convenabil sunt: constanta de afinitate, specificitatea şi
randamentul.
Se cunosc trei tipuri de teste imunologice : Testele RIA (radioimmunoassays), testele
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), şi testele pe coloana de imunoafinitate. În
ultima categorie sunt incluse minicoloanele sau coloanele de imunoafinitate.
4.2.1.1. Testele RIA
În testele RIA, aflatoxina este marcată din punct de vedere al radioactivităţii. Aflatoxina
nemarcată sau aflatoxina în soluţie test şi aflatoxina marcată intră în competiţie pentru
numărul limită de legaturi la anticorpi. Cantitatea de aflatoxina în eşantion este invers
6112161
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
proporţională cu cantitatea de aflatoxină marcată în soluţie. Avantajul acestor teste este acela
că necesită o cantitate scăzută de anticorpi. Prezintă totuşi şi dezavantaje în ceea ce priveşte
radioactivitatea, folosirea marcajelor izotopice.
4.2.1.2 Testele ELISA
Două formate principale ale testelor ELISA sunt dezvoltate: testele competitive şi
testele non-competitive. În testul ELISA tipic, legătură unui complex micotoxină-enzimă cu
anticorpi imobilizaţi este inhibată prin prezenţa micotoxinei în soluţia test. Enzimele legate,
catalizează transformarea substratului într-un complex colorat. Intensitatea culorii este invers
proporţională cu concentraţia de aflatoxine. Peroxidaza care catalizează oxidarea substratului
tetrametilbenzidina într-un complex bleu este enzima de marcaj cel mai des întâlnită. Metoda
ELISA este frecvent întâlnită în cazul laboratoarelor centrale unde sunt frecvent realizate
numeroase teste. Pentru o viziune rapidă şi tot odată detaliată a variantelor metodei, este
prezentat tabelul 2.12.
Principiul metodei ELISA
Testul se bazează pe reacţia antigen - anticorp. Godeurile de microtitrare sunt acoperite cu
anticorpi captură, directionaţi împotriva anticorpilor anti - micotoxină. În fiecare godeu, atât
pentru standard, cât şi pentru probă, se adaugă conjugatul enzimatic şi anticorpii anti -
micotoxină.
Micotoxina liberă şi conjugatul enzimatic concurează pentru siturile de legare ale anticorpilor
de acoperire ai godeurilor (metoda imunoenzimatică competitivă).
Conjugatul enzimatic nelegat este îndepărtat în faza de spălare. Se adaugă substrat/cromogen,
observându-se virarea culorii de la roşu la albastru. Adăugarea reactivului de stopare al
reacţiei determină modificarea culorii albastre în galben. Citirea probelor se realizează la 450
nm. Absorbanţa este invers proporţională cu concentraţia micotoxinei din probă.
Tabel 20. : Aplicaţii ale metodei ELISA în determinarea micotoxinelor în alimentaţie.
Toxina Modul de extracţie Spălare Limita dedetecţie0/g/kg)
Eşantion
6212162
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Aflatoxina B1 Metanol :apă 55 :45 (v/v)
eşantion :solvant 1 :5 (v/w)
Fragmentare în CHCI3, evaporare, rediluare în tampon salin de fosfat
(PBS)
2,9 Alune Unt de alune
Af latoxina Bl CHCl3
eşantion:solvant 1 :5 (w/v)
Evaporare si descompunere in PBS
5 Porumb
Aflatoxina Bl Metanol :tampon salin fosfat 1 :1 (v/w)
Concentrare prin evaporare, diluare cu
PBS
0,1 Arahide
Aflatoxina Bl Metanol :apa 55 :45 (v/v)
Diluare cu un tampon 5-10 Alune,porumb
Ochratoxina CHCI3
eşantion:solvant 1:5 (w/v)
Împărţire în volume egale de NaHC03
2,5 Grau
Ochratoxina CHCl3
eşantion:solvant 1:5 (w/v)
Împărţire între 1,4 x NaHC03 (30 g/l) în
metanol:apa 4 :10 (v/v)
0,5 Rinichi de porc
Ochratoxina CHCI3
eşantion :solvant 1:5 (w/v)
Evaporare şi descompunere în PBS
0,06 Grâu
Ochratoxina Metanol Spălare pe cartuş C18 şi împărţire în soluţie
1 M NaHC03
0,5-1 Grâu
3-acetyl desoxynivaleol
Metanol :apa 6:4 (v/v) Diluare cu un tampon 1 Orez
Toxina T2 - Cartuş C18 Sep-Pak în fază inversă
0,2 Serum, lapte, urină
4.2.2. Metode de imunoafinitate
Coloanele de imunoafinitate sunt preparate prin adsorbţie de anticorpi pe un suport inert
(tuburi de microtitrare , membrane, bile de sticlă). Micotoxinele sunt prelevate de soluţiile
test prin anticorpi imunospecifici. Dupa ce impurităţile din cartuş au fost spălate,
micotoxinele sunt desorbite în metanol şi transferate pe coloană în faza inversă pentru a fi
separate. Apoi determinarea se face cu UV. Folosirea coloanelor de imunoafinitate pentru
prelevarea şi concentrarea micotoxinelor prezintă mai multe avantaje: creşterea selectivităţii,
posibilitatea prelevării din volume mari şi asocierea cu alte tehnici analitice. Această tehnică
6312163
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
prezintă de asemena avantajul de a fi foarte rapidă (10-15 minute) şi nu presupune necesitatea
unui personal calificat. Inconvenientul major al acestei tehnici este folosirea unei cantităţi
importante de anticorpi. Trebuie specificat faptul ca în cazul anumitor micotoxine ca
aflatoxinele, o derivaţie prealabilă trebuie să fie realizată pentru a putea folosi tehnica
fluorimetrică cu lumina UV.
