Embed Size (px)
DESCRIPTION
A DNS Szekvenálás. 2008 Géntechnikák labor. Bevezetés. Restrikciós enzimek / restrikciós térképek Genom könyvtárak Fehérje aminosavsorrend meghatározás Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása, vakcinarezisztens mutánsok) Direkt szekvenálás Egyféle termék Klónozott PCR termék - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
A DNS Szekvenálás
2008Géntechnikák labor
Bevezetés• Restrikciós enzimek / restrikciós térképek• Genom könyvtárak• Fehérje aminosavsorrend meghatározás• Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása,
vakcinarezisztens mutánsok)• Direkt szekvenálás
– Egyféle termék
• Klónozott PCR termék– Többféle termék– Egymásra rakódó szekvenciák– Klónozás plazmidba
Módszerek• Maxam-Gilbert-féle kémiai degradáció
– 5’ radioaktív izotópos jelölés (32P)– Bázis specifikus hasító reakciók– Elektroforézis, autoradiogramm– Mérgező anyagok, négy reakció
• Sanger-féle enzimatikus módszer– Automatizálható!!!!!– Az eljárás közben nő a DNS mennyisége, tehát kisebb
mennyiségű is kimutatható– Egy reakcióban is megoldható– Fluoreszcens molekulával jelölt primer, vagy didezoxinukleotidok– PCR + Elektroforézis poliakrilamid gélben
A reakcióelegy:
• Templát• Oligonukleotid primer• DNS polimeráz• Dezoxinukleotidok (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)
• Didezoxinukleotidok (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)
NO
N
N
ON
NO
NON
OO
O NN
N
NO
N
O
NO
O
O
OO
N N
O
O
NON
O
O NN
N
NO
N
O
N
OO
O
N N
O
ONO
N
N
N
NO
PO
O
OP
OO
OP
OO
OP
OO
O
PO
O
OP
OO
OP
OO
O
PO
O
O
A szekvenálás• Denaturáció• Anelláció
– Egy primer
• Elongáció– Véletlenszerű lánc termináció
A szekvenálás menete
O
NON
O
O N
PO
O
NO
N
N
ON
NO
OP
OO
NO
N
N
ON
NO
OP
OO
PO
O
O
O
N
N
NO
N
O
N
O
O
NON
O
O N
PO
O
O
OO
N N
O
OP
OO
O
Elválasztás• Elektroforézis kapillárisban (375μm / 75μm)
– Nagy felület-térfogat arány → nagy hőleadóképesség → nagyobb feszültségnél sem melegszik annyira
– Kis feszültség: szebb elválasztás• Poliakrilamid mátrix
– Betöltés: nagynyomású nitrogén– nagy felbontás
• Minta bejuttatása– Elektrokinetikus injektálás– Megfelelő neg. Ionok (DNS) legyenek csak!– Ha eltömődik a kapilláris, leesik az áramerősség
Detektálás
• A jelölő molekulát lézerrel gerjesztjük, majd mérjük a fluoreszcenciát
• Fluoreszcensen jelölt primer– Négy reakció– Mindegyikben csak egy didezoxinukleotid– Négy futtatás
• Fluoreszcensen jelölt didezoxinukleotidok– Egy reakció– Egy futtatás– Minden ddNTP más hullámhosszon detektálható
Kiértékelés
• A jelekből egy szoftver kromatogrammot készít, a bázisokat eltérő színű csúcsok jelölik.
– Szekvencia ellenőrzés!!!!!• Olvashatatlannak ítélt pozíciók N betűi• Kiértékelési hibák• Kimaradt betűk
Szekvenciák összehasonlítása• Fontos mindkét szálat megszekvenálni, és
összehasonlítani az eredményeket.• Összehasonlításhoz ingyenes internetes
szoftverek. (Clustal, Multalin)
TTV típusok genomjának összehasonlítása (Multalin)
Irodalomjegyzék
• Berencsi György: Orvosi molekuláris virológia• Multalin ( http://ribosome.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html )
Köszönöm a figyelmet!
