A HAP2-sapka és a flagelláris filamentum közötti ...teo.elte.hu/minosites/ertekezes2009/dioszeghy_z.pdf · 7. Ábra: a hap2 sapka szerkezete. 24 8. Ábra: a hap2-sapka És a filamentum

A HAP2-sapka és a flagelláris filamentum közötti

kölcsönhatás mechanizmusának vizsgálata

Ph. D. doktori értekezés

Készítette: Diószeghy Zoltán

Témavezetı: Dr. Závodszky Péter

egyetemi tanár az MTA rendes tagja

ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Vezetıje: Dr. Erdei Anna akadémikus, egyetemi tanár

Szerkezeti Biokémia Doktori Program

Programvezetı: Dr. Gráf László akadémikus, egyetemi tanár

Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ

Enzimológiai Intézete

Budapest 2008

2

Köszönetnyilvánítás

Szakdolgozatom elkészítése kapcsán ezúton szeretném kifejezni köszönetemet:

Témavezetımnek, Dr. Závodszky Péter akadémikusnak, az MTA SZBK Enzimológiai

Intézete igazgatójának, aki hozzájárult, hogy az általa vezetett kutatócsoportban

dolgozhassam, munkámat irányította és támogatta, és mindig kitartásra biztatott;

Dr. Vonderviszt Ferencnek, aki mind a kutatásokban, mind a dolgozat megírásában

rendkívül sokat segített, akinek tapasztalata és hasznos tanácsai mindig átsegítettek a

nehézségeken;

Dr. Friedrich Péter akadémikusnak, az MTA SZBK Enzimológiai Intézete volt

igazgatójának, aki lehetıvé tette, hogy kutatásaimat az intézetben végezhessem;

Dr. Gráf László akadémikusnak, a Szerkezeti Biokémia Doktori Program vezetıjének;

Végh Barbarának, Gugolya Zoltánnak és Szenczi Árpádnak a dolgozat elkészítéséhez

nyújtott segítségükért;

Csoportunk volt és jelenlegi tagjainak, Dr. Kardos Józsefnek, Dr. Svingor Ádámnak,

Dr. Gál Péternek, Dr. Dobó Józsefnek, Dr. Lırincz Zsoltnak, Dr. Ambrus-Aikelin Gézának,

Dr. Németh Attilának, Kamondi Szilárdnak, Hajdú Istvánnak, akiket mindig zaklathattam

kérdéseimmel;

Az Enzimológiai Intézet valamennyi munkatársának, aki valamilyen formában a

segítségemre volt az elmúlt évek során;

Volt és jelenlegi munkahelyi vezetıimnek, amiért türelemmel viselték a doktori eljárás

hosszúra nyúlt folyamatát;

Végül, de nem utolsó sorban feleségemnek és szüleimnek, amiért folyamatosan

biztattak, támogattak és mindenben mellettem álltak.

Jegyzékek

3

Tartalomjegyzék

TARTALOMJEGYZÉK ...................................................................................................................................... 3

ÁBRÁK JEGYZÉKE ............................................................................................................................................ 5

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE .............................................................................................................................. 6

BEVEZETÉS ......................................................................................................................................................... 7

IRODALOM .......................................................................................................................................................... 9

A BAKTÉRIUMOK MOZGATÓ MECHANIZMUSA ...................................................................................................... 9

A BAZÁLIS TEST ................................................................................................................................................. 10

AZ AXIÁLIS FEHÉRJÉK ÉS A FILAMENTUM FELÉPÜLÉSE ....................................................................................... 13

A KAMPÓ ............................................................................................................................................................ 14

A FLAGELLÁRIS FILAMENTUM ............................................................................................................................ 16

A HAP2-SAPKA ................................................................................................................................................. 22

CÉLKITŐZÉS ..................................................................................................................................................... 26

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ......................................................................................................................... 27

FELHASZNÁLT VEGYSZEREK ÉS MŐSZEREK ........................................................................................................ 27

FEHÉRJÉK EXPRESSZIÓJA, TISZTÍTÁSA ................................................................................................................ 27

Natív filamentumok készítése ......................................................................................................................... 27

Flagellin és HAP2 expressziója és tisztítása ................................................................................................. 28

REKONSTRUKCIÓS MÓDSZEREK.......................................................................................................................... 28

A filamentum monomerizációja és depolimerizációja ................................................................................... 28

A flagellin polimerizációja ............................................................................................................................ 28

A HAP2 sapka rekonstrukciója...................................................................................................................... 29

EMÉSZTÉSI KÍSÉRLETEK ..................................................................................................................................... 29

Áttekintés ....................................................................................................................................................... 29

Rekonstruált filamentumok emésztése ........................................................................................................... 30

Natív filamentumok emésztése ....................................................................................................................... 30

ELLENİRZİ LÉPÉSEK ......................................................................................................................................... 30

Tisztaság és koncentráció ellenırzése ........................................................................................................... 30

Mikroszkópos vizsgálatok .............................................................................................................................. 31

MUTAGENEZIS.................................................................................................................................................... 31

Áttekintés ....................................................................................................................................................... 31

Primerek megtervezése .................................................................................................................................. 32

Mutagenezis, szekvenálás .............................................................................................................................. 32

Jegyzékek

4

További transzformációs lépések ................................................................................................................... 33

SPEKTROFLUORIMETRIA, FESTÉSI ELJÁRÁSOK .................................................................................................... 33

Elméleti háttér ............................................................................................................................................... 33

Fluoreszcens jelölések ................................................................................................................................... 34

SPEKTROPOLARIMETRIA ..................................................................................................................................... 35

Elméleti háttér ............................................................................................................................................... 35

Mérési beállítások ......................................................................................................................................... 36

MIKROKALORIMETRIA ....................................................................................................................................... 37

Elméleti háttér ............................................................................................................................................... 37

Mérési beállítások ......................................................................................................................................... 38

EREDMÉNYEK ÉS ÉRTELMEZÉSÜK .......................................................................................................... 39

A FILAMENTUM FELÉPÜLÉSÉNEK VIZSGÁLATA FRET SEGÍTSÉGÉVEL ................................................................ 39

Áttekintés ....................................................................................................................................................... 39

Mutáns flagellinek készítése .......................................................................................................................... 39

A flagellinek filamentumba történı beépülésének vizsgálata ........................................................................ 41

A terminálisan csonkított fragmentumok elkészítése ..................................................................................... 42

A csonkított fragmentumok kötıdése a filamentumok végéhez ...................................................................... 43

A flagellin rendezetlen terminális régióinak kölcsönhatása a filamentum felépülése során ......................... 45

A NATÍV FLAGELLÁRIS FILAMENTUMOK STABILITÁSA ....................................................................................... 46

A HAP2 sapka hatása a natív flagelláris filmentumok stabilitására ............................................................. 46

A HAP2 sapka depolimerizációt gátló szerepe a natív filamentumoknál ...................................................... 49

A REKONSTRUÁLT FILAMENTUMOK STABILITÁSA .............................................................................................. 51

A polimerizációs feltételek hatása a rekonstruált filamentumok stabilitására .............................................. 51

A HAP2 kötıdése rekonstruált filamentumokhoz .......................................................................................... 52

HAP2 kötıdésének hatása a rekonstruált filamentumok stabilitására .......................................................... 53

A HAP2 kötıdésének depolimerizációt gátló szerepe a rekonstruált filamentumoknál ................................. 58

AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE ........................................................................................................................ 60

ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................................................................ 65

IRODALOMJEGYZÉK ..................................................................................................................................... 67

PUBLIKÁCIÓS LISTA ...................................................................................................................................... 77

A DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK ........................................................................................... 77

EGYÉB KÖZLEMÉNYEK ....................................................................................................................................... 78

Jegyzékek

5

Ábrák jegyzéke

1. ÁBRA: A BAKTERIÁLIS FLAGELLUM FELÉPÍTÉSE. 12

2. ÁBRA: A FLAGELLÁRIS EXPORTRENDSZER SEMATIKUS ÁBRÁJA. 12

3. ÁBRA: A FLAGELLUM FELÉPÜLÉSÉNEK MENETE. 14

4. ÁBRA: A FILAMENTUM POLIMORFIKUS MODELLJE. 17

5. ÁBRA: A FLAGELLIN TÉRSZERKEZETE ÉS MÁSODLAGOS STRUKTÚRÁJA. 19

6. ÁBRA: A FILAMENTUM KERESZTMETSZETI (TENGELYIRÁNYÚ) KÉPE. 20

7. ÁBRA: A HAP2 SAPKA SZERKEZETE. 24

8. ÁBRA: A HAP2-SAPKA ÉS A FILAMENTUM VÉGE KÖZÖTTI KÖLCSÖNHATÁS MODELLJE. 25

9. ÁBRA: A MUTAGENEZIS FİBB LÉPÉSEI 40

10. ÁBRA: EMISSZIÓS SPEKTRUMOK 394 NM-ES GERJESZTÉSI HULLÁMHOSSZ ESETÉN. 42

11. ÁBRA: AZ 512 NM-EN MÉRT FLUORESZCENCIA INTENZITÁS IDİBELI VÁLTOZÁSA. 44

12. ÁBRA: A NATÍV FLAGELLÁRIS FILAMENTUM HİDENATURÁCIÓJÁNAK CD-GÖRBÉJE 222 NM-

EN 47

13. ÁBRA: A NATÍV FLAGELLÁRIS FILAMENTUM CD-GÖRBÉJÉNEK DERIVÁLTJA 222 NM-EN 47

14. ÁBRA: NEGATÍVAN FESTETT FILAMENTUM-SAPKA KOMPLEXUMOKRÓL

ELEKTRONMIKROSZKÓPPAL KÉSZÍTETT MIKROGRÁF. 49

15. ÁBRA: A NATÍV FILAMENTUM DEPOLIMERIZÁCIÓJÁNAK KÖVETÉSE CD-VEL, 50°C-ON, 222

NM-EN 50

16. ÁBRA: A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM STABILITÁSI TARTOMÁNYA 51

17. ÁBRA: MAGOKKAL TÖRTÉNİ REKONSTRUKCIÓ EREDMÉNYE 52

18. ÁBRA: A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM CD-GÖRBÉJÉNEK DERIVÁLTJA 222 NM-EN 55

19. ÁBRA: A FLAGELLIN ÉS A FILAMENTUM KALORIMETRIÁS GÖRBÉI 56

20. ÁBRA: A HAP2 ÉS A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM KALORIMETRIÁS GÖRBÉI 58

21. ÁBRA: A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM DEPOLIMERIZÁCIÓJÁNAK KÖVETÉSE CD-VEL,

45°C-ON, 222 NM-EN 59

22. ÁBRA: A NATÍV ÉS A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM VÉGÉNEK SEMATIKUS SZERKEZETE. 63

Jegyzékek

6

Rövidítések jegyzéke

A abszorbancia

AF350 Alexa Fluor 350 C5 maleimid

AF488 Alexa Fluor 488 C5 maleimid

AS ammónium-szulfát, (NH4)2SO4

bp bázispár

BSA bovine serum albumin

CD cirkuláris dikroizmus

CPM 7-diethylamino-3-(4’-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin

DSC differenciális pásztázó kalorimetria

DTT ditiotreitol

E. Coli Escherichia coli

EDTA etiléndiamin-tetraecetsav

ELC endoproteináz lizin-C

FPLC gyors fehérje-folyadékkromatográfia (Fast Protein Liquid Chromatography)

FRET fluoreszcencia rezonancia energia transzfer

HAP kampó asszociált fehérje (Hook Associated Protein)

IPTG izopropil-béta D-tiogalakto-piranozid

NMR magmágneses rezonancia

PCR polimeráz láncreakció (Polimerase Chain Reaction)

PMSF fenil-metán-szulfonil-fluorid

S. Typhimurium Salmonella typhimurium

SDS nátrium-dodecil-szulfát

SDS-PAGE SDS poliakrilamid gélelektroforézis

Trisz trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán

V8 endoproteináz glutamin-C

Bevezetés

7

Bevezetés

A baktériumok egy összetett fehérjekomplexum, a flagellum révén aktív mozgásra

képesek. Ennek jellemzı formája az egyenes vonalú úszás, amit idınként rövid kalimpálás

vált fel, melynek során a baktérium mozgásiránya véletlenszerően megváltozik. A flagellum

két fı része a membránfehérjékbıl álló motor és a membránból messzire kinyúló filamentum.

A motor egy különleges makromolekuláris gépezet, mely az ember által készített

villanymotorokhoz hasonlóan forgó mozgás létrehozására képes. Azonban, míg a mesterséges

motorokat elektronok áramlása táplálja, addig ezt a bakteriális motort protonfluxus hajtja.

Ezzel a mechanizmussal hatalmas, akár 90 ezres percenkénti fordulatszámot is képesek elérni,

ami mintegy 20-30 µm/sec-os sebességgel hajtja elıre a baktériumot. Ez emberi méretekben a

leggyorsabb japán expresszvonatok száguldásának felel meg. A motor másik különleges

tulajdonsága az, hogy mindkét irányba képes forogni, amivel a baktérium mozgását tudja

szabályozni.

A több különbözı fehérjébıl álló filamentum szuperhelikális szerkezető. Kisebbik

része a kampó, ami nemcsak összeköti a motort a flagelláris filamentummal a forgást

továbbítva, hanem egyfajta molekuláris kardántengelyként is viselkedik: a kampó

görbületének megváltoztatásával képes a forgás tengelyének beállítására. A szerkezet döntı

részét a mintegy 10 µm hosszú flagelláris filamentum alkotja, melyet a flagellin nevő fehérje

több tízezer példánya épít fel. Két figyelemre méltó tulajdonsága van: az önszervezıdı

képesség és a polimorfizmus. Az elsı sajátosság azt jelenti, hogy a flagellin alegységek

megfelelı külsı körülmények hatására képesek a polimerizációra, azaz a szuperhelikális

szerkezet létrehozására. A második, a polimorfizmus azt takarja, hogy a filamentum külsı

megjelenése többféle is lehet: bizonyos külsı körülmények megváltozása illetve a motor

forgásirányának megfordulása esetén módosítja a formáját. Ez azért is szokatlan, mert teljesen

egyforma alegységekbıl többféle makroszkopikus szerkezet is létrejöhet, amik között

ráadásul igen gyors átkapcsolás lehetséges a környezeti körülmények megváltozása esetén.

A filamentum végén egy molekuláris sapka található, melynek in vivo a polimerizáció

elısegítésében van döntı szerepe. Ez a konstrukció teszi lehetıvé, hogy a citoplazmából a

filamentumok belsejében lévı csatornán át transzportálódó flagellin alegységek

beépülhessenek a filamentumok végére, és ne ürüljenek ki az extracelluláris térbe. A sapka

különleges és látszólag ellentmondásos tulajdonságokkal rendelkezik. Egyfelıl nagyon erısen

Bevezetés

8

kötıdik a filamentumok végéhez, és gyakorlatilag sohasem válik le onnan, másfelıl arra is

képes, hogy viszonylag könnyen elengedje a filamentumok végét, lehetıvé téve az újonnan

érkezı flagellin alegységek beépülését, azaz egyfajta „intelligens” kötıdést mutat.

Mindezek a figyelemre méltó tulajdonságok a bakteriális flagellum vizsgálatára

ösztönöznek. A struktúra vizsgálata önmagában is fontos ismereteket nyújthat a baktériumok

mozgásáról, de ezen túl is szolgálhat érdekes megállapításokkal, hiszen az önszervezıdı

képesség vagy a polimorfizmus olyan tulajdonságok, amelyek más biológiai (sıt nemcsak

biológiai) rendszerekben is megtalálhatóak. Az ehhez hasonló molekuláris gépezetek

tulajdonságainak, szervezıdési elveinek megismerése technológiai szempontból is fontos.

Emiatt érdemes ezt a különleges fehérjekomplexumot alaposan tanulmányozni, hogy

szerkezetének és mőködésének hogyanjait és miértjeit megérthessük.

Irodalom

9

Irodalom

A baktériumok mozgató mechanizmusa

Mikroszkóp alatt jól megfigyelhetı, hogy a baktériumok aktív helyváltoztató

mozgásra képesek. Ez az úszó mozgás flagelláris filamentumok forgatásával történik. Ezek a

sejt felszínérıl messze, akár 15 µm-re is kinyúló, mintegy 30 különféle fehérjébıl felépülı

helikális filamentumok, amelyekbıl fajonként változó számú (1-10) található egy sejten. A

flagellum felépítésérıl és mőködésérıl több összefoglaló jellegő cikket is írtak (Manson,

1992; Wilson & Beveridge, 1993; Schuster & Khan, 1994; Blair, 1995; DeRosier, 1995;

Aizawa, 1996; Namba & Vonderviszt, 1997; Macnab, 2003; 2004).

A forgó mozgást egy membránba ágyazott, több különbözı fehérjébıl összeálló

makromolekuláris struktúra, a bazális test hozza létre. Az itt létrejövı forgást egy különleges

szerkezeti egység, a kampó viszi át a filamentumra. A kampó egyúttal kardáncsuklóként a

forgás tengelyét is képes megváltoztatni. Az a tény, hogy itt valóban forgó mozgás történik,

egy filamentum üveglapra kitapasztásával igazolható. Ekkor maga a sejttest fordul el

mikroszkóppal jól láthatóan a filamentum körül (Berg & Anderson, 1973; Silverman &

Simon, 1974; Larsen és mts., 1974).

A motort a belsı sejtmembránon átáramló protonok (illetve egyes esetekben Na+-

ionok) hajtják, egy körbefordulás mintegy 1000 protont igényel (Matsuura és mts., 1977;

Manson és mts., 1977; DeRosier, 1995). Az így elért forgási sebesség átlagosan 15-20 ezer

fordulat/perc, de megfigyeltek már 90 ezres percenkénti fordulatszámot is (Lowe és mts.,

1987; Kudo és mts., 1990; Magariyama és mts., 1995). A forgás 20-30 µm/sec-os úszási

sebességet biztosít oly módon, hogy a filamentumok csokorba állnak össze egy balmenetes

szuperhélixet alkotva, és így hajtják elıre propellerként a sejtet (Macnab & Koshland, 1972).

Ez a haladás azonban nem folyamatos. A sejt pár másodpercig egyenesen úszik, amit

körülbelül egy tizedmásodpercnyi idıre kalimpáló mozgás követ. Ilyenkor a motor normális,

kívülrıl nézve az óramutató járásával ellentétes irányú forgása egy pillanatra átvált az

óramutató járásával megegyezı irányú forgásra (Larsen és mts., 1974). A forgásirány

megváltozása csavaró feszültséget kelt a filamentumban, és szintén egy pillanatra

jobbmenetes szuperhélixszé alakítja. Ennek következtében az egyes filamentumok szétválnak,

és egymástól függetlenül forognak, ami a sejt véletlenszerő elfordulásához vezet, így a

Irodalom

10

következı egyenes úszási szakasz már az új irányba történik (Macnab & Ornston, 1977;

Turner és mts., 2000). A külsı környezeti hatások különféle szignál transzdukciós

mechanizmusokon keresztül erısen befolyásolják a kalimpáló szakaszok gyakoriságát, ami

biztosítja, hogy a baktérium mozgása a tápanyagokban gazdag területek felé történjen. Végsı

soron ez az alapja a baktériumok túlélési hatékonyságának (Namba & Vonderviszt, 1997).

