1

1 Uvod Holesterol je otkrio francuski hemičar Chevreul još 1815. godine, kao komponentu žučnog kamena kod ljudi. Otuda i naziv za ovaj molekul (na grčkom: chole- žuč i stereos-

čvrst). Gotovo vek kasnije, na početku XX veka, holesterol je i dalje bio tek izolovana i samo

delimično okarakterisana supstanca. Tokom narednih 100 godina određena je struktura molekula, utvrđen je put njegove biosinteze i otkriveni su elegantni mehanizmi kojima ćelije

regulišu sadržaj holesterola i njegovih derivata. Značaj rezultata ovih istraživanja, prema broju dodeljenih Nobelovih nagrada, učinila je holesterol najnagrađivanijim malim molekulom, "zvezdom" XX veka (Vance & van den Bosch, 2000; Charlton-Menys & Durrington, 2008). Za svoj rad na određivanju strukture holesterola i holne (žučne) kiseline,

Heinrich Wieland je nagrađen 1927. godine Nobelovom nagradom za hemiju. Zanimljivo je napomenuti da publikovana struktura steroidnog jezgra molekula holesterola iz 1928. godine

nije bila u potpunosti tačna! Konrad Bloch je dobio Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu, 1964. godine, za svoj mukotrpni, dugogodišnji rad na otkrivanju komplikovanog metaboličkog puta biosinteze holesterola. Nobelovom nagradom za fiziologiju i medicinu, 1985. godine, nagrađeni su Michael S. Brown i Joseph L. Goldstein, za svoje radove o

mehanizmima regulacije metabolizma holesterola.

M.E. Chevreul (1786–1889) H. Wieland (1877–1957)

K. Bloch (1912–2000) J. Goldstein (1940– ) M. Brown (1941– )

Slika 1.1 Fotografije nekih od najznačajnih istraživača holesterola.

Otkrivanje veze između metabolizma holesterola i određenih patoloških poremećaja u

organizmu čoveka snažno je pojačalo interes za istraživanja u ovoj oblasti. Još početkom XX veka, u eksperimentima na životinjama, pokazana je povezanost između načina ishrane,

2

povišenog sadržaja holesterola u krvi i razvoja aterogenih promena na zidovima krvnih sudova (Konstantinov et al., 2006). Šezdesetih godina prošlog veka znatno se uvećavaju znanja o prirodi uočenih poremećaja, ključnom značaju prekomernog unosa triacilglicerola i holesterola ishranom i povezanosti nivoa serumskih lipida sa nastankom oboljenja srca i

krvnih sudova. Ovome su najviše doprineli izveštaji, kasnije nadaleko poznate, Framingamske studije (Kannel et al., 1971; Anderson et al., 1987), kao i Studije sedam

zemalja sveta, u kojoj je učestvovala i naša zemlja (Kromhout et al., 1989). Više-decenijska istraživanja dovela su, na kraju prošlog veka, do pojave farmakoloških jedinjenja koja efikasno snižavaju nivo holesterola u krvi i time smanjuju učestalost javljanja kardiovaskularnih oboljenja (Brown & Goldstein, 1996). Danas je i laičkoj javnosti poznata

uloga holesterola u patofiziološkim procesima kao što su aterogeneza i formiranje žučnih kamenčića.

U ovoj doktorskoj disertaciji i objavljenim radovima na kojima se ona zasniva po prvi put je pokazano da se fiziološki značajna količina holesterola može nalaziti na "neočekivano očekivanom" mestu u organizmu čoveka – u citosolu eritrocita, čvrsto vezana za molekule hemoglobina. Utvrđeni su uzroci i predloženi mehanizmi za nagomilavanje holesterola u

unutrašnjosti eritrocita i diskutovan je značaj koji bi eritrociti "napunjeni" holesterolom mogli da imaju u sistemskoj regulaciji homeostaze holesterola u organizmu čoveka. Nadamo se da

će naši rezultati, zajedno sa onima koji će tek uslediti nakon istraživanja problema otvorenih ovim radom, naći mesto u nekom budućem pregledu, kao naš skromni doprinos istraživanjima ovog fascinantnog molekula.

3

2 Pregled literature

Holesterol je kao tipičan lipid praktično potpuno nerastvoran u vodenoj sredini, što suštinski utiče na sve fenomene povezane sa njegovom unosom u organizam, transportom kroz cirkulaciju, kao i metabolizmom unutar ćelija i tkiva. U ovom poglavlju biće ukratko

predstavljeni najvažniji aspekti metabolizma holesterola u organizmu čoveka, uključujući i holesterol iz eritrocita. Posebna pažnja biće posvećena vezi između povišenog sadržaja

holesterola u cirkulaciji i razvoja aterogenih promena na zidovima krvnih sudova, kao i strukturi holesterol-vezujućih proteina. Na kraju, biće dat kraći osvrt na vezivanje malih molekula za hemoglobin, kao i na specifičnosti sistema antioksidativne zaštite u eritrocitima čoveka.

2.1 Holesterol u organizmu čoveka

Ukupan sadržaj holesterola u telu zdravog odraslog čoveka iznosi oko 140 g. Od toga se oko 8 g nalazi u krvi, u sastavu lipoproteina plazme, a ostatak u ćelijama i tkivima (Frayn, 1996). Više od 90% holesterola u ćeliji nalazi se u plazminoj membrani (Goluszko & Nowicki, 2005). Visok sadržaj holesterola karkterističan je za mozak i nervno tkivo

(Björkhem & Meaney, 2004). Ukupan pul izmenljivog holesterola u organizmu odraslog muškarca je oko 60 g. Dnevna razmena ("turnover") holesterola u krvnoj plazmi iznosi oko 5

g. Holesterol u cirkulaciji potiče iz dva izvora: biosinteze i ishrane. Oko 1,1 g de novo holesterola ulazi u telesni pul svakoga dana: oko 200 mg iz ishrane – egzogeni, ili dijetarni holesterol i oko 900 mg iz biosinteze – endogeni holesterol (Charlton-Menys & Durrington, 2008). Sve ćelije koje imaju jedro mogu da sintetišu holesterol i nema biohemijskih, ili

fizioloških dokaza da je holesterol neophodan u ishrani odraslih ljudi. Glavna mesta biosinteze holesterola su jetra i centralni nervni sistem. Tipična ishrana čoveka sadrži 200–

800 mg holesterola na dan, od čega se do 60% apsorbuje iz tankog creva (Charlton-Menys & Durrington, 2008). Približno trećina dnevne produkcije holesterola kataboliše se u jetri u žučne kiseline: 0,2–0,4 g žučnih kiselina nastaje u organizmu čoveka svakoga dana (Tietz, 1996). Znatna količina holesterola (oko 1 g dnevno) direktno se preko jetre izlučuje u

bilijarni sistem, od čega se približno polovina resorbuje, a ostatak izlučuje iz tela fecesom (Frayn, 1996). Sadržaj holesterola u organizmu čoveka regulisan je kroz kontrolu unosa i

ekskrecije viška holesterola, te kontrolu njegove sinteze i katabolizma, na svim nivoima hijararhijske organizacije organizma čoveka.

Rasprostranjenost holesterola u živim sistemima, od minorne komponente ćelija modro-zelenih algi i gljiva, do glavne lipidne komponente (u mol %) u plazminoj membrani

ćelija sisara (Koumanov et al., 2005), ukazuje na njegove evolutivne prednosti u odnosu na strukturno i biosintetski slične sterole (Bloch, 1979). Holesterol je "mali" molekul sa

nebrojeno mnogo "velikih" uloga u organizmu čoveka. Holesterol je biosintetska preteča steroidnih hormona (androgena, estrogena, gestrogena, glukokortikoida i mineralokortikoida), vitamina D i žučnih kiselina (Charlton-Menys & Durrington, 2008). U

4

kompleksu sa lipidima i proteinima ima nezamenljivu ulogu kao regulator fizičko-hemijskih svojstava bioloških membrana (Odeljak 2.5.3). Holesterol je esencijalan i za provođenje nervnih impulsa, posebno na sinaptičkom nivou (Barres & Smith, 2001), kao i za rast ćelija sisara u kulturi tkiva (Chen et al., 1974). Oksidativno modifikovani molekuli holesterola

učestvuju u mnogobrojnim procesima unutar ćelije (Schroepfer, 2000; Brown & Jessup, 2009), uključujući i aktivaciju imunog odgovora organizma (Langlet et al., 2000). Međutim,

višak holesterola i njegovih metabolita je štetan za ćelije i tkiva (Tabas, 2002). Narušavanje homeostaze holesterola u organizmu čoveka je uzrok mnogobrojnih patofizioloških poremećaja od kojih su najpoznatiji (i najbolje izučeni) proces ateroskleroze (Odeljak 2.5.4) i formiranja kamena u žuči (Admirand & Small, 1968). Zato su organizmi sisara razvili

složene mehanizme za regulaciju sadržaja holesterola u cirkulaciji i unutar svojih ćelija (Odeljak 2.5.2).

2.2 Struktura holesterola i nekih njegovih derivata

Holesterol predstavlja 95% od svih sterola prisutnih u tkivima životinja (Matthan &

Lichtenstein, 2004). Steroli su organska jedinjenja steroidne strukture koji u molekulu sadrže hidroksilnu grupu. Osnov steroidne strukture holesterola je 1,2-ciklopentano-

perhidrofenantrensko jezgro, sa dvostrukom vezom između ugljenikovih atoma 5 i 6 (Slika 2.1). Četiri prstena (A–D) su povezana u trans konfiguraciju, što steroidno jezgro čini planarnim, kompaktnim i rigidnim (Bloch, 1983). Hidroksilna grupa je vezana za treći ugljenikov atom (C-3), a bočni, izo-oktil ugljovodonični lanac za C-17. Hidroksilna grupa,

dve angularne metil grupe (C-18 i C-19), kao i bočni lanac nalaze se sa iste strane jezgra (β-konfiguracija; Slika 2.1). Hidroksilna grupa nepolarnom molekulu holesterola daje amfifilni

karakter, što orijentiše molekule holesterola u membrani i omogućuje vodonično vezivanje holesterola sa molekulom vode, ili komponentama membranskog dvosloja (Odeljak 2.5.3).

Slika 2.1 Struktura i model ispunjenih sfera molekula holesterola (holest-5en-3β-ol). Manji deo u ćelijama, ali zato glavnina (60–80%) molekula holesterola u cirkulaciji je

esterifikovana. U adrenalnim žlezdama, gde je holesterol prekursor steroidnih hormona,

preko 80% sterola u ćeliji je esterifikovano. Nasuprot tome, u mozgu i nervnom tkivu, gde holesterol ulazi i u sastav mijelina, sadržaj estarski vezanog holesterola je zanemarljivo mali

5

(Dietschy & Turley, 2004). Esterifikaciju hidroksilne grupe holesterola, molekulom (dugolančane) masne kiseline, katalizuju enzimi lecitin-holesterol acil-transferaza (LCAT) u cirkulaciji (Jonas, 2000) i acil-holesterol acil-transferaze (ACAT1 i ACAT2) unutar ćelija (Chang, 2009). Za najveći deo holesterola u krvnoj plazmi čoveka vezane su nezasićene

masne kiseline (pre svega linolenska kiselina), a unutar ćelija dominiraju palmitinska i oleinska kiselina (Devlin, 1992). Esterifikacija viškova holesterola u ćeliji jedan je od

mehanizama kojima ćelije ograničavaju sadržaj slobodnog holesterola u svojim membranama (Brown & Jessup, 2009).

Oksisteroli, ili oksidativno modifikovani steroli, u molekulu imaju jednu ili više dodatnih funkcionalnih grupa koje sadrže atom kiseonika (hidroksilna, karbonilna ili

epoksidna grupa) (Murphy & Johnson, 2008). Pod fiziološkim uslovima, sadržaj oksisterola u ćelijama sisara je za oko 1000 puta manji od sadržaja holesterola (Brown & Jessup, 2009).

Oksisteroli nastaju oksidacijom steroidnog jezgra, ili bočnog lanca molekula holesterola (Slika 2.2). U jetri, pod dejstvom enzima, nastaju 24-, 25- i 27-hidroksiholesteroli, dok se bočni lanac holesterola obično modifikuje u membranama ćelija, pod dejstvom reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) (van Reyk et al., 2006). Relativno visok nivo oksisterola nađen je u

pojedinim namirnicama bogatim holesterolom (razne vrste mesa, jaja i mlečni proizvodi), verovatno kao posledica termičke obrade hrane (Brown & Jessup, 2009). Najvažnije

fiziološke uloge specifičnih oksisterola u ćelijama sisara su: (a) prekursori u sintezi žučnih kiselina; (b) transport (hole)sterola između tkiva i (c) regulacija genske ekspresije (Brown & Jessup, 2009). Potvrđeni in vitro i in vivo patofiziološki efekti povećanog sadržaja oksisterola u ćeliji uključuju: citotoksičnost, aterogenezu, mutagenezu, karcinogenezu, kao i promene u

svojstvima ćelijskih membrana (Schroepfer, 2000).

Slika 2.2 Izvori i strukture fiziološki najaktivnih oksisterola. Prikazana je kompletna struktura molekula holesterola sa obeleženim atomima ugljenika (1-27) i deo strukture svakog oksisterola. Ch25h, holesterol 25-hidroksilaza; CYP, necitohromski P450 enzim; ROS, reaktivne vrste kiseonika (iz Brown and Jessup, 2009).

6

2.3 Unos i apsorpcija holesterola iz hrane

Unos i intestinalna apsorpcija holesterola važna je karika u homeostazi holesterola u organizmu čoveka (Matthan & Lichtenstein, 2004; Tall, 2008). Kao tipičan produkt životinjskih ćelija, holesterol unosimo samo u hrani životinjskog porekla. Posebno bogat izvor holesterola u svakodnevnoj ishrani čoveka je žumance jajeta (Tabela 2.1). Specifičan

sterol-vezujući protein (Niemann-Pick C1-sličan protein L1) posreduje u apsorpciji dijetarnog holesterola u proksimalnom regionu tankog creva (Tall, 2008). U lumenu tankog

creva, uneti holesterol emulguju soli žučnih kiselina obrazujući micele. Micele putuju do intestinalne mukoze, gde ih apsorbuju enterociti, procesima pasivne difuzije. U epitelijalnim ćelijama holesterol se esterifikuje i potom prikuplja u hilomikronske čestice, koje se sekretuju u limfu i potom ulaze u krvotok i sistemsku cirkulaciju (Odeljak 2.4.1.2). Unos holesterola u

sistemsku cirkulaciju je regulisan ABCG genima. ABC proteini, iz familije ATP-vezujućih kasetnih proteina, moduliraju kretanje holesterola u i iz enterocita. Povećana ekspresija

ABCA1 proteina smanjuje apsorpciju dijetarnog holesterola, vraćajući molekule holesterola iz enterocita nazad u lumen tankog creva (Lu et al., 2001). Kod zdravih ljudi, 30–60% hranom unetog holesterola organizam zadržava u telu, uz manje od 1% svih drugih sterola. Pri povećanom unosu, organizam čoveka usvaja svega četvrtinu dijetarnog holesterola

(Matthan & Lichtenstein, 2004).

