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EXPRESSION OF HETEROLOGOUSEXPRESSION OF HETEROLOGOUS
GENE CLUSTERS: GENE CLUSTERS:
ACTIVATION BYACTIVATION BY
PROMOTER-GENERATING PROMOTER-GENERATING
MUTATIONSMUTATIONS
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
APPROCCIO DI TIPO SPERIMENTALEAPPROCCIO DI TIPO SPERIMENTALE
Studio in vivo di acquisizione di nuove abilità metaboliche
Popolazione microbica sottoposta a pressione selettiva
Esperimenti di Esperimenti di EVOLUZIONE GUIDATAEVOLUZIONE GUIDATA
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Selective pressure: request of functions X and Y
y
x
x
x
x
y
y
y
x
x
y
y ?ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
xy
xy
xy
xy
xy
y
x
xy
xyxy
xy
y
xx
xx
y
yy
x
Selective pressure: request of functions X and Y
Modification of pre-existinggenetic information
activation of cryptic or silent genes
selection of mutations in regulatory or structural genesSurviving of XY cells
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
xy
xy
xy
xy
xy
y
x
xy
xyxy
Selective pressure: request of functions X and Y
Horizontal gene transfer(XENOLOGY) Surviving of XY cells
y
xx
x
x
y
y
x
x y
xx
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
In principle, the gene flow might be limited by the barriersto heterologus gene expression
In In principleprinciple, , the the gene gene flow flow might be limited might be limited by by the barriersthe barriersto heterologus to heterologus gene gene expressionexpression
This persistence is dependent on the expression of transferred genes
ThisThis persistencepersistence isis dependent on dependent on the expressionthe expression of transferred genesof transferred genes
For horizontal transfer to be successful, donated genes mustpersist in the recipient organism
ForFor horizontalhorizontal transfer transfer toto bebe successfulsuccessful,, donated genes mustdonated genes mustpersistpersist in in the recipient organismthe recipient organism
The introgression of foreign genes into a heterologous recipient
does not per se imply their expression in the host cell.
The introgression of foreign The introgression of foreign genes intogenes into a a heterologous recipientheterologous recipient
does not does not per se per se imply imply their expression their expression in in the host cellthe host cell..
On the other hand, the finding that HGT is pervasiveamong microial lineages indicates that these barriers
may somehow be overcome
On the other hand, the finding that HGT is pervasiveamong microial lineages indicates that these barriers
may somehow be overcome
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Can this issue be analyzed under laboratory conditions ?Can this issue be analyzed under laboratory conditions ?
??Thus, how can a heterologous gene (cluster)
be expressed in a host cell whose RNA polymerase
is not able to (efficiently) recognize
the transcriptional signal of the introgressed gene(s)?
………by transferring genes for a given metabolic route from a donor
organism into a heterologous recipient lacking that metabolic ability, and whose transcriptional apparatus does not recognize the regulatory signal of the donor DNA.
………by transferring genes for a given metabolic route from a donor
organism into a heterologous recipient lacking that metabolic ability, and whose transcriptional apparatus does not recognize the regulatory signal of the donor DNA.
This idea relies on the so-called "directed evolution" experiments that demonstrated the occurrence of regulatory mutations in bacterial populations incubated under selective conditions and
allowing the appearance of cells able to thrive in alternative environments.
This idea relies on the so-called "directed evolution" experiments that demonstrated the occurrence of regulatory mutations in bacterial populations incubated under selective conditions and
allowing the appearance of cells able to thrive in alternative environments.