A bazális test

Mint minden forgó motor a bazális test is hengerszimmetrikus, álló, illetve mozgó

részekbıl áll. Az álló részeket a külsı és a belsı membránhoz, illetve a peptidoglikán

réteghez kötıdı győrők alkotják, a mozgó részt pedig a bennük forgó rotor. A bazális testen

belül is több kisebb struktúrát sikerült elkülöníteni, melyeket különféle fehérjék építenek fel

(1. ábra). Az MS győrő a rotor része, a belsı membrán vonalában helyezkedik el és mintegy

25 FliF fehérje alkotja (Jones és mts., 1990; Sosinsky és mts., 1992; Ueno és mts., 1992).

Szintén a rotor részei a FliG fehérjék, amelyek szoros kapcsolatban állnak a FliF fehérjékkel

és a számuk is megegyezik velük (Francis és mts., 1992). Ugyanakkor a FliG, FliM és FliN

fehérjék az MS győrő citoplazmatikus oldalán elhelyezkedı, és szintén a rotorhoz tartozó C

győrő alkotórészei, és együttesen az úgynevezett kapcsoló komplexet alkotják (Driks &

DeRosier, 1990; Khan és mts., 1992; Francis és mts., 1992; 1994; Fukuoka és mts., 2007). A

kapcsoló komplex végzi a motor forgásirányának átváltását.

A MotA és MotB proteinek transzmembrán fehérjék (Dean és mts., 1984; Sharp és

mts., 1995; Zhou és mts., 1995). Mindkettıbıl 10-20 darab alkot egy közös komplexet (Block

& Berg, 1984; Blair & Berg, 1988). Ez a komplex részben a peptidoglikán réteghez, részben a

belsı membránhoz kötıdik, és ennek megfelelıen az álló részhez tartozik (Namba &

Vonderviszt, 1997; Fukuoka és mts., 2007). A MotA fehérje a belsı membránon át alkot egy

protonvezetı csatornát (Blair & Berg, 1990), és valószínő, hogy a komplex a FliG fehérjével

is szoros kölcsönhatásban van (Garza és mts., 1996; Lloyd és mts.,1996).

A rotorhoz kapcsolódó hajtótengely a rúd. Ezt négy fehérje alkotja: FlgB, FlgC, FlgF,

FlgG, illetve ide tartozik még a FliE, ami a rúdhoz csatlakozó adapter fehérje (Homma és

mts., 1990a; Saijo-Hamano és mts., 2004). Az elsı három fehérjébıl egyenként mintegy hat

darab alkotja a rúd közeli (sejt felé esı) végét, míg a negyedik körülbelül 26 kópiáját

tartalmazza a rúd távoli vége (Jones és mts., 1990; Sosinsky és mts., 1992). Az axiális

rendszer többi komponenséhez hasonlóan a rúd fehérjéi is helikális szervezıdésőek (Saijo-

Irodalom

11

Hamano és mts., 2004). A rudat két csapágy tartja a helyén: az L győrő és a P győrő. Az

elıbbi a külsı membránba ágyazódik be és mintegy 25 darab FlgH fehérje alkotja, az utóbbi

ugyanennyi FlgI fehérjébıl áll és a peptidoglikán réteghez kötıdik (DePamphilis & Adler,

1971; Jones és mts., 1990; Sosinsky és mts., 1992). Az LP győrő szilárd komplexet alkot,

mely nagyon ellenálló a külsı kémiai hatásokkal szemben (Akiba és mts., 1991).

Itt kell említést tennünk az axiális fehérjék exportját végzı rendszerrıl is, mivel az

többé-kevésbé a bazális testbe (az MS győrőbe) ágyazva végzi mőködését (2. ábra). Az

apparátusnak kettıs szerepe van: egyrészt a flagelláris fehérjék felismerése, másrészt a

bejuttatásuk a filamentum közepén húzódó csatornába. A flagelláris exportrendszer egy

specializálódott III típusú fehérjeexport szerkezet (ugyanehhez a típushoz tartozik számos

patogén baktérium virulencia faktorainak kiválasztását végzı mechanizmus is). A rendszert

számos fehérje alkotja, melyek közül némelyiknek a pontos funkciója még ismeretlen. A

membránba ágyazott elemek (FlhA, FlhB, FliO, FliP, FliQ, FliR) közül az elsı kettı a

citoplazmatikus elemek (elsısorban a FliI) kötıdését segíti elı, illetve az FlhB ezen kívül még

az export szubsztrát specificitást is szabályozza. A FliI ATP-áz aktivitásával a fehérjeexport

hatékonyságát növeli, de nem elengedhetetlenül szükséges hozzá (Minamino & Namba,

2008). A FliH a FliI ATP-áz aktivitását szabályozza, a FliJ egy általános chaperon (egyéb,

specializálódott chaperonok az FlgN, FliS, FliT), a FliK a kampó hosszát állítja be. A

flagelláris fehérjék felismerése feltehetıen a rendezetlen terminális régiókban található

megkülönböztetı jel (szignálszekvencia) révén történik (Kornacker & Newton, 1994; Végh és

mts., 2006). Ugyanakkor a csatornába való bejutásuk mikéntje továbbra sem ismert, bár

valószínősíthetı, hogy a szők keresztmetszet (20 Å) miatt csak részben vagy egészen

letekeredett formában haladhatnak benne.

Irodalom

12

MS győrő MS győrőFlhB

FliR FliQ FliP FliO

C győrő C győrőFliI FliI

FliI FliIFliI FliI

FliI

FlhA

FliH

FliH

FliJ

Axiálisfehérje

Axiálisfehérje

Axiálisfehérje

1. ábra: A bakteriális flagellum felépítése. A különbözı színek eltérı fehérjéket jelentenek. A szaggatott vonalak a takarásban lévı szerkezeteket jelölik. (Namba & Vonderviszt, 1997; Yonekura és mts., 2002)

2. ábra: A flagelláris exportrendszer sematikus ábrája. Sötétkék szín jelöli a bazális test, világoszöld pedig az export apparátus elemeit. Az exportálandó fehérje sárga színő. (Macnab, 2004 alapján).

Irodalom

13

Az axiális fehérjék és a filamentum felépülése

A szekvenciális hasonlóságok alapján az axiális fehérjék három csoportba oszthatók:

az elsıbe a tartoznak rudat alkotó proteinek, a kampófehérje és a HAP1, a másodikba a

flagellin és a HAP3, míg a HAP2 önmagában alkot egy családot (Homma és mts., 1990a,

1990b). Ugyanakkor mindegyik axiális fehérje közös szerkezeti motívumokkal:

konzerválódott terminális régiókkal és változékony középsı szakasszal rendelkezik. Az

utóbbiakon belül hidrofób aminosavakból álló héttagú ismétlıdések találhatók, ami az α-

helikális kötegekbe rendezıdı szekvenciák sajátossága (Homma és mts., 1990a). Korábban

azt feltételezték, hogy a szomszédos alegységek terminális régiói alkotják a helikális

kötegeket a polimerizáció során, stabilizálva ezáltal a filamentumot. Az újabb eredmények

azonban megkérdıjelezték ezt a modellt, és inkább az alegységen belüli helikális kötegek

lehetıségét valószínősítették (Yonekura és mts., 2003).

A különféle (proteolítikus, kaloriméteres, NMR) vizsgálatok feltárták, hogy az axiális

fehérjék terminális régiói rendezetlen szerkezetőek, szemben a rendezett struktúrájú, kompakt

középsı szakasszal (Vonderviszt és mts., 1989; 1992a; 1998; Furukawa és mts., 2002).

Ugyanakkor az elızı szakaszban leírtaknak megfelelıen a rendezetlen terminális régiók a

fehérjék leginkább konzerválódott részét alkotják, ami jelentıs és sokrétő szerkezeti és

funkcionális szerepükre utal. Egyik legfontosabb feladatuk a polimerizáció szabályozása:

rendezetlenségüknek köszönhetıen a citoplazmában nem, csak a filamentum távoli végén

tudnak a monomer alegységek aggregálódni (Iino, 1974; Vonderviszt és mts., 1991; 1995;

Mimori-Kiyosue és mts., 1997). Ezen kívül az alegységek közötti kölcsönhatásokat is

befolyásolják, illetve lehetıvé teszik a különféle típusú axiális fehérjék közötti kapcsolatokat

(Vonderviszt és mts., 1998; Kitao és mts., 2006). Végül feltehetıen a rendezetlen terminális

régiók jelentik azt a megkülönböztetı jelet, melynek révén a flagellum specifikus

exportrendszer felismeri ezeket a fehérjéket (Kornacker & Newton, 1994; Végh és mts.,

2006).

Irodalom

14

3. ábra: A flagellum felépülésének menete. (Namba & Vonderviszt, 1997)

Az eddigiek alapján a filamentum

felépülése a következıképpen történik (3. ábra)

(Macnab, 2004). Elıször kialakul az MS győrő,

majd ebbe beleágyazódik az export rendszer.

Ezután létrejön a motor és a kapcsoló komplex. Az

export apparátus segítségével két lépcsıben felépül

a rúd az öt fehérjéjébıl, melyhez szükség van egy

segédfehérjére (FlgJ), amely a rudat átmenetileg

lezárja. Eközben a peptidoglikán réteg áttörésénél

kialakul a P-győrő, majd a külsı membránnál az L-

győrő. A rúd elkészülte után a segédfehérje leválik,

és elkezdıdik a kampó felépítése. Ez szintén

igényel egy segédfehérjét (FlgD), ami átmenetileg

lezárja a kampót (Ohnishi és mts., 1994). Miután a

kampó elérte a megfelelı hosszúságot (55±6 nm),

az exportrendszer specificitása a rúd-kampó jellegő

fehérjék felismerésérıl a filamentum típusú

fehérjékére (flagellin, HAP fehérjék) vált át (Ferris

és mts., 2006). A kampó végérıl leválik az FlgD sapka, helyette sorban ráépülnek a kis

példányszámú asszociált fehérjék: a HAP1, majd a HAP3, végül a HAP2 (Homma & Iino,

1985). A helikális filamentum felépülése csak ezután indulhat meg a HAP3 és a HAP2 között,

majd a továbbiakban a filamentum végén.

A kampó

A rúdhoz már a sejten kívül kapcsolódik hozzá a következı erısen görbült szerkezető

elem, a kampó (1. ábra), amely egyrészt létrehozza a kapcsolatot a motor és a filamentum

között, másrészt képes a forgástengely irányának tág határok között történı

megváltoztatására. Hossza 55±6 nm, és mintegy 130 fehérje alegységbıl áll (Hirano és mts.,

1994). Ezt az értéket két fehérje szabályozza: a fliK és a flhB (Hirano és mts., 1994;

Irodalom

15

Kutsukake és mts., 1994), de valószínőleg nem a hagyományos értelemben vett molekuláris

vonalzóként.

Az alegységek képesek polimerizálódni in vitro körülmények között (Kato és mts.,

1982), de in vivo szükség van egy segédfehérjére is a kampó létrehozásához: ez az FlgD. A

filamentum felépülése során elıször néhány FlgD alegység molekuláris sapkaként ráépül a

rúd végére, majd alatta, azaz az FlgD sapka és a rúd között megindul a kampófehérjék

polimerizációja. Amikor a kampó elkészült, az FlgD alegységek leválnak a filamentum

végérıl, hogy helyet adjanak a további komponensek ráépülésének (Ohnishi és mts., 1994). A

kampó másik érdekes tulajdonsága, hogy nagyfokú polimorfizmusra képes: a környezeti

körülmények megváltozása esetén egymástól lényegesen eltérı helikális formákat vesz fel

(Kato és mts., 1984). A szerkezetérıl tudjuk, hogy 11 darab, egymással csaknem

párhuzamosan futó protofilamentum alkotja, amelyek közül mindig a görbület belsı oldalán

lévı a legrövidebb, a külsı oldalán lévı a leghosszabb. Mivel ezek folytonosan cserélıdnek,

ezért nagyfokú flexibilitásra van szükség. A legvalószínőbbnek tőnı magyarázat a kampó

kardáncsuklóként való mőködésére a protofilamentumok konformációjának a forgásiránnyal

ellentétesen történı folytonos változása, melynek köszönhetıen a filamentum tengelye

változatlan helyzetben marad.

A kampófehérje szerkezetérıl tudjuk, hogy a többi axiális fehérjéhez hasonlóan

kompakt magja és rendezetlen terminális régiói vannak. A kompakt mag két, fıként β-

lemezekbıl álló domént tartalmaz (Samatey és mts., 2004). Az önszervezıdı képesség annak

is köszönhetı, hogy a rendezetlen terminális régiók képesek α-helikális kötegekbe

rendezıdni, és ezáltal polimerizálódni, akárcsak a többi axiális fehérjénél. Ugyanakkor

valószínő, hogy nem ez a fı hajtóerı a kampó szerkezetének kialakulásánál, inkább csak a

kampó stabilizációjában és a polimerizációs képességében van szerepe.

A kampó és a filamentum között van egy nagyon rövid összekötı szakasz, amit két

kampó asszociált fehérje alkot: a HAP1 (FlgK) és a HAP3 (FlgL) (Ikeda és mts., 1987).

Mindkét fehérjébıl 13 darab alkotja az összekötı győrőt (Homma és mts., 1984a; Ikeda és

mts., 1987; Jones és mts., 1990). Ennek a szakasznak a legfontosabb szerepe valószínőleg a

kampó és filamentum szerkezeti különbségeinek áthidalása, az ebbıl eredı feszültségek

mérséklése (Namba & Vonderviszt, 1997). A többi axiális fehérjéhez hasonlóan a HAP1 és a

HAP3 terminális régiói szintén rendezetlenek (Homma és mts., 1990a; Vonderviszt és mts.,

1992a; Furukawa és mts., 2002).

Irodalom

16

A flagelláris filamentum

A flagellum leghosszabb része a filamentum, amelyet a flagellin nevő fehérje épít fel,

és akár 30000 alegységbıl is állhat. A filamentum helikális szerkezető, és (a kampóhoz

hasonlóan) 11 egymáshoz képest kismértékben elcsúsztatott protofilamentum alkotja

(O’Brien & Bennett, 1972). Külsı átmérıje 230 Å (Mimori és mts., 1995) és 11 flagellin

alegység alkot két menetet a helikális szerkezetben, azaz menetenként 5.5 alegység van

(Namba & Vonderviszt, 1997). A helikális filamentum egy szuperhélixet alkot, ez teszi

képessé a baktérium propellerszerő elırehajtására. A filamentum két nagyon lényeges és

figyelemre méltó tulajdonsága az önszervezıdı képesség és a polimorfizmus. Az

önszervezıdı képesség azt jelenti, hogy az egyes alegységek megfelelı körülmények hatására

képesek polimerizálódni, ami azért különleges, mert a szuperhelikális struktúra miatt ezek az

alegységek eltérı környezetben vannak. A polimorfizmus az egymástól lényegesen eltérı

külsı megjelenési formák felvételére való képességet takarja.

Ezek a formák többek között a következık lehetnek: egyenes, normál (dugóhúzó

alakú), spirális, fodros (ívelt), stb. (Asakura, 1970) Az egyenes filamentum lehet balra (L-

típus) vagy jobbra (R-típus) dılı (Kamiya és mts., 1979). Az eltérı formák magyarázata az,

hogy a flagellin alegységek két, egymástól kis mértékben eltérı konformációt vehetnek fel.

Ugyanakkor azt is megállapították, hogy egy protofilamentum mentén a konformáció nem

változik. Ha mind a 11 protofilamentum ugyanazzal a konformációval rendelkezik, akkor

egyenes filamentumot kapunk: az egyik konformáció esetén L-típusút, a másiknál R-típusút.

A normál, balra dılı helikális filamentumban mindkét konformációjú protofilamentum

megtalálható (4. ábra) (Asakura, 1970; Calladine, 1975; 1976; 1978). A külsı környezeti

feltételek, mint az ionerı vagy a pH megváltozása (Kamiya & Asakura, 1976; 1977), erıs

ellenáramlás (Hotani, 1982), valamely aminosavcsere (Martinez és mts., 1968) hatására,

illetve a motor forgásirányának megfordulása esetén (Berg & Anderson, 1973; Silverman &

Simon 1974; Larsen és mts., 1974) egy vagy több protofilamentum mentén kooperatívan

megváltozik a konformációs állapot, és ezáltal a normál filamentumból valamely másik forma

jöhet létre. Ez tulajdonság teszi lehetıvé a haladó mozgásból a kalimpáló állapotba való

áttérés mechanizmusát is.

Irodalom

17

4. ábra: A filamentum polimorfikus modellje.

A felsı sorban a filamentum morfológiája, az alsóban az alegységek elrendezıdése látható. A két szín az alegységek kétféle konformációját jelöli. Balról jobbra haladva az egyes típusok elnevezése: (1) L-típusú

egyenes, (2) normál, (3) ívelt és (4) R-típusú egyenes. (Namba & Vonderviszt, 1997)

Az önszervezıdı képesség szorosan összefügg a HAP2 mőködésével, ezért annak

mechanizmusával ott foglalkozunk. A polimerizáció és az önszervezıdés részletesebb

vizsgálata elıtt azonban célszerő a flagellin molekula és a filamentum szerkezetét

megismerni.

A flagellin molekulatömeg fajonként erısen eltér, az általunk használt, Salmonella

typhimurium-ból származó fehérje molekulatömege 51.5 kDa (Kanto és mts., 1991).

Proteolítikus emésztési kísérletek segítségével megállapították, hogy két fı részre osztható. A

rendezetlen terminális régiók könnyen emészthetık, míg a kompakt belsı mag - ez mintegy

41 kDa molekulatömegő, a jele F41 - viszonylag jól ellenáll a proteolízisnek. Kalorimetriás

vizsgálatokból az is kiderült, hogy ez a belsı mag három doménbıl áll. További emésztéssel

egy 27 kDa-os fragmentumot (F27) lehetett elkülöníteni (Kostyukova és mts., 1988;

Vonderviszt és mts., 1989; 1990). A 494 aminosavból álló flagellin 1-55 és 451-494 szakasza

tartozik a rendezetlen terminális régiókhoz, a 56-450 szakasz alkotja az F41-es fragmentumot,

ezen belül a 178-422 az F27-est (5. ábra) (Vonderviszt és mts., 1991; Yamashita és mts.,

1995). A másodlagos szerkezetre a terminális régiókban az α-hélixek, a belsı részen pedig a

β-lemezek és a β-fordulatok jellemzıek (Fedorov és mts., 1988; Vonderviszt és mts., 1990).

Különbözı baktériumfajokból származó flagellinek összehasonlításával azt találták, hogy a

terminális részek, mégpedig a rendezetlen régióknál jóval hosszabb szakaszon (mintegy 180

Irodalom

18

aminosav az NH2-végen és 100 a COOH-végen) konzervatívak és nagyfokú homológiát

mutatnak. Ezzel szemben a belsı mag változékonysága nagy (Joys, 1985; Wei & Joys, 1985;

Trachtenberg & DeRosier, 1988; Kanto és mts., 1991).

Mindez arra utal, hogy a terminális régióknak fontos szerepük van a filamentumok

felépítésében és mőködésében (Namba és mts., 1989; Homma és mts., 1990a; DeRosier,

1992), ezért ezeket részletesebb vizsgálatoknak vetették alá. Egyrészt azt találták, hogy

ezeknek a fehérjeszakaszoknak nagy az α-hélix-, illetve a helikális kötegképzı potenciáljuk

(Fedorov és mts., 1988; Vonderviszt és mts., 1990), másrészt a cirkuláris dikroizmus (CD)

mérésével azt is kimutatták, hogy bár harmadlagosan rendezetlen a szerkezetük, de

tartalmaznak dinamikusan változó fel-/letekeredı másodlagos helikális struktúrákat

(Vonderviszt és mts., 1989; 1990). Proteolítikus emésztési kísérletekbıl és magmágneses

rezonancia (NMR) spektrumokból ugyanakkor az derült ki, hogy polimerizálódva, azaz a

filamentumban ezek a terminális régiók rendezıdnek, stabil harmadlagos szerkezetet vesznek

fel (Aizawa és mts., 1990). További vizsgálatok azt is kiderítették, hogy valószínőleg

egymásba tekeredı amfipatikus α-helikális kötegeket alkotnak (az eredeti feltételezés szerint)

a szomszédos flagellin alegységek végei (Yamashita és mts., 1995). Terminálisan csonkított

fragmentumokkal végzett kísérletekbıl az is kiderült, hogy ezek a régiók nem szükségesek a

filamentum létrehozásához: megfelelı mennyiségő ammónium-szulfát jelenlétében a

polimerizáció a csonkított alegységekkel is lehetséges. A szerepük sokkal inkább a

filamentum stabilizálásában és a polimorfizmus létrehozásában rejlik (nélkülük csak egyenes

filamentumok keletkezhetnek) (Vonderviszt és mts., 1991).

