6.Triana2

Majalah Farmasi Indonesia, 11, (4), 234,2000

Majalah Farmasi Indonesia 11 (4), 2000 234

UJI DAYA ANTIOKSIDAN SENYAWA FLAVONOID DAUN Plantago

major L.

THE DETERMINATION OF ANTIOXIDANT POTENCY OF FLAVONOIDS

FROM Plantago major L. LEAVES

Oleh:

Triana Hertiani *), Suwijiyo Pramono *) dan Supardjan A.M **).

*) Lab. Fitokimia, Fak. Farmasi Universitas Gadjah Mada

**) Lab. Sintesis Obat, Fak. Farmasi Universitas Gadjah Mada

ABSTRAK

Telah dilakukan pengujian daya antioksidan senyawa flavonoid daun Plantago major L. Isolasi

flavonoid dilakukan dengan menggunakan kromatografi kertas preparatif dengan fase gerak air suling.

Isolat yang diperoleh diuji daya antioksidannya menggunakan metode asam tiobarbiturat yang

dimodifikasi dengan kuersetin sebagai pembanding positif.

Hasil isolasi menunjukkan bahwa terdapat setidaknya 3 isolat yang aktif sebagai antioksidan dengan

daya antioksidan sebagai berikut: isolat A 41,08% 4,96%; isolat B 24,88% 5,39%; isolat C 21,08% 6,52%

sedangkan kuersetin menunjukkan potensi sebesar 33,86% 8,32%.

Kata kunci: uji daya antioksidan, flavonoid, Plantago major L.

ABSTRACT

A research has been done to determine the antioxidant potency of flavonoids substances from Plantago

major L. leaves. Isolation was done using a preparative paper chromatography with aquadestilata as a mobile

phase.

The isolates have been examined the antioxidants potencies using the modification of a thiobarbituric

acid method with quercetin as a reference.

The result has shown that there were at least three active isolates with potencies (%) as followed i.e.

isolate A 41,08 4,96; isolate B 24,88 5,39; isolate C 21,08 6,52 while quercetin has shown its potency of

33,86 8,32.

Key words: antioxidant potency assay, flavonoid, Plantago major L.



PENDAHULUAN

Peningkatan pengetahuan dalam bidang kesehatan telah menyadarkan masyarakat

mengenai pentingnya suplemen antioksidan untuk pencegahan berbagai penyakit degeneratif.

Antioksidan sintetik seperti BHA (butylated hidroxy aniline) dan BHT (butylated hidroxy

toluen) telah diketahui memiliki efek samping yang besar antara lain menyebabkan kerusakan

hati. Di sisi lain alam menyediakan sumber antioksidan yang efektif dan relatif aman seperti

flavonoid, vitamin C, beta karoten dan lain-lain. Hal tersebut mendorong semakin banyak

dilakukan eksplorasi bahan alam sebagai sumber antioksidan (Kikuzaki dan Nakatani, 1993).

Flavonoid seperti kuersetin, rutin, diketahui sebagai antioksidan yang potensial.

Aktivitas sebagai antioksidan dimiliki oleh sebagian besar flavonoid disebabkan adanya

gugus hidroksi fenolik dalam stuktur molekulnya. Ketika senyawa-senyawa ini bereaksi

dengan radikal bebas, mereka membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi

inti aromatik (Cuvelier et al., 1994).

Daun Plantago major L. diketahui mengandung senyawa flavonoid yang aktif sebagai

antioksidan (Hertiani dan Pramono, 1999), tetapi belum pernah dilakukan isolasi senyawa

flavonoid tersebut dan uji potensinya sebagai antioksidan. Hal tersebut mendorong

dilakukannya penelitian tentang isolasi dan uji daya antioksidan senyawa flavonoid daun



Plantago major L. menggunakan modifikasi dari metode asam tiobarbiturat oleh Ottolenghi

(Kikuzaki dan Nakatani, 1993) dengan kuersetin sebagai kontrol positif.

METODOLOGI

Peralatan yang dipergunakan adalah spektrofotometer uv-sinar tampak Hitachi,

peralatan gelas, neraca Chyo Yupiter C3-100, inkubator 40C, mikropipet Socorex 2-50l

dan 200-1000l, termometer, centrifuge model DSC 158, bejana pengembang kromatografi

kertas dan lampu uv 366 nm.