4.2.2.1. Minicoloanele
Aceasta metodă a fost inventată în 1976 în Tailanda. Aflatoxina este extrasă în metanol
apos, urmată de o limpezire prin precipitare cu acetat de zinc sau sulfat de amoniu saturat.
Această ultimă metodă permite mai ales reducerea conţinutului de specii interferate.
Aflatoxina este apoi pusă în fluorisilul din minicoloană. Fluorescenta este apoi detectată cu
ajutorul Luminii UV la 365 nm şi comparată cu standardele. Metoda care face referire la
calibrarea aflatoxinelor în cereale cu o limită de detecţie de 20 ppb este metoda Holaday-
Velasco numită şi minicoloane HV. Această metodă a fost acreditată în 1980 de Federal
Grain Inspection Service. Coloana (25cm-6mm) este realizată din aluminiu, silicagel şi din
fluorisil. Sulfatul de sodiu sau calciul anhidru este de asemenea folosit pentru a înlătura toate
urmele de umiditate. Metoda necesită o purificare prealabilă a extractului, care se face de
obicei printr-o simplă filtrare.
4.2.2.2.. Coloane de imunopurificare
Spre deosebire de minicoloane care sunt de obicei folosite ca metode de calibrare,
coloanele de imunoafinitate normale sunt mai degrabă folosite în timpul unei purificări
prealabile a eşantionului înaintea dozării cantitative prin HPLC, de exemplu.
Imunopurificarea constă în purificarea aflatoxinelor sau ochratoxinelor plecând de la extracţia
unui eşantion prin trecere pe coloane de imunoafinitate care conţin un suport prevăzut cu
anticorpi dirijaţi în mod special împotriva micotoxinelor.
4.3. Metode cantitative
4.3.1. Teste kit
Testele kit permit determinarea conţinutului de micotoxine în laboratoare nespecializate.
Testele kit folosite funcţionează după două metode: metoda cromatografiei în strat subţire şi
6412164
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
metoda imunologică. Avantajul folosirii testelor kit TLC este acela că un singur test poate fi
folosit pentru determinarea mai multor micotoxine. Testele kit bazate pe metodele
imunologice au avantajul uşurinţei şi rapidităţii metodei.
4.3.2 Cromatografie în strat subţire (TLC) Cromatografia în strat subţire este o metodă folosită începând cu anul 1990 pentru analiza
aflatoxinelor. Pentru cromatografia în strat subţire limita de detecţie pentru dozarea
aflatoxinelor este de 2 ppb, iar cea pentru tricotecine limita este de 50 ppb. De obicei, această
metodă este urmată de un test ELISA în cazul în care furnizează un răspuns pozitiv. S-a arătat
că cromatografia în strat subţire poate fi aplicată în egală măsură şi în cazul analizei
tricotecenelor, în particular a desoxinivalenolului (DON) şi al zearalenonei (ZON).
Principiul metodei
Extracţia micotoxinelor în solvenţi organici şi separarea lor prin cromatografie în strat
subţire, identificarea micotoxinelor separate în lumina ultravioletă la lungimile de undă de
254 nm şi 366 nm faţă de substanţa etalon şi confirmarea prezenzei micotoxinelor identificate
în spoturi prin reacţii de derivatizare.
4.3.3 HPLC (high performance liquid chromatography- cromatografie cu lichid de
înaltă performanţă)
Metoda HPLC realizează cuantificare de mare precizie. Este o metodă de referinţă şi
poate realiza cuantificarea compusului de analizat aflat în cantităţi foarte mici (ng). În cazul
metodei HPLC dezvoltate limita de detecţie poate ajunge până la 0,02 ppm, în timp ce limita
de cuantificare este de 0,06 ppm. HPLC este o metodă folosită pentru analiza numeroaselor
micotoxine ca: zearalenină, ochratoxina A, fumonisina B1, vomitoxina şi alfatoxine. Deşi
este o metodă cu un preţ ridicat, care necesită experienţa şi timp, această metodă este foarte
mult folosită ca tehnica de confirmare în cazul determinărilor folosind cromatografia în strat
subţire sau folosind teste de imunoafinitate. Avantajele acestei metode raportată la
6512165
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
cromatografia în strat subţire: precizie. Există două tipuri de cromatografie cu lichid de înaltă
performanţă: cu faza normală şi cu faza inversă (RP-HPLC). Dacă prima a avut o perioadă de
glorie acum 20 de ani, astăzi cel mai des folosită este cea de a doua. Totuşi trebuie specificat
faptul că în cazul folosirii (RP-HPLC), fluorescenţa aflatoxinelor B1 şi G1 scade.
Ansamblul cromatografic HPLC este un sistem compus dintr-un modul de separare şi
unul de detecţie.
Modulul de separare – controlează următorii parametri cromatografici: programare
metoda, compoziţie solvent, viteza de eluţie, spălarea garniturilor, injecţia probei, semnalarea
a unor evenimente externe, operarea detectorului prin interfaţa IEEE- 488, termostatare
coloană, termostatare probe, degajare eluent. Modul de separare constă din două sisteme- un
sistem de administrare a solventului (compus din 4 pompe şi o valvă de realizare a
gradientului) şi un sistem de administrare a probei (compus din autosampler cu 5 carusele a
câte 24 de flacoane şi un injector automat)
Modul de deteţie - este un detector performant UV/Vis, cu două canale, destinat aplicaţiilor
HPLC şi operează în domeniul 190- 700 nm. Soft-ul prin intermediul căruia se fac achiziţiile
de date, cât şi prelucrarea lor, este MILLENIUM.