Tabela 2.1 Prosečan sadržaj holesterola u hrani (US Department of Agriculture, 2005).

Vrsta namirnice Specifikacija Holesterol (mg/100 g) obrano mleko 2 mleko (3,6% masti) 14 punomasno mleko u prahu 109 jogurt (3,2% masti) 13 kisela pavlaka (10% masti) 43 slatka pavlaka (30% masti) 111 maslac 225 sirni namaz (30% masti) 50

Mleko i mlečni proizvodi

gauda (45% masti) 105 govedina 72 teletina 68 svinjetina 86 jagnjetina 90 piletina 67 tunjevina 38 viršle 50

Meso i mesne prerađevine

mesni narezak 92 srce 140 jetra 270

Iznutrice

mozak 2000 Čokolada mlečna 22

Jaje kokošije 300

7

2.4 Holesterol u cirkulaciji Biološki problem transporta u vodi nerastvornih lipida do ciljnih ćelija i tkiva rešen je

rano tokom evolucije nastajanjem solubilnih supramolekulskih kompleksa – lipoproteina, koji se sastoje od specifičnih proteina (apolipoproteina) i lipida. Lipoproteini prenose triacilglicerole, holesterol (slobodan i esterifikovan) i masne kiseline kroz cirkulaciju

kičmenjaka (Daniels et al., 2009). Nastaju u jetri i tankom crevu, ili u cirkulaciji iz metabolički izmenjenih prekursornih lipoproteina. Lipoproteini u cirkulaciji podležu

kontinualnom remodelovanju sastava i strukture, dejstvom enzima na njihove lipidne komponente, spontanim ili olakšanim transferom lipida i solubilnih apolipoproteina. Periferna tkiva tokom ovih procesa preuzimaju različite lipidne sastojke lipoproteina. Na kraju, jetra, bubrezi i (delom) periferna tkiva preuzimaju i katabolišu metabolički izmenjene

čestice lipoproteina, receptorom-posredovanim i drugim mehanizmima (Jonas, 2002).

2.4.1 Lipoproteini krvne plazme Lipoproteini se klasifikuju prema svom poreklu, fiziološkim ulogama, hemijskom

sastavu, fizičkim svojstvima, ili metodama izolovanja (gustina čestica nakon ultracentrifugovanja, ili elektroforetska mobilnost u agaroznom gelu). Glavne klase

lipoproteina na osnovu gustine čestica su: hilomikroni (CM, engl. Chylomicrons), lipoproteini veoma male gustine (VLDL, engl. Very Low Density Lipoproteins), lipoproteini

srednje gustine (IDL, engl. Intermediate Density Lipoproteins), lipoproteini male gustine (LDL, engl. Low Density Lipoproteins) i lipoproteini velike gustine (HDL, engl. High Density Lipoproteins). Svaka od navedenih klasa lipoproteina je heterogena frakcija čestica različite veličine i gustine, sadržaja i sastava lipida i apolipoproteina (Daniels et al., 2009).

Najzastupljeniji lipidni konstituenti lipoproteina su triacilgliceroli, neesterifikovani holesterol, estri holesterola i fosfolipidi (Tabela 2.2). Glikolipidi i slobodne masne kiseline

prisutni su samo u tragovima.

Tabela 2.2 Lipidni sastav čestica lipoproteina (Jonas, 2002).

CM VLDL LDL HDL

Gustina (g/mL) <0,94 0,94-1,006 1,006-1,063 1,063-1,210 Ukupni lipidi (%) 98-99 90-92 75-80 40-48 Triacilgliceroli (% lipida)a 81-89 50-58 7-11 6-7 Estri holesterola (% lipida) 2-4 15-23 47-51 24-45 Neesterifikovani holesterol (% lipida) 1-3 4-9 10-12 6-8 Fosfolipidi (% lipida)b 7-9 19-21 28-30 42-51 PC (% fosfolipida) 57-80 60-74 64-69 70-81 SM (% fosfolipida) 12-26 15-23 25-26 12-14 Lizo PC (% fosfolipida) 4-10 ~5 3-4 ~3 Ostali (% fosfolipida) 6-7 6-10 2-10 5-10

a Svega oko 4% nisu triacilgliceroli, već diacilgliceroli ili monoacilgliceroli. b PC, fosfatidilholin, SM, sfingomijelin.

8

Gustinu lipoproteina određuje relativni udeo proteina i lipida u sastavu čestice.

Hilomikroni sadrže svega 1–2% proteina, dok je težinski udeo proteina u HDL oko 50% (Jonas, 2002). U plazmi je normalno prisutan i lipoprotein Lp(a), koji sadrži apo(a), glikoprotein disulfidno vezan za apo B-100 iz LDL čestice. Apo (a) je strukturno i antigenski

sličan sa plazminogenom (Scanu, 1988). Lipoproteini su sfernog (VLDL, LDL, HDL), ili diskoidnog oblika (nascentne HDL

čestice). Opšta strukturna organizacija čestice je slična za sve lipoproteine (Slika 2.3): apolipoproteini i amfifilni lipidi (uglavnom fosfolipidi i neesterifikovani holesterol) obrazuju polarni omotač na površini čestice, koji okružuje jezgro sastavljeno od nepolarnih lipida (triacilgliceroli, estri holesterola i mala količina holesterola i vitamina rastvornih u mastima)

(Margolis & Capuzzi, 1972). Sastav lipoproteina u čoveka u najvećoj meri određuju genetske predispozicije i način ishrane. Koncentracija lipoproteina u krvnoj plazmi zavisi i od godina,

pola, uhranjenosti, metaboličkog/hormonskog statusa i zdravstvenog stanja ispitanika (Jonas, 2002). Fiziološke uloge lipoproteina zavise od sastava apolipoproteina i lipida u strukturi čestice (Jackson et al., 1976).

Slika 2.3 Shematski prikaz strukture tipične čestice lipoproteina (modifikovano iz Alberts et al., 2002).

2.4.1.1 Apolipoproteini

Prema rastvorljivosti u vodi apolipoproteini (skraćenica apo) krvne plazme dele se na nerastvorne (neizmenljive) i rastvorne (izmenljive) proteine. Apo B100 i apo B48, glavne

proteinske komponente LDL, VLDL i Lp(a), odnosno CM čestica, veoma su veliki (Tabela 2.3) i u vodi nerastvorni proteini. U endoplazmatskom retikulumu (ER) hepatocita, ili ćelija tankog creva, udružuju se sa lipidima, obrazujući lipoproteine u čijem sastavu ostaju sve do uklanjanja lipoproteina iz cirkulacije uz pomoć specifičnih receptora (Schneider, 2002).

Nasuprot tome, izmenljivi proteini (npr. apo A1, apo A2, apo C1−3, apo E) imaju mnogo manju molekulsku masu od apo B100 i apo B48 (Tabela 2.3) i manje ili više su rastvorni u

9

vodi. Mogu prelaziti sa jedne na drugu česticu lipoproteina, kao i vezivati lipide u cirkulaciji (Pownall & Gotto, 1992). Solubilni apolipoproteini uglavnom su aktivatori ili inhibitori enzima plazme: apo A1, i u manjoj meri apo E, apo A4 i apo C1 aktiviraju LCAT, apo C2 aktivira lipoproteinske lipaze, a apo C3 i apo A2 deluju i kao inhibitori lipaza iz jetre (Jonas,

2002).

Tabela 2.3 Najzastupljeniji apolipoproteini iz krvne plazme čoveka (Jonas, 2002).

Apolipoproteina Molekulska masab Klasa lipoproteinac Sadržaj (mg/dL)

Apo A1 28.100 HDL, CM 130 Apo A2 17.400 HDL 40 Apo A4 44.500 CM 15 Apo(a) 3-8 x 105 Lp(a) 0,1–40

Apo B100 512.000 LDL, VLDL 250 Apo B48 242.000 CM <5 Apo C1 6.600 VLDL, CM, HDL 3 Apo C2 9.000 VLDL, CM, HDL 12 Apo C3 9.000 VLDL, CM, HDL 12 Apo D 22.000 HDL 12 Apo E 34.200 VLDL, CM, HDL 7

a Drugi, manje zastupljeni apolipoproteini izolovani iz lipoproteina uključuju apo F, apo H, apo J, apo L i apo M. Njihova uloga u metabolizmu lipoproteina nije sasvim jasna. b Molekulske mase proteinskog dela, bez saharidne komonente. c Boldom su označene klase lipoproteina koje sadrže najviše datog apolipoproteina, a italikom one sa manjom zastupljenošću istog.

Jedinstvena uloga svih apolipoproteina je da pomažu solubilizaciju neutralnih lipida u cirkulaciji. Apolipoproteini u vodenoj sredini spontano obrazuju agregate sa fosfolipidima i

holesterolom. In vivo, agregiranje apolipoproteina i lipida, uz nastanak zrelih čestica lipoproteina, obično zahteva asistenciju ćelijskih proteina, kao što su mikrozomalni transfer proteini za lipide, ili ABCA1 transporter (Vance, 2002). Apolipoproteini imaju esencijalnu ulogu i u prepoznavanju i vezivanju čestica lipoproteina za odgovarajuće receptore na površini (ciljnih) ćelija (Fielding & Fielding, 2002). Osim u vezivanju i solubilizaciji lipida, modulaciji aktivnosti enzima i vezivanju za specifične receptore, otkrivene su i mnoge druge

fiziološke uloge pojedinih apolipoproteina. Tako na primer, pokazano je da apo E učestvuje u in situ regeneraciji nerava (Mahley & Rall, 2000), apo(a) u procesu zgrušavanja krvi (Spronk et al., 2004), a apo A4 u signalizaciji sitosti (Culnan et al., 2009).

2.4.1.2 Hilomikroni, lipoproteini veoma male i male gustine

Hilomikroni nastaju u tankom crevu nakon obroka bogatog mastima. Luče se u

krvotok preko limfe. Jetra direktno u krvotok sekretuje lipoproteine veoma male gustine. Za razliku od periodičnog stvaranja hilomikrona, hepatička sekrecija VLDL čestica je relativno

stalna. CM i VLDL su triacilglicerolima-bogate čestice lipoproteina. Molekul apo B48 je

10

integralni strukturni protein hilomikrona i marker-protein za čestice lipoproteina poreklom iz tankog creva, dok je jedan molekul apo B-100 u strukturi marker za praćenje katabolizma VLDL čestica (Jonas, 2002). Proteinske komponente hilomikrona koji nastaju u tankom crevu su i apo A1, apo A2 i apo A4. U cirkulaciji, međutim, ovi apolipoproteini cirkulišu

između hilomikrona i HDL čestica, dok se za hilomikrone vezuju apo E i apo C poreklom iz HDL čestica (Fielding & Fielding, 2002). Apo C2 aktivira lipoproteinske lipaze, smeštene u

endotelu kapilara perifernih tkiva, koje hidrolizuju triacilglicerole iz jezgra hilomikrona. Okolne ćelije preuzimaju oslobođene masne kiseline, a molekuli apo C sa površine hilomikrona vraćaju se na HDL čestice, zajedno sa nešto fosfolipida. Najveći deo smanjenih i triacilglicerolima-osiromašenih (delipidovanih) čestica hilomikrona, tzv. hilomikronski ostaci

ili remnanti, sa očuvanim sadržajem apsorbovanog dijetarnog holesterola, preuzimaju ćelije jetre, preko apo E specifičnih receptora (Jonas, 2002). Povećan sadržaj hilomikronskih

remnanta u plazmi smatra se aterogenim (Sakurai et al., 2005). VLDL prenose triacilglicerole sintetisane u jetri, kao i triacilglicerole poreklom iz

hilomikronskih remnanta, do tkiva u kojima se masne kiseline deponuju (adipozno tkivo), ili služe kao izvor energije (mišićno tkivo). Katabolizam VLDL čestica veoma je sličan onom

hilomikrona (Slika 2.4).

Slika 2.4 Uprošćeni shematski prikaz metabolizma hilomikrona i VLDL čestica (modifikovano sa http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/lipoprot/index.htm). Za objašnjenje videti tekst.

Smanjenjem sadržaja triacilglicerola (delipidaciona kaskada), iz velikih i manje gustih

VLDL čestica, preko lipoproteina srednje gustina (VLDL remnanti) nastaju manje i gušće LDL čestice. LDL frakcija je heterogena po svom sastavu. Najzastupljenije sub-populacije ovih čestica u krvnoj plazmi čoveka su: velike, flotirajuće LDL-I čestice, ujedno i najbogatije holesterolom; LDL-II čestice, označene i kao fenotip A i najmanje i najgušće LDL-III čestice

(fenotip B), koje sadrže veću količinu triacilglicerola (Krauss, 1991). Lipoproteini male gustine imaju relativno dug poluživot u cirkulaciji od oko 3 dana. Sadrže oko 70% ukupnog

11

holesterola u lipoproteinima krvi čoveka i glavni su prenosioci holesterola do perifernih tkiva (Frayn, 1996). Izuzev eritrocita i ćelija centralnog nervnog sistema sve ćelije u organizmu čoveka imaju na svojoj površini receptore visokog afiniteta za LDL čestice. LDL receptori su brojniji u plazminoj membrani ćelija i u tkivima i organima gde uneti holesterol obezbeđuje

polazni materijal za biosintetske procese (Tietz, 1996). Visoka koncentracija LDL-holesterola u cirkulaciji smatra se glavnim uzrokom ateroskleroze krvnih sudova srca i osnovnim

nezavisnim faktorom rizika za razvoj kardiovaskularnih oboljenja uopšte (Odeljak 2.5.4). 2.4.1.3 Lipoproteini velike gustine (HDL)

Lipoproteini velike gustine razlikuju se od svih ostalih lipoproteina plazme po tome što nastaju u cirkulaciji, kao među- ili završni proizvod metabolizma lipidnih i proteinskih komponenti različitog porekla i metaboličke sudbine (Rye et al., 1999). Tako, dok se CM i VLDL izlučuju kao već oformljene čestice iz tankog creva, odnosno jetre, a LDL nastaju iz

delipidiranih VLDL, HDL čestice nastaju u izvanćelijskom prostoru, gde im se sastav i struktura stalno remodelira (Nestel, 1987). Metabolizam HDL čestica (Gotto & Brinton,

2004) može da se (uopšteno) podeli na: (1) sintezu i sekreciju apo A1 u plazmu, što vodi obrazovanju prekursornih HDL čestica; (2) preuzimanje viškova slobodnog holesterola sa površine perifernih ćelija; (3) esterifikaciju usvojenog holesterola, uz sazrevanje HDL čestice; (4) isporuku holesterola na ciljna mesta u telu (jetra, steroidogeni organi i apo B-

sadržujući lipoproteini); (5) katabolizam apo A1. Anabolički put počinje sintezom i lučenjem velikih molekula pro-apo A1 iz jetre i

tankog creva u plazmu, gde dejstvom izvanćelijskih proteaza sazrevaju u obliku apoproteina (Nestel, 1987). Apo A1, posredstvom ABCA1 proteina, vezuje fosfolipide (pretežno fosfatidil-holin) poreklom iz ćelija obrazujući nascentnu HDL (pre-β) česticu (Gotto & Brinton, 2004). Nascentna HDL čestica potom usvaja holesterol iz plazmine membrane ćelija

perifernih tkiva preko ABCA1, ABCAG1/G4 u makrofagima, receptora čistača klase B tip 1 (SR-B1), proteina kaveolina, ili pasivnom difuzijom (Schneider, 2002). Holesterol može da

potiče i iz hilomikronskih ostataka i VLDL čestica. Rano tokom formiranja HDL čestica, apo A2 se sekretuje iz jetre u krvotok i vezuje se za površinu nastajuće čestice, što doprinosi strukturnom integritetu lipoproteina. Kako HDL čestica postaje sve veća i poprima diskoidni oblik vezuju se i ostali apolipoproteini (apo A4 i apo A5, kao i apo C proteini), kao i molekuli

LCAT, koje u krvotok sekretuju hepatociti (Tall, 1990). Pod fiziološkim uslovima, β-HDL se prevodi u zrelu, α-HDL česticu dejstvom LCAT. Novosintetisani estri holesterola kreću se

prema nepolarnom središtu čestice, što ne samo da sprečava vraćanje holesterola nazad u periferne ćelije, već i dodatno mobiliše efluks viškova holesterola iz makrofaga (Nestel, 1987). U poslednjoj fazi "sazrevanja", HDL čestice mogu da prime i molekule apo E, koje sintetišu hepatociti, makrofagi, ali i druge ćelije (Tall, 1990). Tokom svih ovih procesa HDL

poprima sferni oblik (Schneider, 2002). Aktivnošću proteina za transport estara holesterola (CETP, engl. Cholesterol Ester

Transfer Protein), sekretovanih u krvotok iz jetre i najvećim delom vezanih za HDL čestice,

12

više od 50% esterifikovanog holesterola iz HDL čestica prelazi u apo B-lipoproteine (Gotto & Brinton, 2004). Na ovaj način, višak holesterola iz ćelija može da bude vraćen u jetru ne samo preko HDL-receptorskog puta ("direktan" povratni prenos holesterola, već i preko LDL-receptorskog puta ("indirektan" povratni prenos holesterola) (Slika 2.5). Istovremeno,

međutim, aktivnost CETP doprinosi stvaranju manje gustih LDL čestica, većeg aterogenog potencijala (Tallis, 1994).