Bahan yang dipergunakan adalah daun Plantago major L. yang dikumpulkan pada

bulan September 1998 dari BPTO Tawangmangu dan dideterminasi di laboratorium

Farmakognosi bagian Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UGM, etanol absolut, asam 2-

tiobarbiturat, asam fosfomolibdat (E Merck) asam linoleat (Sigma) sebagai pereaksi dan

kuersetin sebagai pembanding.

CARA KERJA

Skema kerja:

Infus serbuk daun kering

Uapkan sampai kental

Tambahkan etanol sampai endapan sempurna dan disentrifuge

Filtrat diuapkan



Kromatografi kertas

Semprot dengan asam fosfomolibdat dalam aseton

Diikuti dengan penambahan uap amoniak

Isolasi bercak yang positif (biru abu-abu )

dengan Kromatografi kertas

Uji potensi antioksidan

Uji potensi antioksidan dengan metode asam 2-tiobarbiturat yang dimodifikasi: (Ottolenghi

cit Kikuzaki dan Nakatani, 1993).

Ke dalam vial bertutup ulir (50 ml) dengan diameter 38 cm dan tinggi 75 mm dimasukkan

campuran sampel (2 mg) dalam 4 ml etanol, lalu ditambahkan 4,1 ml 2,53% asam linoleat

dalam etanol ditambah 8 ml dapar fosfat 0,5 M (pH 7) dan akuades 3,9 ml. Campuran tersebut

diinkubasi pada 40 C dalam gelap. Asam linoleat akan mengalami reaksi autooksidasi

menjadi TBArs (Asam 2-tiobarbiturat reacting substance). Reaksi autooksidasi tersebut akan

dihalangi oleh senyawa reduktor yang diperkirakan terdapat dalam sampel sehingga akan

menurunkan jumlah TBArs yang terbentuk.

Setiap 24 jam campuran diatas diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambahkan pereaksi

asam 2-tiobarbiturat (selanjutnya disebut TBA) dipanaskan di atas penangas air mendidih

selama 10 menit dan setelah dingin disentrifugasi pada 3200 rpm selama 20 menit. Senyawa

TBArs yang terbentuk akan bereaksi dengan TBA membentuk senyawa kompleks yang



berwarna merah jambu. Filtrat dibaca absorbansinya pada 534,2 nm. Aktivitas antioksidan

ditentukan berdasarkan absorbansi pada hari akhir.

Penetapan potensi antioksidan menggunakan rumus sebagai berikut (Yen dan Hsieh,

1997):

Absorbansi kontrol negatif – Absorbansi sampel

% penghambatan = x 100%

Absorbansi kontrol negatif

Daya antioksidan dinyatakan sebagai % penghambatan untuk bobot sampel 1 mg.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat 3 bercak yang positif sebagai

antioksidan dengan metode asam fosfomolibdat seperti ditunjukkan oleh data kromatogram

pada tabel I. Metode asam fosfomolibdat merupakan metode pendahuluan untuk mengetahui

aktivitas senyawa antioksidan secara kualitatif (Ranganna, 1978). Prinsip kerjanya adalah

reaksi oksidasi-reduksi sebagaimana dijelaskan sebagai berikut:

2 MoO3 MoO2.MoO3

Pada reaksi tersebut Mo(IV) dari H3(P(MO3O16)4) direduksi dengan adanya senyawa

antioksidan menjadi Mo(IV) yang berupa campuran oksidan yang berwarna biru abu-abu

(Jork et al., 1990).



Untuk uji secara kuantitatif dilakukan dengan metode TBA. Metode ini mudah dan

murah serta banyak digunakan untuk uji antioksidan. Metode ini memiliki kerugian yaitu

waktu pengujian relatif lama (Wu dan Brewer, 1993).

Tabel I. Data kromatogram fraksi non musilago dengan pelarut etanol, fase diam kertas

Whatman no. 1, fase gerak akuades.