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
XX --
XX ++
FENOTIPOFENOTIPO
XX -- Cromosoma
PLASMIDE
X
TRASFERIMENTOTRASFERIMENTOGENICOGENICO
ORIZZONTALEORIZZONTALE
PRESSIONE SELETTIVAPRESSIONE SELETTIVA(Richiesta della Funzione X)(Richiesta della Funzione X)
PLASMIDE
X
Cromosoma
X
Plasmide Cromosoma
P
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
PP
X geneX gene
Bacterial cellBacterial cell
Acquisition Acquisition of a of a potentiallypotentiallyfunctioning functioning X gene by HGTX gene by HGT
XX phenotypephenotype
Selective pressureSelective pressure::request of functionrequest of function X X
Model for the expression of newly acquired metabolic genes by promoter-creating mutations in a host celllacking the function encoded by a gene X and which has an X- phenotype. This cell may acquire (by
xenology or sinology) a heterologous gene X whose regulatory signals are not recognized by thetranscriptional apparatus of the host cell; therefore the cell phenotype is still X-. The appearance of cell
with X+ phenotype is possible if under starvation conditions requiring the function X, mutations fallingupstream of the gene X create a promoter sequence, and render the gene X expressable.
--
--
++
Overall experimentalstrategy
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Escherichia coli G D C B H A F IE
Azospirillum brasilense Bd H Orf 168 A F Orf
122E
pRK290pRK290
TetTetrr
EcoRIEcoRI
Bd H Orf 168 A F Orf
122E
pAF58pAF58
TetTetrr
EcoRIEcoRI
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
E. coli E. coli FB251FB251
hisBhisB recArecA
E. coli E. coli FB182FB182
hisAhisA
E. coli E. coli FB184FB184
hisFhisF
His PhenotypeHis Phenotype
XXhisBhisB++hisAhisA--hisFhisF++
hisBhisB--hisAhisA++hisFhisF++
XX
hisBhisB++hisAhisA++hisFhisF--
XX
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
E. coli E. coli FB251FB251
hisBhisB recArecA
E. coli E. coli FB182FB182
hisAhisA
E. coli E. coli FB184FB184
hisFhisF
A. A. brasilense his brasilense his biosynthetic genesbiosynthetic genes
His PhenotypeHis Phenotype
XXhisBhisB++hisAhisA--hisFhisF++ BAF
pAF58pAF58
hisBhisB--hisAhisA++hisFhisF++ BAF
pAF58pAF58
XX
hisBhisB++hisAhisA++hisFhisF-- BAF
pAF58pAF58
XX
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Selective pressureSelective pressure::request of histidinerequest of histidine
Acquisition of Acquisition of A. A. brasilense hisbrasilense hisgene cluster by HGTgene cluster by HGT
E. coli E. coli HisHis-- mutantmutant
HisHis phenotypephenotype
E. coli E. coli HisHis++ revertantrevertant
BAF
pAF58pAF58
BAF
pAF5803pAF5803
PP
Working hypothesisWorking hypothesis
E. coli E. coli FB251FB251
hisBhisB recArecA
E. coli E. coli FB182FB182
hisAhisA
E. coli E. coli FB184FB184
hisFhisF
A. A. brasilense his brasilense his biosynthetic genesbiosynthetic genes
His PhenotypeHis Phenotype
XXhisBhisB++hisAhisA--hisFhisF++
hisBhisB--hisAhisA++hisFhisF++
XX
hisBhisB++hisAhisA++hisFhisF--
XX
BAF
pAF5803pAF5803
PP
BAF
pAF5803pAF5803
PP
BAF
pAF5803pAF5803
PP
++
++
++ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
RESULTS
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Transformation ofhisB E.coli with plasmid pAF58
Transformation ofTransformation ofhisBhisB E.coli E.coli with plasmid with plasmid pAF58pAF58
Ability of plasmid pAF58 to complement the hisB mutation(crescita in ASSENZA di istidina)
Ability of plasmid Ability of plasmid pAF58 pAF58 to complement the to complement the hisB hisB mutationmutation(crescita in ASSENZA di (crescita in ASSENZA di istidinaistidina))
hisBhisB--hisAhisA++hisFhisF++ BAF
pAF58pAF58
XXE. coli E. coli FB251FB251
hisBhisB recArecA
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
TUTTI i trasformanti crescono in ASSENZA di istidina
TUTTI i trasformanti crescono in ASSENZA di istidina
Ability of plasmid pAF58 to complement the hisB mutation(crescita in ASSENZA di istidina)
Ability of plasmid Ability of plasmid pAF58 pAF58 to complement the to complement the hisB hisB mutationmutation(crescita in ASSENZA di (crescita in ASSENZA di istidinaistidina))