Slika 2.5 Uprošćeni prikaz povratnog prenosa holesterola, procesa kojim viškovi holesterola iz perifernih ćelija odlaze u jetru za izlučivanje preko žuči. Adenozin-trifosfat vezujući kasetni (ABC)A1 transportni protein posreduje u efluksu molekula slobodnog holesterola iz perifernih ćelija, pre svega makrofaga, do apolipoproteinom (apo) A-I–bogatim nascentnim lipoproteinima velike gustine (HDL). Esterifikacija holesterola dejstvom lecitin cholesterol aciltransferaze (LCAT) ima za posledicu obrazovanje zrelih i sferičnih HDL2 čestica. Nakon razmene estara holesterola (CE) sa triacilglicerolima (TG), procesa posredovanog aktivnošću transfer proteina za estre holesterola (CETP), TG hidrolizuje lipaza iz jetre (HL). Preostali CE u sastavu HDL2 se selektivno uklanjaju iz plazme pomoću receptora-čistača (SR-B1) u jetri ("direktan" povratni prenos holesterola (RCT)), što vodi stvaranju malih, lipidima siromašnim, apo A čestica (ostareli HDL), koji su pogodni za glomerularnu filtraciju i endocitozu, pomoću kubilin/megalin receptora u proksimalnim tubulama bubrega. Deo CE prenetih na čestice koje sadrže apo B (VLDL), lipoproteini srednje gustine (IDL) i LDL čestice transportuje se do jetre, gde se unose u ćeliju preko LDL receptora ("indirektni" RCT). LDL-R, receptor za lipoproteine male gustine; LPL, lipoproteinska lipaza; mLDL, modifikovani lipoproteini male gustine (iz Gotto & Brinton, 2004).

HDL čestice imaju relativno dug (5–6 dana) poluživot u cirkulaciji. Razgradnja se odvija, različitim intenzitetom, u različitim tipovima ćelija. Najizraženija je u jetri i tankom

crevu, u fibroblastima i endokrinim ćelijama je mala, dok ne postoji u humanim eritrocitima (Eisenberg, 1984). Za razliku od jedinstvenog i specifičnog receptora za LDL čestice, lipoproteini velike gustine imaju nekoliko mogućnosti za ulazak svojih lipidnih komponenti u ciljne ćelije. Receptori čistači tipa B1, na površini hepatocita i ćelija koje proizvode steroidne

13

hormone, imaju glavnu ulogu u selektivnom preuzimanju estara holesterola iz HDL čestica (Acton et al., 1996). U znatno manjoj meri, HDL čestice ulaze u hepatocite i preko LDL-u sličnog receptora na površini ćelije, ukoliko u svojoj strukturi sadrže apo E (Hill and McQueen, 1977). Internalizacija i kompletna razgradnja ovako unetih HDL čestica je slična

LDL degradacionom putu. Aktivnost enzima i transportnih proteina za lipide u plazmi, kao i receptora na

površini ćelija kompletira složeni put tzv. povratnog prenosa holesterola (RCT, engl. Reverse Cholesterol Transport), kojim višak holesterola iz perifernih tkiva završava u jetri. Holesterol se u jetri prevodi u žučne kiseline, koje se preko žuči izlučuju u tanko crevo, gde olakšavaju digestiju dijetarnih lipida (Agelon, 2002). Lipidima siromašne apo A1 čestice (ostareli HDL)

podesne su i za glomerularnu filtraciju, preko kubilin/megalin receptora u proksimalnim tubulama bubrega (Christensen & Birn, 2001).

Epidemiološke studije su pokazale da je HDL-holesterol nezavistan faktor rizika za razvoj kardiovaskularnih bolesti (Wilson, 1988). Za razliku od hilomikrona, VLDL i LDL čestica, HDL čestice imaju nesumnjiva anti-aterogena svojstva. Mehanizmi kojima HDL ispoljava zaštitnu ulogu na nivou krvnog suda su višestruki (Odeljak 2.5.4). Kao telesni

rezervoar za apoproteine klase C između obroka, HDL čestice imaju i središnje mesto u razgradnji lipoproteina bogatih triacilglicerolima u cirkulaciji (Tall, 2008).

2.4.2 Koncentracija holesterola u cirkulaciji

Koncentracija lipida u krvnoj plazmi čoveka na prvom mestu zavisi od ishrane i genetski predodređenih faktora (Grundy and Denke, 1990). Nakon unosa hrane bogate lipidima koncentracija triacilglicerola u krvi brzo raste, dostiže maksimum 2−3 sata nakon

obroka i nakon 4 sata naglo opada. Zbog toga se za analizu lipidnog profila plazme ili seruma krv uzima nakon gladovanja bez hrane i tečnosti, u trajanju od najmanje 12 sati – uzorak

našte. U plazmi zdravih osoba uzetoj našte holesterol, zatim fosfolipidi (od čega oko 75% fosfatidil-holina), a potom i triacilgliceroli su najzastupljeniji lipidi. Kao referentne vrednosti za koncentraciju holesterola i triacilglicerola u krvnoj plazmi, koje je prihvatio i Odbor za lipide Srpskog lekarskog društva 2005. godine, koriste se vrednosti predložene od strane

ekspertske grupe za detekciju, evaluaciju i tretman povišene koncentracije holesterola u odraslih (NCEP ATP III, 2002).

Rezultati eksperimentalnih istraživanja na životinjama, epidemioloških i kontrolisanih kliničkih studija pokazuju da je povišen nivo ukupnog holesterola u lipoprotenima krvi glavni faktor rizika za razvoj kardiovaskularnih oboljenja (CVD, engl. Cardiovascular Disease) (NCEP ATP III, 2002). Zbog toga se kod odraslih ljudi sadržaj ukupnog holesterola u serumu

klasifikuje po kategorijama rizika (Tabela 2.4). Prilikom interpretacije laboratorijskih nalaza uzimaju se u obzir i drugi faktori rizika, kao što su pol i godine života ispitanika, porodična

istorija bolesti, visok krvni pritisak, gojaznost i dijabetes. Zato se i preporučuje da se svakom čoveku nakon navršene 20. godine života uradi kompletan lipoproteinski profil barem jednom u svakih pet godina, a posle 30. godine i češće (NCEP ATP III, 2002). Početna klasifikacija

14

(kategorija rizika) je zasnovana na vrednostima za sadržaj ukupnog i HDL-holesterola u serumu ili plazmi našte (Tabela 2.4). Ukoliko je sadržaj ukupnog holesterola najmanje 5,2 mmol/L, ili je sadržaj HDL-holesterola niži od 1,0 mmol/L, neophodni su i podaci za sadržaj LDL-holesterola i triacilglicerola.

Tabela 2.4 Klasifikacija koncentracija lipida u plazmi, prema kategorijama rizika od kardiovaskularnih oboljenja (NCEP ATP III, 2002).

Ukupan holesterol Kategorija rizika

Manji od 5,16 mmol/L Poželjna vrednost Nizak rizik od CVD

5,17−6,18 mmol/L Granično visok holesterol

6,19 mmol/L i viši Visok holesterol Više nego udvostručen rizik od CVD

HDL holesterol Kategorija rizika

Manji od 1,03 mmol/L (za muškarce)

Nizak HDL holesterol Glavni faktor rizika za CVD

Manji od 1,29 mmol/L (za žene)

Nizak HDL holesterol. Glavni faktor rizika za CVD

1,54 mmol/L i viši Visok HDL holesterol Smatra se da štiti od CVD

LDL holesterol Kategorija (sugestije) Manji od 2,58 mmol/L Optimalan

2,58−3,35 mmol/L Blizu/ iznad optimalnog (provera jednom u 5 godina)

3,36−4,11 mmol/L Granično visok (provera jednom godišnje)

4,12−4,90 mmol/L Visok (dijetni režim tokom 6 meseci)

4,91 mmol/L i viši Veoma visok (dijetni režim i terapija lekovima)

Triacilgliceroli Kategorija Manji od 1,70 mmol/L Odgovarajući

1,70−2,25 mmol/L Granično povišeni 2,26−5,64 mmol/L Visok 5,65 mmol/L i viši Veoma visok

Napomena: nisu utvrđene preporučene vrednosti za sadržaj fosfolipida u serumu, s obzirom

da kod zdravih osoba on postepeno raste sa godinama života (Schaefer et al, 1958).

Primarne hiper-holesterolemije nastaju kao posledica genetski uzrokovanih defekata u

metabolizmu holesterola i lipoproteina (Tietz, 1996). Među sekundarnim hiper-holesterolemijama važno mesto zauzimaju one koje su rezultat izmenjenih životnih navika. Višak holesterola u plazmi često je egzogenog porekla i u vezi je sa povećanim unosom lipida životinjskog porekla (Odeljak 2.4.2.2). Sadržaj ukupnog holesterola u lipoproteinima

plazme raste za oko 4 mg/dL (oko 0,01 mmol/L) za svaki kilogram viška telesne mase (WHO document, 2000). Usled promena u fluidnosti plazmine membrane, pre svega zbog

15

povećanog unosa zasićenih masnih kiselina i holesterola u ishrani, gojazne osobe imaju prekomernu produkciju apo B100 i delimičnu supresiju aktivnosti LDL receptora u hepatocitima (Grundy & Denke, 1990). Svakodnevna dozirana fizička aktivnost kod zdravih osoba smanjuje broj VLDL čestica u cirkulaciji i podiže sadržaj HDL-holesterola (Lakka &

Bouchard, 2005). Veliki broj lekova utiče na metabolizam lipoproteina. Povišena koncentracija

holesterola u serumu se javlja tokom korišćenja steroidnih hormona (glukokortikoida, progesterona i anaboličkih hormona), diuretika, β-blokatora i imunosupresiva (Stone, 1994). I endokrinološki poremećaji mogu biti uzrok sekundarnih lipoproteinemija. Hipotireoidizam je jedan od najčešćih endokrinoloških poremećaja praćenih hiper-lipoproteinemijom, koji

karakteriše porast nivoa cirkulišućih LDL čestica, snižen HDL-holesterol, kao i porast sadržaja triacilglicerola i lipoproteinskih remnanta u plazmi (Stone, 1994). Koncentracija

holesterola u plazmi raste i kod oboljenja hepatobilijarnog sistema praćenih holestazom (Longo et al., 2001). Estrogeni hormoni smanjuju koncentraciju holesterola u serumu, zbog povećanja broja LDL receptora na površini hepatocita, što ubrzava katabolizam holesterola u jetri. To je i osnovni razlog zbog kojeg žene do menopauze, u proseku, imaju niže vrednosti

za sadržaj holesterola u plazmi (Farhat et al., 1996). Nivo ukupnog i LDL-holesterola značajno je povećan i kod neregulisanog dijabetesa (Stone, 1994).

2.4.2.1 Sezonske promene u sadržaja holesterola u lipoproteinima

Statistički značajne razlike u sadržaju holesterola u lipoproteinima plazme u zavisnosti od godišnjeg doba nađene su u velikom broju studija, nezavisno od zemlje u kojoj je istraživanje obavljeno, godina, pola, etničke pripadnosti i bazalnog lipidnog profila plazme

ispitanika (Kelly, 2005). Utvrđeno je da je koncentracija ukupnog holesterola u serumu za 3–10% veća u zimskim u poređenju sa letnjim mesecima (Robinson et al., 1993; Bluher et al., 2001). Nešto manje razlike dobijene su za sadržaj LDL-holesterola (Mänttäri et al., 1993) i HDL-holesterola (Bluher et al., 2001), ponovo sa većim vrednostima tokom zime. Pravilnost u promeni koncentracije holesterola u cirkulaciji tokom kalendarske godine može da se opiše modelom sinusoidne krive: najveće vrednosti beleže se, na severnoj polulopti, u decembru i

januaru, a najmanje tokom juna i jula (Gordon, 1988). Sezonske varijacije u sadržaju holesterola u lipoproteinima plazme rezultat su, pre

svega, razlika u načinu ishrane tokom godine, konkretno, povećanog unosa zasićenih masnih kiselina i holesterola tokom zime (Shahar et al., 1999). Na razlike u sadržaju holesterola u plazmi u zavisnosti od doba godine izgleda da utiče i temperatura vazduha i izlaganje sunčevim zracima (Jenner et al., 1988), promene u fizičkoj aktivnosti ispitanika (Thomas et

al., 1961; Antonis et al., 1965), ali i unutrašnji biološki činioci (Kelly, 2005). Bez obzira na ubedljive nalaze o ne tako malim razlikama u lipidnom profilu ispitanika, sezonske varijacije u sadržaju holesterola u serumu ne uzimaju se u obzir prilikom interpretacije nalaza laboratorijskih analiza (NCEP ATP III, 2002).

16

2.4.2.2 Uticaj ishrane na sadržaj holesterola u lipoproteinima

Sistematska istraživanja uticaja glavnih nutrijenata (lipidi, ugljeni hidrati i proteini) na sadržaj lipida u serumu čoveka počela su od 60-tih godina prošlog veka i klasičnih radova Keys-a i Hegsted-a (Keys et al., 1965; Hegsted et al., 1965). Ova istraživanja su pokazala da na nivo LDL-holesterola od sastojaka hrane najviše utiče unos zasićenih masnih kiselina.