A monomer flagellin és a filamentum szerkezetét röntgendiffrakciós és

elektronmikroszkópos kísérletekkel vizsgálták. Ezek során egyenes filamentumokat

használtak, mivel ezek egyféle konformációs állapotú alegységekbıl állnak, ezért egyszerőbb

a szerkezetük, mint a normál filamentumnak. A vizsgálatok révén sikerült az F41 fragmentum

szerkezetét 2 Å felbontással, a filamentumét pedig 4 Å felbontással meghatározni (Mimori és

mts., 1995; Morgan és mts., 1995; Samatey és mts., 2001; Yonekura és mts., 2003).

A kapott eredmények alapján megállapítható, hogy a flagellin négy doménbıl (D0,

D1, D2, D3) áll (5. ábra). Az N-terminális vég a D0-ban van, innen indulva a lánc végigmegy

az összes doménen, a D3-ban visszafordul, és ismét végigmegy az összes doménen, azaz a C-

terminális vég szintén a D0-ban van. Ezeken kívül érdemes még megemlíteni a D0 és D1

domént összekötı viszonylag hosszabb szakaszt, amit a filamentumban betöltött helye (lásd

késıbb) alapján küllı régiónak (DS) neveztek el. A D0 a monomer formában rendezetlen

Irodalom

19

terminális régiókat tartalmazza, azonban a polimerizáció után mindkét láncvég α-hélixet

alkot, melyek a filamentumban helikális kötegekbe állnak össze (Yonekura és mts., 2003). A

D1 domén jellemzıen α-hélixekbıl áll, míg a D2 és D3 döntıen β-szálas szerkezető (Samatey

és mts., 2001).

5. ábra: A flagellin térszerkezete és másodlagos struktúrája.

Az utóbbin sárga szín jelöli az α-hélixeket, zöld a β-lemezeket, lila a β-fordulatokat. Alatta a domének szekvenciához való hozzárendelése látható, még lejjebb pedig az alegységek közötti kölcsönhatásokban résztvevı szakaszok külön-külön csoportosítva a 11-, az 5-, a 6- és a 16-menetes hélix mentén fennálló

kapcsolatokat. (Yonekura és mts., 2003 alapján)

A filamentum szerkezetét a 6. ábra mutatja. Átmérıje mintegy 230 Å, közepén egy 20

Å átmérıjő csatorna húzódik. Sőrőségtérképe alapján a filamentum két részre osztható: egy

belsı (mag) részre, ami sugárirányban 10-tıl 55 Å-ig terjed, és egy külsı részre 55-tıl 115 Å-

ig. A belsı részen két nagy sőrőségő koncentrikus képzıdmény különíthetı el: a belsı győrő

(10-30 Å), melyet a flagellin alegységek D0 doménjei alkotnak, és a külsı győrő (35-55 Å),

melyet a D1 domének építenek fel. A két győrőt összekötı küllıket a DS domén alkotja

Irodalom

20

(innen jön az elnevezésük). A D0 és D1 domén helikális kötegei mind tengely-, mind

oldalirányban szorosan kölcsönhatnak, stabilizálva ezáltal a filamentumot (Mimori és mts.,

1995; Yonekura és mts., 2003). Csonkított flagellinekbıl képzett filamentumokat vizsgálva

megállapították, hogy már pár aminosav levágása esetén is helytelenül tekeredik fel a belsı

győrő, és a belsı csatorna helyén aggregátumok keletkeznek. Ugyanakkor hosszabb

szakaszok elemésztésekor egyre nagyobb darabok tőnnek el az aggregátumból. Ez a

megfigyelés is azt bizonyítja, hogy a terminális régiók a belsı győrőt alkotják (Yamashita és

mts., 1995).

6. ábra: A filamentum keresztmetszeti (tengelyirányú) képe.

Az ábrán 11 alegység, azaz két teljes menet látható. A különbözı színek a különbözı másodlagos szerkezeti elemeket jelölik. (Yonekura és mts., 2003)

A belsı győrővel szemben a filamentum külsı részén az egyes alegységek jól

elkülönülnek egymástól, és két részre oszlanak. A külsı győrőhöz csatlakozik 60-tól 80 Å-ig

a vertikális oszlop domén, melyet a flagellin D2 doménje alkot. Ehhez kapcsolódik a D3

domén által felépített 50 Å hosszúságú nyúlvány, melyet egy keskeny nyak oszt fel két részre.

Irodalom

21

A külsı rész a balkezes ötmenetes hélix mentén szomszédos alegységgel áll kölcsönhatásban

(Mimori és mts., 1995; Yamashita és mts., 1995; Mimori-Kiyosue és mts., 1997).

A szerkezetek ismeretében mind a polimorfizmusra, mind az önszervezıdésre

magyarázatot adhatunk. A polimorfizmus jobb megértéséhez csonkított flagellinekbıl

növesztett filamentumok vizsgálatai járultak hozzá (Mimori-Kiyosue és mts., 1996; 1997).

Ezek a filamentumok egy újfajta szimmetriával rendelkeztek, ami mind az L-, mind az R-

típusútól eltért: az Lt-típusúval. A csonkítás miatt a filamentumok nem rendelkeztek belsı

győrővel, a külsı győrő pakolása viszont csaknem tökéletesen megegyezett az R-típusúéval.

Viszont a protofilamentumok (a külsı győrő távolságában) sokkal nagyobb mértékben

fordultak el a filamentum tengelyéhez képest, mint az R- vagy az L-típusnál. Ennek alapján

elmondható, hogy a külsı győrő magától az R-típusú szimmetriát választja, de a belsı

győrővel való kölcsönhatása olyan feszültségeket okoz, amik az elfordulási szöget

megváltoztatják. Ugyanakkor az elfordulási szög szabja meg a kétféle protofilamentum

arányát is, mivel a hengerpalást megfelelı záródása csak így biztosítható.

A kétfajta szimmetria közötti átkapcsolás pontos mechanizmusának felderítésére

kiterjedt molekuladinamikai szimulációt végeztek (Kitao és mts., 2006). Ennek során az

alegységek között háromféle kölcsönhatás típust különítettek el: „állandó” kölcsönhatásokat,

melyek minden konformációban jelen vannak, „csúszó” kölcsönhatásokat, melyek kis

energiaváltozással járnak, és „kapcsoló” kölcsönhatásokat, melyek az alegységek közötti

kölcsönhatásokat az alegységen belüliek rovására stabilizálják. A szimuláció megmutatta,

hogy a sóhidak és hidrogénkötések kialakulása az eredetileg (monomer formában) R-típusú

konformációval rendelkezı alegységeket az L-típus felvételére ösztönzi.

Az önszervezıdı képesség két fontos kérdést vet fel: hogy továbbítódnak a flagellin

molekulák a polimerizáció helyére, ami a filamentum csúcsán van (Iino, 1969), és itt hogyan

történik maga a polimerizáció. A második kérdéssel a HAP2-sapka mőködésénél

foglalkozunk. Az elsıvel kapcsolatban már régóta tudjuk, hogy a filamentum különféle

alegységei a belsı csatornán keresztül jutnak el a polimerizáció helyéhez, ami a folyamatosan

épülı flagellum csúcsán van (Morgan és mts., 1993; 1995; Mimori és mts., 1995). Szintén

tudható, hogy a következı szerkezeti egység fehérjéinek az expressziója csak az elızı egység

elkészülte után indul el (a HAP1 a kampó-fehérje után, a HAP3 a HAP1 után, stb.)

(Kutsukake és mts., 1990; Liu & Matsumura, 1994; Aizawa, 1996). Az viszont részleteiben

még ma sem ismert, hogyan haladnak elıre a monomerek a csatornában. A filamentum nagy

felbontású szerkezetébıl ugyanakkor kiderült, hogy a belsı csatorna átmérıje mindössze 20 Å

Irodalom

22

(Yonekura és mts., 2003), ami nem teszi lehetıvé például a flagellin alegységek számára,

hogy natív térszerkezettel ide beférjenek. Erre két elmélet létezik: az egyik szerint a

filamentum lokálisan kitágul a monomer áthaladásának a helyén, míg a másik azt állítja, hogy

az alegységek részben vagy egészen letekeredve jutnak át a csatornán (Ruiz és mts., 1993).

Mindenesetre valószínőnek tőnik, hogy a terminális régióknak a továbbításban is fontos

szerepük van, mivel a csatornában haladó alegység elsısorban a belsı győrőt alkotó

végszakaszokkal kerülhet kapcsolatba (Mimori-Kiyosue és mts., 1997). Végül a flagellin

alegységek a filamentum csúcsához érkeznek, ahol a HAP2 sapkával lépnek kölcsönhatásba,

és alatta polimerizálódnak.

A HAP2-sapka

A filamentum végén egy molekuláris sapka található, amit öt darab HAP2 (FliD)

fehérje épít fel (Ikeda és mts., 1984; 1985; 1987; Imada és mts., 1998; Maki és mts., 1998). A

sapka a flagellin molekulák polimerizációjához szükséges (Homma és mts., 1985; 1986),

hiányában a sejten nem képzıdik filamentum (a felépülés megáll a kampónál), a flagellin

alegységek nem épülnek be a filamentum végére, hanem monomer formában az

extracelluláris térbe ürülnek (Homma és mts., 1984b). Másrészt viszont a sapkával ellátott

filamentumhoz kívülrıl nem lehet további flagellin molekulákat hozzáadni (Homma és mts.,

1986). Eszerint a sapka szerepe egyrészt a flagellin kijutásának a megakadályozása, másrészt

a polimerizáció elısegítése. Ez okozza azt a furcsa kettısséget, hogy a HAP2 nagyon erısen

kapcsolódik a filamentum végéhez, és ezáltal megakadályozza a flagellin molekulák

kiürülését az extracelluláris térbe, ugyanakkor mégis elég laza a kötıdés ahhoz, hogy az újabb

és újabb alegységek képesek legyenek a sapka és a filamentum vége közé ékelıdni.

Laboratóriumi körülmények között viszont éppen a sapkával ellátott filamentum az,

amelyre nem tudnak további alegységek ráépülni (Ikeda és mts., 1985). In vitro kétféle módon

keletkezhet filamentum a monomerekbıl: ammónium-szulfát (Ada és mts., 1963;

Wakabayashi és mts., 1969), illetve rövid filamentum kezdemények (magok) hozzáadásával

(Asakura és mts., 1964). Az eltérı konformációs állapotú alegységek kopolimerizálhatók, és a

különféle polimorfikus formájú magokra bármilyen monomer ráépíthetı (a normálra akár

csonkított is, ha elegendıen magas az ammónium-szulfát koncentrációja, ekkor spirális lesz a

kialakuló filamentum) (Asakura & Iino, 1972; Kamiya és mts., 1980).

Irodalom

23

A Salmonella typhimurium-ból származó HAP2 molekulasúlya 49.8 kDa és 466

aminosavból áll. A molekula szerkezeti vizsgálatai azt mutatták, hogy a többi axiális

fehérjéhez hasonlóan a HAP2 is rendezetlen terminális régiókkal, illetve egy 40 kDa-os

kompakt maggal (HP40) rendelkezik, másrészt viszont szekvenciálisan nem hasonlít hozzájuk

(Vonderviszt és mts., 1998). Ugyanakkor úgy tőnik, hogy kismértékben homológ egyes

chaperonokkal.

A HAP2 monomerek képesek nagyobb, győrőszerő struktúrákba rendezıdni:

dekamereket, pentamereket és kismértékben egyéb oligomereket alkotni (Ikeda és mts., 1996;

Imada és mts., 1998; Maki és mts., 1998). Ez a rendezıdés erısen hımérséklet-, pH- és

ionerı-függı: 36°C alatt a dekamer, felette a pentamer forma jellemzı (Vonderviszt és mts.,

1998), 8-as pH alatt a dekamer, 8.5-es pH felett viszont a monomer forma van túlsúlyban, és a

sókoncentráció növelése is a monomerképzıdés irányába tolja el az egyensúlyt (Imada és

mts., 1998).

A különféle struktúrák felépülésére NMR- és CD-spektrumok, illetve keresztkötéses

kísérletek alapján a következı modellt állították fel (Vonderviszt és mts., 1998). Öt HAP2

molekula győrőszerően összekapcsolódva egy pentamert alkot. Ennek a szélessége 120 Å, a

vastagsága pedig 25 Å. Kialakulásában a HP40 fragmentumok közötti kölcsönhatásoknak van

döntı szerepük. Két ilyen pentamer aztán egy bipoláris dekamerré áll össze, amelyben a

pentamerek rendezetlen terminális régiókat tartalmazó oldalai kapcsolódnak egymáshoz oly

módon, hogy ezek a szakaszok α-helikális kötegekké fonódnak össze.

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok (Yonekura és mts., 2000; Maki-Yonekura és

mts., 2003) megerısítették ezt a képet (7. ábra). Ezek szerint a HAP2 négy doménbıl áll:

fedılemez, nagy láb, vékony rúd, kötılemez. A polipeptidlánc feltehetıen a flagellinhez

hasonlóan fut végig ezeken: az N-terminális vég a kötılemezen van, innen indulva a lánc

végighalad az összes doménen, a fedılemeznél visszafordul, és ismét végigmegy az összes

doménen, azaz a C-terminális vég szintén a kötılemezen van (Maki-Yonekura és mts., 2003).

A kötılemez és a vékony rúd a monomer formában rendezetlen terminális régiókat

tartalmazza, melyek a dekamer vagy a filamentum végét lezáró sapka kialakulásakor

rendezett (a többi axiális fehérjéhez hasonlóan α-helikális) térszerkezetet vesznek fel. A

kötılemez a filamentumhoz való kapcsolódásért, míg a vékony rúd feltehetıen a sapka

különleges flexibilitásáért felelıs. A nagy láb és a fedılemez (a többi axiális fehérje

jellemzıen β-szerkezető kompakt magjától némileg eltérıen) hasonló arányban tartalmaz α-

helikális és β-lemezes szerkezeti elemeket (Vonderviszt és mts., 1998).

Irodalom

24

7. ábra: A HAP2 sapka szerkezete.

A bal oldali ábra a HAP2 dekamer háromdimenziós sőrőségtérképének reprezentációja, a jobboldali pedig a HAP2-sapka és a filamentum vége által alkotott szerkezeté. A jobb alsó képen látható fordított L-alakú rés a

sapka és a filamentum között feltehetıen az újonnan érkezı flagellin alegység beépülési helye. A lépték a filamentum átmérıjével egyenlı (230 Å). (Yonekura és mts., 2000)

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok azt mutatják, hogy a filamentumot lezáró sapka

a pentamer forma (Maki és mts., 1998; Yonekura és mts., 2000). Ezt a szerkezetrıl nyert

ismeretek is alátámasztják, hiszen a HAP2 rendezetlen terminális régiói tudnak

kölcsönhatásra lépni a flagellin hasonló szakaszaival, ami csak a pentamer formánál

lehetséges. Feltételezhetı, hogy a sapka és a filamentum között hasonló kapcsolat van, mint a

filamentumon belül, azaz α-helikális kötegek biztosítják a stabilitást. A kötıdés erısségét két

további topológiai tényezı befolyásolja. Egyrészt a sapka ötszörös szimmetriája nem

illeszkedhet tökéletesen a filamentum 11-szeres szimmetriájához. Másrészt a filamentum vége

nem egy sík felület: részben - a hélix emelkedése miatt - az alegységek eltolódása egymáshoz

képest, részben az egy alegységen belüli strukturáltság igen bonyolult felületet eredményez.

Emiatt a sík HAP2 sapka alegységei eltérı erıséggel, illetve eltérı konformációban vesznek

részt a kölcsönhatásban, így a leggyengébben kötıdınél viszonylag könnyebben be tud épülni

egy új flagellin alegység (Vonderviszt és mts., 1998; Maki-Yonekura és mts., 2003).

Irodalom

25

Mindezek alapján a következı modellt állították fel a HAP2 sapka mőködésére (8.

ábra). A korábban leírtaknak megfelelıen a flagellinek polimerizációja a HAP3 és a HAP2

között indul meg, majd a továbbiakban a filamentum végén folytatódik. A belsı csatornán

keresztül megérkezik a flagellin alegység feltehetıen részben vagy egészen letekeredett

formában. Itt a sapka egyrészt megakadályozza, hogy kikerüljön az extracelluláris térbe,

másrészt az effektív koncentráció megnövelésével meggyorsítja a polimerizációt.

Másodpercenként akár 20 flagellin alegység is képes beépülni (Iino, 1974). A sapka alatt lévı

üreg a nagysága alapján éppen egy flagellin alegységet tud befogadni, ami lehetıvé teszi a

natív térszerkezet újbóli kialakulását anélkül, hogy más alegységekkel aggregálódna közben.

A mechanizmus alapján a HAP2 egyfajta feltekeredést segítı chaperonnak is tekinthetı

(Ikeda és mts., 1993), amit a gyenge homológia is alátámaszt.

8. ábra: A HAP2-sapka és a filamentum vége közötti kölcsönhatás modellje.

A felsı ábra a HAP2-sapka és a filamentum vége által alkotott szerkezetet mutatja be az öt HAP2 alegység öt különbözı nézıpontjából. Az alsó ábra a HAP2-alegységek lábainak mozgását mutatja be egy (kék színnel

jelölt) új flagellin alegység beépülése során. (Maki-Yonekura és mts., 2003)

Az új flagellin alegység beépülésének helye a következı szabad hely lesz az

egymenetes hélix mentén. Az ehhez tartozó HAP2 alegység az új flagellin alegységhez fog

kötıdni, míg a másik négy HAP2 kis mértékben konformációt vált (8. ábra). Az apró

elmozdulások eredményeként a sapka folyamatosan felfele mozog (alegységenként 4.7 Å-

mel), illetve a flagellinek beépülésével ellentétes irányban forog (alegységenként 6.5 fokkal)

(Yonekura és mts., 2000; Maki-Yonekura és mts., 2003). A konformációs változások

energiáját közvetlenül feltehetıen a flagellin kötıdése, végsı soron pedig a fehérjeexportot

hajtó proton gradiens biztosítja (Minamino & Namba, 2008).

Célkitőzés

26

Célkitőzés

A teljes bakteriális flagellum rendkívül bonyolult makromolekuláris struktúra,

amelynek egyszerre csak egyes részei tanulmányozhatóak megfelelı alapossággal.

Vizsgálataink ennek megfelelıen a flagelláris filamentum felépülésére, a filamentum

stabilitására, illetve a HAP2 sapka ebben játszott szerepének felderítésére korlátozódtak.

Kísérleteink során konkrét céljaink a következık voltak:

• A rendezetlen terminális régiók szerepének tisztázása a filamentum felépülésében. A

fı célkitőzés a kölcsönhatásban résztvevı csoportok pontos felderítése volt festett

flagellin monomerek terminális csonkítás utáni polimerizációjával.

• A flagelláris filamentum stabilitásának, illetve a HAP2 stabilizáló képességének

pontosabb jellemzése a következı munkaterv alapján:

� A natív filamentum stabilitásának vizsgálata különös tekintettel a HAP2 sapka

esetleges stabilizáló hatására.