Proba de la care se pleacă este reprezentată de cereale măcinate. Fiind o probă solidă,
trebuie să se facă extracţia prealabilă a compusului de analizat, DON fiind solubil în solvenţi
folosiţi în mod curent pentru extracţie.
Deoarece extractul este foarte complex este necesară realizarea unei separări prealabile,
care are rolul de a înlătura eventualii interferenţi, dar şi de a proteja coloana cromatografică.
Pentru separare s-a optat pentru utilizarea a două tipuri de coloane, pe de o parte, coloane de
iminoafinitate DONprep, care leagă micotoxina, la trecerea acesteia prin coloana, de
anticorpul specific aflat în umplutura coloanei, iar pe de altă parte, coloane multifuncţionale,
Mycosep® 225 şi coloana Multisep® 216, care lasă să treacă micotoxina prin coloana, în
timp ce compuşi de interferenţă sunt reţinuţi în umplutura coloanei.
În selectarea metodei HPLC şi a condiţiilor iniţiale se porneşte de la proba de analizat. În
urma extracţiei şi a separării se obţine o probă care conţine molecule cu mase moleculare
mici. Caracteristicile chimice ale compusului de analizat, DON-ul, indică abordarea unei
cromatografii cu faza inversă.
Alegerea coloanei de separare se face cunoscănd ca DON-ul are masa moleculară mai
mică de 2000, este solubil în solvenţi apoşi, nu este ionic şi nici polar. Coloana de separare
6612166
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
aleasă pentru analiză este Symetry C18, având lungimea de 25 cm şi diametrul interior de
0,46 cm. Faza staţionară este octadecilsilanul, care prezintă o retenţie foarte bună deoarece
lungimea lanţului hidrocarbonat grefat pe suportul silanic este mare (18 atomi de carbon).
Dimensiunea porilor este de 100 Å, iar dimensiunea particulelor este de 5 μm, opţiunea fiind
justificată de masa moleculară mică a compusului de analizat.
Partea a doua :PARTEA EXPERIMENTALĂ
1. Analiza microbiologică a cerealelor
Analiza microbiologica este indispensabilă atât pentru a asigura produsului o calitate şi
o conservabilitate mai bune, cât şi pentru a garanta calitatea igienică şi siguranţa
consumatorilor. Pentru tehnicile de analiză microbiologică, cantitative şi calitative s-au
cumpărat din Piaţa Centrală Galaţi cereale: porumb, orz şi secară destinate consumului uman
6712167
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
şi animal. Probele au fost evaluate calitativ pentru a studia gradul de contaminare cu
mucegaiuri.
1.1 Evaluarea calitativa- aprecierea aspectului coloniilor dezvoltate prin cultivarea boabelor
de cereale pe medii selective (MMA) , în condiţii de aerobioză la temperatura de 25˚ C.
Materiale necesare :
S-au folosit 15 probe de porumb, 14 probe grâu, 13 probe orz şi 10 probe de secară,
medii de cultura specifice (must de malţ cu agar), plăci Petri.
Mod de lucru :
Mediul de cultură de MMA este fluidificat, repartizat în plăci Petri. După solidificarea
mediului se adaugă în fiecare placă cu o pensetă sterilă boabe de porumb, grâu, orz şi secară.
Plăcile sunt termostatate la 25°C timp de 5 zile. Coloniile de mucegai dezvoltate în plăcile
Petri sunt izolate (metoda în strii) şi analizate microscopic si macroscopic. După
termostatare s-a observat că gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai este relativ mare
( tabel nr.1.) Astfel din 15 probe de porumb analizate, 80% au fost contaminate cu mucegai,
la 14 probe de grâu 71 % au fost contaminate cu mucegai, din 13 probe de orz 85 % au fost
contaminate şi din 10 probe de secară 70% au fost contaminate cu mucegai.
Tabel 21. Gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai
CEREALE
NUMĂR
PROBE
PROBE CONTAMINATE
CU MUCEGAI (%)
Porumb 15 80
Grâu 14 71
Orz 13 85
Secară 10 70
Identificarea microscopică s-a realizat cu ajutorul preparatelor umede.
Obţinerea preparatelor umede
6812168
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Principalele etape pentru executarea unui preparat umed:
- pregătirea lamei şi lamelei- lama curată şi degresată se sterilizează trecând ambele feţe
prin flacăra becului de gaz. Lamela se şterge cu hârtie de filtru;
- realizarea suspensiei de celule pe lamă – se depune o picătură de apă sterilă pe lama de
sticlă sterilizată, în zona centrală. Pentru recoltarea celulelor aflate în medii lichide se
foloseşte ansa sau pipetă sterilă, iar pentru recoltarea microorganismelor aflate pe medii
dense (solide sau solidificate) se foloseşte firul metalic.
- realizarea preparatului între lamă şi lamelă – după obţinerea suspensiei de celule, lamela
curată se sprijină şi se deplasează pe lamă la un unghi de 45°, până când devine tangentă la
picătură, apoi se lasă să cadă peste aceasta. Lichidul în exces se absoarbe pe marginile
lamelei cu hârtie de filtru.
Un preparat bun nu trebuie să prezinte bule de aer, acestea putănd determina aglomerări de
celule şi îngreună studiul preparatului microscopic.
După analiza microscopică şi macroscopică a coloniile de mucegai dezvoltate pe mediul de
cultură după perioada de termostatare s-a observat prezenţa urmatoarelor specii de mucegai
Aspergillus sp., Penicillium, Fusarium, Mucor şi Rhizopus (Fig.nr.11,12,13, 14,).