Epidemiološke studije pokazuju da populacije koje u ishrani koriste velike količine zasićenih masnih kiselina i holesterola imaju visok rizik od kardiovaskularnih oboljenja (Keys et al.,

1986). Analize rezultata ogromnog broja studija pokazuju da za (svakih) 1% povećanja unosa zasićenih masnih kiselina (u odnosu na ukupan kalorijski unos) LDL-holesterol u serumu raste za oko 2% (NCEP ATP III, 2002). Glavni izvori zasićenih masnih kiselina u ishrani čoveka su mlečni proizvodi sa visokim sadržanjem masnoća (punomasno mleko, sirevi, puter,

sladoled, kremovi), masna mesa, tropska ulja, kao i pekarski proizvodi koji sadrže životinjske masti (NCEP ATP III, 2002). Smatra se da sadržaj LDL-holesterola u cirkulaciji raste kao

posledica poremećaja u uklanjanju LDL čestica iz cirkulacije, zbog promena u fluidnosti plazmine membrane koje izazivaju zasićene masne kiseline (Grundy and Denke, 1990), kao i zbog pojačane sinteze i sekrecije apo B lipoproteina (Slika 2.6). Veličina hiper-holesterolskog efekta zavisi od vrste zasićenih masnih kiselina u ishrani. Dok kratkolančane

masne kiseline (6–12 ugljenikovih atoma u molekulu) praktično ne utiču na sadržaj holesterola u plazmi, miristinska (C-14) i palmitinska (C-16) kiselina imaju najizraženiji

hiper-holesterolski efekat (Schaefer et al., 1995). Masna životinjska mesa su posebno bogata palmitinskom, a puter miristinskom kiselinom. Stearinska kiselina (C-18), zbog brzog prevođenja u mononezasićenu oleinsku kiselinu, ne povećava nivo holesterola u lipoproteinima plazme (Grundy and Denke, 1990).

Slika 2.6 Shematski prikaz mehanizma povećanja sadržaja LDL-holesterola u serumu usled povećanog unosa zasićenih masnih kiselina. Povećani sadržaj holesterola u hepatocitima, kao posledica ishrane bogate lipidima, inhibira sintezu LDL receptora, što smanjuje unos LDL čestica i VLDL remnanta. Ovo smanjuje katabolizam LDL frakcije i ubrzava prevođenje VLDL remnanta u LDL čestice (iz Grundy and Denke, 1990).

17

Klinička istraživanja su ukazala na posebno štetne efekte povećanog unosa namirnica za čiju se proizvodnju koriste delimično hidrogenizovana biljna ulja koja sadrže trans masne kiseline (trans-izomeri nezasićenih masnih kiselina) (NCEP ATP III, 2002). Ovi efekti se ogledaju u smanjenju sadržaja HDL-holesterola i povećanju sadržaja LDL-holesterola u

plazmi (Ascherio et al., 1999; Judd et al., 1994). Mononezasićene masne kiseline (na primer oleinska kiselina) snižavaju nivo LDL-

holesterola u serumu, ali ne utiču značajno na sadržaj HDL-holesterola, ili triacilglicerola (Mensink & Katan, 1992). Zbog toga se, u cilju korekcije povećanih vrednosti holesterola u plazmi, preporučuje povećan unos mononezasićenih masnih kiselina iz biljnih izvora (maslinovo ulje i orašasti plodovi), do najviše 20% ukupnog kalorijskog unosa (Tabela 2.5).

Dva tipa polinezasićenih masnih kiselina (PUFA, engl. Polyunsaturated Fatty Acids), dominiraju u ishrani čoveka: n-6 i n-3. U biljnim uljima soje, suncokreta, uljane repice i lana,

najviše ima n-6 linolne (18:2) i n-3 linolenske kiseline (18:3). Riblja ulja, posebno ona lososa, bakalara, haringe, skuše i tune, su izuzetno bogata u dve n-3 polinezasićene masne kiseline: eikozapentaenskom i dokozaheksaenskom kiselinom. Kao zamena za zasićene masne kiseline, PUFA iz biljnih ulja blago smanjuju LDL-holesterol u serumu (do 5%).

Efekat potiče od inhibicije sinteze apo-B lipoproteina u jetri (Mensink & Katan, 1992). Zbog smanjenog nastajanja VLDL čestica, visok unos n-3 masnih kiselina iz riba snižava

koncentraciju triacilglicerola u cirkulaciji i do 15% (Davidson, 2006). Kontrolisane kliničke studije pokazuju da izokalorijska zamena zasićenih masnih kiselina nezasićenim značajno smanjuje ukupan rizik od kardiovaskularnih oboljenja (Gordon, 1995). Međutim, zbog moguće štetnih posledica oksidacije polinezasićenih masnih kiselina i rizika od maligniteta

(Schaefer et al., 1995), prema sadašnjim preporukama, unos PUFA u terapeutske svrhe treba ograničiti na najviše 10% od ukupno unete energije (NCEP ATP, 2002).

Tabela 2.5 Preporuke Svetske zdravstvene organizacije o dnevnom unosu makro-nutrijenata (WHO document, 2000).

Nutrijent Preporuka o unosu

Ukupne masti 15–30% od ukupne energije Zasićene masti <10% od ukupne energije Mononezasićene masti do 20% od ukupne energije Polinezasićene masti 3–7% od ukupne energije Proteini 10–15% od ukupne energije Ugljeni hidrati kompleksni 55–65% od ukupne enrgije prosti <10% od ukupne enrgije

Vlakna (ne-skrobni polisaharidi) 16–24 g/dan Voće i povrće >400 g/dan So (NaCl) <6 g/dan Holesterol <300 mg/dan

18

Povećan unos holesterola ishranom uzrokuje izraženu hiper-holesterolemiju kod laboratorijskih životinja, uključujući nehumanoidne primate (NCEP ATP, 2002). Visok unos holesterola kod ljudi nema tako dramatične efekte (Grundy & Denke, 1990). Rezultati kontrolisanih metaboličkih studija nesumljivo pokazuju da kontinuirano visok unos

holesterola podiže nivo LDL-holesterola u serumu čoveka (Clarke et al., 1997; Hopkins, 1992). Procenjuje se da na svakih 100 mg holesterola, unetog sa 1000 kcal, koncentracija

holesterola u serumu raste za oko 0,026 mmol/L (Grundy et al., 1988). Znatno manji efekat dijetarnog holesterola na koncentraciju lipida u serumu je nađen u manje striktno kontrolisanim studijama (Howell et al., 1997).

Smatra se da su kod zdravih ljudi velike međusobne razlike u intenzitetu hiper-

holesterolskog efekta holesterola iz ishrane posledica genetskih razlika (NCEP ATP, 2002). Ipak, smanjenje unosa dijetarnog holesterola od veoma visokog do niskog značajno smanjuje

sadržaj LDL-holesterola kod većine ispitanika (Denke, 1995). Meta-analiza većeg broja kontrolisanih studija je pokazala da dugotrajni povećani unos holesterola povećava količnik ukupnog i HDL-holesterola, što potvrđuje njegov nepovoljan efekat na profil holesterola u serumu (Weggemans et al., 2001). Razloge za porast koncentracije LDL-holesterola kod ljudi

sa povećanim unosom holesterola iz hrane treba tražiti, slično efektu zasićenih masnih kiselina, u supresiji aktivnosti receptora za LDL čestice (Slika 2.6). Poslednjih decenija

uočen je trend smanjivanja unosa holesterola u visoko-industrijalizovanim zemljama sveta, što je rezultat smanjenog korišćenja mesa i mlečnih proizvoda u svakodnevnoj ishrani (Tippett & Cleveland, 1999). Oko trećina dijetarno unetog holesterola je poreklom iz žumanceta jajeta i ovaj udeo blago raste u poslednje vreme (Putnam & Gerrior, 1999).

Povećani unos ugljenih hidrata ne utiče na sadržaj holesterola u lipoproteinima plazme (Grundy & Denke, 1990). Međutim, veoma visok unos ugljenih hidrata (više od 65%

ukupne energije) se povezuje sa blagim smanjenjem sadržaja HDL-holesterola i značajnijim porastom koncentracije triacilglicerola u serumu (Turley et al., 1998). Ishrana bogata dijetarnim vlaknima smanjuje hiper-triglicerolemični efekat ugljenih hidrata (Jenkins et al., 1993).

Proteini imaju zanemarljiv efekat na koncentraciju lipida u plazmi, osim što zamena životinjskih proteina proteinima iz soje izgleda da blago snižava LDL-holesterol (Anderson

et al., 1995). Umereni unos alkohola (najviše 30 g dnevno za muškarce i 20 g za žene) povećava

sadržaj HDL-holesterola i apo A1 (Rimm et al., 1999).

Visok dnevni unos (5–10 g) rastvornih biljnih vlakana (iz ječma, ovasa, pektinima

bogatog voća ili pasulja) snižava nivo LDL-holesterola za oko 5%, pošto smanjuje apsorpciju dijetarnog holesterola (Brown et al., 1999). Redovni dnevni unos (2–3 g) fitosterola može da

smanji sadržaj LDL-holesterola 6–15%, bez većih promena u sadržaju HDL-holesterola i triacilglicerola u serumu (Gylling & Miettinen, 1999).

19

2.5 Holesterol u ćeliji

Da bi zadovoljile svoje mnogobrojne potrebe za holesterolom i njegovim derivatima ćelije kontinuirano sintetišu i/ili unose holesterol iz lipoproteina plazme. Endogeni holesterol je esencijalan za normalan razvoj i održanje funkcije moždanog tkiva, koje ne usvaja holesterol poreklom iz lipoproteina plazme. U hepatocitima je glavnina holesterola poreklom

iz receptorima posredovanog unosa LDL čestica, dok je u ostalim tkivima holesterol uglavnom iz de novo sinteze (Dietschy & Turley, 2001). Da holesterol iz ishrane inhibira

biosintezu holesterola u ćelijama jetre utvrđeno je još 50-tih i 60-tih godina prošlog veka. U 70-tim je pokazano da je prvi i najvažniji ograničavajući korak u nastajanju holesterola fosforilacija ključnog enzima u biosintetskom putu, HMG-CoA reduktaze (Vance and van den Bosch, 2000). Istražujući porodičnu hiper-holesterolemiju, nasledno metaboličko

oboljenje koje karakteriše izuzetno visok sadržaj holesterola u cirkulaciji, Brown i Goldstein otkrivaju receptor za LDL čestice (Brown & Goldstein, 1976; Brown & Goldstein, 1986).

Sadržaj holesterola u ćeliji, a posebno u plazminoj membrani ćelija sisara, održava se u veoma uskim intervalima fizioloških vrednosti. Danas znamo da su biosinteza i unos holesterola u ćeliju precizno regulisani transkripcionim, translacionim i post-translacionim mehanizmima (Goldstain & Brown, 2009). Složeni procesi u kojima višak holesterola iz

perifernih tkiva, uz pomoć HDL čestica, prelazi u jetru gde se kataboliše i/ili eliminiše iz tela, takođe su od izuzetnog značaja za sistemsku homeostazu holesterola u organizmu čoveka

(Fielding & Fielding, 2002). 2.5.1 Biosinteza holesterola

Izuzev u zrelim eritrocitima, sinteza holesterola je moguća u svim ćelijama čoveka. Najintenzivnija je u jetri, sledi sluzokoža tankog creva, testisi, ovarijum, placenta, kora

nadbubrega i koža (Bloch, 1983). Biosinteza holesterola odvija se u citosolu i membrani endoplazmatskog retikuluma i peroksizoma ćelije (Liscum, 2002). To je izuzetno složen i za

ćeliju energetski veoma zahtevan proces, čiji je pojednostavljeni prikaz dat na slici 2.7. Na primer, samo za prevođenje molekula lanosterola u molekul holesterola potrebno je 18 enzimima katalizovanih hemijskih reakcija. Za ciklizaciju skvalena u lanosterol, uvođenje hidroksilne grupe, kao i oksidativno uklanjanje metil- grupa sa molekula lanosterola,

neophodan je molekulski kiseonik (Tabas, 2002). Holesterol nastaje iz dva molekula acetil-CoA, kroz tzv. izoprenoidni put. Esencijalni

nesteroidni izoprenoidi (dolihol, prenilovani proteini, hem A, ili izopentenil adenozin tRNK-e) takođe nastaju u ovom putu (Slika 2.7). Stoga ne čudi da metabolički defekti u biosintezi holesterola imaju razorne posledice po ćelije i organizam u celini (Waterham, 2006).

20

Slika 2.7 Put biosinteze holesterola: navedeni su glavni intermedijeri i krajnji proizvodi, kao i lokalizacija enzima iz biosintetskog puta unutar ćelije (iz Olivier & Krisans, 2000).

2.5.2 Regulacija sadržaja holesterola u ćeliji

Homeostaza holesterola u ćeliji se postiže usaglašenim odvijanjem tri procesa: (1)

unosa holesterola u ćeliju; (2) biosinteze holesterola unutar ćelije; i (3) eksporta (efluksa) viška holesterola iz ćelije. Homeostazi doprinosi i raspodela raspoloživog holesterola između

plazmine membrane i membrana ćelijskih organela (Simons & Ikonen, 2000). Proteini kaveolini učestvuju u raspodeli unetog, ili endogeno sintetisanog holesterola između membranskih kompartmenta ćelije (Ikonen et al., 2004).

Unos holesterola u ćeliju odvija se desorpcijom i transferom molekula holesterola sa

površine čestice lipoproteina na spoljašnju površinu membranskog lipidnog dvosloja, ili unosom čitave čestice lipoproteina, posredstvom specifičnih proteinskih receptora na površini

ćelije (Fielding & Fielding, 1995). Najbolje proučeni i kvantitativno najznačajniji proces

21

ulaska holesterola u ćelije uključuje LDL čestice i njihov receptor (Brown & Goldstein, 1976). Receptor za LDL je integralni membranski glikoprotein, za čiji se izvanćelijski domen vezuju lipoproteini koji sadrže apo B100 ili apo E. Apolipoproteini klase E imaju veći afinitet za vezivanje za LDL receptor od apo B100, zbog čega se CM ostaci i VLDL čestice

efikasnije odstranjuju iz krvotoka od LDL čestica (Schneider, 2002). Nakon vezivanja, nastali kompleks procesom endocitoze ulazi u unutrašnjost ćelije. Nakon internalizacije, ATP-

zavisna protonska pumpa snižava pH u endozomu, kompleks disosuje i LDL receptorni protein se reciklira, preko ER, nazad na površinu ćelije. Endocitotske vezikule se potom fuzionišu sa lizozomima, u kojima enzimi hidrolizuju estre holesterola iz jezgra lipoproteina, a kisele hidrolaze razlažu molekul apo B100. Smatra se da većina molekula apo E izbegava

hidrolizu i vraća se u cirkulaciju kao komponenta HDL čestica (Schneider, 2002). U ćeliji postoji kontinualni fluks fosfolipida, glikolipida i holesterola od mesta sinteze

(ER i Goldži sistem) do drugih unutarćelijskih membranskih struktura, uključujući i plazminu membranu. Mehanizmi transporta holesterola unutar ćelije su višestruki (Slika 2.8). Molekuli holesterola, oslobođeni iz kasnog endozoma i lizozoma u citosol ćelije, posredstvom različitih sterol-vezujućih proteina mogu da budu preneseni do plazmine membrane ćelije.