� A rekonstruált filamentumok stabilitásának vizsgálata HAP2 nélkül különféle

rekonstruálási módszerek és körülmények alkalmazása esetén.

� Megfelelı módszer kidolgozása a HAP2 rekonstruált filamentumokhoz történı

kötıdésének detektálására.

� A rekonstruált filamentumok stabilitásának vizsgálata HAP2 kötıdése után.

Ezen belül különféle inkubálási technikák alkalmazásával a filamentum végére

bekötıdött HAP2 molekulák mennyiségének változtatása, és a stabilizációs

különbségek mikrokaloriméter, illetve spektropolariméter segítségével történı

detektálása.

• A kapott eredmények felhasználásával egy olyan eljárás kidolgozása, melynek

segítségével intakt sapkával ellátott filamentumok hozhatók létre. Ennek fontossága

abban rejlik, hogy így lényegében az in vivo létrejövı filamentumokat lehet

tanulmányozni, azaz a baktériumokban ténylegesen fennálló kölcsönhatások

vizsgálhatók.

Anyagok és módszerek

27


Felhasznált vegyszerek és mőszerek

A vizsgálatok során felhasznált fehérjék (flagellin és HAP2) a Salmonella

typhimurium SJW1103-as törzsébıl (i szerotípus) származtak. A tripszin, a tripszin inhibitor,

a Staphylococcus aureus V8 törzsbıl származó endoproteináz Glu-C (V8) és az endoproteináz

Lys-C (ELC) a Boehringer-tıl származtak. A többi vegyszer is analitikai tisztaságú volt, és

hagyományos kereskedelmi forrásokból származott.

A rekonstruált filamentumokkal végzett mérések foszfát pufferban (10 mM Na-

foszfát, 150 mM NaCl, pH=7.0), míg a natív filamentumokkal végzett kísérletek Trisz-

pufferban (20 mM Trisz-HCl, 150 mM NaCl, pH=7.8) történtek. A flagellin koncentrációja

minden esetben 1mg/ml körül volt (amennyiben nem jelezzük másként a szövegben).

A fehérjék preparálása során a centrifugálásokat BECKMAN Avanti és L7-55

centrifugákkal végeztük. Kis mennyiségő filamentum centrifugálásához BECKMAN TL-100

asztali ultracentrifugát használtunk. Az ioncserélı kromatográfiát Pharmacia FPLC

készüléken végeztük.

A spektroszkópiai (fotometria, fluorimetria, polarimetria) méréseknél különféle

HELLMA kvarcküvettákat használtunk.

Fehérjék expressziója, tisztítása

Natív filamentumok készítése

A natív filamentumokat a következı módon állítottuk elı: Az SJW1103 szalmonella

törzsbıl származó sejteket o/n növesztettük 3%-os élesztıkivonatot tartalmazó kultúrában

(LB tápoldat). A sejteket 4°C-on 10 perc 2000 rpm-es, majd 30 perc 4000 rpm-es

centrifugálással győjtöttük össze. A csapadékot Trisz-pufferban szuszpendáltuk és 3 percig

vortexszel kevertettük. Ezután a mintát újból centrifugáltuk, ezúttal 20 percig, 12000 rpm-

mel, 4°C-on. A csapadékot kidobtuk, mivel a letöredezett filamentumok a felülúszóban

voltak. Ezeket egy újbóli, 60 perces, 40000 rpm-es, 15°C-os ultracentrifugálással győjtöttük

össze és a fehérjét a mérésekig ebben a csapadék formában tároltuk.


28

Flagellin és HAP2 expressziója és tisztítása

Mind a vad típusú, mind a mutáns flagellinek expresszióját és tisztítását az

irodalomban megtalálható módszertan szerint hajtottuk végre apróbb módosításokkal

(Asakura és mts., 1964; 1966; Wakabayashi és mts., 1969; Vonderviszt és mts., 1989). A

mutáns flagellinhez az ioncserélı kromatográfia alkalmazása elıtt 5mM dithiothreitolt (DTT)

adtunk a molekulák közötti diszulfid hidak redukálása érdekében.

A HAP2-t az E. coli BL21(DE3) törzsében expresszáltuk, ami a pLysS és pKOT134

plazmidokat is tartalmazta. A fehérje tisztítása az irodalomban leírtaknak megfelelıen történt

(Ikeda és mts., 1996; Imada és mts., 1998).

Rekonstrukciós módszerek

A filamentum monomerizációja és depolimerizációja

A továbbiakban megkülönböztetem a filamentum monomerizációját a

depolimerizációtól. Az elıbbi a monomer flagellinek elıállítását jelenti a filamentumból, míg

az utóbbi a filamentum ellenırzött körülmények között történı lassú lebomlását. A

monomerizálásnál 10 percig 65-70°C-on inkubáltuk a fehérjeoldatot, majd újabb 10 percig

jeges vízfürdıben lehőtöttük, végül 12 percig, 95000 rpm-mel, 4°C-on centrifugáltuk. Az

utóbbira azért volt szükség, mert az esetleg az oldatban maradó filamentumkezdemények

polimerizációs magokként szolgálhatnak, és pár óra alatt az egész oldat újra polimerizálódhat.

A centrifugálás után a felülúszót megtartottuk, ez lett a monomeroldat, míg a csapadékot

eldobtuk.

A filamentum depolimerizációja a monomerizációnál lényegesen alacsonyabb

hımérsékleten történt: a natív filamentumok esetében 50, illetve 55°C-on, míg a rekonstruált

filamentumoknál 45, 42.5 és 40°C-on. A depolimerizáció folyamatát minden esetben a CD-jel

változásával követtük, az ezzel kapcsolatos beállítások a spektropolarimetriáról szóló

szakaszban találhatók.

A flagellin polimerizációja

A polimerizációra kétféle eljárást alkalmaztunk. Az elsınél a tisztított monomer

flagellinekbıl álló oldathoz 0.2-0.9 M-nyi ammóniumszulfátot ((NH4)2SO4) adtunk hozzá,

míg a másodiknál 10-20 %-nyi filamentumkezdeményt, azaz rövid filamentumot (magot). A


29

reakciót sokáig (pár órától pár napig terjedı intervallumban) hagytuk folyni, majd az elegy

centrifugálása után a felülúszót eldobtuk (megszabadulva ezzel az ammónium-szulfáttól,

illetve a nem polimerizálódott flagellin alegységektıl), a csapadékot pedig foszfát pufferban

feloldottuk. Megjegyzendı, hogy az ammónium-szulfátos polimerizáció után a centrifugálási-

szuszpendálási lépéseket többször is meg kellett ismételni. A polimerizáció eredményességét

sötét látóterő mikroszkóp használatával állapítottuk meg (lásd késıbb).

A magok létrehozásához elıször 0.8 M ammónium-szulfáttal az elızı szakaszban leírt

módon végrehajtottuk a polimerizációt (a tisztítási lépéseket is beleértve), majd néhány percig

tartó szonikálással apró darabokra törtük a filamentumokat.

A HAP2 sapka rekonstrukciója

A HAP2 sapka létrehozására irányuló kísérletekben a flagellin polimerizációjánál leírt

módon rekonstruált filamentumokhoz adtunk hozzá 10%-nyi HAP2-t (tömegarányosan). Az

inkubálást többféle körülmény beállításával is végrehajtottuk: 20 és 37°C-on, 2 órán keresztül

és o/n. A fölös HAP2-t ultracentrifugálással távolítottuk el (12 perc, 95000 rpm, 4°C). A

HAP2 kötıdés hatékonyságának ellenırzéséhez a HAP2-vel kezelt filamentumokhoz

monomer flagellint adtunk 20-szoros mennyiségben (tömegarányosan), majd egy napos 25°C-

on történı inkubálás után sötét látóterő mikroszkóppal ellenıriztük a filamentumok

növekedését.

Emésztési kísérletek

Áttekintés

A proteolítikus emésztési kísérletek kétféle célt szolgáltak és ennek megfelelıen két

típusuk volt. Az egyiknél a ciszteint tartalmazó mutáns flagellineket csonkítottuk a

fluoreszcens jelöléssel történı vizsgálatokhoz, a másiknál pedig a natív filamentumokat a

HAP2 stabilizáló szerepének bemutatásához (ezek elméleti hátterét lásd az eredményekrıl

szóló részben).


30

Rekonstruált filamentumok emésztése

Ahogy az korábban már említésre került, a flagellin rendezetlen terminális régiókkal

rendelkezik, amelyek proteolítikus emésztı enzimekkel könnyen eltávolíthatóak. A festési

kísérleteknél alkalmazott enyhe proteolítikus kezelés célja ezeknek a terminális régióknak az

ellenırzött eltávolítása volt. A fehérje méretének fokozatos csökkenése gélelektroforézissal

jól nyomon követhetı: a terminális régiók elemésztésével elıször az F40-es fragmentumot

kapjuk meg, majd további proteolízissel az F27-es kompakt magot, amely viszonylag jobban

ellenáll az emésztésnek. Az emésztéshez használt különféle proteolítikus enzimekrıl, illetve

az alkalmazott eljárásokról az irodalomban részletes leírások találhatók (Vonderviszt és mts.,

1991). A mostani vizsgálatok során alkalmazott korlátozott proteolízis során háromféle

emésztı enzimet használtunk: az F(20-494) fragmentum elıállításához ELC-t, az F(1-461) és

az F(30-461) fragmentumokhoz V8-at, míg az F(67-450) fragmentumhoz tripszint. Az

emésztések eredményeként kapott fragmentumokat ioncserélı kromatográfiával különítettük

el a kisebb fragmentumoktól, illetve az el nem emésztett flagellintıl.

Natív filamentumok emésztése

A natív filamentumok proteolítikus kezelése tripszinnel történt, és ennek célja a

HAP2-sapkával nem rendelkezı filamentumok teljes elemésztése volt (azaz a sapkával

lezártak elkülönítése). A fehérjekoncentráció ezeknél a méréseknél 3 mg/ml körüli volt. A

filamentumokat elıször 20 percig 45°C-os hıkezelésnek vetettük alá, majd hozzáadtuk a

tripszint (1:50 tömegarányban). A proteolítikus kezelés szintén 45°C-on történt és 12 órán át

tartott, a végén tripszin inhibitor hozzáadásával állítottuk le (1:40 tömegarányban). Az

elemésztett fragmentumokat és az enzimeket ultracentrifugával (10 perc, 60000 rpm, 25°C)

választottuk el az intakt (emésztetlen) filamentumoktól. A felülúszót kidobtuk, a csapadékot

pedig nagyon óvatosan (nehogy megint eltöredezzenek a sapkával lezárt filamentumok)

szuszpendáltuk Trisz-pufferban.

Ellenırzı lépések

Tisztaság és koncentráció ellenırzése

A fehérjék tisztaságát, illetve az emésztési folyamatot poliakrilamid

gélelektroforézissel (SDS-PAGE) ellenıriztük (Stryer, 1995). A fehérjék koncentrációját az


31

abszorpciós görbéjük felvételével határoztuk meg a Beer-Lambert törvény alapján (Cantor &

Schimmel, 1980) egy JASCO V-550 típusú spektrofotométerrel. 1 cm úthosszú küvettánál, a

280 nm-en megadott moláris extinkciós koefficiensek behelyettesítésével és a formula

átalakításával a következı alakra hozható az összefüggés:

C=3.1·A280 (monomer flagellin)

C=2.9·A280 (HAP2)

Itt A280 a 280 nm-en mért abszorpciót jelöli, a koncentrációt pedig a képlet

alkalmazásával mg/ml-ben kapjuk meg. Fontos megjegyezni, hogy a flagellinre megadott 3.1-

es érték a monomer állapotra vonatkozik, azaz a koncentráció méréséhez elıször

monomerizálni kell a filamentumot. Ennek oka az, hogy a filamentum nagy mérete miatt

erısen szórja a fényt, ami komolyan befolyásolhatja az elnyelés mért értékeit.

Mikroszkópos vizsgálatok

A különféle polimerizációs kísérletek ellenırzéséhez sötét látóterő mikroszkópot

használtunk. Ez egy hagyományos Nikon LABOPHOT-2 típusú fénymikroszkóp volt, melyet

sötét látóteret biztosító kondenzorral szereltek fel. A képalkotás immerziós technikával

történt, azaz a kondenzorlencse és a tárgylemez közti rést n=1.515 törésmutatójú immerziós

olaj töltötte ki. A használt 20-szoros és 40-szeres objektívekkel megfelelı nagyítást lehetett

elérni, amivel már tanulmányozni tudtuk a filamentumokat.

A natív filamentumok emésztés utáni elektronmikroszkópos vizsgálata 1% (w/v)

uranil-acetáttal negatívan festett mintákon történt. Az alkalmazott mőszer egy JEM1010

(JEOL) elektronmikroszkóp, a tipikus nagyítás pedig 50000-szeres volt.

Mutagenezis

Áttekintés

A fluoreszcens vizsgálatoknál tiol-reaktív festékeket használtunk, amihez szükséges

volt ciszteint tartalmazó mutáns flagellinek gyártása (mivel a vad típusú flagellin nem

tartalmaz ciszteint). A ciszteint pontmutációként (azaz egyetlen aminosav megváltoztatásával)

illesztettük be a flagellin középsı, variábilis régiójába, amirıl irodalmi ismereteink alapján

feltételeztük, hogy nem elengedhetetlenül szükséges a filamentumképzıdéshez. Eredetileg

háromféle pontmutánst (S356C, G365C, G377C) gyártottunk, mivel elıfordulhatott volna,


32

hogy valamelyik mégis zavarja a filamentumok képzıdését, illetve bármilyen egyéb módon a

flagellin rendes mőködését. Ezek közül az egyikbıl (G365C) nem kaptunk jó klónt, a másik

kettıbıl viszont sikerült filamentum képzésére alkalmas fehérjét gyártani. A fluoreszcens

vizsgálatoknál végül az S356C került felhasználásra.

Az irányított mutagenezis a hagyományos módon, egyes szálú DNS (M13mp18 fliCi

(KpnI, BamHI) SS-DNS) felhasználásával történt. Az M13mp18 fliCi (KpnI, BamHI) SS-

DNS olyan egyes szálú M13mp18 DNS, mely a KpnI-BamHI hasítóhelyeken beillesztett vad

típusú fliCi (azaz flagellin) gént tartalmazza. A mutáns géneket a pKOT1 vektor segítségével

transzformáltuk a megfelelı sejtekbe. A pKOT1 annak a plazmidnak az elnevezése, amely a

pBR322 plazmidból az EcorI hasítóhelyen a vad típusú fliCi gén beillesztésével jött létre (9.

ábra).

Primerek megtervezése

Az irányított mutagenezis elsı lépéseként kijelöltük a mutációk pontos helyét, és ez

alapján megterveztük a primer szekvenciákat. A hely kijelölésében a fent már említett

szempontokon kívül azt is célul tőztük ki, hogy az eredeti aminosav a ciszteinhez nagyjából

hasonló mérető legyen, és a cisztein bevitelét egyetlen bázis megváltoztatásával meg tudjuk

oldani. Ezek alapján a következı primer szekvenciákat terveztük meg:

Mutáció Primer szekvencia Eredeti kodon Új kodon S356C 5’-acggtacatgcaaaactgc-3’ S356: tcc C356: tgc G365C 5’-aaactgggttgcgcaga-3’ G365: ggc C365: tgc G377C 5’-tctattggttgtaaaactta-3’ G377: ggt C377: tgt

A primer szekvenciában a módosított kodont vastag bető jelöli, azon belül külön

kiemeltük a megváltoztatott bázist.

Mutagenezis, szekvenálás

A mutagenezis az irodalomban is szereplı hagyományos módon történt (Yamashita és

mts., 1995). Elıször foszforileztük a primereket, majd hibridizáltuk a vad típusú flagellint

tartalmazó egyes szálú DNS-sel (M13mp18 fliCi (KpnI, BamHI) SS-DNS), végül

szintetizáltuk az új szálat. Ezekhez a lépésekhez egy MJ Research PCR készüléket

használtunk.


33

A mutagenezis után a Sanger módszer szerinti kézi szekvenálással kerestük meg a jó

klónokat (Sanger & Coulson, 1975). Ehhez elıször egyes szálú DNS-t preparáltunk a mutáns

génekbıl, hibridizáltuk a szekvenáló primerrel és radioaktív jelölıvel (α-35S) láttuk el. A

polimerizációt a megfelelı ddNTP-kkel állítottuk le. A mintákat karbamidos poliakrilamid

gélelektroforézissel futtattuk, majd az eredményként kapott gélrıl autoradiogramot

készítettünk. Ennek kiértékelésével kerestük meg a jó (sikeresen mutált) klónokat.

További transzformációs lépések

A jó klónokat ezután E. Coli 7118-ba transzformáltuk, majd KpnI és BamHI

enzimekkel preparatív emésztést végeztünk rajtuk. A mintákat preparatív gélelektroforézissel

(SeaPlaque GTG agaróz gélen) futtattuk, melynek végén a mutáns gént tartalmazó inzerteket

kivágtuk a gélbıl. Az inzerteket beligáltuk az üres (azaz a KpnI és BamHI hasítóhelyek közti

szakasz nélküli) pKOT1 vektorba, majd az így kapott plazmidokat elıbb E. Coli 7118-ba,

majd E. Coli LB5000-be, végül elektroporáció segítségével a flagellin-deficiens SJW2536 S.

Typhimurium törzsbe transzformáltuk. Az így kapott mutáns törzsekbıl azután a vad típussal

megegyezı módon expresszáltuk és tisztítottuk a (mutáns) flagellineket.

Spektrofluorimetria, festési eljárások

Elméleti háttér

A fluoreszcencia spektroszkópia a fehérjék vizsgálatának egyik elterjedt módszere.

Lényege az, hogy a fehérje által elnyelt fény egy része fluoreszcencia formájában

visszasugárzódik, és ez a viszonylag lassú folyamat sokféle információval szolgál a

molekuláról, mivel a kromofórok, azaz a fény elnyelésére képes csoportok környezete erısen

befolyásolja egyrészt az elnyelésük, másrészt az emissziójuk tulajdonságait (Cantor &

Schimmel, 1980; Eftink, 1991). Az optikailag gerjesztett állapot kioltásának egy különleges

módja, amikor egy térben viszonylag közeli kromofór (az akceptor, A) kerül gerjesztett

állapotba, miközben az eredeti molekula (a donor, D) visszakerül az alapállapotba. Ezt hívjuk

fluoreszcencia rezonancia energiatranszfernek (FRET), amelynek Förster dolgozta ki az

elméletét (Förster, 1948).

A fehérjék természetes fluoreszcenciája többnyire gyenge, mivel az azért felelıs

három aromás aminosav (fenilalanin, tirozin, triptofán) fluoreszcencia érzékenysége alacsony.


34

Ezen olyan festékekkel lehet segíteni, amelyek stabilan képesek kapcsolódni a fehérjéhez és

erısen fluoreszkálnak. Ezek a festékek általában két részbıl állnak: az egyik a kötıdést

biztosítja, a másik a fluoreszcencia tulajdonságait (gerjesztési és emissziós spektrum) szabja

meg. A fluoreszcencia jelölés másik kedvezı tulajdonsága, hogy lehet olyan festékpárokat

találni, amelyeknél az egyik emissziós spektruma erısen átfed a másik gerjesztési

spektrumával, és így FRET vizsgálatokra alkalmasak (Cantor & Schimmel, 1980; Lakowicz,

1983; Eftink, 1991; Haugland, 2002).