În urma graficilor obţinute s-a observat că în probele de porumb a predominat într-un
procent de 60% Aspergillus sp. În comparaţie cu celelalte specii care au fost într-un procent
mai mic Penicillium 20%, Fusarium 13% şi Rhizopus 7%. În comparaţie cu probele de grâu
procentul de Aspergillus a fost mai mic de numai 36% dar a predominat Penicillium într-un
procentaj de 43% şi procentul cel mai mic de 21% Fusarium.
În probele de orz au fost observate mai multe speciile de micotoxine în număr de 5 iar
procentul cel mai mare avându-l tot Aspergillus ca şi în probele de porumb celelalte având un
procent de Penicillium 23%, Fusarium 15%, Rhizopus 15% şi Mucor 8%. În probele de
secară s-au observat doar 3 specii de micotoxine în care Fusarium a reprezentat 50% ,
Aspergillus 30% şi Penicillium 20%.
6912169
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Fig. 11. Principalele specii de mucegai prezente pe porumb
Fig. 12 Principalele specii de mucegai prezente pe grâu
7012170
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Fig.13 Principalele specii de mucegai prezente pe orz
Fig.14 Principalele specii de mucegai prezente pe secară
2. Evidenţierea mucegaiurilor producătoare de aflatoxine
Metoda se bazează pe cultivarea mucegaiurilor izolate sub formă de culturi pure din
alimente mucegăite, pe mediu optim pentru elaborarea aflatoxinelor şi determinarea calitativă
sau semicantitativă a micotoxinelor prin cromatografie şi studiu în lumină U.V cu lungimea
de undă 365 nm.
Modul de lucru: Din culture pure ale mucegaiurilor din genul Aspergillus de pe cereale, cu
ajutorul firului se recoltează cantităţi mici de spori şi se fac inoculări în zona centrală a
plăcilor Petri în care se află în prealabil repartizat mediul Hara cu agar( tabel.nr.2.) Plăcile se
incubează la 28 °C timp de 5-7 zile, condiţii optime pentru elaborarea aflatoxinelor. După
acest interval, plăcile se expun la radiaţii ultraviolete cu λ= 365 nm. Deoarece culturile
analizate au prezentat o zonă fluorescentă în jurul coloniei (fig nr.15), se presupune că
mucegaiul prezintă caracter toxicogen .
Tabel nr.22. Compozitia mediului HARA
Reactiv Cantitate Reactiv Cantitate
(NH4)H2PO4 10 g Zaharoză 30 g
7112171
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
K2HPO4 1 g HgCl2 5x
MgSO4·7 H2O 0,5 g Glucoză 0,5 g
KCl 0,5 g Agar 20 g
FeSO4·7H2O 0,01 G
Fig.nr.15 Coloniile speciei Aspergillus cultivate pe Mediu HARA incubate la 25°C
timp de 7 zile observate cu şi fără lumina UV
3. Analiza calitativă a aflatoxinelor
Pentru analiza calitativă au fost realizate patru medii de cultură, un mediu lichid sintetic
(tabel nr.23) şi trei medii solide pe bază de cereale (tabel nr.24).
Mediul pe baza de cereale a fost obţinut prin fierberea amestecului de cereale cu apă timp de
30 minute, filtrat şi s-a adus la 1 litru cu apă distilată din fiecare mediu câte 100 ml au fost
repartizate în pahare Erlenmeyer şi sterilizate timp de 20 min. La 121°C.
Tabel 23 Compoziţia mediului lichid sintetic
Component Cantitate Component Cantitate
Peptonă 5 g Sucroză 40 g
Extract drojdie 20 g Apă distilată 1 l
Tabel 24 Compoziţia mediului pe bază de cereale
Component Cantitate
Cereale măcinate
(porumb,grâu,orz şi secară)
30 g
Apă distilată 1 l
7212172
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
3.1 Pregătire inocul
Mucegaiul a fost crescut 7 zile pe MMA la 25° C, a sporulat. Sporii au fost suspendaţi în
apă distilată cu 0,005 % agent Tween 80. Cu camera Thoma s-au numărat sporii şi pentru a
obţine o suspensie cu spori pentru inoculare s-au realizat diluţii decimale.
Numărare cu Camera Thoma
Pentru numărare se plasează o picătură din suspensia de 73ositiv de analizat pe
platforma centrală, în dreptul suprafeţei delimitate. Peste suspensie se plasează o lamelă
care se sprijină pe cele două platforme la terale şi astfel între lamelă şi citometru se creează
o peliculă de lichid cu înălţime egală cu denivelarea platformei centrale (0,1 mm). Astfel,
volumul de lichid plasat pe fiecare pătrăţel elementar este . Preparatul obţinut se
studiază la microscop cu obiectiv cu grosisment x40, când în câmpul microscopic poate fi
vizualizat un grup de 16 pătrăţele elementare, din care se numără celulele a căror suprafaţă
se află mai multe câmpuri microscopice ( = 100) şi se calculează numărul mediu de
celule pe un pătrăţel elementar:
n =
Numărul de celule prezente într-un de suspensie de analizat se determină cu formula:
N= n·4· ·k
în care : n este numărul mediu de celule pe un pătrăţel elementar;
k- coeficientul de diluţie
3.2 Inoculare şi incubare
În mediu proaspăt preparat s-a inoculate o suspensie cu spori. Mediile au fost agitate
10 min. Pentru repartizarea sporilor în tot mediul. Mediile inoculate au fost termostatate la
28°C, timp de 14 zile, staţionar(fig. nr 6).