Kode

Bercak

hRf

Sinar tampak

UV 366

Tanpa

perlakuan

Uap

Amoniak

Asam

fosfomolibdat

Tanpa

perlakuan

Uap

amoniak

D

96

Coklat

Kuning

-

Kuning hijau

Hijau

C

80

-

Kuning cerah

+

Biru gelap

Hijau

B

50

-

Kuning cerah

+

Biru terang

Biru hijau

A

5

Kuning coklat

Kuning cerah

+

Coklat gelap

Coklat gelap

Keterangan: - : tidak terdeteksi; +: bercak biru abu-abu.

Data kromatogram di atas menunjukkan bahwa terdapat 4 bercak yang kemungkinan

merupakan flavonoid. Jika mengacu pada Mabry et al.(1970), dan Markham (1982), tentang

hubungan antara warna bercak dengan struktur flavonoid maka kemungkinan sruktur

flavonoid dari masing-masing bercak tersebut adalah seperti tercantum pada tabel II sebagai

berikut:



Tabel II. Kemungkinan struktur flavonoid bercak kromatogram pada tabel 1.

Kode

bercak

Warna bercak flavonoid

Kemungkinan type flavonoid UV 366 nm NH3/UV366 nm

A Coklat gelap Coklat gelap Flavon atau flavonol dengan 3-OH tersubsitusi

dan 5-OH bebas; atau isoflavon,

dihidroflavonol, biflavonil dan flavanon

dengan 5-OH

B Biru terang Biru hijau Flavon atau flavanon dengan 5-OH bebas atau

flavonol tanpa 5-OH bebas dengan 3-OH

tersubstitusi.

C Biru gelap Hijau Flavon atau flavanon dengan 5-OH bebas atau

flavonol tanpa 5-OH bebas dengan 3-OH

tersubstitusi.

D Kuning hijau Hijau Flavonol dengan 3-OH bebas dan atau tanpa

5-OH bebas.

Struktur umum flavonoid adalah sebagai berikut:

O

O

34

5

6

7

81'

2' 3'

4'

5'6'



Isolat hasil kromatografi preparatif yaitu isolat A,B,C dan kuersetin sebagai kontrol

positif diuji daya antioksidannya dengan metode TBA yang dimodifikasi. Pemilihan kuersetin

sebagai senyawa pembanding karena senyawa ini telah diketahui memiliki aktivitas yang

tinggi sebagai antioksidan. Hal tersebut kemungkinan disebabkan adanya gugus ortho-

dihidroksi pada posisi 3’ dan 4’, gugus OH pada posisi 3,5 dan 7 (Foti et al., 1996)

Pada awal uji dilakukan penentuan panjang gelombang serapan maksimal, waktu

operasional dan masa inkubasi. Hasil penentuan panjang gelombang serapan maksimal adalah

pada panjang gelombang 532,4 nm.

Penentuan waktu operasional sampai dengan jam ke-5 menunjukkan bahwa pengujian

pada jam ke-1 memberikan hasil yang relatif stabil sehingga untuk pengujian selanjutnya

waktu operasional ditentukan antara 1 – 1 ½ jam setelah sentrifugasi untuk menyamakan

kondisi percobaan.

Penentuan masa inkubasi dilakukan pada kontrol negatif memberikan data seperti

ditunjukkan oleh grafik pada gambar 1. Pada gambar tersebut terlihat adanya peningkatan

absorbansi pada hari ke-0 sampai dengan hari ke-8 yang menunjukkan proses autooksidasi

masih berlangsung. Terlihat bahwa mulai hari ke-8, absorbansi relatif stabil, sehingga

penelitian dilakukan pada hari ke-8 dari masa inkubasi. Diharapkan pada hari ke-8 itu semua

asam linoleat pada kontrol negatif telah mengalami autooksidasi membentuk TBArs. Dengan

demikian TBArs yang terbentuk sudah maksimal.



Gambar 1. Penentuan masa inkubasi kontrol negatif

Prinsip kerja dari metode ini adalah proses autooksidasi dari asam linoleat

menghasilkan senyawa TBA-reacting substance (TBArs) seperti misalnya malondialdehida

yang dengan adanya asam 2-tiobarbiturat (TBA) akan membentuk senyawa berwarna merah

jambu yang kemudian diukur absorbansinya pada 532 nm. (Kikuzaki dan Nakatani, 1993).