Il PROMOTORE dell’operone his di A. brasilense è riconosciuto dalla
RNA polimerasi di E. coli
Il PROMOTORE dell’operone his di A. brasilense è riconosciuto dalla
RNA polimerasi di E. coli
FINEFINEFINE
TUTTI i trasformanti NON crescono in ASSENZA di istidina
TUTTI i trasformanti NON crescono in ASSENZA di istidina
Il PROMOTORE dell’operone his di A. brasilense NON è riconosciuto dalla
RNA polimerasi di E. coli
Il PROMOTORE dell’operone his di A. brasilense NON è riconosciuto dalla
RNA polimerasi di E. coli
MA, dopo alcunigiorni compaiono dei revertanti His+
MA, dopo alcunigiorni compaiono dei revertanti His+
MA, dopo alcunigiorni, compaiono dei revertanti His+
MA, dopo alcunigiorni, compaiono dei revertanti His+
I revertanti sono capaci di sintetizzare l’istidina
(COMPLEMENTAZIONE)
I revertanti sono capaci di sintetizzare l’istidina
(COMPLEMENTAZIONE)
RICOMBINAZIONEintermolecolare
RICOMBINAZIONERICOMBINAZIONEintermolecolareintermolecolare MUTAZIONE MUTAZIONE
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
MUTAZIONE MUTAZIONE
PLASMIDICA PLASMIDICA CROMOSOMICA(reversione del gene hisB mutato)
CROMOSOMICA(reversione del gene hisB mutato)
Aumento del numerodi copie
Aumento del numerodi copie
Creazione di un PROMOTORECreazione di un PROMOTORE
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
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TRASFORMAZIONETRASFORMAZIONEIncorporaziome di molecole di DNA
(ricombinanti o non)da parte di
cellule ospiti “competenti”
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Miscela di cellule competenti del ceppoMiscela di cellule competenti del ceppoFB251 FB251 hisBhisB e di e di
molecole di DNA molecole di DNA plasmidico plasmidico pAF58pAF58
Una frazione delle cellule competentiUna frazione delle cellule competentiincorpora molecole di DNAincorpora molecole di DNA
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Come riconoscere, tra tuttele cellule (qualche miliardo)
potenzialmente trasformabili, icloni positivi,
cioè quelli che hanno incorporatoil plasmide ricombinante pAF58?
QuesitoQuesitoQuesito
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E istidinaistidina
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Lamoltiplicazione
diqueste celluleporterà allacomparsa di
colonieresistenti allatetraciclina
LaLamoltiplicazionemoltiplicazione
didiqueste cellulequeste celluleporterà allaporterà allacomparsa dicomparsa di
coloniecolonieresistenti allaresistenti allatetraciclinatetraciclina
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Come verificare se il plasmide pAF58 è capace di complemetare
la mutazione his del ceppoFB251?
Come verificare se il Come verificare se il plasmide plasmide pAF58 è capace di pAF58 è capace di complemetarecomplemetare
la mutazione la mutazione hishis del ceppo del ceppoFB251?FB251?
QuesitoQuesitoQuesito
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Piastra di terreno selettivo contenentePiastra di terreno selettivo contenentetetraciclina ma NON ISTIDINAtetraciclina ma NON ISTIDINA
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINATerreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA
Replica-Replica-platingplating
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Se il Se il promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dalportati dalplasmide plasmide pAF58 pAF58 è riconosciutoè riconosciuto dalla RNA- dalla RNA-
polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli ... ...
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
CRESCITA di TUTTE le COLONIECRESCITA di TUTTE le COLONIE su su
terreno contenente tetraciclina terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Se il Se il promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dalportati dalplasmide plasmide pAF58 pAF58 NONNON è riconosciutoè riconosciuto dalla dalla
RNA-RNA-polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli ... ...