Višak holesterola iz plazmine membrane i Goldži aparata ćelije, istim putevima, može da se vrati u ER, gde reguliše sopstvenu biosintezu (Maxfield & Tabas, 2005). Kao brzi odgovor

ćelije na povećani unos holesterola nastaje ACAT-om katalizovana esterifikacija viškova slobodnog holesterola (Chang, 2009). Esterifikovani holesterol se skladišti i čuva u lipidnim kapljicama rasutim u citoplazmi. Ukoliko ćeliji zatreba holesterol, estri holesterola iz ovih kapljica biće efikasno izhidrolizovani dejstvom neutralnih holesterol-estar hidrolaza, koje u

nekim ćelijama uključuju i hormon-osetljive lipaze, enzime koji hidrolizuju triacilglicerole u adipocitima (Yeaman, 2004). Naizmenični ciklusi esterifikacije i hidrolize estarski vezanog

holesterola omogućuju kratkotrajno puferisanje sadržaja holestrola u ćeliji. Aktivnost ACAT-a, kao homeostatskog senzora, je regulisana koncentracijom holesterola u ćeliji (Maxfield & Tabas, 2005).

Ćelije regulišu sadržaj holesterola i preko regulacije aktivnosti nekoliko enzima iz

biosintetskog puta holesterola. Pod svim fiziološkim uslovima, 75–90% HMG-CoA reduktaze, ključnog enzima koji kontroliše brzinu sinteze holesterola, je fosforilovano i

inaktivno. Rezerve inaktivnog enzima omogućuju ćelijama brzi odgovor na kratkotrajne potrebe za holesterolom (Liscum, 2002). Čak i uz dodatak egzogenog holesterola, potpuna inhibicija HMG-CoA reduktaze bi dovela do smrti ćelije, usled nedostatka esencijalnih nesteroidnih izoprenoida, derivata mevalonata. HMG-CoA reduktaza je i najvažnija

terapeutska meta za tretman hiper-holesterolemija. Enzim inhibiraju statini, potentni kompetitivni inhibitori HMG-CoA reduktaze (Liscum, 2002). Regulacija enzima uključenih u

biosintezu holesterola odvija se i na nivou stabilnosti iRNK, translacije i enzimske degradacije (Liscum, 2002). Izoprenoidni put nastajanja sterola u ćeliji regulišu ne samo krajnji proizvodi biosintetskog puta, već i nesteroidni intermedijeri (Goldstein & Brown, 1990). Najvažniji fiziološki faktori koji utiču na sintezu holesterola su: urinarni ritam, insulin

22

i glukagon, tiroidni hormoni, glukokortikoidi, estrogen i žučne kiseline (Ness & Chambers, 2000).

Slika 2.8 Transport holesterola unutar ćelije. LDL čestice (narandžasti krugovi) vezuju se za LDL receptore na površini ćelije (svetlo plavi Y-oblik) i nakon internalizacije prelaze u endozomsko-lizozomski sistem iz kojeg holesterol može da pređe u ćelijske kompartmente, pre svega plazminu membranu i endoplazmatski retikulum (ER). LDL receptori se vraćaju u plazminu membranu preko endocitotskog reciklujućeg kompartmenta (ERC). Holesterol može da pređe iz plazmine membrane do ERC ne-vezikularnim, od ATP-a zavisnim, procesom. Povratak holesterola u plazminu membranu odvija se ne-vezikularnim transportom i preko membranskih vezikula koje sadrže i druge reciklovane komponente membrana. Novo-sintetisani molekuli holesterola iz ER uglavnom direktno odlaze u plazminu membranu ćelije, iako neki slede biosintetski sekretorni put iz ER do Goldžijeve oblasti. Viškovi holesterola u ER bivaju esterifikovani pomoću acil-holesterol acil-transferaze (ACAT) i uskladišteni u citoplazmi ćelije, u obliku lipidnih kapljica. TGN, trans-Goldžijeva mreža (iz Maxfield & Tabas, 2005).

Noviji radovi (na primer Brown & Goldstein, 1997) su ubedljivo pokazali da je

SREBP/SCAP proteinski kompleks esencijalni regulator sadržaja holesterola u ćeliji na molekulskom nivou (Slika 2.9). Proksimalni promotori gena uključenih u metabolizam holesterola sadrže SRE (engl. Sterol Regulatory Element). Transkripcioni faktori koji se vezuju za ove elemente su SRE-vezujući proteini (SREBPs, engl. Sterol Regulatory Element

Binding Proteins), čiji se prekursor nalazi u membrani ER ćelija. Proteolitičkim cepanjem SREBP oslobađa se amino-terminalni deo proteina iz Goldži oblasti u citosol, koji potom

putuje do jedra ćelije i vezivanjem za SRE reguliše ekspresiju proteina uključenih u metabolizam lipida (Horton et al., 2002). Transkripciona aktivacija uključuje ne samo enzime iz biosintetskog puta holesterola (HMG-CoA sintaza, HMG-CoA reduktaza, farnezil-difosfat sintaza i skvalen sintaza), nego i receptorski protein za LDL čestice, kao i enzime uključene u

sintezu i unos masnih kiselina u ćeliju (acetil-CoA karboksilaza, sintaza masnih kiselina i lipoproteinska lipaza) (Brown & Goldstein, 1999).

23

Proteolitična aktivacija SREBPs je regulisana od strane, takođe za membranu ER vezanog, SCAP proteina (engl. Sterol Cleavage Activating Protein) (Brown & Goldstein, 1997). Za oslobađanje iz membrane ER i prelazak u jedro ćelije, prekursorni SREBP mora prvo da veže SCAP i da, potom, SCAP/SREBP kompleks napusti ER i pređe u Goldži

kompleks ćelije (Slika 2.10). Transport je vezikularni, uz posredovanje specifičnih COPII proteina (engl. Coat Protein). SCAP sadrži specifični vezujući domen za holesterol koji je

senzor sadržaja holesterola u ćeliji i smatra se da promene u koncentraciji holesterola u membrani na neki način menjaju prirodu interakcija između SCAP i SREBPs (Goldstein & Brown, 2009). Vezivanje holesterola za SCAP izgleda da favorizuje vezivanje SCAP/SREBP kompleksa za druga dva proteina (Insig-1 i Insig-2), što blokira asocijaciju SCAP sa COPII

proteinima (Sun et al., 2007) i translokaciju SCAP/SREBP kompleksa u Goldži aparat. Nedavno je pokazano da se oksisteroli, posebno 25-hidroksi-holesterol, vezuju za Insig

proteine sa većim afinitetom nego SCAP (Radhakrishnan et al, 2007), inhibirajući biosintezu holesterola u ćeliji.

Kada je sadržaj holesterola u ćeliji visok, proteaza nije aktivirana, SREBP nije oslobođen, ekspresija gena za HMG-CoA reduktazu i LDL receptor nije indukovana, tako da

su unos i endogena biosinteza holesterola u ćeliji minimalni. Kada je sadržaj holesterola u ćeliji nizak, prekursorni SREBP se cepa, SREBP migrira do jedra i omogućuje ekspresiju

navedenih gena, što za posledicu ima povišen i unos i sintezu holesterola u ćeliji (Goldstein & Brown, 2009).

Slika 2.9 Mehanizmi regulacije sadržaja holesterola u ćeliji. (a) Kada je sadržaj holesterola u ćeliji odgovarajući, sterol vezujući regulatorni protein (SREBP) koji aktivira cepanje SREBP (SCAP) i Insig-1 obrazuju makromolekulski kompleks u membrani endoplazmatskog retikuluma. (b) Snižavanje sadržaja holesterola u ER stimuliše oslobađanje Insig-1 iz kompleksa, što omogućava da SCAP sprovede SREBP do vezikula ogrnutim COPII proteinom. (c) COPII vezikule prenose SCAP/SREBP do Goldži aparata. (d) U Goldži aparatu, SREBP se proteolitički cepa na dva mesta, uz oslobađanje sterol-vezujućeg elementa koji migrira do jedra (iz Goldstein & Brown, 2009).

24

Nedavno je indentifikovan jedarni hormonski receptor, nazvan LXRα (engl. Liver X

Receptor α), kao drugi glavni transkripcioni faktor uključen u homeostazu holesterola u ćelijama jetre. Smatra se da ovaj receptor učestvuje u regulaciji unosa dijetarnog holesterola u hepatocite (Zhao & Dahlman-Wright, 2010). Kako je za nekoliko različitih oksisterola

nađeno da su fiziološki ligandi za LXRα, izgleda da su oksisteroli važni regulatori sadržaja holesterola u ćelijama jetre. Aktiviranje LXRα stimuliše sintezu i sekreciju žučnih kiselina,

sintezu masnih kiselina, verovatno i esterifikaciju holesterola (Zhao & Dahlman-Wright, 2010). Istovremena regulacija biosinteze holesterola i sinteze masnih kiselina izgleda da omogućuje ćeliji da istovremeno reguliše sadržaj holesterola i fosfolipida u svojim membranama (Brown & Goldstein, 1997).

Treći nivo regulacije sadržaja holesterola unutar ćelije obezbeđuju mehanizmi eksporta viškova slobodnog holesterola iz ćelije u izvanćelijsku sredinu. Poznata su tri takva

mehanizma (Slika 2.10): (a) difuzija holesterola u vodenu fazu; (b) efluks holesterola posredovan SR-B1 proteinima; (3) kvantitativno najznačajniji, efluks holesterola posredovan ABCA1 proteinima. Ključni akceptori holesterola iz ćelija su HDL čestice i za njih asosovan apo A1 (Yancey et al., 2003). Smatra se da su kaveole, holesterolom bogati mikro-domeni

plazmine membrane, mesta efluksa molekula holesterola iz ćelije (Ikonen et al., 2004).

Slika 2.10 Shematski prikaz mehanizama efluksa holesterola iz perifernih ćelija: difuzija kroz vodenu fazu i ugradnja holesterola u HDL česticu (spori proces koji se odvija u svim tipovima ćelija); SR-BI posredovani efluks holesterola (SR-BI vezuje lipoproteine i potpomaže dvosmernu razmenu holesterola između ćelije i izvanćelijskih akceptora); ABCA1 posredovani efluks holesterola (potpomaže jednosmerni efluks holesterola i fosfolipida iz membrane ćelije do apolipoproteina) (iz Yancey et al., 2003).

Difuzija holesterola u izvanćelijsku sredinu putem vodene faze se odvija u svim

tipovima ćelija. To je pasivan i relativno spor proces u kojem se desorbovani molekuli holesterola iz plazmine membrane vezuju za serum albumin, LDL čestice i, pre svega, za zrele HDL čestice. Holesterol vezan za albumin brzo se redistribuira u lipoproteine (Zhao &

25

Marcel, 1996). SR-B1 nespecifično prepoznaje i vezuje čestice lipoproteina, što omogućuje dvosmernu pasivnu razmenu holesterola između ćelije i izvan-ćelijskog matriksa. Zrele, fosfatidil-holinom bogate HDL čestice su najbolji akceptori holesterola eksportovanog iz ćelije putem SR-B1 proteina u plazminoj membrani. Osim uloge u eliminisanju viškova

slobodnog holesterola iz ćelija, SR-B1 posreduje i u selektivnom unosu fosfolipida, estara holesterola i triacilglicerola u ćeliju (Thuahnai, 2001), pospešujući delipidaciju (pre svega)

HDL čestica. Smer i veličina neto transfera holesterola iz perifernih ćelija u cirkulaciju, procesima pasivne difuzije i preko SR-B1, zavisi od gradijenta sadržaja holesterola (izraženog na sadržaj ukupnih fosfolipida) između kompartmenta uključenih u razmenu (Thuahnai, 2001), kao i od sastava akceptorskih lipoproteina (Rothblat, 1999). ABCA1, član

velike familije kasetnih transportnih proteina međusobno slične strukture, koristi ATP za transport različitih lipidnih supstrata (Dean et al., 2001). Stoga je, za razliku od prethodna dva

mehanizma, smer prenosa molekula holesterola i fosfolipida uvek isti: iz plazmine membrane ćelije prema nascentnim HDL česticama (Slika 2.10). Humani makrofagi, glatke mišićne ćelije aorte ili fibroblasti, ali ne i eritrociti, ostvaruju preko ABCA1 intenzivan efluks viškova holesterola iz svojih ćelija (Fielding & Fielding, 1995).

Aktivnost LCAT u krvnoj plazmi stvara i održava gradijent (slobodnog) holesterola između plazmine membrane i akceptornih lipoproteina, što omogućuje neto transfer

holesterola iz ćelijskih membrana u lipoproteine plazme (Glomset, 1968). LCAT uglavnom deluje na holesterol iz HDL čestice (Akanuma & Glomset, 1968), što je jedan od razloga za jedinstvenu ulogu lipoproteina velike gustine u efluksu ćelijskog holesterola. Katalitičko delovanje LCAT i CETP u plazmi čoveka deo je regulisane sekvence koraka kojima molekuli

slobodnog holesterola iz ćelija prelaze u estarski vezan holesterol u jezgru lipoproteina, što, na posletku, omogućuje katabolizam holesterola u hepatocitima (Fielding & Fielding, 1982).

Efikasno vraćanje viškova holesterola iz perifernih ćelija i tkiva u jetru usporava njegovo nagomilavanje u zidovima arterija (Yancey et al., 2003).

Transfer molekula holesterola iz ćelije ili u ćeliju predstavlja tako fizički fenomen koji se kvalitativno dešava u svim tkivima u organizmu čoveka, ali čiji kvantitativni značaj,

pre svega, zavisi od metaboličkog stanja ćelije.

2.5.3 Holesterol u membranama ćelija

Najveći deo holesterola u ćeliji nalazi se unutar membrana, isključivo u slobodnoj (ne-esterifikovanoj) formi. Holesterol se u membranu umeće vertikalno na ravan dvosloja, sa polarnom hidroksilnom grupom na površini, hidrofobnim steroidnim jezgrom u unutrašnjosti

i bočnim lancem prema centru dvosloja (Slika 2.11). Holesterol je podjednako zastupljen u oba sloja, bez obzira na tip ćelijske membrane (Blau & Bittman, 1978). Razlog za ovo treba

tražiti u veoma brzoj translokaciji molekula holesterola unutar membranskog dvosloja. Za razliku od molekula fosfolipida, za koje polu-vreme prelaska iz jednog u drugi sloj membrane iznosi oko 270 minuta, za molekule holesterola je, na primeru membrana humanih eritrocita, nađeno da iznosi manje od 50 minuta (Brasaemle et al, 1988). Holesterolom je najbogatija

26

plazmina membrana ćelije (30–50% ukupnih lipida). Membrane mitohondrija i ER sadrže relativno malo holesterola (5–15%), dok je sadržaj holesterola u Goldži kompleksu između ovih vrednosti (Yeagle, 1985). Različiti sadržaj holesterola u različitim membranskim kompartmentima posledica je ne-vezikularnog puta transporta holesterola kroz ćeliju,

pomoću specifičnih sterol-vezujućih proteina koji prenose holesterol iz membrana organela (ER i Goldžijeva oblast) u plazminu membranu ćelije (Maxfield and Tabas, 2005).