Fluoreszcens jelölések

A fluoreszcens jelölésekhez tiol-reaktív festékeket használtunk. A FRET kísérletekben

a donor molekula 7-diethylamino-3-(4’-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin (CPM) vagy

Alexa Fluor 350 C5 maleimide (AF350), míg az akceptor molekula Alexa Fluor 488 C5

maleimide (AF488) volt, melyek a Molecular Probes-tól származtak. Mindhárom festék

kovalensen kötıdik a fehérje tiol-csoportjaihoz (Haugland, 2002). A jelölést a monomer

formájú (natív, illetve terminálisan csonkított) flagellinen végeztük. A felhasznált festékek

spektrális tulajdonságai a következık (Haugland, 2002):

Festék FRET szerep

Moláris extinkciós koefficiens

Abszorpciós csúcs

Emissziós csúcs

CPM Donor 33 000 cm-1·M-1 384 nm 470 nm AF350 Donor 19 000 cm-1·M-1 346 nm 442 nm AF488 Akceptor 65 000 cm-1·M-1 495 nm 519 nm

A tiol-reaktív fluoreszcens festékeket kovalensen kötöttük a ciszteint tartalmazó (natív

és csonkított) mutáns flagellinekhez az irodalomban szereplı standard eljárásoknak

megfelelıen (Haugland, 2002). A jelölési reakció elıtt a molekulák közötti diszulfid hidakat

Tris-(2-carboxyethyl)phosphine segítségével redukáltuk. A maradék festéket Sephadex G-25

oszlopon történı gélszőréssel választottuk el a megjelölt flagellintıl. A festés hatékonyságát a

következı képlettel számítottuk ki:

mlfehérje mg

lyamolekulasú Fehérje

(mól) mennyisége Fehérje

(mól) mennyiségeFesték ⋅=

εxA

Itt Ax az abszorpció értéke, ε pedig a festék moláris extinkciós koefficiense az

abszorpciós csúcsnál. Ezek számszerő értékei az elızı táblázatban láthatók. A flagellin és

csonkított fragmentumainak koncentrációját a 280 nm-en mért elnyelés alapján számoltuk ki


35

(a korábban részletezett módon), azonban azt korrigáltuk a festék abszorpciójával ugyanezen

a hullámhosszon (Haugland, 2002). A festés hatékonysága jellemzıen 40% és 70% között

volt, azaz 0.4-0.7 festék molekula jutott egy fehérje molekulára.

A festékkel jelölt flagellin molekulák polimerizációs képességének ellenırzése

céljából ammónium-szulfát hozzáadásával filamentum képzıdést indukáltunk. A

filamentumok létrejöttét fluoreszcencia mikroszkópiával vizsgáltuk meg, az ehhez használt

mőszer egy fluoreszcencia feltéttel ellátott Olympus BX50 mikroszkóp volt.

A FRET detektálásához elıször rövid filamentumokat készítettünk a jelöletlen

flagellinekbıl a korábban leírt polimerizációs eljárás segítségével. Következı lépésként

vékony rétegben donor molekulával jelölt monomereket polimerizáltattunk a rövid

filamentumok végére (a monomer:filamentum összetétel 1:50 volt tömegarányosan). A

vékony réteg azért fontos, hogy ne legyen túl nagy a fluoreszcens hátterünk, hanem csak a

kötıdés közelében legyenek festékmolekulák. Ezután AF488-cal megfestett alegységeket

adtunk a mintához 0.1 mg/ml koncentrációban, melyek kötıdését az akceptor 512 nm-nél

mért indukált fluoreszcenciájának FRET miatti megjelenésével detektáltuk. Ezeket a

méréseket egy számítógép által vezérelt Fluoromax-2 (Jobin-Yvon) fluoreszcens

spektrofotométerrel hajtottuk végre.

Spektropolarimetria

Elméleti háttér

A biológiai makromolekulák többsége optikailag aktív, melynek két formája van: az

optikai forgatás (ORD), ami a cirkuláris kettıs töréssel egyenértékő, és a cirkuláris

dikroizmus (CD), ami az ellipszicitással egyezik meg. Az elsı esetben a lineárisan poláros

fény síkja elfordul a mintán való áthaladás során. A másodikban a balra és jobbra cirkulárisan

poláros fény abszorpciójának eltérése miatt a mintát elhagyó fény elliptikus lesz (Cantor &

Schimmel, 1980). A fehérjék esetében különösen a kitüntetett iránnyal rendelkezı

másodlagos szerkezetek (α-hélix, β-lemez, β-fordulat) optikai aktivitása erıs, mivel ezeknél a

peptidkötések dipólmomentumai nagyjából párhuzamosan állnak, és így összeadódnak.

Ezeknek a másodlagos szerkezeteknek jellegzetes CD-spektrumuk van, mivel a forgatóerı,

akárcsak az elnyelés, a hullámhossz függvényében változik.


36

A másodlagos szerkezetekre jellemzı CD görbék segítségével elvileg bármilyen

ismeretlen szerkezető fehérje másodlagos struktúráinak aránya meghatározható a fehérje CD-

spektrumának ismeretében. Másrészt a denaturáció is vizsgálható a CD-jel mérésével, ugyanis

ennek során a másodlagos szerkezetek eltőnnek, a fehérje teljesen letekeredett állapotba kerül.

Ez természetesen azt eredményezi, hogy megszőnik az ezen szerkezetek rendezettségébıl

fakadó dipólmomentum, ami erısen lecsökkenti a CD-jelet. Ezzel a módszerrel jól

tanulmányozható például a hımérsékleti átmenet helye.

Mérési beállítások

A fehérjék CD görbéinek vizsgálata a távoli UV tartományban történt. A méréshez

használt mőszer egy szabályozható hımérséklető cellatartóval felszerelt JASCO J-720 típusú

spektropolariméter volt. A mérést minden esetben 1 mm vastagságú, termosztálható, hengeres

kvarcküvettával végeztük. A fehérje koncentrációja 1 mg/ml körüli volt. A CD-jelen kívül az

elnyelés nagyságát is ellenıriztük, mivel annak túl alacsony értéke rontja a jel/zaj arányt, a túl

magas viszont a bizonytalanságot növeli.

Alapvetıen háromféle különbözı típusú görbét vettünk fel: a CD-jel változását a

hullámhossz, a hımérséklet, illetve az idı függvényében. Az elsı egyszerően a CD-spektrum

felvételét jelentette, a második a denaturációs hımérséklet meghatározására szolgált, míg a

harmadikkal a filamentum depolimerizációját követtük nyomon. A spektrumméréseknél 300

nm-tıl 200 nm-ig vettük fel a CD-jelet 100 nm/perc sebességgel. A hımérsékleti görbéket

222 nm-en mértük, 20°C-ról 75°C-ra 50°C/óra sebességgel főtöttük fel a mintát. A 222 nm

kiválasztásában az játszott szerepet, hogy itt a fehérjék CD-jele általában nagy, ráadásul a

polimerizáció és a depolimerizáció során végbemenı α-hélix tartalom változás is itt követhetı

jól nyomon.

Végül az idımérés során 100 percig vettük fel a CD görbét szintén 222 nm-en. A

rekonstruált filamentumok 45°C-on végzett depolimerizációs vizsgálatánál a 100 perces

mérés két részre oszlott. Az elsı egy gyors felfőtési szakasz volt, ahol a mintát kb. 20°C-ról

mintegy 10 perc alatt az adott (45°C-os) hımérsékletre melegítettük, míg a maradék idıben

ezen a hımérsékleten vizsgáltuk a CD-jel változását. Hasonló mérést végeztünk 40°C-on és

42.5°C-on is. A natív filamentumok 50°C-on végrehajtott depolimerizációs vizsgálatánál ettıl

kissé eltérı módszert alkalmaztunk. A spektropolarimétert elımelegítettük 50°C-ra, mielıtt


37

betettük volna a mintát, ezzel elkerültük a kezdeti 10 perces tranziens szakaszt. Hasonló

mérést végeztünk 55°C-on is.

A görbék kiértékelését mind a hımérsékleti, mind az idımérések esetén részben a

JASCO által a mőszerhez biztosított Standard Analysis segédprogrammal (zajszőrés), részben

az ORIGIN grafikonkezelı programmal végeztük.

Mikrokalorimetria

Elméleti háttér

A fehérjék térszerkezetének változásait a termodinamikai paraméterek: az entrópia, az

entalpia, a hıkapacitás változása kíséri. Ezek mérésére szolgál a differenciális pásztázó

mikrokalorimetria (Differential Scanning Calorimetry, DSC), melynek segítségével

tanulmányozható különbözı fehérjék hıstabilitása, valamint a natív háromdimenziós

térszerkezetükbıl való letekeredésük. Ezáltal a molekulán belüli kölcsönhatások erısségére

(van der Waals erık, H-hidak, stb.), a molekula kompaktságára, a kooperatív egységek

(domének) számára következtethetünk.

A kalorimetriás mérések során a minta és a referenciaként használt puffer hıkapacitás-

különbségét mérjük a hımérséklet függvényében egy adott hımérséklettartományban. A

denaturáció egy (vagy több) éles csúcsként jelentkezik a hıkapacitás görbén. A folyamat

(kalorimetrikus) entalpiaváltozása a görbe alatti területtel egyenlı. Meghatározásánál

figyelembe kell venni, hogy a natív és a denaturált fehérje hıkapacitásai eltérnek egymástól,

melynek fı oka a natív állapotban eltemetett hidrofób csoportok felszínre kerülése.

A kalorimetrikus entalpiaváltozáson kívül meghatározható a Van't Hoff entalpia is,

mely az egyensúlyi állandó hımérsékletfüggésébıl számítható ki valamilyen adott

(alapesetben kétállapotú) denaturációs modellt feltételezve. Egy doménbıl álló fehérje és

kétállapotú átmenet esetén a kétféle entalpia megegyezik egymással. Ha ettıl eltérı esettel

van dolgunk, akkor az entalpiák értéke is különbözik. A kalorimetrikus entalpiaváltozás

magasabb értéke jellemzıen többlépcsıs, intermedier állapotokon keresztüli átmenetre utal,

míg a fordított eset (magasabb Van't Hoff entalpia) gyakran oligomer szerkezetet és az ezzel

járó erısen kooperatív denaturációt jelez.


38

Mérési beállítások

A HAP2 kötıdésének hatását vizsgáló DSC méréseket egy DASZM-4 típusú,

számítógéppel vezérelt differenciális pásztázó mikrokaloriméterrel végeztük, míg a

polimerizációs körülmények hatását a filamentum stabilitására egy MicroCal VP-DSC

segítségével tanulmányoztuk. A mérés során a kaloriméter két cellája közül az egyikbe a

mérendı minta, a másikba a referencia anyag került (azaz hıkapacitás-különbséget mértünk)

mindkét mőszernél. A rendszer felfőtésénél megfelelıen alacsony főtési sebesség (1°C/perc)

választásával kvázistacionárius folyamatra törekedtünk. A mérési tartomány a DASZM-4

esetében 10-70°C, míg a MicroCal VP-DSC-nél 15-75°C volt. Utóbbinál a mérés elıtt 30

percig az induló hımérsékleten termosztáltuk a rendszert.

A konkrét méréseknél elıször egy alapvonalat rögzítettünk (mindkét cellába referencia

oldatot töltve), majd az egyik cellában a referenciát a mérendı mintára cseréltük, és felvettük

a fehérjére jellemzı termogramot. A minta hıabszorpciós görbéjébıl kivontuk az alapvonalat,

ezzel kiküszöböltük a két cella közötti különbséget, és megkaptuk a fehérje Cp(T) függvényét.

A kapott eredményeket az ORIGIN grafikonkezelı program segítségével dolgoztuk fel

(simítás, görbe alatti terület számítása, stb.).

Eredmények

39

Eredmények és értelmezésük

A filamentum felépülésének vizsgálata FRET segítségével

Áttekintés

Kísérleteink elsı szakaszában a filamentum felépülését, illetve a flagellin rendezetlen

terminális régióinak ebben játszott szerepét tanulmányoztuk. A fı célkitőzés a

kölcsönhatásban résztvevı csoportok pontos felderítése volt festett flagellin monomerek

terminális csonkítás utáni polimerizációjával, kihasználva a fluoreszcencia rezonancia energia

transzfer (FRET) jelenségét.

A FRET két festékmolekula közötti erısen távolságfüggı, fotonkibocsátás nélküli

kölcsönhatás. Minden olyan folyamat, ami a donort és az akceptort közel hozza egymáshoz,

energiatranszfert fog eredményezni. Ennek köszönhetıen a FRET nagyon érzékeny eszköz a

makromolekulák közötti kölcsönhatások detektálására, így alkalmas annak felderítésére is,

miként építik fel a rendezetlen terminális régiók a filamentumok belsı magját.

Mivel a fluoreszcens jelölésekhez tiol-reaktív festékeket (CPM, AF350 és AF488)

választottunk, ezért elıször ciszteint is tartalmazó mutáns flagellineket kellett gyártanunk.

Ezután az így kapott mutáns flagellinek polimerizációja során detektáltuk a FRET jelenségét.

Végül különféle terminálisan csonkított flagellin fragmentumot készítettünk, és a FRET

segítségével megvizsgáltuk a polimerizációs képességüket.

Mutáns flagellinek készítése

A kiválasztott tiol-reaktív fluoreszcens festékek ciszteinhez tudnak kötıdni, azonban a

S. typhimuriumból származó flagellin aminosav szekvenciája egyetlen ciszteint sem tartalmaz

(Kanto és mts., 1991). A FRET kísérletek elsı lépése éppen ezért olyan mutáns flagellinek

gyártása volt, amelyek ciszteint is tartalmaznak.

A mutáció során a ciszteint a flagellin központi, változékony részébe illesztettük be,

mivel a molekulának errıl a régiójáról kimutatták, hogy nem szükséges alapvetıen a

filamentum kialakításához (Namba & Vonderviszt, 1997; Yamashita és mts., 1995; Mimori-

Kiyosue és mts., 1997). A pontmutáció pontos helyéhez három pozíciót választottunk ki: a

Eredmények

40

356-os szerint, a 365-ös glicint és a 377-es glicint, azaz összesen három különbözı

pontmutánst próbáltunk meg elkészíteni.

FliCi gén (3500 bp)

STARTSTOP

Kódoló szakaszpBR322

(4363 bp)

EcoRI

pKOT1(7863 bp)

EcoRIEcoRI

START

STOP

BamHI

KpnI

ÜrespKOT1

(5680 bp)

EcoRI

STOP

BamHI

KpnI

START

Inzert (2183 bp)

KpnI

EcoRI

BamHI

START

Inzert (2183 bp)

KpnI

EcoRI

BamHI

S356C

START

Inzert (2183 bp)

KpnI

EcoRI

BamHI

G365C

START

Inzert (2183 bp)

KpnI

EcoRI

BamHI

G377C

pKOT1(7863 bp)

EcoRIEcoRI

START

STOP

BamHI

KpnIS356C

pKOT1(7863 bp)

EcoRIEcoRI

START

STOP

BamHI

KpnIG365C

pKOT1(7863 bp)

EcoRIEcoRI

START

STOP

BamHI

KpnIG377C

9. ábra: A mutagenezis fıbb lépései

Az irányított mutagenezist a hagyományos génsebészeti technikák segítségével

hajtottuk végre egyes szálú DNS (M13mp18 fliCi (KpnI, BamHI) SS-DNS) felhasználásával.

A jó klónokat. preparatív emésztés (KpnI-BamHI) és gélelektroforézis után a pKOT1 vektor

Eredmények

41

segítségével (9. ábra) transzformáltuk több lépésen keresztül a flagellin-deficiens SJW2536 S.

Typhimurium törzsbe. A kapott mutáns törzsekbıl azután a vad típussal megegyezı módon

expresszáltuk és tisztítottuk a (mutáns) flagellineket. A mutagenezis végeredményeként a

három mutáció közül kettıbıl lettek jó klónok: az S356C és a G377C-bıl, melyek közül a

további vizsgálatoknál az S356C jelő mutánst használtuk fel.

A flagellinek filamentumba történı beépülésének vizsgálata

A kísérletek következı szakaszában az elızı lépésben legyártott S356C jelő mutáns

flagellin segítségével vizsgáltuk a filamentum felépülését. Ennek során fı célunk a flagellin

alegységek filamentum végére történı beépülésekor létrejövı energiatranszfer detektálása

volt.

A tiol-reaktív fluoreszcens festékeket kovalensen kapcsoltuk a ciszteint tartalmazó

mutáns flagellinhez. Donor és akceptor molekulának CPM-et, illetve AF488-at (Haugland,

2002) választottunk az energiatranszfer mérések során. Ennek a donor-akceptor párak magas

a kvantumhatásfoka, az abszorpciós spektrumaik jól elkülönülnek, ugyanakkor a CPM

emissziós spektruma jelentıs mértékben átfed az AF488 abszorpciós spektrumával. A CPM-et

394 nm-en gerjesztettük és a FRET jelenségét az akceptor aktivált fluoreszcenciájának

megjelenésével mutattuk ki 512 nm-en.

A mutáció során módosított 356-os pozíció a filamentum külsı oldalán helyezkedik el,

vagyis feltételezésünk szerint nem befolyásolta a polimerizációt. Annak bizonyítására, hogy a

fluoreszcens festékek kötıdése a flagellinhez valóban nem zavarja a filamentum kialakulását,

a CPM-mel, illetve AF488-cal jelölt flagellin polimerizációs képességét teszteltük AS-tal

indukálva a filamentum képzıdését (Wakabayashi és mts., 1969). Egynapos,

szobahımérsékleten történı inkubálás után fluoreszcencia mikroszkóppal megfigyelhetı volt,

hogy a festékkel megjelölt flagellin mintáink (0.2 M AS koncentráció felett) helikális

filamentumokká polimerizálódtak. A filamentumok képzıdése arra utal, hogy a festékek

flagellinhez kapcsolódása nem gátolta meg a polimerizációs képességet.

A következı kísérlet célja az volt, hogy detektáljuk mindössze néhány molekula

kötıdését a filamentumok végéhez. Az érzékenység növelése érdekében rendkívül rövid

filamentumokat készítettünk nagy (1M) AS koncentráció alkalmazásával, majd ezt a mintát

szonikáltuk, hogy tovább növeljük a szabad végek számát, amelyeken az alegységek

beépülése lezajlik. A jelöletlen filamentumok végeire csak néhány CPM által megfestett

Eredmények

42

flagellin alegységet polimerizáltattunk rá, hogy az energiatranszfer mérésekhez a donor

molekulákból minél vékonyabb réteget képezzünk, ezáltal minimalizálva a fluoreszcens

hátteret.

Az AF488-cal festett flagellin hozzáadása a CPM által megjelölt alegységekkel

lefedett rövid filamentumokat tartalmazó oldathoz a fluoreszcencia intenzitás csökkenését

eredményezte a CPM emissziós maximumánál (470 nm), miközben egy új csúcs jelent meg

512 nm körül (10. ábra, kék vonal). Az idı függvényében vizsgálva a fluoreszcens jel

változását 512 nm-en növekedést tapasztaltunk (11. ábra, kék vonal), amit a donor és akceptor

molekulák között létrejövı energiatranszferként, vagyis a flagellin alegységek filamentum

végén történı egymáshoz kötıdéseként lehetett interpretálni. A kontrollkísérletekben nem

észleltünk energiatranszfert a CPM és AF488 által megjelölt flagellin monomerek között az

oldatban.

10. ábra: Emissziós spektrumok 394 nm-es gerjesztési hullámhossz esetén.

Az egyes görbék natív flagellin (kék) és F(67-450) fragmentum (zöld) monomerek filamentumhoz történı hozzáadása esetében mutatják az intenzitás alakulását. Az alacsonyabb hullámhosszú csúcs a donor, a magasabb

az akceptor emissziós maximumát jelzi.