7312173
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Fig. 16 Mediile de cultură după perioada de termostatare
3.3 Extracţie
După terminarea perioadei de termostatare, s-a adaugat la fiecare probă 100 ml
chloroform apoi s-a agitat timp de 24 h, 200 rot./min la 25°C. Separarea de cloroform s-a
făcut cu pâlnii de separare. Extracţia cu cloroform se va repeta şi cele două extracte se vor
amesteca şi vor fi analizate prin cromatografie în strat subţire. Extractele obţinute au fost
examinate la lampa U.V pentru a vedea fluorescenţa care indica prezenţa aflatoxinelor.
Fig. 19 Extractele obţinute observate cu şi fără lumina U.V
Aparatura necesară pentru cromatografia în strat subţire
- camera de vizualizare în ultraviolete cu filter de 254 nm şi 366 nm;
- plăci pentru cromatografie în strat subţire gata preparate cu strat de silicagel 60 G de
0.3 mm grosime sau plăci sticla preparate în laborator cu dimensiunile de 200x200 mm sau
100x200 mm;
7412174
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
- tanc pentru cromatografie sau camera cromatografică în formă de U (vas
paralelipipedic din sticlă);
- Shaker
- rotovapor;
- seringa Hamilton 10 μl;
- cilindri gradaţi de 50 ml, 100 ml, 250 ml;
- şablon pentru aplicarea spoturilor pe placă;
Reactivi
- cloroform;
- sulfat de sodiu anhidru;
- aflatoxine: B1;
- amestec de acetonă –apă 85:15 (V/V);
- amestec alcool metilic -apă 85:15 (V/V);
- system de de solvenţi de developare: toluene- acetat de etil acid formic în proporţie
de 6:3:1(V/V/V);
- silicagel G 60
- clorură de metilen acetonă (98: 2)
- amestec eter etilic eter de petrol(20 :30)
-
Prepararea sistemului de cromatografie în strat subţire
Plăcile de sticlă s-au spalat bine cu detergent, s-a clătit bine cu multă apă curentă, apoi cu
apă distilată şi s-a uscat. Înainte de întinderea absorbantului s-a şters cu tampon de tifon cu
alcool sau acetonă, apoi cu tifon curat şi uscat. Pe plăcile astfel pregătite s-a aplicat amestecul
absorbant cu ajutorul dispozitivului de aplicat absorbantului pe placă. Pentru a obţine plăci cu
strat absorbant bine fixat s-a substituit 20 ml amidon 10 %. Grosimea stratului adsorbant
aplicat pe placă trebuie să fie de 0.3 mm.
Plăcile s-a lăsat să se usuce la temperature camerei în poziţie orizontală timp de 1…2 h.
Apoi sunt activate prin introducere în etuvă, la 110°C, timp de 1 h, după care s-a scos
imediat, sau s-a putut păstra într-un exsicator cu clorură de calciu. Dacă s-a ţinut mai mult
înainte de întrebuinţare trebuie activate din nou.
Aplicarea spoturilor pe placa cromatografică
7512175
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Placa cromatografică pregătită, s-a aşezat pe o suprafaţă plană, s-a marcat linia de start la 2
cm de la marginea plăcii şi s-a marcat linia până la care trebuie să migreze 76ositiv
solventului care se situează la 15 cm faţă de linia de start.
Reziduul rămas la evaporare conform punctului 1, s-a reluat cu solvent de spotulare din care
s-a luat 10 μl cu o micropipetă şi s-a aplicat pe placa cromatografică sub formă de spoturi
rotunde cu diametrul de 5 mm.
Pe o placă cromatografică cu dimensiunile de 200x200 mm s-a putut aplica maximum opt
spoturi la o distanţă de minim 1 cm faţă de marginile laterale. Din soluţiile etalon de
micotoxine cu concentraţia de 1 mg/ml şi din proba de analiză s-a aplicat cu o microseringă
spoturi de 10 μl soluţie pe placa cromatografică în cele poziţii posibile astfel:
- în poziţia 1 se aplică 10 μl soluţie de aflatoxină B1(soluţia etalon Ridasreen cu o
concentratie de aflatoxine totale de 4050 ppt achiziţionat de la firma Diamedix.
S.R.L fig.nr.10);
- în poziţia 2 se aplică 10 μl soluţie din prima probă de analiză;
- în poziţia 3 se aplică 10μl soluţie din a doua probă de analiză;
- în poziţia 4 se aplică 10 μl soluţie din a treia probă de analiză;
- în poziţia 5 se aplică 10 μl soluţie din a patra probă de analiză;
Fig.17.Soluţia etalon de aflatoxină
Developarea
În tancul de developare s-a introdus amestecul de solvenţi de developare până la o înălţime
de max 5 mm. Partea interioară a tancului s-a căptuşit cu hărtie de filtru care să imbibe cu
solvenţii de developare pentru a asigura o atmosferă saturată cu vaporii developantului şi
pentru a evita evaporarea acestuia de pe placă în timpul developării. După executarea acestor
operaţii tancul s-a închis, s-a lăsat 20…30 minute pentru saturarea atmosferei cu vapori.
7612176
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
După care s-a introdus placa cromatografică cu capătul pe care s-au aplicat spoturile în
sistemul de solvenţi de developare din tanc. S-a închis etanş cu capacul şi s-a lăsat la
developat până când frontul solventului a atins linia marcată la 15 cm de linia de start.
S-a scos placa, şi s-a uscat la temperatura camerei timp de câteva minute.