Holesterol je jedan od najvažnijih regulatora lipidne organizacije, strukturnih i

funkcionalnih karakteristika bioloških membrana. Uspostavljajući mnogobrojne kontakte sa molekulima (gliko)fosfolipida, (gliko)sfingolipida i proteina, holesterol povećava mehaničku

stabilnost lipidnog dvosloja (Slika 2.11) i pomaže u održanju lipidnog miljea neophodnog za aktivnost membranskih proteina. Za opisivanje "čvrstoće" strukturne organizacije bioloških membrana koriste se pojmovi fluidnost i viskoznost (recipročna vrednost fluidnosti). Fluidnost zavisi od strukturnih (neuređenost ugljovodoničnih nizova u lipidnom dvosloju) i

dinamičkih svojstava (brzina kretanja makromolekula) membrana (Owen, 1981). Fluidnost bioloških membrana, pre svega, zavisi od strukture i sadržaja membranskih glicerofosfolipida

i sfingolipida, temperature i prisustva (prirodnih i/ili sintetičkih) amfifilnih supstranci (Cooper, 1977). Zahvaljujući svojoj jedinstvenoj trodimenzionalnoj strukturi, holesterol modulira fluidnost bioloških membrana, pre svega, obrazovanjem kompleksa sa ostacima zasićenih dugolančanih masnih kiselina iz molekula sfingomijelina i fosfatidil-holina (Slotte,

1999). Interkalacija molekula holesterola u membranski dvosloj povećava uređenost pakovanja lipidnih molekula i smanjuje mobilnost ugljovodoničnih lanaca fosfolipida, u

širokom opsegu temperatura (Ohvo-Rekila et al., 2002). Povećani sadržaj holesterola u plazminoj membrani ćelije smanjuje, međutim, njenu pasivnu propustljivost za rastvorene supstance. Stoga su ćelije sisara razvile sofisticirane mehanizme kojima se nivo holesterola u membranama održava unutar uskih granica (Goldstein & Brown, 2001). Višak holesterola iz

plazmine membrane se efikasno vraća u unutrašnjost ćelije, gde može biti signal sa smanjenje ukupnog pula holesterola u ćeliji, ili podleže efluksu u izvanćelijski prostor (Odeljak 2.5.2).

Slika 2.11 Položaj holesterola u fosfolipidnom dvosloju bioloških membrana. Strukturu holesterola karakteriše ravno i glatko α lice, koje sadrži samo aksijalne atome vodonika, što favorizuje van der Waals-ove interakcije sa acil-ostacima zasićenih masnih kiselina fosfolipida, kao i rapavo β lice, od prisustva metil grupa u molekulu, koje interaguje sa acil-ostacima zasićenih masnih kiselina fosfolipida ili sfingolipida, kao i sa transmembranskim domenima integralnih membranskih proteina (iz Paila & Chattopadhyay, 2010).

27

Interakcije između proteina i lipida unutar membrane, kao i relativni sadržaj proteina

u odnosu na ukupne lipide, mogu da modifikuju fluidnost membrana (Chapman et al., 1979). Preko efekta na uređenost pakovanja membranskih fosfolipida, holesterol (indirektno) modulira aktivnost membranskih proteina. Naime, integralni membranski proteini (jonski

kanali, receptori i enzimi) su osetljivi na fizičke promene u lipidnom miljeu koji ih okružuje (Ohvo-Rekila et al., 2002), posebno oni smeštani u membranskim raftovima (Kurzchalia &

Parton, 1999). Holesterol asosovan sa sfingolipidima esencijalna je komponenta ovih membranskih sub-domena, koja su mesta intenzivne signalne aktivnosti (Ohvo-Rekila et al., 2002). Protein kaveolin nađen je u posebnoj grupi lipidnih raftova, nazvanim kaveolama (Fielding & Fielding, 2000). Veći broj (uglavnom perifernih) membranskih proteina iz

kaveola vezuju holesterol i uključeni su, direktno ili indirektno, u održavanje homeostaze holesterola u ćeliji (Schroeder et al., 2010). Zajednička strukturna karakteristika ovih proteina

je da sadrže konzervirane regione u aminokiselinskoj sekvenci, takozvane "sterol-sensing" domene (Odeljak 2.7).

Prisustvo molekula holesterola u biološkim membranama omogućuje, tako, delikatno podešavanje strukture, organizacije i, shodno tome, normalno funkcionisanje bioloških

membrana, bez obzira na promene u spoljašnjem i unutrašnjem okruženju ćelije.

2.5.4 Holesterol i ateroskleroza

Ateroskleroza je oboljenje arterijskih krvnih sudova koje zahvata sva vaskularna korita i karakteriše se zadebljanjem i otvrdnućem zida arterija. Nastaje kao posledica stvaranja ateroma (plaka sačinjenog od lipidnog jezgra okruženog vezivnim tkivom) na mestu povrede endotela krvnog suda. Plakovi nastaju usled akumulacije izvanćelijskih i

unutarćelijskih lipida, infiltracije monocita i makrofaga, formiranja penastih ćelija, proliferacije glatkih mišićnih ćelija i akumulacije vezivno-tkivnih proteina (Schachter, 1997).

Sve ovo može da smanji dotok krvi do vitalnih organa, uključujući srce, mozak i ekstremitete, a zbog smanjenja elastičnosti krvnih sudova povećava se i krvni pritisak. Ishemija nastaje kao posledica pucanja plaka i formiranja tromba, koji može i da potpuno blokira protok krvi na mestu povrede endotela, što uzrokuje embolizam, ili nekrozu (infarkt)

tkiva. Infarkt miokarda izaziva srčani udar, a infarkt moždanog tkiva šlog, ili moždani udar, često sa smrtnim ishodom. Ateroskleroza je tihi ubica: endotel nema inervaciju i zato

aterosklerotski proces ne izaziva bolove i dugo je asimptomatičan (Scott, 2002). Ateroskleroza je izuzetno kompleksno patofiziološko stanje (Slika 2.12). Neki od

najbitnijih faktora rizika su poremećaji u metabolizmu lipida, arterijska hipertenzija, pušenje, gojaznost, dijabetes, starost, porodična anamneza za kardivaskularne bolesti kod rođaka u

prvoj liniji (muškarci mlađi od 55 godina, žene mlađe od 65 godina) i nedovoljna i neredovna fizička aktivnost (Wilson et al., 1988). Novija istraživanja su pokazala da pored navedenih

postoje i netradicionalni faktori rizika, koji obuhvataju povišeni oksidativni stres, disfunkciju endotela krvnog suda, inflamaciju i stres (Hackam & Anand, 2003). Interventne studije

28

pokazuju da se regulacijom promenljivih predisponirajućih faktora rizika značajno smanjuje učestalost kardiovaskularnih oboljenja (Chisolm & Steinberg, 2000). Uobičajeni biomarkeri za procenu rizika su koncentracija ukupnog, HDL- i LDL-holesterola, količnik ukupnog i HDL-holesterola, sadržaj homocisteina, C-reaktivnog proteina i apolipoproteina A1 i B100 u

serumu ispitanika. Smatra se da je najbolji dugoročni prediktor rizika visok odnos ukupnog i HDL-holesterola, te prisustvo malih i gustih LDL čestica u cirkulaciji (Castelli, 1988).

Uprkos tome što u patogenezi ateroskleroze učestvuje veliki broj faktora i dalje se centralna uloga pripisuje poremećajima metabolizma holesterola. Hipoteza lipidne teorije ateroskleroze zasniva se na povećanom nakupljanju i potom akumulaciji LDL čestica u zid krvnog suda, na mestu povrede endotela, uporedo sa njihovom transformacijom u mnogo

aterogeniji, oksidativno modifikovani oblik (Chisolm & Steinberg, 2000). Zbog svoje složene lipidno-proteinske strukture LDL čestice su posebno podložne oksidativnim oštećenjima.

Svaka LDL čestica sadrži oko 700 molekula fosfolipida, 185 molekula triacilglicerola i 1600 molekula estarski vezanog holesterola. PUFA u sastavu ovih lipida, holesterol iz estara holesterola i oko 600 molekula slobodnog holesterola podložni su reakcijama oksidacije. Apolipoprotein B100 u strukturi LDL čestice, sa velikim brojem izloženih ostataka tirozina i

lizina na svojoj površini, može biti direktno oksidovan, ili modifikovan proizvodima oksidacije lipida (Miller et al., 2010). Male i guste LDL čestice su posebno aterogene, s

obzirom da lakše prodiru kroz sloj endotelijalnih ćelija i podložnije su oksidativnoj transformaciji (Hackam & Anand, 2003). Oksidacija LDL čestica u plazmi, ili unutar arterijskog zida, posredovana je dejstvom enzima (lipooksigenaze, mijeloperoksidaze, NADPH oksidaze), jonima metala (Cu2+, Fe2+) i/ili reaktivnim vrstama kiseonika i azota

(Miller et al., 2010). Oksidativno modifikovane LDL čestice postaju ligandi za različite receptore čistače

(SR, engl. Scavenger Receptors) na makrofagima, delom i na endotelnim i glatkomišićnim

ćelijama (Chisolm & Steinberg, 2000). Naime, fagocitne ćelije retikulo-endotelijalnog sistema na svojoj površini imaju receptore čistače koji prepoznaju i vezuju LDL čestice, što

omogućuje da razgrade preostale količine LDL čestica u cirkulaciji. Međutim, za razliku od LDL receptora, receptori čistači ne samo da nisu pod nishodnom regulacijom, već specifično vezuju i unose u ćeliju i modifikovane LDL čestice (Hackam & Anand, 2003). Stoga će se holesterol, u uslovima kada je u plazmi povećana koncentracija LDL-a (hiper-

holesterolemije) i/ili oksidativno modifikovanih LDL čestica, brzo nagomilavati u fagocitima (Miller et al., 2010). Zbog ogromne količine lipidnih kapljica esterifikovanog holesterola u

citosolu makrofagi se pretvaraju u takozvane "penaste" ćelije (engl. foam cells). U zidovima arterija ovo izaziva inflamaciju i aktivaciju imunog odgovora organizma, što na posletku dovodi do obrazovanju aterosklerotskog plaka i eventualno tromba (Slika 2.12). Najnovije studije potrđuju značaj oksisterola kao lipidnih medijatora u procesu aterogeneze, s obzirom

da su oksidativno modifikovani steroli nađeni u aortnom tkivu aterosklerotskog plaka (Brown & Jessup, 1999).

29

Slika 2.12 Shematski prikaz uzroka i mehanizama nastanka ateroskleroze. PUFA, polinezasićene masne kiseline; VLDL, lipoproteini veoma male gustine; LDL, lipoproteini male gustine; HDL, lipoproteini velike gustine; TAG, triacilgliceroli; NEFA, ne-esterifikovane masne kiseline (prema Harwood at al., 2007).

Nizak sadržaj HDL čestica u serumu je nezavistan faktor rizika za nastanak

kardiovaskularnih bolesti. Procenjuje se da u opštoj populaciji oko 35% muškaraca i 15% žena ima nizak HDL-holesterol (WHO document, 2000). Meta analiza četiri velike prospektivne studije pokazala je da porast HDL-holesterola za 1 mg/dL (oko 0,026 mmol/L)

smanjuje rizik od ishemijske bolesti srca za 2% kod muškaraca i 3% kod žena, nezavisno od nivoa LDL-holesterola (Gordon et al., 1977). Osim što omogućava odstranjivanje viškova

holesterola iz perifernih tkiva, u procesu povratnog prenosa holesterola (Schneider, 2002), drugi kardioprotektivni mehanizmi HDL čestica obuhvataju: zaštitu normalne funkcije endotela, antioksidativni, antiinflamatorni i antitrombozni efekat (Stein & Stein, 1999; Assmann & Gotto, 2004; Tall, 2008). Antioksidativna aktivnost potiče od prisustva velike

količine antioksidanasa i antioksidativnih enzima u strukturi čestice. Zaštitna uloga u odnosu na endotel ogleda se u sposobnosti HDL čestica da izazovu povećanje sadržaja endotelne

azot-oksid sintaze i spreče apoptozu endotelnih ćelija. HDL čestice poseduje i profibrinolitičko dejstvo pošto inhibiraju aktivaciju trombocita i koagulaciju. Antiinflamatorna aktivnost se ogleda u suprimiranju ekspresije nekoliko adhezionih molekula i antigena. Novije eksperimentalne studije pokazale su i direktan antiaterogeni efekat apo A1.

Kod bolesnika sa akutnim koronarnim sindromom, intravenska primena rekombinantnog apo A1 Milano dovela je do značajnog smanjenja veličine ateroma (Nissen et al., 2003).

30

2.6 Holesterol u eritrocitima

Krv je specijalizovano tečno vezivno tkivo koje se sastoji iz oformljenih elemenata (eritrocita, leukocita i trombocita) i plazme. U poređenju sa ukupnom zapreminom ekstracelularne tečnosti, zapremina krvi u organizmu čoveka je mala: 70 mL/kg telesne mase. Formirani elementi zauzimaju 37–54% ukupne zapremine krvi, od kojih su eritrociti

najzastupljeniji (99,9% ćelija). Tipično, mililitar krvi sadrži 4,5–6,3 x 109 eritrocita kod muškarca, a kod žena nešto manje: 4,2–5,5 x 109 RBC/mL krvi (Ashton, 2007). Eritrociti su

ćelije bikonkavnog oblika, prečnika oko 7,8 µm, i visine 2,6 µm na najdebljem delu i 0,8 µm u sredini. Ovakav oblik reflektuje odsustvo organela u zrelim eritrocitima i obezbeđuje da ćelija ima veliku površinu u odnosu na zapreminu, što je idealno za razmenu gasova. Bikonkavni oblik omogućuje i da se eritrociti međusobno slepljuju, što olakšava kretanje

ćelija kroz male kapilare i čini eritrocite dovoljno fleksibilnim da prođu kroz kapilare prečnika svega oko 4 µm (Ashton, 2007). Životni vek humanih eritrocita iznosi oko 120 dana.

U krvi čoveka oko 1% eritrocita se zameni svakoga dana, što ukazuje na njihov visok obrt ("turnover"). Eritropoeza kod odraslih ljudi se odvija u koštanoj srži, iz mijeloidnih matičnih ćelija, i stimulisana je eritropoetinom, hormonom bubrega. Ostarele eritrocite iz cirkulacije uklanjaju mononuklearni fagociti u slezini, jetri i koštanoj srži. Smatra se da makrofagi

prepoznaju apoptotske promene u lipidnoj organizaciji plazmine membrane eritrocita (Ashton, 2007).

2.6.1 Holesterol u plazminoj membrani eritrocita

Kao i druge biološke membrane, plazmina membrana eritrocita se sastoji od lipidnog

dvosloja i uronjenih proteina (Darnell et al., 1986). Liziranjem eritrocita u hipotonim rastvorima može da se izoluje nefragmentisana ćelijska membrana, koja se sastoji od 49% proteina, 43% lipida i 8% ugljenih hidrata (Voet & Voet, 2004). Lipidni deo membrane izgrađen je od fosfolipida, sfingolipida, holesterola, glikolipida i fosfatidne kiseline.