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
ASSENZA di CRESCITAASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE di TUTTE le COLONIE
su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
RISULTATO dell’ESPERIMENTORISULTATO dell’ESPERIMENTO(dopo (dopo 24 24 ore di incubazione delle piastre a 37°C)ore di incubazione delle piastre a 37°C)
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
ASSENZA di CRESCITAASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE di TUTTE le COLONIE
su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
IL IL promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dal portati dal plasmideplasmidepAF58 pAF58 NONNON è riconosciutoè riconosciuto dalla RNA- dalla RNA-
polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
RISULTATO dell’ESPERIMENTORISULTATO dell’ESPERIMENTO(dopo (dopo 4848 ore di incubazione delle piastre a 37°C)ore di incubazione delle piastre a 37°C)
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
CRESCITACRESCITA di ALCUNE MICRO-COLONIE di ALCUNE MICRO-COLONIE
su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
RISULTATO dell’ESPERIMENTORISULTATO dell’ESPERIMENTO(dopo (dopo 7272 ore di incubazione delle piastre a 37°C)ore di incubazione delle piastre a 37°C)
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
Il NUMERO delleIl NUMERO delle MICRO-COLONIE MICRO-COLONIE
su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINA MA NON ISTIDINA AUMENTAAUMENTA
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
RISULTATO dell’ESPERIMENTORISULTATO dell’ESPERIMENTO(dopo (dopo 9696 ore di incubazione delle piastre a 37°C)ore di incubazione delle piastre a 37°C)
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
Il NUMERO delleIl NUMERO delle MICRO-COLONIE MICRO-COLONIE
su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINA MA NON ISTIDINA continua ad AUMENTAREcontinua ad AUMENTARE
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
RISULTATO dell’ESPERIMENTORISULTATO dell’ESPERIMENTO(dopo (dopo 192 192 ore di incubazione delle piastre a 37°C)ore di incubazione delle piastre a 37°C)
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
Il NUMERO delleIl NUMERO delle MICRO-COLONIE MICRO-COLONIE
su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINA MA NON ISTIDINA NON AUMENTA PIU’NON AUMENTA PIU’
Che cosa sono le microcolonie?Che cosa sono le Che cosa sono le microcoloniemicrocolonie??
QuesitoQuesitoQuesito
Revertanti HisB+Revertanti HisBRevertanti HisB++
RispostaRispostaRisposta
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Revertanti HisB+Revertanti HisBRevertanti HisB++
Revertanti CROMOSOMICI
Revertanti Revertanti CROMOSOMICICROMOSOMICI
Mutanti plasmidiciMutanti Mutanti plasmidiciplasmidici
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
???
Come discernere trale due possibilità?
Come discernere traCome discernere trale due possibilità?le due possibilità?
“Curing” del plasmide““CuringCuring” del ” del plasmideplasmide
???