Fig. 18 Operaţia de developare
Identificarea micotoxinelor
Pe placa cromatografică s-a examinat la lampa U.V (fig.18) şi s-a încercuit zonele cu
fluorescenţă asemănătoare cu a etaloanelor şi s-a pulverizat cu soluţie de derivatizare. După
pulverizare, placa cromatografică s-a introdus în etuvă timp de 2..3 minute, la o temperatură
de 60°C. Se examinează din nou placa la lumina ultravioletă şi dacă fluorescenţa a suferit
modificări similare celor din etaloane s-a confirmat prezenţa micotoxinei în proba analizată.
Tipurile de micotoxine, raportul zonelor de fluorescenţă asemănătoare etaloanelor şi culoarea
fluorescenţei în ultraviolete sunt redate în tabelul 25. Raportul zonelor de fluorescenţă
asemănătoare cu cele ale etaloanelor (Rt) se calculează cu formula :
Rt = d1/d2
În care : d1- distanţa dintre linia de start şi centrul zonei fluorescente a micotoxinei, în mm;
d2- distanţa dintre linia de start şi linia până la care a migrat frontal solventul, în
mm;
7712177
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Fig. Nr. 18 Lampa U.V
Derivatizarea şi confirmarea micotoxinelor
Pentru confirmarea unei micotoxine, se stabileşte pe placa cromatografică zona
asemănătoare cu cea a etalonului micotoxinei respective şi se pulverizează cu soluţie de
derivatizare. După pulverizare zona şi etalonul devin de culoare careacteristică micotoxinei.
După realizarea analizelor se întocmesc buletine de analiză în care trebuie să se menţioneze
următoarele:
- datele necesare pentru identificarea lotului;
- rezultatele obţinute;
- SR 9597/19:1993
Tabel 25 Caracteristici de identificare a micotoxinelor prin cromatografie în strat subţireNr. crt
Denumirea micotoxinei şi forma
Rt Culoarea în UV la 254 nm
Culoarea în UV la 336 nm
Substanţele de
vizualizare
Culoarea în UV la 366 nm după apreciere
1 Aflatoxina B1 0.21 Albastru strălucitor
Albastru strălucitor
Acid sulfuric 20 %
Galben verzui
2 Aflatoxina B2 0.18 Albastru violet
Albastru strălucitor
Acid sulfuric 20 %
Galben verzui
3 Aflatoxina G1 0.15 Albastru verzui
Verde strălucitor
Acid sulfuric 20 %
Galben verzui
4 Afaltoxina G2 0.12 Verde Verde Acid Galben
7812178
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
strălucitor strălucitor sulfuric 20 %
5 Zearalenona (T2) 0.55 Albastru deschis
Verde albăstrui
Amestec de diazotare
Vizibil brun închis
6 Ochratoxina A 0.42 Bleu strălucitor
Bleu intens strălucitor
Hidroxid de sodium 0.1N Acid sulfuric 50% în metanol
Albastru intens strălucitor Bleu-verde intens strălucitor
Concluzii
Micotoxinele sunt substanţe chimice unele simple sau unele complexe; metaboliţi produşi
de miceţii dezvoltaţi pe un substrat care poate să producă îmbolnăvirea celor ce consumă
produsul respectiv.
Cercetările efectuate a pus în evidenţă 240 de mucegaiuri toxicogene, identificându-se
peste 2000 substanţe toxice, iar o anumită specie de mucegai poate produce un complex de
substanţe cu structuri diferite şi aceeaşi toxină poate fi produsă de mai multe mucegaiuri.
Prezenţa micotoxinelor în alimente nu constituie o problemă nouă, dar este o problemă de
actualitate.
Eradicarea totală a acestor contaminanţi de origine naturală este dificilă, folosirea
metodelor de decontaminare prezentând un interes major. Diversitatea propietăţilor fizice şi
chimice ale diferitelor familii de micotoxine care prezintă risc pentru sănătate face ca fiecare
metodă de decontaminare să fie diferită de la caz la caz.
7912179
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Amoniacarea materiilor prime asociată sau nu cu folosirea adsorbanţilor din familia
aluminosilicaţilor prezintă un interes major în cazul contaminării cu aflatoxine.
În ceea ce privesc alte micotoxine, numărul metodelor fiind ineficiente, nici o metodă
chimică sau fizică nu poate reprezenta o metodă garantată pentru o decontaminare totală.
Eliminarea fizică (curăţire şi separare) a materiilor prime contaminate oferă un interes
foarte mare.
Prevenirea dezvoltării mucegaiurilor, pe câmp, sau în timpul depozitării constituie deci un
mod de a lupta împotriva unei contaminări a alimentelor cu fumonisine, tricotecine,
zearalenona, ochratoxine. Folosirea ulterioară a tratamentelor fizice sau chimice cu ajutorul
adsorbanţilor nu poate fi considerată ca fiind o metodă eficientă.
Eficacitatea scăzută a acestor tratamente în termen de “decontaminare micotoxicologică”
nu înseamnă că aceste metode nu trebuie să fie folosite.
Datorită adaptării la diferite condiţii de mediu, micotoxinele se întâlnesc în toate mediile
naturale. Se găsesc în special pe sol, de unde ajung în aer sub formă de spori sau fragmente
de hife.
Temperatura şi umiditatea sunt principali factori care favorizează contaminarea cerealelor
cu micotoxine. Între aceşti factori există o strânsă legătură, la care este posibilă dezvoltarea
microorganismelor; astfel cu cât este mai ridicat conţinutul în apă al boabelor, cu atât este
mai extinsă zona de temperatură la care se observă creşterea numerică a microbiotei.
Analizând valorile temperaturii şi ale aw, putem spune că sunt condiţii optime pentru
creşterea şi proliferarea fungică la t>20°C, aw-0.75 şi umiditatea 14 %.