Najzastupljeniji fosfolipidi su, kao i kod drugih membrana, nejednako raspoređeni u membranskom dvosloju. Fosfatidil-holin (19,0%) i sfingomijelin (17,5%) dominiraju u

spoljašnjem, a fosfatidil-etanolamin (18% ukupnih lipida) u unutrašnjem delu membrane, dok se fosfatidil-serin (8,5%) isključivo nalazi u unutrašnjem sloju membrane eritrocita čoveka (Op den Kamp, 1981). U membranama bogatim holesterolom, asimetričnu distribuciju membranskih fosfolipida održava aktivnost proteinskih translokaza, specifičnih lipidnih

transportera. Dva takva integralna membranska proteina, aminofosfolipid Mg2+-ATP-azna translokaza i Ca2+-zavisna skramblaza, su izolovana iz humanih eritrocita (Ikeda et al., 2006).

Holesterol je pojedinačno glavna lipidna komponenta plazmine membrane humanih eritrocita (25% ukupnih lipida) i ravnomerno je zastupljen u oba sloja lipidnog dvosloja. Prisustvo raftova, membranskih domena nerastvornih u nejonskim detergentima, nađeno je i u membrani humanih eritrocita (Civenni et al., 1998). Citoskelet eritrocita razlikuje se od

tipičnog citoskeleta u ćelijama sisara pošto formira proteinski "oklop" koji se proteže ispod celokupne membrane i sa njom je povezan na mnogim mestima (Slika 2.13). Ovo omogućuje

31

ćeliji da bude jaka i fleksibilna (Voet & Voet, 2004). Citosolna površina membrane eritrocita sadrži veliki broj vezivnih mesta za molekule hemoglobina: anjonski kanal (traka 3), integralni transmembranski protein, specifično vezuje hemoglobin sa visokim afinitetom, dok se hemoglobin slabije (elektrostatičkim interakcijama) vezuje za fosfatidil-serin (Shviro et al.,

1982).

Slika 2.13 Model membrane humanih eritrocita (modifikovano sa: http://course1.winona.edu/sberg/ILLUST/memb-mod.jpg).

Veći broj in vitro i in vivo studija je pokazao da je holesterol u membrani eritrocita u

dinamičkoj ravnoteži sa holesterolom iz lipoproteina plazme, moguće i sa holesterolom iz

endotela arterija (Chung, 1998). Holesterol iz membrane eritrocita isključivo se izmenjuje sa slobodnim holesterolom iz lipoproteina plazme (Hagerman & Gould, 1951) i sam proces ne

zahteva utrošak energije (Murphy, 1962). Usled stalne razmene, sastav lipida u eritrocitima, posebno masnih kiselina u sastavu membranskih (fosfo)lipida, sličan je onom u plazmi (Cooper, 1977). Praktično sav holesterol iz membrane eritrocita je dostupan za razmenu, pošto i do 80% molekula može da pređe u lipoproteine plazme sa smanjenim sadržajem

slobodnog holesterola u njima (Gottlieb, 1978). Kroz procese ravnotežne raspodele, eritrociti mogu da usvajaju višak holesterola iz lipoproteina plazme. "Spur-cell" anemiju, čestu kod

osoba sa cirozom jetre, karakteriše značajno veći sadržaj holesterola u membrani eritrocita (25–65%), uz nepromenjen sadržaj fosfolipida (Cooper et al., 1972). Ovo povećava molski odnos holesterola i fosfolipida (Ch/PL) u membrani eritrocita, sa fiziološke vrednosti od oko 0,9, na vrednosti veće i od 1,6, što dovodi do ireverzibilnih promena u morfologiji eritrocita

koji poprimaju šiljat ("spiculated") oblik, imaju smanjenu deformabilnost i skraćeni životni vek (Cooper et al., 1975). I normalni eritrociti mogu da poprime karakteristike "spur" ćelija,

ukoliko se prenesu u plazmu pacijenata sa "spur-cell" anemijom (Allen & Manning, 1996). Post-prandijalna i plazma našte, u prisustvu aktivnih LCAT i CETP, može da usvoji

značajne količine holesterola iz membrane humanih eritrocita (Chung, 1998). Svi lipoproteini u plazmi mogu da prihvate esterifikovane molekule membranskog holesterola, što ukazuje da

32

lipoproteini deluju kao "odlivnik" za višak holesterola iz eritrocita (Atger et al., 1997). Oko 35% holesterola iz membrane eritrocita može biti akumulirano od strane lipoproteina iz sveže plazme (Murphy, 1962). Efluks holesterola iz membrane eritrocita u plazmu izgleda da je moguć jedino putem nespecifične difuzije molekula holesterola kroz vodenu fazu, pri čemu

brzina efluksa zavisi od sadržaja holesterola u kompartmentima uključenim u razmenu i aktivnosti LCAT (Yancey et al., 2003; Czarnecka & Yokoyama, 1996). Zbog toga se, u in

vitro uslovima, intenzitet i smer efluksa holesterola iz eritrocita u krvnu plazmu može lako menjati promenom količine ćelija u inkubacionoj smeši (Chung, 1998).

Iako je razmena molekula holesterola i fosfolipida između lipoproteina plazme i eritrocita veoma intenzivna fiziološki značaj ovih procesa nije u potpunosti razjašnjen

(Cooper, 1977). Lipidi iz membrane eritrocita jedan su od glavnih rezervoara lipida u cirkulaciji (Mindham & Mayes, 1991). Razmena holesterola između eritrocita i lipoproteina

plazme mnogo je intenzivnija nego što je to slučaj sa razmenom holesterola u slezini, plućima, srcu, mišićima, bubrezima i mozgu (Avigan et al., 1962). Pokazano je da se holesterol akumulira u ograničenom broju organa kod pacijenata sa LCAT deficijencijom i da su eritrociti jedno od glavnih mesta u organizmu gde se ovaj proces dešava (Glomset, 1983;

Simon & Scheig, 1970). 2.6.2 Sadržaj holesterola u eritrocitima

Za razliku od holesterola u plazmi koji se rutinski određuje u kliničkoj praksi, analiza

ukupnog sadržaja holesterola u eritrocitima mnogo se ređe radi. Koncentracija holesterola u eritrocitima određuje se u ekstraktu ukupnih lipida primenom uobičajenih hemijskih metoda (Huang et al., 1961), ili primenom komercijalnih enzimskih testova. Za ekstrakciju lipida iz hemolizovanih eritrocita najčešće se koristi jedan od tri postupka: po Folch-u i saradnicima

(1957), Reed-u i saradnicima (1960), ili Rose-u i Oklander-u (1965). U svim radovima autori eksplicitno (na primer Cooper et al., 1978), ili implicitno (na primer Owen & McIntyre,

1978) polaze od pretpostavke da se holesterol u eritrocitima isključivo nalazi u plazminoj membrani. U tabeli 2.6 sumirane su vrednosti za sadržaj holesterola i ukupnih fosfolipida u eritrocitima iz ovih studija.

Iz tabele 2.6 se vidi da se koncentracija holesterola u humanim eritrocitima kreće u

širokom intervalu srednjih vrednosti (2,0–4,3 mmol Ch/L RBC), pri čemu je u većini studija koncentracija holesterola ispod 4,0 mmol Ch/L RBC. Visoke koncentracije holesterola su

praćene i odgovarajuće visokim koncentracijama ukupnih fosfolipida (2,2–4,9 mmol PL/L RBC), dok je Ch/PL odnos u svim studijama sličan: od 0,76 (Cignarelli et al., 1983) do 0,95 (Prisco et al., 1991). Samo u dve studije (Prisco et al., 1991; Zailaie et al., 2003) sadržaj holesterola i fosfolipida u eritrocitima je izuzetno nizak (oko 2,0 mmol Ch/L RBC i oko 2,2

mmol PL/L RBC) i znatno odstupa od vrednosti nađenih u svim ostalim studijama (Tabela 2.6). Međutim, važno je istaći da samo vrednosti iz ovih studija (približno) odgovaraju

literaturnim vrednostima za sadržaj holesterola koji se navodi da se nalazi u izolovanoj membrani humanih eritrocita: 2,2–2,5 mmol Ch/L RBC (na primer Dodge et al., 1963).

33

Tabela 2.6 Literaturne vrednosti za sadržaj holesterola i ukupnih fosfolipida u eritrocitima čoveka.

Holesterol

(mmol/L RBC) Ukupni fosfolipidi

(mmol/L RBC) Referenca:

3,54 ± 0,10 4,42 ± 0,21 Reed et al., 1960 3,08 ± 0,22 3,77 ± 0,25 Farquhar & Ahrens, 1963 3,71 ± 0,19 4,54 ± 0,34 Ways et al., 1963 4,21 ± 0,22 4,86 ± 0,14 Cooper, 1969 3,42 − 4,53 4,58 − 5,19 Bagdade & Ways, 1970 4,24 ± 0,13 4,81 ± 0,19 Cooper & Gulbrandsen, 1971 3,60 ± 0,48 4,00 ± 0,45 Gottfried & Robertson, 1974 3,30 ± 0,23 3,86 ± 0,25 Owen & McInture, 1978 3,00 ± 0,20 4,00 ± 0,30 Cignarelli et al., 1983 1,97 ± 0,24 2,17 ± 0,13 Prisco et al., 1991 3,00 ± 0,29 3,48 ± 0,26 Lijnen & Petrov, 1995 2,13 ± 0,07 2,19 ± 0,11 Zailaie et al., 2003

2.7 Holesterol-vezujući proteini

U humanim tkivima je nađen veći broj proteina koji specifično vezuju holesterol. To su na primer: apo A1, StAR familija steroidogenih regulatornih proteina (engl. Steroidogenic Acute Regulatory Proteins), periferni tip benzodiazepinskog receptora (PBR), NPC2 (engl.

Protein Deficient in Niemann-Pick type C2 disease), citohrom P450c26/25, sterol transportni protein-2, holesterol 7-mono-oksigenaza, holesterol oksidaza, holesterol esteraza i ACAT

(Epand, 2006). Vezivanje holesterola za navedene proteine ima esencijalnu ulogu u održanju homeostaze holesterola u ćeliji, kroz regulaciju procesa biosinteze, transporta i raspodele holesterola unutar ćelije, a utiče i na uvijanje i stabilnost sterol-vezujućih proteina i/ili njihovu lokalizaciju u ćeliji (Epand, 2006).

Strukturni motivi za vezivanje holesterola u sterol-vezujućim proteinima obuhvataju: (1) tunel ili šupljinu u koju se vezuje holesterol, (2) evolutivno konzervirani START domen,

(3) "sterol-sensing domen" (SSD), (4) holesterol prepoznajuću aminokiselinsku konsenzus sekvencu (CRAC, engl. Cholesterol Recognition Amino acid Consensus) i (5) holesterol konsenzus motiv (CCM, engl. Cholesterol Consensus Motif). Međutim, treba naglasiti da veći broj proteina koji specifično interaguju sa holesterolom ne sadrže ni jedan od gore

navedenih motiva (Gimpl, 2010). Tunel ili šupljina u koju se vezuje holesterol predstavlja hidrofobni "džep" koji je

često pokriven "poklopcem" i ispunjen mrežom molekula vode (Natarajan et al., 2004). Nađeni su kod apolipoproteina A1 (Natarajan et al., 2004), enzima i drugih proteina, na primer NPC2 (Xu et al., 2007). Ovi proteini mogu da vežu jedan molekul holesterola sa (relativno) visokim afinitetom.

START proteini predstavljaju superfamiliju proteina koji vezuju hidrofobne ligande i sadrže ligand-vezujući domen od oko 210 aminokiselina. Proteini sa START domenom

34

nađeni su u citosolu, pričvršćeni za membranu, ili u jedru ćelija sisara. Kod čoveka, START domeni su nađeni kod 15 proteina (StARD1-StARD15), podeljenih u 6 familija (Alpy & Tomasetto, 2005). Pet od njih specifično vezuju holesterol: StAR, MLN-64 (StARD3), StARD4, StARD5 i StARD6 (Lavigne et al., 2010).

SSD se nalazi kod transmembranskih proteina kao što su SCAP, HMG-CoA reduktaza, ili NPC1 i sastoji se od pet transmembranskih heliksa, samo delimično

konzervirane strukture (Kuwabara & Labouesse, 2002). Njegova uobičajena, iako ne i univerzalna strukturna karakteristika je prisustvo sekvence YIYF u C-terminalnom delu poslednjeg transmembranskog segmenta. U nekim proteinima YIYF je deo CRAC domena (Epand, 2006).

CRAC motiv je prvi put identifikovan kao holesterol vezujući motiv u C-terminalnom delu poslednjeg trans-membranskog heliksa PBR (Li et al., 2001). Konsenzus sekvencu

obrazuje: (a) ostatak neutralne i nepolarne aminokiseline, leucina ili valina; (b) ostatak neutralne i polarne aminokiseline, tirozina i (c) bazni aminokiselinski ostatak arginina ili lizina. Jedan do pet različitih (bilo kojih) aminokiselinskih ostataka umetnut je između ova tri aminokiselinska ostatka za koje se smatra da interaguju sa holesterolom: ~L/V–(X)1-5–Y-

(X)1-5–R/K~ (Li & Papadopoulos, 1998). U tabeli 2.7 navedeni su primeri CRAC sekvenci u holesterol vezujućim proteinima.

Holesterol konsenzus motiv je opisan u kristalnoj strukturi β2-adrenergičnog receptora (Hanson et al., 2008) i u još oko 40 membranskih receptora kuplovanih sa G-proteinima, na primer kod receptora koji vеzuju oksitocin i serotonin (Gimpl, 2010). Dva molekula holesterola su nađena u vezivnom mestu receptora koje obrazuju segmenti

transmembranskih heliksa 1-4. Prema Ballesteros-Weinstein-ovoj nomenklaturi za obeležavanje aminokiselina u transmembranskim heliksima definisan je sledeći CCM: [4,39-

4,43(R,K)]–[4,50(W,Y)]–[4,46(I,V,L)]–[2,41(F,Y)] (Gimpl, 2010).

Tabela 2.7 Primeri CRAC sekvenci u holesterol vezujućim proteinima (Li & Papadopoulos, 1998; Epand, 2006).

Protein CRAC motiv*

PBR čoveka 147-ATTLNYCVWRDN P450scc čoveka 86-PWVAYHQYYQRPIG Apo A1 miša 207-NPTLNEYHTRAK Kaveolin čoveka 91-TFTVTKYWFYRLL Hh čoveka 247-GAKKVFYVIETREP StAR miša 5-KLCAGSSYRHMRNG Holesterol oksidaza strept. 417-ETWVSLYLAITKNP Aneksin II pacova 144-RVYKEMYKTDLEKD Lipaza aktivirana solima žučnih kiselina čoveka 222-SLQTLSPYNKGLIRRI Holesterol 7α-monooksigenaza miša 166-WVTEGMYAFCYRVM P450c26/25 pacova 422-QFVLCTYVVSRDP ACAT zeca 93-STLVVDYIDEGRLV

* Boldom su obeležena tri aminokiselinska ostatka esencijalna za vezivanje holesterola.

