04/10/23 1

Materi 6

(High Performance Liquid Chromatography)

High Price Liquid Chromatography

KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)

04/10/23 2

Hampir 20 % senyawa yang diketahui tidak dapat dianalisis dengan Kromatografi Gas dengan berbagai alasan antara lain;

• Tidak mudah menguap (insufficiently volatile)

• Tidak dapat melewati kolom

• Tidak tahan panas (Thermally unstable)

• Terurai dalam kondisi saat pemisahan dengan GC.

HPLC tidak terbatas untuk senyawa yang mudah menguap, tetapi juga mampu memisahkan makromolekul dan jenis-jenis ion, senyawa alami yang labil, material polimer, dan berbagai senyawa dengan BM besar yang mempunyai banyak gugus fungsi dan dapat digabungkan dengan Spektrofotometer Infra Red (IR) dan Spektrometri Massa (MS)

.

04/10/23 3

Teori HPLC

Pemisahan komponen campuran berdasarkan pada distribusi kesetimbangan (K) dari komponen di dalam kedua fasa.

K =Cs

CmCs = Konsentrasi komponen dalam fasa diam

Cm = Konsentrasi komponen dalam fasa gerak

Variabel yang mempengaruhi perbedaan migrasi adalah’

1. Kompetisi fasa gerak

2. Temperatur

3. Jenis fasa diam

04/10/23 4

Volume retensi dan waktu merupakan ukuran yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi puncak pada kromatogram.

Waktu retensi (Tr) adalah waktu yang diperlukan untuk mengelusi oleh suatu zat/bahan yang sampai pada konsentrsi maksimum. Waktu retensi merupakan suatu fungsi dari kecepatan fasa gerak dan volume fasa gerak. Sedang volume retensi adalah volume fasa gerak puncak komponen tersebut sampai tepat diujung kolom.

VR = F x TrVR = Volume retensi

Tr = Volume alir (flow rate)gerak fasa

04/10/23 5

Sistem HPLC1. Isokratik (ratio fasa gerak dicampur diluar sistem)

2. Gradient (ratio fasa gerak diatur melalui sistem dengan bantuan mikroprosesor)

3. Recycling (isokratik dan gradient fasa gerak kembali kedalam sistim)

Waktu Retensi

Ratio Pelarut

B 100 %

A 0 Waktu RetensiA 0

Ratio Pelarut

B 100 %

04/10/23 6

Rangkaian Dasar HPLC

PompaWadah fasa

gerak

Injektor

KolomDetektor

Wadah Pembuangan

Rekorder atau data prosesor

04/10/23 7

Wadah fasa gerak1. Tunggal (isokratik)

2. Lebih dari satu (gradient)

1. Piston tunggal

2. Piston ganda

1. 50 – 100 L (analitik)

2. 500 L - 5 ml (preparatif)

Pompa

Injektor

Kolom

1. Prekolom

2. Standard

3. Radial Compression

4. Narrow Bore

5. Short

Detektor

1. RI (refractive Index)

2. UV-Vis

3. Flourescence

4. PDA (Photo Diode Array)

5. Amperometric

04/10/23 8

Jenis-jenis kolom HPLC

N0 Nama kolom Jenis adsorban

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Ultrasil-Si

Ultrasil-octyl

Ultrasil-ODS

LiChrosorb Si

LiChrosorb RP-2

LiChrosorb RP-8

LiChrosorb RP-18

LiChrosorb NH2

LiChrosorb CN

SiO2 (silika)

Octana (C8)

Octadecana (C-18)

SiO2 (silika)

Etana (C-2)

Octana (C8)

Octadecana (C-18)

Amina

Cyano

04/10/23 9

Mekanisme pemisahan pada HPLC

Fasa gerak

Fasa diam

Kolom

Fasa gerak ke detektor

Waktu retensi (min)

Sampel A dan B

Sinyal pada rekorder

A dan B mulai terpisah

BA

04/10/23 10

Syarat fasa gerak (pelarut/elusi) HPLC

Inner Tidak bereaksi baik dengan bahan kolom dan senyawa yang akan dipisahkan

Harus p.a (pro analysis) atau HPLC grade Mempunyai viskositas yang rendah Homogenous dengan pelarut lainnya Tidak mempunyai pengaruh terhadap sistem

detektor Tidak korosif Tidak explosif baik akibat pemanasan maupun

tekanan

04/10/23 11

Macam-macam tampilan puncak senyawa pada kromatogram

1. Tajam (sharp)

2. Kembar (twin)

3. Berbahu (Shoulder)

4. Melebar (slope)

04/10/23 12

Tampilan puncak pada kromatogram pada HPLC tidak selalu sebagaimana yang diharapkan yaitu segi tiga sama kaki, bentuk puncak yang asimetri umum dijumpai. Hal ini terjadi sampel yang diinjeksikan lebih besar dari kapasitas daya migrasi partikel kolom. Misalkan kemampuan daya migrasi partikel kolom 0,1 mg/g, sedangkan sampel yang diinjeksikan 1 mg/g, sehingga puncak memberikan kenaikan yang tajam pada permulaan dan kemudian melebar.

h

Axis waktu

ba10 % h

AF = b/a = 1

Axis waktu

h

a b10 % h

AF = b/a = 2

AF = asimetri faktor

04/10/23 13

Kolom selektifitas, efesiensi, ratio pemisahan

Selektifitas cukup, tetapi efesiensi rendah

Selektifitas dan efesiensi baik

Selektifitas rendah, tetapi efesiensi baik

04/10/23 14

Cara-cara mengatasi permasalah pemisahan/migrasi senyawa pada HPLC

1. Mengatur kecepatan alir (flow rate) atau menaikan dan menurunkan kecepatan alir fasa gerak.

2. Merubah perbandingan (ratio) fasa gerak atau merubah kepolar fasa gerak.

3. Menaikan atau menurunkan temperatur kolom.

4. Membuat turunan (derivat) senyawa yang dipisahkan.

4. Menambah panjang kolom (double column)

04/10/23 15

Kalkulasi hasil kromatogram HPLC

Di dasarkan pada perbandingan luas area puncak yang dihasil antara cuplikan (sampel) dan kontrol (standard).

1. Luas segi tiga sama kaki (alas x 1/2 tinggi)

2. Garis regresi linier

04/10/23 16

Keuntungan-keuntungan melakukan analisa dengan HPLC

a. Cepat (waktu analisis kurang dari 1 jam)

b. Daya pisahnya (migrasi) baik

c. Peka, detektor spesifik (UV-Vis dan Flourescence dapat mendeteksi sampai jumlah g)

d. Kolom dapat dipakai kembali

e. Ideal untuk molekul besar, ion yang tidak bisa dengan GC

f. Mudah memperoleh kembali cuplikan (sampel)