A terminálisan csonkított fragmentumok elkészítése

A következı lépés a festett flagellin monomerek terminális csonkítása utáni

polimerizációs vizsgálat volt, melynek során azt tanulmányoztuk, hogy a rendezetlen

terminális régiók közül melyik milyen szerepet játszik a filamentum felépülésében. Azt már

az irodalomból tudjuk, hogy a csonkított alegységek megfelelı körülmények között képesek

Eredmények

43

ráépülni a filamentumkezdeményekre (Vonderviszt és mts., 1991). Kérdés, hogy ebben

milyen szerepet játszanak az N-, illetve a C-terminális régiók. A kérdés megválaszolásához

fel lehet használni a festett monomereket, mivel ezek polimerizációja fluoreszcencia

mikroszkóppal, illetve a FRET jelenségét kihasználva fluoriméterrel jól követhetı.

A fragmentumok elkészítéséhez az elızıekben elkészített ciszteint tartalmazó S356C

jelő mutáns flagellint használtuk fel. Erısen specifikus proteázok alkalmazásával a flagellin

rendezetlen terminális régiói elıre meghatározott módon távolíthatók el, és az eredményül

kapott fragmentumok könnyen tisztíthatók ioncserélı kromatográfiával (Vonderviszt és mts.,

1991). Az F(20-494) fragmentumok, amelyeknél a flagellin 19 N-terminális aminosava

hiányzik, ELC-vel történı enyhe proteolítikus kezeléssel állíthatók elı, míg az F(1-461) és az

F(30-461) fragmentumokat V8 proteázzal történt emésztéssel kaptuk. Az F(1-461) intakt N-

terminális régióval rendelkezik, de hiányzik 33 C-terminális aminosava, míg az F(30-461)

mindkét végén csonkításokat tartalmaz. Ezeken túlmenıen mindkét rendezetlen terminális

régiót teljesen eltávolítottuk tripszines emésztéssel, ami az F(67-450) fragmentumot

eredményezte.

A csonkított fragmentumok kötıdése a filamentumok végéhez

A FRET kísérletek utolsó szakaszában a flagellin N- és C-terminális rendezetlen

régióinak polimerizáció során játszott szerepének felderítése érdekében megvizsgáltuk

különbözı terminálisan csonkított fragmentumok kölcsönhatását a flagelláris filamentumok

végével.

A tiol-reaktív fluoreszcens festékeket a fentebb már ismertetett módon kovalensen

kapcsoltuk a ciszteint tartalmazó mutáns flagellin terminálisan csonkított fragmentumaihoz.

Az AF488 által jelölt flagellin fragmentumok polimerizációjának FRET által történı nyomon

követése feltárta, hogy a 19 N-terminális aminosav eltávolítása utáni F(20-494)

fragmentumok hatékonyan tudtak kötıdni a filamentumok végéhez (11. ábra, piros vonal).

Ezzel szemben a C-terminális szakaszok eltávolítása a kötıdési képesség teljes elvesztését

eredményezte mind az F(1-461), mind az F(67-450) fragmentumok esetében (11. ábra, fekete

és zöld vonal).

Eredmények

44

11. ábra: Az 512 nm-en mért fluoreszcencia intenzitás idıbeli változása.

Az egyes görbék natív flagellin (kék), F(20-494) fragmentum (piros), F(1-461) fragmentum (fekete) és F(67-450) fragmentum (zöld) monomerek filamentumhoz történı hozzáadása esetében mutatják az emisszió

alakulását. Az F(20-494) fragmentumokkal lezárt filamentumhoz további F(20-494) alegységek hozzáadásakor tapasztalt jelváltozást a sárga görbe mutatja. A gerjesztési hullámhossz minden esetben 394 nm volt.

Habár az F(20-494) fragmentumok képesek voltak kötıdni a filamentumok végéhez,

fiziológiás körülmények között alkalmatlanok voltak a folyamatos polimerizációra, amit a

következı kísérlettel tártunk fel. Elsı lépésként AF488-jelölt F(20-494) fragmentumokat a

fent leírt módon kötöttünk a filamentumok végéhez, ami akceptorok által jelölt, csonkított

alegységekkel lezárt filamentumokat eredményezett. A donorok által jelölt CPM-F(20-494)

fragmentumok ezt követı hozzáadása során nem észleltünk energiatranszfert (11. ábra, sárga

vonal), ami arra utal, hogy az F(20-494) fragmentumok tengelyirányban nem képesek

egymáshoz kötıdni, vagyis feltehetıen csak egyetlen alegység réteget képeznek a filamentum

végén. A kontrollkísérletekben a CPM által megjelölt flagellin hozzáadása az AF488-cal

festett alegységekkel lezárt filamentumokhoz nagyon hasonló kötıdési görbéket

eredményezett, mint amiket a fent részletezett fordított elrendezés során kaptunk, ami arra

utal, hogy a dipólus geometria mindkét esetben hatékony energiatranszfert tesz lehetıvé.

Eredmények

45

A flagellin rendezetlen terminális régióinak kölcsönhatása a filamentum felépülése során

A bakteriális ostorok helikális filamentumainak szerkezete a monomer flagellin

rendezetlen terminális régiói által felépített legbelsı mag kivételével atomi felbontásban már

korábban meghatározásra került (Samatey és mts., 2001). A rendezetlen terminális régiókról

ugyanakkor tudjuk, hogy erıs hajlamot mutatnak amfipatikus α-hélixek kialakítására

(Vonderviszt és mts., 1990; 1992b). A flagellin polimerizációját ezeknek a rendezetlen

szakaszoknak α-helikális konformációba történı stabilizálódása kíséri (Aizawa és mts., 1990;

Namba & Vonderviszt, 1997; Yamashita és mts., 1998). Mindezek alapján korábban azt

feltételezték, hogy a tengelyirányban szomszédos alegységek α-helikális N- és C-terminális

régiói kölcsönhatnak, és összefonódó helikális kötegeket (coiled-coil) alakítanak ki a

polimerizáció során (Homma és mts., 1990a).

Ezzel szemben a legfrissebb eredmények azt mutatják, hogy a helikális kötegek ugyan

valóban léteznek, de nem az alegységek között, hanem az alegységeken belül alakulnak ki az

N- és C-terminális régiók összefonódásával. A már létrejött kötegek közötti hidrofób

kölcsönhatás alapvetı szerepet játszik a filamentum szerkezetének stabilizálásában (Yonekura

és mts., 2003).

A filamentum szerkezetérıl alkotott képünk megváltozásával saját eredményeink

értelmezését is módosítanunk kellett. Korábban úgy magyaráztuk megfigyeléseinket, hogy a

filamentumok távoli végén az alegységek szabad N-terminális véggel rendelkeznek, ami

hozzáférhetı az újonnan beépülı flagellin molekulák C-terminális szakasza számára. Az

újabb szerkezeti ismeretek tükrében a magyarázat ennél némileg bonyolultabb. Eszerint az

F(1-461), az F(30-461) és az F(67-450) flagellin fragmentumoknál teljesen hiányzik az

összefonódó helikális kötegek kialakításához szükséges C-terminális α-hélix. Ennek

hiányában ugyanakkor a helikális kötegek sem tudnak kialakulni, ami viszont az alegységek

közötti hidrofób kölcsönhatásokat is lehetetlenné teszi. A filamentumot stabilizáló

kölcsönhatások nélkül viszont nem tudnak új alegységek beépülni, ami azt eredményezi, hogy

ezek a fragmentumok teljesen elveszítik a polimerizációs képességüket.

Ezzel szemben az F(20-494) fragmentumnál az N-terminális α-hélix csak részben

hiányzik, vagyis a helikális kötegek feltehetıen részben ki tudnak alakulni. Ezek a

fragmentumok képesek voltak hozzákötıdni a filamentumok végéhez, ami arra utal, hogy a

tökéletlen helikális kötegek is képesek voltak elegendı stabilizáló hidrofób kölcsönhatás

létrehozására a már felépült filamentummal. Ugyanakkor nem észleltünk energiatranszfert a

Eredmények

46

donorokkal jelölt F(20-494) monomerek hozzáadásakor az akceptorral jelölt F(20-494)

alegységek által lezárt filamentumokhoz, vagyis mindössze egyetlen F(20-494) réteg tudott

kialakulni. Ebbıl arra következtethetünk, hogy a tökéletlen helikális kötegek egymással már

nem tudtak megfelelı hidrofób kapcsolatokat alkotni. Összességében elmondható, hogy

eredményeink alátámasztják a filamentum szerkezetének legújabb, alegységen belüli

összefonódó helikális kötegeket, és az ezek között fennálló, a szerkezetet stabilizáló hidrofób

kölcsönhatásokat tartalmazó modelljét.

A natív flagelláris filamentumok stabilitása

A HAP2 sapka hatása a natív flagelláris filmentumok stabilitására

Kísérleteink következı szakaszában a natív filamentumok stabilitását vizsgáltuk

HAP2 sapkával, illetve sapka nélkül. Ennek során elıször a filamentum denaturációs

hımérsékletét, illetve annak változását tanulmányoztuk különféle körülmények között.

A natív flagelláris filamentumokat több lépcsıben történı centrifugálással és

újraszuszpendálással választottuk le a baktériumokról és különítettük el tılük. A tisztítási

eljárás során a filamentumok könnyen kisebb darabokra törnek. Ennek köszönhetıen a natív

filamentum elegyek várhatóan mind HAP2-sapkával rendelkezı, mind anélküli

filamentumokat tartalmaznak. A natív filamentum minták olvadási profiljai kétfázisú

viselkedést mutattak (12. ábra és 13. ábra, piros vonal) a 222 nm-en mért távoli ultraibolya

CD spektroszkópia alapján. Kézenfekvınek tőnik az a magyarázat, hogy az elsı, 57°C körüli

átmenet a sapka nélküli filamentumok denaturációjához köthetı, míg a második, 61°C körüli

átmenet a HAP2-sapkával rendelkezı filamentumoknak köszönhetı. A kapott olvadási

profilok alapján feltételezhetı, hogy a filamentumoknak mintegy 20%-a tartalmazhat intakt

sapkát, ugyanakkor ez az arány eltért a különbözı mintákban.

Eredmények

47

25 30 35 40 45 50 55 60 65 70-300

-200

-100

0

Natív filamentum Natív filamentum emésztés után Natív filamentum inkubálás után

CD

-jel

[mde

g]

Hımérséklet [°C]

12. ábra: A natív flagelláris filamentum hıdenaturációjának CD-görbéje 222 nm-en

25 30 35 40 45 50 55 60 65 700

2

4

6

8

Natív filamentum Natív filamentum emésztés után Natív filamentum inkubálás után

A C

D-j

el d

eriv

áltja


13. ábra: A natív flagelláris filamentum CD-görbéjének deriváltja 222 nm-en

Eredmények

48

Arra a feltételezésre alapozva, hogy a HAP2 sapkával rendelkezı filamentumok

ellenállóbbak a hıindukált depolimerizációval szemben, mint a sapka nélküliek,

kialakítottunk egy eljárást az intakt HAP2 sapkával lezárt filamentumok elkülönítésére: a

natív filamentum mintákat hosszasan inkubáltuk 45°C-on tripszin jelenlétében. Míg a

flagelláris filamentumokról tudható, hogy meglehetısen ellenállóak a proteolítikus

emésztéssel szemben, addig a monomer flagellint nagyon gyorsan lebontják a proteolítikus

enzimek, mivel a terminális régiói rendezetlenek (Vonderviszt és mts., 1989; Aizawa és mts.,

1990). Feltételeztük, hogy a sapka nélküli filamentumok megnövelt hımérsékleten történı

inkubációja elısegíti a depolimerizációt. Az egyensúlyt még inkább a szétesés irányába lehet

eltolni proteázok hozzáadásával, mivel a fentebb leírtaknak megfelelıen proteolítikus

emésztéssel a monomerek hatékonyan eltávolíthatók az oldatból. Ezek alapján azt vártuk a

tripszinnel történı kezeléstıl magas hımérsékleten, hogy a sapka nélküli filamentumok teljes

depolimerizációját és megsemmisítését eredményezze. Másrészt viszont az intakt sapkával

rendelkezı filamentumokról feltételeztük, hogy túlélik a kezelést.

Kísérleteink tanúsága szerint a natív filamentumoknak csaknem 80%-a lebontódott a

45°C-on 12 órán át alkalmazott tripszines kezelésnek köszönhetıen, ami jó összhangban volt

az olvadási profilból kikövetkeztethetı arányokkal. Várakozásunknak megfelelıen a maradék

az eredeti minta második átmenetének megfelelı hıdenaturációs profilt mutatott (12. ábra és

13. ábra, zöld vonal). Az elektronmikroszkópos ábrák is azt mutatták, hogy ez a minta

megfelelı sapkával lezárt filamentumokat tartalmaz (14. ábra). A kontrollkísérletek során a

45°C-os, hosszan tartó inkubálás proteolítikus kezelés nélkül a CD-jel enyhe csökkenését

eredményezte, ugyanakkor az olvadási profil kétfázisú viselkedése megmaradt (12. ábra és

13. ábra, lila vonal). Megfigyeléseink azt mutatják, hogy a natív filamentum elegyek HAP2

sapkával rendelkezı része hatékonyan elválasztható a fent leírt eljárással.

Eredmények

49

14. ábra: Negatívan festett filamentum-sapka komplexumokról elektronmikroszkóppal készített mikrográf.

A nagyítás 50000-szeres, a lépték 100 nm-t mutat.

A HAP2 sapka depolimerizációt gátló szerepe a natív filamentumoknál

A denaturációs hımérséklet, illetve annak megváltozása sok mindent elárul egy

fehérjekomplexum stabilitásáról, azonban a flagelláris filamentumok esetében a stabilizáció

változását nemcsak a denaturációs hımérséklet eltolódásával, hanem a hıindukált

depolimerizációval szembeni ellenállás, a depolimerizációs sebesség megváltozásával is lehet

jellemezni, ahogy az már az elızı fejezetbıl is kiderült. A natív filamentumok

tanulmányozásának következı lépéseként ezért megvizsgáltuk a depolimerizáció alakulását

különféle körülmények esetén.

Eredmények

50

A HAP2 sapkával történı lezárás védıhatását a hıindukált depolimerizációval

szemben szintén a 222 nm-en mért távoli ultraibolya CD spektroszkópia segítségével

vizsgáltuk. A depolimerizáció során a CD jel intenzitása számottevıen csökken (Uratani és

mts., 1972), mivel a flagellin alegységek terminális régiói, melyek összefonódó helikális

kötegeket alkotnak a filamentáris szerkezetben (Samatey és mts., 2001; Yonekura és mts.,

2003), rendezetlen állapotot vesznek fel monomer formában (Vonderviszt és mts., 1989;

Aizawa és mts., 1990). Míg a natív filamentum minták meglehetısen gyorsan

depolimerizálódtak 50°C-on (15. ábra, piros vonal), addig a tripszines kezelés révén

megtisztított rész lassan változó CD jelet mutatott ezen a hımérsékleten (15. ábra, kék vonal).

A HAP2 sapkával rendelkezı filamentumok centrifugálással és újraszuszpendálással történı

elválasztása az emésztési elegytıl enyhe töredezettséget okozhat. Ellenıriztük, hogy a

megfigyelt lassú szétesés valóban jellemzı-e az intakt filamentum-HAP2 komplexumokra,

vagy ezekbıl a töredezett filamentumdarabokból ered. Amikor a nyers (mind HAP2 sapkával

rendelkezı filamentumokat, mind elemésztett és lebomlott flagellintörmeléket tartalmazó)

emésztési elegyeket közvetlenül vizsgáltuk meg, a depolimerizáció sebessége elenyészı volt

(15. ábra, zöld vonal), ami arra utal, hogy a natív filamentum-HAP2 komplexumok 50°C-on

ellenállnak a hıindukált depolimerizációnak. Tapasztalataink szerint a HAP2-sapkával történı

lezárás hatékonyan gátolta meg a filamentumok depolimerizációját még 55°C-on is (az adatok

nincsenek bemutatva).

0 20 40 60 80 100-75

-70

-65

-60

-55

-50

-45

-40

-35

-30

-25

Natív filamentum emésztés elıtt Natív filamentum emésztés után Natív filamentum emésztés után,

centrifugálás nélkül

CD

-jel

[m

deg]

Idı [perc]

15. ábra: A natív filamentum depolimerizációjának követése CD-vel, 50°C-on, 222 nm-en

Eredmények

51

A rekonstruált filamentumok stabilitása

A polimerizációs feltételek hatása a rekonstruált filamentumok stabilitására

Kísérleteink következı szakaszában a rekonstruált filamentumok stabilitását

vizsgáltuk különös tekintettel a HAP2 kötıdésének hatására. Mielıtt azonban erre rátértünk

volna, megvizsgáltuk, mennyiben befolyásolja a stabilitást, ha megváltoztatjuk a filamentum

monomer flagellinekbıl történı létrehozásának körülményeit.

A módszertani fejezetben leírtaknak megfelelıen kísérleteink során a filamentumokat

vagy ammónium-szulfát (AS), vagy rövid filamentumkezdemények (magok) segítségével

rekonstruáltuk a monomer flagellin alegységekbıl (Wakabayashi és mts., 1969). Ugyanakkor

tapasztalataink szerint mind az AS, mind a magok koncentrációjának módosítása jelentıs

mértékben megváltoztatta a rekonstruált filamentum tulajdonságait. Minél magasabb volt az

alkalmazott AS- (vagy mag-) koncentráció, annál gyorsabban ment végbe a polimerizáció,

ami több szerkezeti hiba kialakulásához vezetett, csökkentve ezáltal a létrejött filamentum

stabilitását. A mikrokalorimetriával kapott denaturációs hımérsékletek különbsége jól mutatja

ezt a jelenséget (16. ábra). Az ábra a monomer flagellin és a natív filamentum görbéjét is

tartalmazza, mivel ezek az elméletileg elérhetı hıstabilitás alsó, illetve felsı korlátjának

tekinthetık.

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Monomer (alsó korlát) Polimerizáció 0.9 M (NH

4)

2SO

4

Polimerizáció 0.6 M (NH4)

2SO

4


2SO

4


2SO

4

Natív filamentum (felsı korlát)

Hık

apac

itás

[cal

/°C

]


16. ábra: A rekonstruált filamentum stabilitási tartománya

Eredmények

52

A 0.9 M AS koncentrációval polimerizált filamentum átmeneti hımérséklete alig

magasabb a monomernél. A polimerizációhoz használt AS koncentrációjának csökkentésével

fokozatosan növekszik a denaturációs hımérséklet, ami javuló hıstabilitásra utal. A 0.2 M AS

alkalmazásával polimerizált minta átmeneti hımérséklete csak kis mértékben alacsonyabb a

natív filamentuménál. Ugyanakkor az is megállapítható, hogy a magok alkalmazása általában

magasabb átmeneti hımérsékleteket eredményez, mint az AS használata (17. ábra): 10%-nyi

maggal, illetve 0.2M AS-tal történı polimerizáció hozzávetıleg ugyanahhoz a denaturációs

hımérséklethez vezetett.

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

Polimerizáció 2% mag Polimerizáció 10% mag

Polimerizáció 0.2 M (NH4)2SO4

Hık

apac

itás

[cal

/°C

]


17. ábra: Magokkal történı rekonstrukció eredménye

A HAP2 kötıdése rekonstruált filamentumokhoz

A rekonstruált filamentumok stabilitásvizsgálatának logikus következı lépéseként

tanulmányozni kívántuk a HAP2 kötıdés hatását. Ehhez azonban elıször ki kellett

dolgoznunk egy olyan módszert, amelynek segítségével egyszerő eszközök felhasználásával

lehetséges a HAP2 kötıdésének detektálása a filamentum végéhez.