35

Najveći broj proteina koji specifično vezuju holesterol su nerastvorni u vodi, ili ne

kristališu sa holesterolom kao svojim prirodnim ligandom, što otežava određivanje njihove 3-D strukture i prirode interakcija sa holesterolom. Do sada je određena kristalna struktura tri proteina sa START domenom koji specifično vezuju holesterol (StARD3-5). Zajedničko za

ove proteine je prisustvo konzervirane α/β "heliks-grip" strukture, kao i prisustvo unutrašnje šupljine dovoljno velike da prihvati hidrofobni ligand (Lavigne et al., 2010). U StARD3

proteinu (Slika 2.14), centralna antiparalelna β-nabrana pločica je okružena N-terminalnim i C-terminalnim α-heliksima (α1 i α4), a potonji heliks je spakovan iznad izvijene β-nabrane pločice od devet segmenata (Iyer et al, 2001). Dve omega petlje su umetnute između segmenata β5 i β6 (Ω1) i segmenata β7 i β8 (Ω2). Trodimenzionalna organizacija domena

gradi unutrašnji tunel. Izvijena β-nabrana pločica, tri α-heliksa (α2, α3, α4) i jedna petlja (Ω1) grade zid hidrofobnog tunela koji je dovoljnih dimenzija da prihvati jedan molekul

holesterola (Slika 2.14). Smatra se da konformaciono fleksibilni heliks u C-terminalnom delu StARD3 kontroliše pristup i vezivanje molekula holesterola (Alpy & Tomasetto, 2005).

Slika 2.14 Model strukture START domena u StARD3 proteinu (levo) na kojoj se vidi karakteristično α/β "heliks-grip" uvijanje polipeptidnog niza (iz Alpy & Tomasetto, 2005). Molekul holesterola vezan u šupljinu unutar domena (desno) (iz Lavigne et al., 2010).

Vezivanja holesterola za StARD3 i StAR proteine prikazano je detaljnije na slici 2.15.

Smatra se da je za vezivanje holesterola ključno prisustvo konzerviranog sonog mosta između kiselog aminokiselinskog ostatka u β-segmentu 5 i ostatka Arg u β-segmentu 6, pri dnu

vezivnog mesta, kao i da hidroksilna grupa holesterola specifično interaguje sa guanidino grupom konzerviranog ostatka Arg, pri čemu oblik šupljine gotovo idealno odgovara 3-D strukturi molekula holesterola (Lavigne et al., 2010).

Navešćemo i primer humanog NPC2 proteina koji vezuje dihidroergosterol,

fluorescentni analog holesterola, sa mikromolarnim afinitetom i stehiometrijom 1:1 (mol/mol), na neutralnom i kiselom pH (Ko et al., 2003). Za razliku od drugih sterol-

vezujućih proteina, iz kristalne strukture NPC2 proizilazi da protein ne sadrži (pre-oformljenu) dovoljno veliku šupljinu, tunel, ili površinski džep u koji bi mogao da se smesti

36

holesterol (Friedland et al., 2003). Studije mutageneze ubedljivo pokazuju da se holesterol (ipak) vezuje u hidrofobnu unutrašnjost proteina, za šta su izgleda esencijalni kontakti holesterola sa ostatkom Val i još dva aromatična aminokiselinska ostatka: Phe i Tyr (Slika 2.16). Humani NPC2 od sekundarnih struktura sadrži samo β-pločice (Friedland et al., 2003).

Proteini ovakve sekundarne strukture najčešće imaju imunoglobulinima-sličan tip uvijanja, sa "labavo" spakovanim hidrofobnim jezgrom, čija hidrofobna šupljina mora da se proširi da bi

primila molekul holesterola. Stoga se smatra da je konformaciona promena u molekulu NPC2 preduslov da bi molekul holesterola uopšte mogao da se veže (Friedland et al., 2003).

Slika 2.15 Vezivno mesto za holesterol u StAR proteinu (iz Mathieu et al., 2002). Obratiti pažnju na konzervirani soni most između ostatka Glu i Arg, kao i na vodoničnu vezu između hidroksilne grupe holesterola i guanidino grupe Arg (Murcia et al., 2006).

Slika 2.16 Predložena struktura vezivnog mesta za holesterol u NPC2 proteinu: crvenom bojom su obeleženi bočni ostaci (Phe66, Val96 i Tyr100) za koje je pokazano da su esencijalni za vezivanje holesterola (Ko et al., 2003).

37

2.8 Interakcije hemoglobina sa malim molekulima

Dobro je poznato da reaktivni molekuli koji su duže vremena prisutni u cirkulaciji i mogu da prođu kroz membranu eritrocita mogu da reaguju sa određenim bočnim aminokiselinskim ostacima u molekulu hemoglobina (Harding, 1985). Od ovih primera

najpoznatiji je glikozilovani hemoglobin kod kojeg se molekul glukoze vezuje za N-terminalnu amino grupu u β-nizu molekula hemoglobina (Bunn et al., 1979). Ove

modifikacije mogu da izazovu strukturne promene u molekulu hemoglobina i da izazovu promene u njegovoj aktivnosti (Harding, 1985).

Pored kovalentnog vezivanja, mali molekuli mogu i da interaguju sa molekulom hemoglobina, što takođe može da utiče na strukturna i funkcionalna svojstva hemoglobina.

Tako je na primer pokazano da jedinjenja hidroksilamina i supstituisani derivati fenola izazivaju oksidaciju oksihemoglobina do methemoglobina, što je praćeno oksidativnim

stresom u eritrocitima i njihovom povećanom hemolizom (Nohl & Stolze, 1998). Pomenućemo i nedavno objavljene radove u kojima je pokazano primenom spektroskopskih metoda da neki antipsihotici interaguju sa molekulom hemoglobina, što dovodi do konformacionih promena u molekulu hemoglobina (Chakraborti 2003; Kar et al., 2006;

Maitra, 2007). Detaljna strukturna ispitivanja vezivanja određenih supstanci različite hemijske strukture, od kojih su neke i lekovi, za molekul hemoglobina primenom rengenske

strukturne analize opisana su samo u jednom radu (Perutz et al., 1986). Prikazaćemo ukratko najvažnije rezultate ove izvanredne studije.

U ovom radu je određena detaljna kristalna struktura kompleksa ispitivanih supstanci (Slika 2.17) sa dezoksihemoglobinom. Za ova ispitivanja izabran je antihiper-lipoproteinski

lek, bezafibrat (I), diuretik, etakrinska kiselina (II), peptid, sukcinil-L-triptofan-L-triptofan (III) i p-bromobenziloksi sirćetna kiselina (IV). Na slici 2.18 obeležili smo mesta vezivanja

ovih supstanci na dobro poznatom modelu molekula dezoksihemoglobina.

I - Bezafibrat (BZF)

II - Etakrinska kiselina (ECA)

III - Sukcinil-L-triptofan-L-triptofan (STT)

IV - p-bromobenziloksi sirćetna kiselina (BBA)

Slika 2.17 Strukture ispitivanih jedinjenja (I–IV) (iz Perutz et al., 1986).

38

Slika 2.18 Mesta vezivanja supstanci I–IV sa slike 2.18 na molekulu dezoksihemoglobina (na osnovu Perutz et al., 1986).

BZF (I) se vezuje van der Waals-ovim interakcijama za najmanje devet

aminokiselinskih ostataka iz centralne šupljine molekula hemoglobina, gradeći kontakte sa jednom β- i dve α-subjedinice. Interakcije su uglavnom nepolarne prirode, bez formiranja

(jačih) vodoničnih veza koje bi čvršće vezivale molekul leka za molekul hemoglobina. Analizom kristalne strukture pokazano je da ECA (II) reaguje sa oba ostatka Cys u položaju β-93, kao i sa oba ostatka His u položaju β-117, što je praćeno nizom polarnih i nepolarnih interakcija između molekula ECA i hemoglobina. Tako, kod molekula ECA koji je

kovalentno vezan za His nađeno je da karboksilna grupa gradi soni most sa ε-amino grupom ostatka lizina u položaju α-14 susednog polipeptidnog niza, dok karbonilni kiseonik gradi

vodoničnu vezu sa NH- grupom iz Asn β-19, na rastojanju od 2,8 Å. STT (III) se vezuje za centralnu šupljinu molekula hemoglobina između dve α subjedinice, uglavnom vodoničnim vezama sa polarnim grupama globina, dok van der Waals-ove interakcije povezuju indolova jezgra u strukturi leka sa susednim ostacima aminokiselina. Vezivno mesto za BBA (IV)

nalazi se u unutrašnjosti α lanca molekula dezoksihemoglobina, unutar šupljine koju obrazuju nehelikoidni CD segment i B heliks. Karboksilna grupa leka obrazuje soni most sa ostatkom

Lys na poziciji α-40, koji izgleda da usmerava lek u svoje mesto vezivanja. Autori na kraju rada zaključuju da ispitivani molekuli "traže" udubljenja u

proteinskom delu molekula hemoglobina, te da je stereohemija vezivanja određena van der Waals-ovim prostorom i maksimalnim elektrostatičkim interakcijama, kao i hidrofobnim

efektom. Istaknut je i značaj vodoničnog vezivanja (Perutz et al., 1986). Interesantno je da su mesta vezivanja ispitivanih supstanci za molekul hemoglobina krajnje različita i da se ne

39

podudaraju niti sa aktivnim mestom na hemu, niti sa mestom vezivanja 2,3-difosfoglicerata, prirodnog alosternog modulatora hemoglobina.

Paralelno sa ispitivanjem strukture u nezavisnim eksperimentima je ispitivan i efekat navedenih supstanci na afinitet hemoglobina za kiseonik. Utvrđeno je da ECA povećava, dok

BZF i STT smanjuju afinitet hemoglobina za kiseonik. STT može da se veže jedino za T (dezoksi) oblik hemoglobina, pošto se prelaskom molekula u R (oksi) oblik centralna šupljina

smanjuje i molekul STT-a ne može više u nju da se smesti (Perutz et al., 1986). Na kraju ovog kratkog pregleda ćemo spomenuti i rezultate elektroforetske i NMR

studije vezivanja antiepileptika fenobarbitala (PB) i oksihemoglobina iz naše laboratorije (Niketić et al., 1994). Elektroforetska ispitivanja su pokazala da se pKa vrednost

hemoglobina u prisustvu PB-a smanjuje sa 7,0 na 6,8. Ovo je u skladu sa rezultatima NMR ispitivanja koja su pokazala da se PB vezuje u blizini C-terminala oksihemoglobina gradeći

vodonične veze sa ostacima His β-2 i terminalnom β-NH2 grupom. Ovo dovodi do smanjenja pKa vrednosti β-NH2 grupe i objašnjava zapaženo povećano ne-enzimsko glikozilovanje hemoglobina u prisustvu PB in vivo i in vitro (Niketić et al., 1994) . 2.9 Specifičnosti sistema antioksidativne zaštite u eritrocitima čoveka

Zbog svojih strukturnih i funkcionalnih karakteristika, pre svega visokog sadržaja kiseonika, polinezasićenih masnih kiselina u sastavu membranskih lipida, kao i Fe2+ jona u

strukturi hemoglobina, humani eritrociti su izloženi oksidativnom stresu (Clemens & Waller, 1987; Cimen, 2008). Eritrociti su zato razvili potentan antioksidativni zaštitni sistem koji čini skup enzima i jedinjenja male molekulske mase, sa ciljem da spreče lančane reakcije oksidacije i oštećenja makromolekula, inicirane reaktivnim vrstama nastalih od molekulskog

kiseonika (Halliwell & Gutteridge, 2007). Glavni izvor reaktivnih vrsta kiseonika u eritrocima je auto-oksidacija oksi-

hemoglobina (Hb) do met-hemoglobina (MetHb), uz oslobađanje superoksid anjon radikala (Rifkind et al., 2003; Winterbourn, 1983). Superoksid anjon radikal se dismutuje aktivnošću CuZn superoksid dismutaze (SOD1; EC 1.15.1.1), pri čemu se nastali vodonik peroksid razlaže dejstvom katalaze (CAT; EC 1.11.1.6), ili redukuje pomoću Se-zavisne glutation

peroksidaze (GSH-Px; EC 1.11.1.9) do vode, mehanizmom zavisnim od redukovanog glutationa (GSH). Ovi enzimi, zajedno sa glutation reduktazom (GSH-R; EC 1.6.4.2),

održavaju visoku koncentraciju redukovanog glutationa u eritrocitima (Cimen, 2008). Sadržaj dijetarnih antioksidanasa u eritrocitima čoveka veoma je visok (Gabbianelli et

al., 1998). Glutation i tokoferoli mogu da spreče oksidaciju gvožđa u hemu i sulfhidrilnih grupa u molekulu hemoglobina i u plazminoj membrani eritrocita (Richards et al., 1998).

Posedujući i sam antioksidativnu aktivnost i hemoglobin doprinosi zaštiti od oksidativnih oštećenja eritrocita (Gabbianelli et al., 1998).

Plazmina membrana dodatno štiti hemoglobin unutar eritrocita od izvora oksidativnog stresa izvan ćelija (Lenfant et al., 2005). Dvostruke veze u acil-lancima fosfolipida i sfingolipida u plazminoj membrani podložne su oksidativnim modifikacijama. Iako u

40

eritrocitima nema de novo sinteze lipida, ćelije poseduju efikasan sistem za popravku, deacilacijom oksidovanih ostataka masnih kiselina, uz brzu i selektivnu reacilaciju lizo-fosfolipida, molekulom masne kiseline iz plazme. Na ovaj način, sastav masnih kiselina u plazminoj membrani eritrocita ostaje relativno sličan tokom životnog veka ćelije. Supstratni

pul masnih kiselina određen je unosom masnih kiselina ishranom (Kuypers, 2007). Iako mehanizam nije u potpunosti razjašnjen, smatra se da acil-CoA vezujući enzimi iz citosola

eritrocita regulišu aktivnost enzima uključenih u proces reparacije oksidativno modifikovanih lipida (Fyrst et al., 1995). S obzirom da eritrociti ne mogu da zamene proteine ireverzibilno ostećene dejstvom reaktivnih vrsta oksidativni stres uzima svoj danak u relativno kratkom životnom veku eritrocita u cirkulaciji (Cimen, 2008).

Zbog svoje izuzetne reaktivnosti i nestabilnosti direktno određivanje koncentracije slobodno-radikalskih vrsta u ćelijama i tkivima nije moguće. Indirektno, stepen oksidativnog

stresa može da se proceni na osnovu uvida u stanje antioksidativne odbrane organizma, određivanjem neke od njegovih komponenti u krvi (Cimen, 2008). Merenje aktivnosti enzima antioksidativne odbrane u eritrocitima (CuZn SOD, CAT, GSH-Px i GSH-R), uz određivanje koncentracije GSH i vitamina C i E u krvnoj plazmi, pruža relativno pouzdane podatke o

statusu antioksidativne zaštite u organizmu čoveka (Lenfant et al., 2005). Pri tome treba imati u vidu da se aktivnost CuZn SOD značajno smanjuje sa godinama života, a da je aktivnost

GSH-Px pod uticajem štetnih životnih navika i faktora spoljašnje sredine (Andersen, 1997).