Prevenirea contaminării cerealelor cu micotoxine presupune:
Aplicarea practicilor bune de lucru;
Determinarea conţinutului de apă al cerealelor şi spaţiului de depozitare;
Verificarea temperaturii;
Menţinerea unei valori a activităţii apei de 0.7 sau inferioară verificarea temperaturi;
Trebuie să se realizeze verificări regulate de temperatură (la o saptămână sau maxim două)
pentru a evita pierderi considerabile de produs. O creştere anormală a temperaturii, poate fi
semnul unui debital degradării cerealelor.
Depozitarea se va realiza în silozuri cu sisteme de ventilaţie, care au rolul de a
menţine cerealele la o temperatură suficient de scăzută şi permite deasemenea în anumite
cazuri, obţinerea unei uscări lente.
Recoltarea se va face la manipularea completă a plantei;
8012180
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
Prevenirea infestării cu insecte;
Folosirea de soiuri rezistente la contaminarea cu micotoxine;
Astăzi, tot mai mult problema micotoxinelor din nutreţuri şi alimente este abordată nu
numai din prisma profilaxiei infestării şi dezvoltării fungilor, ci şi prin cea a reducerii
efectelor dăunătoare a micotoxinelor din hrana contaminată (inclusiv intensificarea
răspunsului imun al organismului). Modul acesta de a privi lucrurile pleacă de la modificările
nutriţionale datorate micotoxinelor. Dar, există nenumărate date care arată că în ciuda
rezultatelor pozitive obţinute în domeniul cercetării micotoxinelor din hrană, mai sunt încă
multe necunoscute. În permanenţă sunt descoperite noi micotoxine dar limitarea efectelor
acestora şi a cantităţilor de reziduuri în produsele animalelor ridică răspunderi tot mai mari
biotehnologiilor responsabile de protecţia consumatorilor.
Atât micotoxinele, cât şi fungi care le produc au ca efecte deteriorarea şi descompunerea
plantelor şi a alimentelor, în diferite grade. În principiu acestea pot invada şi creşte pe orice
tip de hrană şi în orice moment, atât înaintea recoltării, cât şi în timpul depozitării, precum şi
în alimentele prelucrate sau în amestecul de hrană. Detectarea lor în sau pe hrană depinde de
tipul hranei, organismele implicate şi gradul de invazie.
Studiile au demonstrat că porumbul este cereala cea mai susceptibilă privind contaminarea
cu aflatoxine, în special în clima care favorizează dezvoltarea miceţilor Aspergillus flavus şi
Aspergillus parasiticus în culturi, precum şi în făinuri furaje.
Problemele puse de micotoxine sunt relativ recente, tehnicile care permit analiza lor şi
legislaţia într-o continuă evoluţie. La ora actuală HPLC, se impune ca metodă tehnica de
lucru pentru analiza cantitativă a majorităţii micotoxinelor.
Cum a demonstrat acest studiu al metodologiei analitice analiza micotoxinelor constituie o
problemă complexă şi necesită supervizarea şi controlul organismelor competente, validând
testele interlaboratoriale ale tehnicilor specifice fiecărei micotoxine. Aceste tehnici sunt de
două tipuri: calitative şi cantitative.
Cromatografie în strat subţire continuă să fie o metodă oficială de analiză; este o metodă
ieftină, rapidă şi practică se pot analiza simultan mai multe micotoxine prezintă probleme în
cazul multidetecţiei deoarece este dificilă ca în acelaşi timp să se realizeze mai mult de o
purificare (sistemul de limpezire folosit poate fi foarte eficient pentru un tip de produs şi mai
puţin eficient pentru alt tip de produs).
8112181
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
HPLC este o tehnică din ce în ce mai utilizată şi este aplicată în mai multe metode oficiale;
este scumpă şi nu permite multidetecţii datorită coloanelor de imunoafinitate care sunt
specifice fiecărei micotoxine în parte.
ELISA este o metodă care permite atât determinarea cantitativă cât şi calitativă a
micotoxinelor.
Bibliografie
1. GABRIELA BAHRIM, ANCA NICOLAU, CLEMANSA TOFAN, MARGARETA
ZARA, Mirobiologia produselor alimentare Tehnici şi analize de laborator, Editura AGIR
2002.
2. CLEMANSA TOFAN, Microbiologie alimentară, Editura AGIR, Bucureşti, 2004.
3. VALENTINA DAN, BRAD SEGAL, RODICA SEGAL, VITALIE TEODORU,
Determinarea calităţii produselor alimentare, Editura CERES, 1985.
4. N. GEORGESCU, C. SAVU, Siguranţa alimentelor, riscuri şi beneficii, Editura SEMNE,
Bucureşti, 2004.
5. LATGE J-P, Aspergillus fumigatus and aspergillosis, Clinical Microbiologz Rewiewes,
1999.
6. CLEMANSA TOFAN, Igiena şi securitatea produselor alimentare, Editura AGIR, 2004
7. GABRIELA BAHRIM, VALENTINA DAN,CRISTINA KRAMER, ANCA NICOLAU,
MARGARETA ZARA, Memorator pentru mucegaiuri, Editura Evrika, Brăila.
8. VALENTINA DAN, Microbiologia cerealelor şi produselor derivate, Universitatea
Galaţi, 1975.
8212182
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
9. ABDEL-WAHHAB M.A., NADA S.A. et AMRA H.A., Effect of aluminosilicates and bentonite on aflatoxin-induced developmental toxicity in rat. J. Appl. Toxicol., 1999,
10. ABO-NORAG M., EDRINGTON T.S., KUBENA L.F., HARVEY R.B. et PHILLIPS T.D., Influence of a hydrated sodium calcium aluminosilicate and virginiamycin on aflatoxicosis in broiler chicks. Poult. Sci., 1995.