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
CRESCITA di REVERTANTI CRESCITA di REVERTANTI HisBHisB+ + ininpresenza di arancio di presenza di arancio di acridinaacridina
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA
Terreno contenente Terreno contenente
arancio di arancio di acridina acridina
E ISTIDINAE ISTIDINA
Terreno massimo NON Terreno massimo NON
contenente tetraciclinacontenente tetraciclina
Semina della colturaSemina della coltura
Verificare il Fenotipo delle colonie cresciuteVerificare il Fenotipo delle colonie cresciute
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Terreno massimo NON Terreno massimo NON
contenente tetraciclinacontenente tetraciclina
Scenario 1Se la mutazione responsabile del fenotipo Se la mutazione responsabile del fenotipo HisHis+ dei+ dei
revertantirevertanti è a carico del è a carico del plasmideplasmide::
Le cellule potranno essere Le cellule potranno essere TetTetrr o o TetTetss
••Tutte le cellule Tutte le cellule TetTetrr devono essere anche devono essere anche HisHis++
••Tutte le cellule Tutte le cellule TetTetss devono essere anche devono essere anche HisHis--
Scenario 2Se la mutazione responsabile del fenotipo Se la mutazione responsabile del fenotipo HisHis+ dei+ dei
revertantirevertanti è a carico del è a carico del cromosoma:cromosoma:
••Tutte le cellule sarannoTutte le cellule saranno HisHis+ + indipendentemente dalindipendentemente dal fenotipo fenotipo TetTet
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Terreno MM -Terreno MM -Tet Tet --HisHis
Terreno massimo NON Terreno massimo NON
contenente tetraciclinacontenente tetraciclina
Terreno MM +Terreno MM +TetTet - -HisHis
Terreno MM +Terreno MM +TetTet + +HisHis
Terreno MM -Terreno MM -TetTet + +HisHis
???Estrazione DNA plasmidico dai revertanti HisB+
Estrazione DNA Estrazione DNA plasmidico plasmidico dai dai revertanti HisBrevertanti HisB++
???
Come discernere trale due possibilità?
Come discernere traCome discernere trale due possibilità?le due possibilità?
“Curing” del plasmide““CuringCuring” del ” del plasmideplasmide
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
ESTRAZIONE del DNA PLASMIDICOESTRAZIONE del DNA PLASMIDICO
dai REVERTANTI dai REVERTANTI HisBHisB++
pAF5803pAF5803(milioni di copie)(milioni di copie)
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Miscela di cellule competenti del ceppoMiscela di cellule competenti del ceppoFB251 FB251 hisBhisB e di e di
molecole di DNA molecole di DNA plasmidico plasmidico pAF5803pAF5803
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Una frazione delle cellule competentiUna frazione delle cellule competentiincorpora ilincorpora il plasmide plasmide pAF5803pAF5803
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E istidinaistidina
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Lamoltiplicazione
diqueste celluleporterà allacomparsa di
colonieresistenti allatetraciclina
LaLamoltiplicazionemoltiplicazione
didiqueste cellulequeste celluleporterà allaporterà allacomparsa dicomparsa di
coloniecolonieresistenti allaresistenti allatetraciclinatetraciclina
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Se il Se il promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dalportati dalplasmide plasmide pAF5803pAF5803 NONNON è riconosciutoè riconosciuto dalla dalla
RNA-RNA-polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
ASSENZA di CRESCITAASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE di TUTTE le COLONIE
su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA
Revertante cromosomicoRevertante cromosomico
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Se il Se il promotore promotore dei geni dei geni hishis portati dalportati dalplasmide plasmide pAF5803pAF5803 è riconosciutoè riconosciuto dalla RNA- dalla RNA-
polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
CRESCITA di TUTTE le COLONIECRESCITA di TUTTE le COLONIE su su
terreno contenente tetraciclina terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA
Mutante Mutante plasmidicoplasmidico
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
RISULTATO dell’ESPERIMENTORISULTATO dell’ESPERIMENTO(dopo (dopo 24 24 ore di incubazione delle piastre a 37°C)ore di incubazione delle piastre a 37°C)
Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina
E ISTIDINAE ISTIDINA
CRESCITA di TUTTE le COLONIECRESCITA di TUTTE le COLONIE su su
terreno contenente tetraciclina terreno contenente tetraciclina
MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA
Mutante Mutante plasmidicoplasmidicoProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Genetic andmolecular
characterization ofplasmid DNA from
twenty HisB+
revertantsProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Extraction of mutant (?) plasmid DNAfrom 20 HisA+ revertants
Extraction Extraction ofof mutant mutant (?)(?) plasmid plasmid DNA DNAfromfrom 20 20 HisAHisA++ revertantsrevertants
Transformation ofhisA, hisF, hisB E.coli cells
Transformation ofTransformation ofhisAhisA, , hisFhisF, , hisBhisB E.coli E.coli cellscells
Ability of mutant plasmids to complement hisA, hisB and/or hisF
Ability of mutant plasmids to Ability of mutant plasmids to complement complement hisAhisA, , hisBhisB and and/or /or hisFhisF
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
ComplementationComplementation**
FB251 FB251 hisBhisB FB184 FB184 hisAhisA FB182 FB182 hisF hisF
0 0.1 10 0.1 1 0 0.1 10 0.1 10 0.1 10 0.1 1
OriginOrigin
PlasmidPlasmid StrainStrainSelective conditionsSelective conditions
HisHis TimeTimeN N cellscells
platedplated
pAF58 FB184 - - - - pAF58 FB184 - - - - - - - - - - - - - -
pDS1-3 “ 0 5x10pDS1-3 “ 0 5x1066 2 + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + +
pDS4-5 pDS4-5 “ 0 5x10 “ 0 5x1077 3 + + + + 3 + + + + + + + + + + + + + +
pDS6-7 “ 0 5x10pDS6-7 “ 0 5x1077 4 + + + + 4 + + + + + + + + + + + + + +
pDS8 pDS8 “ 0.1 5x10 “ 0.1 5x1066 2 + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + +
pDS9-11 “ 0.1 5x10pDS9-11 “ 0.1 5x1077 2 + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + +
pDS12 “ 0.1 5x10pDS12 “ 0.1 5x1077 3 + + + + 3 + + + + + + + + + + + + + +
pDS13 “ 0.1 5x10pDS13 “ 0.1 5x1077 5 + + + + 5 + + + + + + + + + + + + + +
pDS14-15 “ 1.0 5x10pDS14-15 “ 1.0 5x1066 2 + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + +
pDS16 “ 1.0 5x10pDS16 “ 1.0 5x1066 3 + + + + 3 + + + + + + - - + + + - - +pDS17-18 “ 1.0 5x10pDS17-18 “ 1.0 5x1066 3 + + + + 3 + + + + + + + + + + + + + +pDS19-20 “ 1.0 5x10pDS19-20 “ 1.0 5x1077 4 + + + + 4 + + + + + + + + + + + + + +
* * Growth on selective Growth on selective medium medium after after 24 h 24 h incubation at incubation at 37°C37°CProfProf. Renato Fani. Renato Fani
These results suggest thatThese results suggest thatThese results suggest that
This mutation might have generated a promoter-like sequence rendering the A. brasilense his operon
(efficiently) transcriptable by the E. coli RNA-polymerase
This mutation might have generatedThis mutation might have generated a a promoterpromoter--like sequencelike sequence rendering the rendering the A. A. brasilensebrasilense hishis operon operon
((efficientlyefficiently)) transcriptable transcriptable by by the the E. coliE. coli RNA- RNA-polymerasepolymerase
The appearance of HisB+ revertants was due to a mutation occurring in plasmid pAF58 and NOT to a retromutation
The appearanceThe appearance ofof HisBHisB++ revertants was revertants was due due to to a a mutation mutation occurringoccurring in in plasmid plasmid pAF58 pAF58 and and NOT NOT to to a a retromutation retromutation