Proses autooksidasi tersebut dapat dihalangi oleh senyawa antioksidan, sehingga TBArs yang

terbentuk akan lebih sedikit daripada tanpa penambahan senyawa antioksidan.

Data pengujian daya antioksidan isolat dan kontrol positif ditunjukkan pada tabel 3

dan diilustrasikan pada gambar 2.

Tabel III. Data hasil pengujian daya antioksidan

Sampel Daya antioksidan (%)

I II III Rerata SD

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Hari ke-

Absorbansi



A 43,46 44,39 35,38 41,08 4,96

B 33,13 23,98 23,62 24,88 5,39

C 18,21 28,55 16,49 21,08 6,52

Kuersetin 38,21 24,36 39,00 33,86 8,32

Keterangan: I,II,III : replikasi ke-1, ke-2 dan ke-3; SD : standar deviasi

atau diilustrasikan pada gambar 2 sebagai berikut:

0

10

20

30

40

50

Isolat A Isolat B Isolat C Kuersetin

Sampel

Daya

Antioksidan

(%)

Gambar 2. Data hasil pengujian daya antioksidan

Hasil pengujian daya antioksidan di atas menunjukkan harga standar deviasi yang

besar. Hal tersebut kemungkinan disebabkan sampel belum merupakan senyawa murni,

sehingga jumlah senyawa aktif yang bereaksi sebagai antioksidan dalam tiap replikasi sampel

tidak sama.

Hasil statistika dengan uji t taraf kepercayaan 95% menunjukkan bahwa isolat A

berbeda bermakna dengan isolat B dan C dan kuersetin dan menunjukkan daya antioksidan

yang paling tinggi.



KESIMPULAN

Dalam daun Plantago major L. setidaknya terdapat 3 senyawa flavonoid yang aktif

sebagai antioksidan menurut metode asam 2-tiobarbiturat yang dimodifikasi (Ottolenghi,

1959 cit Kikuzaki dan Nakatani, 1993). Isolat A memiliki daya antioksidan tertinggi yaitu

sebesar 41,08%.

UCAPAN TERIMAKASIH

Penelitian ini terlaksana dengan bantuan dana URGE dari Dirjen DIKTI, Depdiknas

RI.

DAFTAR PUSTAKA

Cuvelier, M.E., Richards, H., and Besset, C., 1994, Comparison of The Antioxidative Activity

of Some Acid Phenols: Structure-Activity Relationship, Biosci. Biothech. Biochem.,

56(2), 324 – 325.

Foti, M., Piatelli, M., Baratta, M.T., and Ruberto, G., 1996, Flavonoids, Coumarins, and

Cinnamic Acids as Antioxidants in a Micellar System. Structure-Activity

Relationship, J.Agric. Food. Chem., 44(2), 497-500.

Hertiani, T., dan Pramono, S., 1999, Uji Pendahuluan Kandungan Antioksidan dalam Infus

Daun Plantago major L., Makalah, Seminar Biologi Menuju Milenium III, Fakultas

Biologi UGM, Yogyakarta.

Jork, H., Funk, W., Fischer, W., and Wimmer, H., 1990, Thin Layer Chromatography,

Reagents and Detection Methods, Physical and Chemical Detection Methods:

Fundamentals, Reagents I, Vol. Ia, VCH, New York.

Kikuzaki, H., and Nakatani, N., 1993, Antioxidant Effects of Some Ginger Constituents, J.

Food Sci., 58(6), 1407



Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic Identification of

Flavonoids, Springer-Verlag, New York.

Markham, K.R., 1982, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh

Padmawinata, K., 1988, Penerbit ITB, Bandung.

Ottolenghi, A., 1959, Interaction of Ascorbic Acid and Mithocondrial Lipids, cit Kikuzaki,

H., and Nakatani, N., 1993, J. Food Sci., 58(6), 1407.

Ranganna, S., 1978, Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products, Tata Mc Graw-Hill

Publishing Company Limited, New Delhi.

Wu, S., and Brewer, S., 1993, Screening Antioxidative and Prooxidative Activity in A Solid

Medium Model System, J. Food Biochem., 17(1), 2.

Yen, G. and Hsieh, C., 1997, Antioxidant Effects of Dopamine and Related Compounds,

Biosci. Biotech. Biochem., 61(10), 1647.



Documents

6.Triana2