11. ADEMOYERO A.A. et DALVI R.R., Efficacy of activated charcoal and other agents in the reduction of hepatotoxic effects of a single dose of aflatoxin B1 in chickens. Toxicol. Lett., 1983.
12. ANGENAULT J. : La chimie: dictionnaire encyclopédique, Pages, Dunod, Paris, 1991.
13. ANONYMOUS : Classe silicates, http://www2.biam2.org/www/ Cla88482.html, page consultée le 10 octobre 2000.
14. ANONYMOUS , The zeolite group of minerals, http://mineral.galleries.com/minerals/silicate/zeolites.htm, page consultée le 10 octobre 2000
15. BENNETT G.A., RICHARD J.L. et ECKHOFF S.R. : Distribution of fumonisins in food and feed products prepared from contaminatedcorn. Adv. Exp. Med. Biol., 1996, 392, 317-22.
16. BONNA R.J., AULERICH R.J., BURSIAN S.J., POPPENGA R.H.,BRASELTON W.E. et WATSON G.L., Efficacy of hydrated sodium calcium aluminosilicate and activated charcoal in reducing the toxicity of dietary aflatoxin to mink. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 1991.
17. BRACKETT R.E. et MARTH E.H., Ascorbic acid and ascorbate cause disappearance of patulin from buffer solutions and apple juice. J. Food Protect., 1979.
18. CARSON M.S. et SMITH T.K., Role of bentonite in prevention of T- 2 toxicosis in rats. J. Anim. Sci., 1983.
19. CHANG H.L., DEVRIES J.W., LARSON P.A. et PATEL H.H., Rapid determination of deoxynivalenol (vomitoxin) by liquid chromatography using modified Romer column cleanu., J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1984.
20. CONWAY H.F., ANDERSON R.A. et BAGLEY E.B., Detoxification of aflatoxin-contaminated corn by roasting. Cereal Chem., 1978.
8312183
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
21. DALVI R.R. et ADEMOYERO A.A. : Toxic effects of aflatoxin B1 in chickens given feed contaminated with Aspergillus flavus and reduction of the toxicity by activated charcoal and some chemical agents. Avian Dis., 1984.
22. DALVI R.R. et MCGOWAN C., Experimental induction of chronic aflatoxicosis in chickens by purified aflatoxin B1 and its reversal by activated charcoal, phenobarbital, and reduced glutathione. Poult. Sci., 1984.
23. DECKER W.J. et CORBY D.G., Activated charcoal adsorbs aflatoxin B1. Vet. Hum. Toxicol., 1980.
24. DICKENS J.W. et WHITAKER T.B., Efficacity of electronic color sorting and hand picking to remove aflatoxin contaminated kernes from commercial lot of shelled peanuts. Peanut Sci., 1975.
25. DOKO M.B. et VISCONTI A., Occurrence of fumonisins B1 and B2 in corn and corn-based human foodstuffs in Italy. Food Addit.Contam., 1994.
26. DOYLE M.P. et MARTH E.H., Bisulfite degrades aflatoxins: effect of citric acid and methanol and possible mechanism of degradation. J. Food Protect., 1978.
27. DOYLE M.P. et MARTH E.H., Bisulfite degrades aflatoxins: effect of temperature and concentration of bisulfite. J. Food Protect., 1978.
28. FRIEND D.W., TRENHOLM H.L., YOUNG J.C., THOMPSON B.K. et HARTIN K.E., Effect of adding potential vomitoxin (deoxinivalenol) detoxicants for a F. graminearum inoculated corn supplement to wheat diets fed to pigs. Can. J. Anim. Sci., 1984.
29. GUERRE P., Principales mycotoxicoses observées chez les ruminants. Le Point Vétérinaire, 1998.
30. GUERRE P., GALTIER P. et BURGAT V., Le métabolisme : un facteur de susceptibilité à la toxicité des aflatoxines. Revue Méd. Vét., 1996.
31. HUFF W.E., KUBENA L.F., HARVEY R.B. et PHILLIPS T.D., Efficacy of hydrated sodium calcium aluminosilicate to reduce the individual and combined toxicity of aflatoxin and ochratoxin A. Poult. Sci., 1992.
32. AZERST G, The affects of misture and temperature on growth and spore germination in some fungi, J.STORED Prod. Res.5.(1969).
8412184
Studiul efectelor de contaminare a alimentelor cu micotoxine
33. FROBISHER M., Fundamental of Microbiology, London, 1965.
34. Mycotoxin prevention and control in foodgrains: Aflatoxin sampling and determination in bulk maize for export, Pin Pithaya- Acharlyakul, 1998.www.fao.org/inpho/vlibrarz/x0036e/x0036EOf.htm).
35. Mycotoxin : (Woodson- Tenent Laboratories)(http://www.wtlabs.com/mzco.htm).
36. Mycotoxin prevention and control in foodgrains: Aflatoxin analytical methods for groundnuts, D.M. Willson, 1999.
37.Mycotoxin prevention and controlin foodgrains: Palstc minicolumn for aflatoxin detection, Sritsit Karunyavanij,(www.fao.org/inpho/vlibrary/xoo36e/x0036Eoh.htm)
38.Mycotoxin prevention and control in foodgrainns: Aflatoxin anlytical methods for groundnuts,D.M. Wilson, 1999.
39. Pagini web www.mold.ph www.mycology.adelaide.edu.au www.vscht.cz www.tamagawa.ac.ip]
8512185