At least two different mutations should have occurredAt At leastleast two two differentdifferent mutationsmutations should should havehave occurredoccurred
These mutations should have fallen upstream of the first gene ofA. brasilense his operon, hisB
These mutations should have fallenThese mutations should have fallen upstream upstream ofof the first the first gene gene ofofA. A. brasilense his operonbrasilense his operon, , hisBhisB
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
ProfProf. Renato Fani. Renato Fani
Bd H Orf 168 A F Orf
122E
Bd H Orf 168 A F Orf
122E
- - -- - -
+ + ++ + +
Bd H Orf 168 A F Orf
122E
Bd H Orf 168 A F Orf
122E
EcoRIEcoRI BamHIBamHI
PhenotypePhenotypeHisB HisB HisA HisA HisFHisF
- - -- - -
+ + ++ + +
pAF58pAF58
MutantMutant
plasmidplasmid
The mutation is localized on the 479 bp fragment including the 5’ end of hisBd
and its upstream region
The mutation is localizedThe mutation is localized on theon the 479 479 bp fragment bp fragment includingincluding thethe 5’ 5’ endend ofof hisBdhisBd
andand itsits upstreamupstream regionregion
Bd H Orf 168 A F Orf
122E
Bd H Orf 168 A F Orf
122E
EcoRIEcoRI BamHIBamHI
pAF58pAF58
MutantMutant
plasmidsplasmids
PCRPCRPCR
Nucleotide sequenceNucleotide sequenceNucleotide sequenceProfProf. Renato Fani. Renato Fani
pDS1-15 + + + + + + + + + -------------pDS1-15 + + + + + + + + + -------------T-----------T-----------
pDS17-20pDS17-20
ComplementationComplementation
FB251 FB251 hisBhisB FB184 FB184 hisAhisA FB182 FB182 hisFhisF
0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1 0 0.1 1
pDS16 + + + + + + - - pDS16 + + + + + + - - + + ----A------------------------A--------------------
pAF58 - - - - - - pAF58 - - - - - - - - - - - - cttcctgacttcctgaTAAAACTAAAACccggactcccggactcatgatg
TatAaTTatAaT
Nucleotide sequenceNucleotide sequence
hisBhisBE.coliE.coli -10 -10 consensusconsensus
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FB251(pDS44)
O.D
. 550
FB251(pAF58)
0 1 2 3 4 5 6 7
Time (h)
O.D
. 550
FB251(pDS49)O.D
. 550
10
1
0.1
0.01
10
1
0.1
0.01
10
1
0.1
0.01
FB184 (pAF58)FB184 (pAF58)
FB184 (pDS1)FB184 (pDS1)
FB184 (pDS16)FB184 (pDS16)
Time (h)Time (h)
ODOD550550
ODOD550550
ODOD550550
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Promoter probe vectorPromoter probe vector
pKK232-8Ampr
T1T2
T2T1
Cams
Vettori per il clonaggio e l’analisi di sequenze regolative
Codoni di stop-traduzione leggibili in tutti e tre i moduli di lettura
Shine e Dalgarno (gaagg)
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E. coliE. coli
CamCam phenotypephenotype
Cams
pKK232-8pKK232-8
Camr
pKK0001pKK0001
PP
Working hypothesisWorking hypothesis
SS
SSE. coliE. coli
(pKK232-8)(pKK232-8)
E. coliE. coli
(PKK001)(PKK001) RR
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14C14CCam + Cam + AcetilAcetil--CoACoACATCAT
14C14CCam-Cam-Acetilato Acetilato + + CoACoA
E.coliE.coli EE.coli.coli(pKK232-8)(pKK232-8)
E.coliE.coli(pKK0001)(pKK0001)
Non Non acetilatoacetilato
MonoMono--acetilatoacetilato
Di-Di-acetilatoacetilato
CromatografiaCromatografia
SAGGIO CATSAGGIO CAT
E.coliE.coli(pKK0002)(pKK0002)
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CAT ASSAY
CAT ASSAYCAT ASSAY
CLONING of the REGULATORY REGION upstream ofthe cam promoterless gene of the
PROMOTER-PROBE vector
CLONING CLONING of the of the REGULATORY REGION REGULATORY REGION upstream ofupstream ofthethe camcam promoterlesspromoterless gene gene of the of the
PROMOTER-PROBE PROMOTER-PROBE vectorvector
Strain Strain Plasmid Plasmid CAT CAT activityactivity**
E.coliE.coli hisBhisB -- 1.21.2
“ pKK232-8 “ pKK232-8 1.4 1.4
“ “ PKK0001 PKK0001 99.799.7
“ “ pKK0002pKK0002 1.5 1.5
**percentage of percentage of 1414CC--acetylated Camacetylated Cam; 0.01 ; 0.01 µµg g of total proteinsof total proteinsProfProf. Renato Fani. Renato Fani