A HAP2-sapka kötıdését a filamentum növekedését gátlı hatása alapján kívántuk

detektálni, amihez a flagelláris filamentumok vizsgálatához széles körben alkalmazott sötét

látóterő mikroszkópiát használtuk fel. Elıször HAP2 nélkül polimerizáltuk a flagellint AS

vagy magok hozzáadásával. Az ammónium-szulfáttal végzett polimerizációknál azt

Eredmények

53

állapítottuk meg, hogy a sókoncentráció csökkenésével egyre hosszabbak és így egyre jobban

láthatóak a filamentumok. Ugyanakkor az ammónium-szulfát arányának növelésével egyre

több, de egyre rövidebb filamentumot kapunk (Wakabayashi és mts., 1969). Ezt a sajátosságot

lehet kihasználni nagyszámú filamentumkezdemény létrehozására, melyek monomer oldathoz

hozzáadva polimerizációt indukáló magokként viselkednek. Az ezekkel végzett

polimerizációs kísérleteknél azt tapasztaltuk, hogy a magok arányát csökkentve az elızıhöz

hasonló jelenség volt megfigyelhetı, azaz egyre hosszabb és jobban látható filamentumok

keletkeztek. Ez a módszer rendkívül érzékeny volt, már 1 %-nyi mag hozzáadása is elindította

a polimerizációt, sıt éppen ilyenkor keletkeztek a leghosszabb és így legjobban látható

filamentumok. Összességében megállapítható, hogy a sötét látóterő mikroszkópia nagyon

hatékonyan képes detektálni a polimerizáció megtörténtét.

A módszer kialakításának második lépéseként elvégeztük a polimerizációs kísérleteket

HAP2 hozzáadásával is. Ennek során 0.5-1 %-nyi HAP2-t adtunk hozzá a

filamentumoldathoz, majd pár órán át inkubáltuk szobahımérsékleten. Azután ehhez az

oldathoz adtunk sokszoros (10-100-szoros) mennyiségő monomert, majd több óráig vagy akár

pár napig is állni hagytuk, akárcsak a normál polimerizációs kísérleteknél. Az így kapott

minták közül egyikben sem voltak sötét látóterő mikroszkóppal detektálhatók filamentumok,

ami arra utal, hogy a HAP2 hozzáadása megakadályozta a képzıdésüket, mivel minden egyéb

körülmény megegyezett a normál polimerizációnál alkalmazottal, és a detektálási módszer

nagyon érzékeny a sapka nélküli magok jelenlétére, hiszen már egészen alacsony

magkoncentrációnál beindul a mikroszkóppal jól ellenırizhetı polimerizáció. Vagyis a

hozzáadott HAP2 kötıdött a filamentumokhoz, és ezt a kötıdést tudtuk is detektálni, azaz egy

egyszerő mikroszkópos vizsgálattal megállapítható, hogy a HAP2 valóban kapcsolódott-e a

filamentum végéhez. Sikerült tehát kidolgoznunk egy olyan módszertant melynek révén

egyszerő eszközökkel is detektálható a HAP2 kötıdésének ténye.

HAP2 kötıdésének hatása a rekonstruált filamentumok stabilitására

A HAP2 kötıdésének detektálása lehetıvé tette, hogy megvizsgáljuk a HAP2 hatását a

rekonstruált filamentumok stabilitására. Ennek során elıször (hasonlóan a natív filamentumok

vizsgálatához) a filamentum denaturációs hımérsékletét, illetve annak változását

tanulmányoztuk különféle körülmények között. Ugyanakkor bıvítettük a korábbi

módszertant, mivel ezúttal nemcsak spektropolariméterrel, hanem mikrokaloriméterrel is

végeztünk méréseket.

Eredmények

54

A filamentum-sapka komplexumot a rövid rekonstruált filamentumok és tisztított

HAP2 oldat elegyítésével hoztuk létre. A korábbi rekonsturálási próbálkozások (Maki és mts.,

1998) kimutatták, hogy a sapka kialakulásának hatékonysága széles pH tartományban (5 és 11

pH között) nem különbözött számottevıen, ugyanakkor az inkubálási hımérséklet

megváltoztatásának jelentıs hatása volt. A rekonstruálást 20°C-on, illetve 37°C-on hajtottuk

végre, variálva az inkubálási idıtartamokat.

A rövid filamentumok tisztított flagellinbıl készültek 0.8 M végsı koncentrációjú

ammónium-szulfát hozzáadásával. A HAP2 kötıdését polimerizációs kontrollkísérletekkel

ellenıriztük, ahol azt használtuk ki, hogy csak a HAP2-vel nem lefedett filamentumokra

tudnak további flagellin monomerek polimerizálódni és ezáltal hosszú, mikroszkóp alatt is

látható filamentumokat létrehozni. A polimerizációs vizsgálatot a korábban leírtakkal egyezı

módon végeztük, a filamentum:monomer arány 1:20 volt. A HAP2-vel inkubált mintákban

nem volt megfigyelhetı polimerizáció, ami a mikroszkóppal történı detektálás rendkívüli

érzékenysége miatt azt jelenti, hogy a HAP2 szilárdan kötıdik a flagelláris filamentumok

végéhez, és gyakorlatilag minden filamentumot, legalábbis részben, HAP2 fedett

(Vonderviszt és mts., 1998).

Alapvetıen ötféle mintát vizsgáltunk: kezeletlen filamentumot, illetve négy különbözı

módon létrehozott filamentum + 10% HAP2 keveréket. Az elsınél 2 órán át 20°C-on

inkubáltuk az elegyet, majd további kezelés nélkül lemértük. A másodiknál ugyanez volt az

inkubálási módszer, de a 2 óra letelte után a keveréket centrifugáltuk, a felülúszót leöntöttük

eltávolítva így a fölös (nem kötıdött) HAP2-t, majd a kapott csapadékot újraszuszpendálva

mértük az elegyet. A harmadik minta elkészítése ehhez teljesen hasonló volt, csak az

inkubálás nem 20°C-on, hanem 37°C-on történt. A negyedik mintánál ugyancsak 37°C-on

történt az inkubálás, azonban nem 2 óráig, hanem overnight.

A stabilizációra vonatkozó méréseket egyrészt cirkuláris dikroizmus (CD), másrészt

mikrokalorimetria (DSC) alkalmazásával végeztük el. A kísérletek során arra a kérdésre

kerestük a választ, hogy mennyiben változtatja meg a HAP2 bekötıdése a filamentum

stabilitását, illetve mennyire tekinthetı intaktnak az in vitro létrehozott sapka. Az utóbbi

esetben azt vártuk, hogy amennyiben intakt sapkák jönnek létre a filamentumok végén, akkor

az inkubálási körülményektıl, illetve az oldatban lévı szabad HAP2 mennyiségétıl nem

különösebben függ a stabilitás változása, feltéve persze, hogy a megfelelı számú sapka

képzıdéséhez elegendı HAP2-t adtunk a filamentumokhoz. A hımérséklet függvényében

felvett méréssorokkal azt próbáltuk kideríteni, hogy milyen hatással van a HAP2 kötıdése a

Eredmények

55

filamentum denaturációs hımérsékletére, azaz a stabilitására. Az in vivo tapasztalt

tulajdonságok alapján azt vártuk, hogy a HAP2 stabilizálja a filamentumot.

A CD-vel végzett mérések eredményeinek tanúsága szerint a rekonstruált

filamentumok HAP2-vel történı kezelése a stabilitás kismértékő növekedését eredményezte

(18. ábra). A rövid rekonstruált filamentumaink 52.3°C-on gombolyodtak le. A HAP2-vel

20°C-on 2 órán tartó kezelést követıen a denaturációs hımérséklet 53.2°C-ra nıtt, míg a

hasonló módon, de 37°C-on végrehajtott kezelés 53.9°C-os átmeneti hımérsékletet

eredményezett. A rekonstruált filamentumok 37°C-os, overnight inkubálása HAP2-vel

54.4°C-ra emelte az olvadási hımérsékletet. Ugyanakkor még magasabb átmeneti

hımérsékletet, Tm=55.3°C-ot figyeltünk meg, amikor a fölös HAP2-t az oldatban hagytuk. Ez

arra utal, hogy dinamikus egyensúly áll fenn a HAP2 kötött és szabad formái között.

Emlékeztetıül: a natív HAP2 sapka kötıdése a filamentum végéhez nagyon stabil volt ebben

a hımérsékleti tartományban. A hıstabilitás kismértékő, de jól reprodukálható növekedése a

filamentumok 20°C helyett 37°C-on végrehajtott HAP2-vel történı kezelésének köszönhetıen

arra utal, hogy a sapka kialakulása hatékonyabban megy végbe 37°C-on.

25 30 35 40 45 50 55 60 65 700

5

10

15

20

25

30

35 Filamentum HAP2 nélkül

Filamentum+HAP2 (20°C, 2h, fugálva)

Filamentum+HAP2 (37°C, 2h, fugálva)

Filamentum+HAP2 (37°C, o/n, fugálva)

Filamentum+HAP2 (20°C, 2h, fuga nélkül)

CD

-jel

der

ivál

tja


18. ábra: A rekonstruált filamentum CD-görbéjének deriváltja 222 nm-en

A DSC-vel felvett hıabszorpciós görbék (19. ábra) tanúsága szerint a kezeletlen rövid

rekonstruált filamentumok elsı felfőtésekor a kalorimetrikus görbe 53.2°C-nál mutatott éles

Eredmények

56

maximumot, amely viszonylag jól egyezett a CD-nél mért denaturációs hımérséklettel. A

második felfőtésnél - jelentısen eltolódva - 47°C-nál volt a csúcs helye, a harmadik

felfőtésnél pedig már nem változott. A filamentum monomerekre esett szét, tehát az átmenet

nem reverzibilis (azonban a flagelliné igen), ebbıl adódóan a flagellin stabilitása és a csúcs

alatti terület is lényegesen kisebb lett. A filamentum hıkapacitás görbéjének alakja nem

teljesen szabályos, egy váll látszik a csúcson, amely az oldatban lévı monomer állapotú

flagellinre utal. Korábbi filamentummal végzett kalorimetriás méréseknél két csúcsot

regisztráltak (Fedorov & Kostyukova, 1984). Lényegében a monomer csúcsa szuperponálódik

rá a polimeréra, amelyrıl korábban, kettıs csúcsnak vélve, a filamentum két stabil állapoton

keresztüli denaturációját tételezték fel tévesen. A hıabszorpciós csúcs alatti területbıl

számított kalorimetrikus entalpiaváltozás filamentumra ∆Hcal=1950kJ/mol, flagellinre

∆Hcal=960 kJ/mol. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy polimerizációkor a fehérje

szerkezete jelentısen stabilizálódik, hiszen olvadáspontja és kalorimetrikus entalpiája is

számottevıen megnı. A flagellin denaturációjánál kétállapotú átalakulást feltételezve

kiszámíthatjuk a folyamat Van't Hoff entalpiáját: ∆HVan'tHoff=660 kJ/mol. A kalorimetrikus

entalpiával összehasonlítva, az eltérés jelentısnek mondható, vagyis a feltételezés nem helyes,

az átalakulás többállapotú, intermedier állapotokon keresztüli denaturációra utal.

10 20 30 40 50 60 70 80

4 J/g°C

Filamentum Flagellin Filamentum+HAP2


19. ábra: A flagellin és a filamentum kalorimetriás görbéi

Eredmények

57

A HAP2 hıabszorpciós görbéje 59.2°C-nál, azaz a filamentuménál jóval magasabb

hımérsékleten éri el maximumát (20. ábra, piros görbe). A számított kalorimetrikus

entalpiaváltozás ∆Hcal=590 kJ/mol és Van't Hoff entalpia ∆HVan'tHoff=1680kJ/mol. Az utóbbi

majdnem háromszorosa a kalorimetrikus entalpiaváltozásnak, így itt sem klasszikus

kétállapotú átalakulással van dolgunk. A második felfőtéskor eltőnt a csúcs, ami azt jelenti,

hogy a HAP2 hıdenaturációja irreverzibilis.

Ezek után felvettük a korábban már leírt (filamentumhoz 10 % HAP2 hozzáadásával

készült) minták hıabszorpciós görbéit is (20. ábra). A görbék maximumhelyei kis mértékben

eltolódtak a magasabb hımérsékletek felé. A 20°C-on, illetve 37°C-on inkubált, majd

centrifugált minták esetében 53.7°C-nál, a nem centrifugáltnál pedig 54.8°C-nál jelentkeztek

az éles csúcsok. Az elıbbi esetben mintegy 0.5°C-os, az utóbbiban 1.5-2°C-os eltolódás

tapasztalható. Ezek az eredmények szintén nagyrészt megegyeznek a CD mérésekbıl kapott

átalakulási hımérséklet értékekkel. Itt is a legalacsonyabb denaturációs hımérséklető a

kezeletlen filamentum volt, ezt követték a 20°C-on, illetve 37°C-on inkubált, centrifugált

minták, majd a 20°C-on inkubált nem centrifugált minta. A számított kalorimetrikus

entalpiaváltozások 1700 kJ/mol körüli értékek köré estek (a 20°C-os centrifugált mintánál

∆Hcal=1670 kJ/mol, a 37°C-osnál 1710 kJ/mol, a 20°C-os nem centrifugáltnál pedig 1620

kJ/mol). A kis mértékő csökkenés valószínőleg az anyagveszteségnek és a HAP2 hatásának

tulajdonítható.

Eredmények

58

10 20 30 40 50 60 70 801

2

3

4

5

6

7

8

9

HAP2 Filamentum+HAP2 (20°C) Filamentum+HAP2 (37°C)

Hık

apac

itás

[J/g

°C]


20. ábra: A HAP2 és a rekonstruált filamentum kalorimetriás görbéi

A HAP2 kötıdésének depolimerizációt gátló szerepe a rekonstruált filamentumoknál

A denaturációs hımérséklet mellett ebben az esetben ugyancsak célszerő a hıindukált

depolimerizáció sebességét is megvizsgálni (hasonlóan a natív filamentumok vizsgálatához).

Ennek megfelelıen a rekonstruált filamentumok stabilitásvizsgálatának következı

szakaszában a depolimerizáció alakulását tanulmányoztuk különféle körülmények esetén.

A hıindukált depolimerizáció detektálására szintén a CD-jel változását használtuk fel,

csak ezúttal nem a hımérséklet, hanem az idı függvényében. A mérési eljárás az volt, hogy a

különbözıféleképpen inkubált mintákat viszonylag magas (de a denaturációsnál alacsonyabb)

hımérsékletre főtöttük fel, majd mértük, hogy mennyire különbözik az ezen a hımérsékleten

már jelentıs depolimerizációjuk gyorsasága. Feltételezésünk ebben az esetben is az volt, hogy

a HAP2-nek stabilizáló a hatása, azaz lassítja a depolimerizációt. Fontos megjegyezni, hogy

(az anyagok és módszerek részben leírtaknak megfelelıen) a mérések egy gyors felfőtési

szakasszal kezdıdtek, melynek során a mintát kb. 20°C-ról mintegy 10 perc alatt az adott

mérési hımérsékletre melegítettük, ami a görbéken egy kezdeti, nagyjából lineáris

szakaszként jelentkezik.

Eredmények

59

A méréseket 45°C-on hajtottuk végre, és a kapott eredmények jól tükrözték a

feltételezéseket, és megerısítették a hımérsékleti görbék tapasztalatait. A kezeletlen

filamentumnál volt a leggyorsabb a depolimerizáció, a 20°C-on inkubált, majd centrifugált

mintánál lassabb, még lassabb a 37°C-on inkubált mintánál, végül itt is a 20°C-on inkubált, de

nem centrifugált minta okozta a leglassabb depolimerizációt, azaz a legnagyobb stabilizációt

(21. ábra). Mindezek alapján egyrészt megállapítható, hogy a HAP2 hozzáadása lassította a

depolimerizációt, vagyis növelte a filamentum stabilizációját. Másrészt az egyes inkubálási

módok között is voltak különbségek, amelyek szintén a hımérsékleti mérések tapasztalatait

erısítették meg.

0 20 40 60 80 100-190

-170

-150

-130

-110

-90

-70

-50

Filamentum HAP2 nélkül Filamentum+HAP2 (20°C, 2h, fugálva) Filamentum+HAP2 (37°C, 2h, fugálva) Filamentum+HAP2 (20°C, 2h, fuga nélkül)

CD

-jel

[m

deg]

Idı [perc]

21. ábra: A rekonstruált filamentum depolimerizációjának követése CD-vel, 45°C-on, 222 nm-en

A depolimerizációs vizsgálatokat 45°C-nál alacsonyabb hımérsékleteken (42.5°C-on

és 40°C-on) is végrehajtottuk, ami lényegében hasonló eredményekre vezetett, bár a görbék

konkrét lefutása némileg eltért (az adatok nincsenek bemutatva). Az eltérések oka az, hogy az

alkalmazott hımérséklet módosítása nemcsak a depolimerizáció sebességét változtatja meg,

hanem a filamentumvég dinamikus egyensúlya (fel-/leépülése) miatt folyamatosan keletkezı

monomerek denaturációját is, ami természetesen befolyásolja az eredményt, hiszen nemcsak a

depolimerizációra vonatkozó stabilizáló hatás játszik benne szerepet.

Eredmények

60

Összességében elmondható, hogy az idımérések is alátámasztják a hımérsékleti

görbéknél tapasztaltakat. Másrészt viszont az is megállapítható, hogy a natív filamentumhoz

képest a rekonstruált minták sokkal érzékenyebbek voltak, hiszen már 40°C-on is instabilnak

bizonyultak, és hıindukált depolimerizáción mentek keresztül. Bár a HAP2-vel történı

kezelés egyértelmően csökkentette a depolimerizáció sebességét, minden rekonstruált

filamentum-HAP2 mintánk sokkal érzékenyebbnek bizonyult a hıindukált depolimerizációval

szemben, mint a natívok. Nem sikerült a tökéletes sapkával rendelkezı rekonstruált

filamentumokat megtisztítanunk proteolítikus emésztés megemelt hımérsékleteken történı

alkalmazásával sem. A filamentumok rekonstruálása során kipróbáltunk különféle

ammónium-szulfát koncentrációkat, használtunk rövid filamentumkezdeményeket,

alkalmaztunk változatos HAP2 inkubációs módszereket, azonban a mintáink minden esetben

teljesen elemésztıdtek.

Az eredmények értelmezése

A flagelláris filamentumok in vitro képesek a spontán önszervezıdésre, ám in vivo

csak a HAP2 fehérjekomplexum jelenlétében megy végbe szerkezetük kialakulása. A HAP2

molekulák öt alegységbıl álló molekuláris sapkát formálnak a filamentumok végén. Az

alegységek kooperatívan kötıdnek a filamentum végéhez: minden újabb beépülı molekula

növeli a korábbi kötıdések stabilitását is. Az így létrejövı HAP2 sapka teszi lehetıvé, hogy a

citoplazmából a filamentumok belsejében lévı csatornán át transzportálódó flagellin

alegységek beépülhessenek a filamentumok végére, és ne diffundáljanak szét a közegben. A

HAP2 sapka „intelligens” kötıdésre képes, és látszólag ellentmondásos tulajdonságokkal

rendelkezik. Egyfelıl nagyon erısen kötıdik a filamentumok végéhez, és gyakorlatilag

sohasem válik le onnan. Másfelıl képesnek kell lennie arra is, hogy viszonylag könnyen

elengedje a filamentumok végét, lehetıvé téve az újonnan érkezı flagellin alegységek

beépülését. Vagyis a HAP2 in vivo alapvetı szerepet játszik a flagelláris filamentumok

létrejöttében azáltal, hogy egy sapkát alkot a filamentumok végén, ami elısegíti a flagellum

központi csatornáján keresztül exportálódó flagellin alegységek beépülését (Yonekura és mts.,

2002).

A flagelláris filamentumok több ezer flagellin alegységbıl épülnek fel. A natív

filamentumokkal végzett kísérleteink kimutatták, hogy az apró HAP2 sapka jelentıs

stabilizációs hatást fejt ki erre az óriási makromolekuláris szerkezetre: a hıstabilitását

Eredmények

61

mintegy 4°C-kal emeli (57°C-ról 61°C-ra) és egészen 55°C-ig hatékonyan gátolja a

hıindukált depolimerizációt is.

A monomer flagellin 47°C-on hıindukált denaturáción megy keresztül (Vonderviszt

és mts., 1990). Méréseink szerint a sapka nélküli natív flagelláris filamentumok denaturációs

hımérséklete 57°C volt, ami azt mutatja, hogy a flagellin alegységek stabilizálódnak a

filamentum állapotban. A flagelláris filamentumok polimerizációja, illetve depolimerizációja

egyirányú folyamat, ami csak a filamentumok távolabbi végén megy végbe (Iino, 1974). 47°C

fölött a filamentumok depolimerizációja az alegységek azonnali denaturációja miatt

visszafordíthatatlan. A HAP2 sapka stabilizáló hatása arra utal, hogy a filamentumok

hımérséklet okozta megsemmisülése depolimerizációval kezdıdik, amit az alegységek

legombolyodása követ. Egy rövidebb filamentumokat tartalmazó minta várhatóan magasabb

depolimerizációs sebességet mutat, mivel ilyenkor magasabb a szabad filamentumvégek

száma, azaz egyszerre több helyen történik a depolimerizáció. A gyorsabb depolimerizáció

következtében ugyanakkor alacsonyabb denaturációs hımérsékletet tapasztalunk. Ez a

jelenség megmagyarázza, miért mutattak a rövid rekonstruált filamentumaink számottevıen

alacsonyabb átmeneti hımérsékletet, mint a jóval hosszabb natívok. Ugyanakkor azt is

érthetıvé teszi, hogy a csökkenı ammónium-szulfát koncentrációval készített, emiatt egyre

hosszabb filamentumokat tartalmazó rekonstruált minták miért mutattak fokozatosan növekvı

denaturációs hımérsékletet, megközelítve a sapka nélküli natív filamentumok esetén kapott

értéket.

A HAP2 61°C körül hıdenaturálódik (Vonderviszt és mts., 1998). Míg a HAP2

sapkával való kölcsönhatás a filamentumok stabilizálódását eredményezi, addig ez a

stabilizáló hatás aszimmetrikus: a natív filamentum-HAP2 komplexum ugyanazon a

hımérsékleten gombolyodik le, ahol a HAP2 hıdenaturációja megtörténik. Vagyis a HAP2

denaturációja az a lépés, ami a natív filamentum-sapka szerkezetek széteséséhez és

denaturációjához vezet.

A HAP2 sapka stabilizáló hatására alapozva kifejlesztettünk egy eljárást, amivel a

HAP2 sapkával rendelkezı natív filamentumok elválaszthatók és megtisztíthatók. Az

elektronmikroszkópos ábrák azt mutatták, hogy az eljárással kapott minta megfelelı sapkával

lezárt filamentumokat tartalmaz. A natív filamentum-sapka komplexumok erısen ellenálltak a

proteolítikus lebontásnak és depolimerizációnak. Ezek a minták elısegíthetik a filamentum-

HAP2 komplexumok egyrészecske képanalízissel történı szerkezeti tanulmányozását.

Eredmények

62

A flagelláris filamentumok flagellin oldatból rekonstruálhatók rövid

filamentumkezdemények (Asakura és mts., 1964) vagy valamilyen precipitálószer (mint

például az ammónium-szulfát) (Wakabayashi és mts., 1969) hozzáadásával. Korábban

kimutatták a filamentum-HAP2 komplexumok képzıdését, amennyiben a rekonstruált

filamentumokhoz HAP2 alegységeket adtak (Maki és mts., 1998). A rekonstruált

filamentumok és a filamentum-HAP2 komplexumok széles körben használatosak a

krioelektronmikroszkópiával, illetve röntgen-száldiffrakcióval történı szerkezeti analízishez

(Yonekura és mts., 2000; 2001; 2003; Maki-Yonekura és mts., 2003).

Vizsgálataink feltárták, hogy a HAP2 ugyan könnyen kötıdött a rekonstruált

filamentumok végéhez, azonban a kapott filamentum-HAP2 komplexumok egyik esetben sem

érték el a natív szerkezetek stabilitását, és megemelt hımérsékleteken gyors depolimerizáción

mentek keresztül. A HAP2 kötıdés stabilizáló hatása jelentıs mértékben függött az

alkalmazott inkubációs módszertıl, például a hosszan tartó 37°C-os inkubálás a

szobahımérsékleten történıhöz képest elısegítette a sapka kialakulását. Ennek az eltérésnek a

magyarázata valószínőleg az, hogy az in vitro növesztett filamentumok vége eltér az in vivo

filamentumokétól.

A filamentum vége még a natív esetben sem sík felület: ezt eltorzítja egyrészt a

szomszédos protofilamentumokban az alegységek egymáshoz képesti közel fél alegységnyi

eltolódása, másrészt az alaphélix ehhez hozzáadódó menetemelkedése. Emiatt a sík HAP2

sapka alegységei eltérı erıséggel, illetve eltérı konformációban vesznek részt a filamentum

végével való kölcsönhatásban (22. ábra) (Vonderviszt és mts., 1998; Maki-Yonekura és mts.,

2003). Bár a filamentum felépülése az egymenetes hélix mentén történik, azonban ez a HAP2

sapka hatásának következménye, ami csak így engedi polimerizálódni az új alegységeket.

Ugyanakkor a filamentumot stabilizáló kölcsönhatások nem az egymenetes, hanem az 5-, 6-,

11- és 16-menetes hélix mentén szomszédos alegységek között állnak fenn (5. ábra)

(Yonekura és mts., 2003). Ez viszont azt jelenti, hogy az in vitro rekonstrukció során a

felépülés valószínőleg nem az egymenetes hélix mentén fog történni, hiszen a megfelelı

stabilizáló kölcsönhatások megléte esetén (azaz ha az 5-, 6-, 11- és 16-menetes hélix mentén

egyaránt vannak szomszédos alegységek) be tud épülni egy új monomer. Természetesen az

így kimaradó helyeket a filamentum továbbépüléséhez elıbb-utóbb fel kell tölteni, azonban a

filamentum végén nagy valószínőséggel nem a natív esetre jellemzı viszonylag egyenletes

felület található, hanem egy egyenetlen, nagyobb kiugrásokkal és bemélyedésekkel tarkított

struktúra jön létre (22. ábra).

Eredmények

63

Filamentum

HAP2 alegység

Flagellin alegység

Sapka

Natív filamentum Rekonstruált filamentum

22. ábra: A natív és a rekonstruált filamentum végének sematikus szerkezete.

A könnyebb áttekinthetıség kedvéért csak a kölcsönhatások egy részét jeleztük az ábrán. A részletes struktúra az irodalmi bevezetıben (8. ábra) látható.

Az egyenetlen végekre viszont valószínőleg nem tud olyan intakt, öt alegységbıl álló

HAP2 sapka ráépülni, mint az in vivo filamentumoknál, hanem csak pár HAP2 alegység fog

megkötıdni. Ugyanakkor a HAP2-flagellin kötıdés erısebb a flagellin-flagellin

kölcsönhatásnál, vagyis az egyszer már kapcsolódott HAP2 alegység nehezen válik le a

filamentum végérıl. A hımérséklet emelésével viszont csökken a filamentum stabilitása,

gyorsul a végeken a dinamikus fel-leépülés, vagyis megnı az esélye, hogy egy már megkötött

HAP2 mellett lévı kiemelkedés vagy gödör eltőnik, és így kedvezı feltételek teremtıdnek

egy újabb HAP2 alegység kooperatív bekötıdéséhez. Mivel a HAP2 kötıdésére a

hımérséklet növelése kevésbé hat, ezért a végek gyors változása azt eredményezi, hogy

megnı a több alegységbıl álló, sıt akár tökéletesen intakt sapkák kialakulásának esélye,

vagyis lényegében több HAP2 alegység fog kötıdni a filamentumok végeihez. Összegezve: a

magasabb inkubálási hımérséklet növeli a megkötıdött HAP2 mennyiségét, a több HAP2

viszont jobban megemeli a denaturációs hımérsékletet, vagyis jobban növeli a filamentum

stabilitását.

Szintén hasonló magyarázat állhat a nem centrifugált, vagyis fölös, nem kötıdött

HAP2-vel rendelkezı mintának még az elızıeknél is magasabb denaturációs hımérséklete

mögött. A denaturálás során ugyanis, ahogy melegítjük a filamentumokat, úgy válnak a végek

Eredmények

64

egyre változékonyabbá, vagyis úgy nı a több alegységes és intakt sapka kialakulásának

esélye. A lecentrifugált mintákban azonban már nincs szabad HAP2, ami ki tudná használni

ezt a kedvezı kötıdési lehetıséget, vagyis a kötıdött HAP2 mennyisége nem nı. Ezzel

szemben a nem centrifugált mintában van fölös HAP2, ami a hımérséklet emelésével egyre

gyorsabban módosuló végekre rá tud kötıdni, vagyis ebben a mintában nıni fog a megkötött

HAP2 mennyisége, ami ismét magasabb denaturációs hımérsékletet és nagyobb stabilitást

eredményez.

A korábbi rekonstrukciós kísérletek arra utaltak, hogy a sapka-filamentum

rekonstrukciójának hatékonysága 37°C-on akár a 60%-ot is elérheti (Yonekura és mts., 2001).

Ennek ellenére a korábban leírt és a natív filamentumoknál jól mőködı emésztési eljárással

nem sikerült izolálnunk az intakt sapkával rendelkezı filamentumokat tartalmazó mintát. A

rekonstruált filamentum-HAP2 komplexumok proteolízissel szembeni ellenállása meglepıen

alacsony volt. Függetlenül attól, hogy melyik filamentum vagy HAP2 inkubációs módszert

alkalmaztuk, a mintáink minden esetben teljes mértékben elemésztıdtek.

Eredményeink azt mutatják, hogy tökéletes filamentum-HAP2 komplexumok aligha

kaphatók a hagyományos rekonstrukciós módszerekkel. Habár a rekonstruált filamentum-

HAP2 komplexumok alakjukat tekintve nagyon hasonlítanak a HAP2 sapkával rendelkezı

natív filamentumokhoz, szerkezeti hibákat tartalmaznak, melyek csökkentik a stabilitásukat,

és érzékenyebbé teszik ıket a proteolítikus emésztéssel szemben. Ugyanakkor a tökéletes

sapkával rendelkezı natív filamentumok izolálására általunk kifejlesztett eljárás megnyithatja

az utat a pontosabb szerkezeti információk megszerzése elıtt.

Összefoglalás

65

Összefoglalás

A doktori értekezés a flagelláris filamentumokkal és az ıket lezáró molekuláris

sapkával foglalkozik. Ennek során tanulmányoztuk a rendezetlen terminális régiók szerepét a

filamentum felépülésében, a filamentum stabilitásának változását a HAP2 kötıdése során és

az intakt sapkával ellátott filamentumok in vitro létrehozásának lehetıségét. A kísérletek

során a következı eredményekre jutottunk:

• Irányított mutagenezis segítségével elkészítettünk két flagellin pontmutánst (S356C,

G377C), melyek a vad típussal ellentétben ciszteint is tartalmaztak. A mutáns fehérjék

alkalmasak voltak filamentumok létrehozására, azaz megırizték polimerizációs

képességüket.

• Az egyik flagellin pontmutáns (S356C) különbözı fluoreszcens festékekkel történı

megfestése révén sikerült a filamentumba beépülı flagellin alegységek között

fluoreszcencia rezonancia energia transzfert (FRET) létrehozni, és ennek segítségével

alátámasztani a filamentum szerkezetének legújabb, alegységen belüli összefonódó

helikális kötegeket, és az ezek között fennálló, a szerkezetet stabilizáló hidrofób

kölcsönhatásokat tartalmazó modelljét. Ezen túlmenıen sikerült az egyes régiók

pontosabb szerepét is tisztázni.

• A hıdenaturációs folyamat spektropolariméterrel történı nyomon követésével

megállapítottuk, hogy a HAP2 sapka jelentısen (mintegy 4°C-kal) emeli a natív

filamentumok denaturációs hımérsékletét, illetve növeli a hıindukált

depolimerizációval szembeni ellenálló képességüket is. A HAP2 stabilizáló hatása arra

utal, hogy a natív filamantumok hıdenaturációját (illetve hıindukált

depolimerizációját) vezérlı lépés a HAP2 denaturációja.

• A HAP2 sapka stabilizáló hatására alapozva kifejlesztettünk egy eljárást, melynek

segítségével az intakt HAP2 sapkával rendelkezı natív filamentumok hatékonyan

elválaszthatók és megtisztíthatók. A módszer lényege a natív filamentum minták

hosszas inkubálása 45°C-on tripszin jelenlétében. A kapott natív filamentum-sapka

komplexumok erısen ellenálltak a proteolítikus lebontásnak és a depolimerizációnak.

Ezek a minták elısegíthetik a filamentum-HAP2 komplexumok egyrészecskés

elektronmikroszkópiás szerkezetanalízissel történı tanulmányozását.

Összefoglalás

66

• Mikrokalorimetriás mérésekkel megmutattuk, hogy a filamentum létrehozásának

körülményei (a filamentumkezdemények, illetve az ammónium-szulfát aránya) szintén

jelentıs mértékben befolyásolják a filamentum stabilitását. A magasabb

precipitálószer koncentráció egyfelıl megnöveli a polimerizáció sebességét,

ugyanakkor a szerkezeti hibák számát is emeli, csökkentve ezáltal a filamentum

stabilitását.

• A HAP2-kötıdés sötét látóterő mikroszkóppal történı detektálására kidolgoztunk egy

módszert, melynek lényege az, hogy csak azokra a filamentumkezdeményekre fognak

további flagellin alegységek ráépülni, melyek végén nem található HAP2, vagyis csak

ekkor növekszik látható méretővé a filamentum a mikroszkóp alatt. Ez praktikus,

kevés felszerelést igénylı módszer, ráadásul rendkívül érzékeny, mivel a

filamentumkezdemények egészen alacsony koncentrációjánál megindul a

polimerizáció, viszont már egy-két HAP2 alegység is tökéletesen meggátolja azt.

• Spektropolarimetriás és mikrokalorimetriás vizsgálatok segítségével megállapítottuk,

hogy a rekonstruált filamentum stabilitása megnı a HAP2 kötıdésével, ami egyrészt a

denaturációs hımérséklet megemelkedésében, másrészt a depolimerizációval

szembeni ellenállás megnövekedésében mutatkozik meg. A stabilizáció

növekedésének mértéke szabályozható az inkubálási feltételek megváltoztatásával.

• A rekonstruált filamentumok HAP2 hozzáadása után kevésbé voltak stabilak, mint a

sapkával lezárt natív filamentumok. Magasabb hımérsékleten gyorsan

depolimerizálódtak, és a proteolítikus emésztéssel szemben is érzékenyebbek voltak.

Mindez arra utal, hogy laboratóriumi körülmények között csak kivételesen keletkezik

intakt sapka, az esetek többségében ötnél kevesebb HAP2 molekula kötıdik be a

filamentum végére. Az intakt sapka nehéz létrehozásának az a valószínő magyarázata,

hogy in vitro a filamentum vége bonyolult szerkezető, nagyobb kiugrásokkal és

bemélyedésekkel tarkított struktúra. Az inkubálási körülmények megváltoztatásával

szabályozható a bekötıdött HAP2 alegységek száma (így az intakt sapkák aránya is),

ami a filamentum eltérı stabilitásához vezet. Minél több HAP2 molekula kötıdik,

annál stabilabb a filamentum.

Irodalomjegyzék

67

Irodalomjegyzék

ADA, G.L., NOSSAL, G.J., PYE, J. & ABBOT, A. (1963). Behavior of active bacterial antigens

during the induction of the immune response. (I) Properties of flagellar antigens from

Salmonella. Nature (London) 199, 1257-1259.

AIZAWA, S.-I., VONDERVISZT, F., ISHIMA, R. & AKASAKA, K. (1990). Termini of Salmonella

flagellin are disordered and become organized upon polymerization into flagellar

filament. J. Mol. Biol. 211, 673-677.

AIZAWA, S.-I. (1996). Flagellar assembly in Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol. 19, 1-

5.

AKIBA, T., YOSHIMURA, H. & NAMBA, K. (1991). Monolayer crystallization of flagellar L-P

rings by sequential addition and depletion of lipid. Science 252, 1544-1546.

ASAKURA, S., EGUCHI, G. & IINO, T. (1964). Reconstitution of bacterial flagella in vitro. J.

Mol. Biol. 10, 42-56.

ASAKURA, S., EGUCHI, G. & IINO, T. (1966). Salmonella flagella: in vitro reconstruction and

overall shapes of flagellar filaments. J. Mol. Biol. 16, 302-316.

ASAKURA, S. (1970). Polymerization of flagellin and polymorphism of flagella. Advan.

Biophys. (Japan) 1, 99-155.

ASAKURA, S. & IINO, T. (1972). Polymorphism of Salmonella flagella as investigated by

means of in vitro copolymerization of flagellins derived from various strains. J. Mol.

Biol. 4, 251-268.

AZEVEDO, J.R. & JOHNSON, D.A. (1990). Temperature-dependent lateral and transverse

distribution of the epidermal growth factor receptor in A431 plasma mebranes. J.

Membrane Biol. 118, 215-224.

BERG, H.C. & ANDERSON, R.A. (1973). Bacteria swim by rotating their flagellar filaments.

Nature (London) 245, 380-382.

BLAIR, D.F. & BERG, H.C. (1988). Restoration of torque in defective flagellar motors.

Science 242, 1678-1681.

BLAIR, D.F. & BERG, H.C. (1990). The MotA protein of E. coli is a proton-conducting

component of the flagellar motor. Cell 60, 439-449.

BLAIR, D.F. (1995). How bacteria sense and swim. Annu. Rev. Microbiol. 49, 489-522.

BLOCK, S.M. & BERG, H.C. (1984). Successive incorporation of force-generating units in the

bacterial rotary motor. Nature (London) 309, 470-472.

Irodalomjegyzék

68

CALLADINE, C.R. (1975). Construction of bacterial flagella. Nature (London) 225, 121-124.

CALLADINE, C.R. (1976). Design requirements for the construction of bacterial flagella. J.

Theoret. Biol. 57, 469-489.

CALLADINE, C.R. (1978). Change of waveform in bacterial flagella: The role of mechanics at

the molecular level. J. Mol. Biol. 118, 457-479.

CANTOR, C.R. & SCHIMMEL, P.R. (1980). Biophysical Chemistry. Part II.:Techniques for the

Study of Biological Structure and Function. Freeman, San Francisco.

DEAN, G.E., MACNAB, R.M., STADER, J., MATSUMURA, P. & BURKE, C. (1984). Gene

sequence and predicted amino acid sequence of the MotA protein, a membrane-

associated protein required for flagellar rotation in Eschericia coli. J.Bacteriol. 159,

991-999.

DEPAMPHILIS, M.L. & ADLER, J. (1971). Attachment of flagellar basal bodies to the cell

envelope: specific attachment to the outer lipopolysaccharide membrane and the

cytoplasmic membrane. J. Bacteriol. 105, 396-407.

DEROSIER, D.J. (1992). Whipping flagellin into shape. Curr. Op. Struct. Biol. 2, 280-285.

DEROSIER, D.J. (1995). Spinning tails. Curr. Op. Struct. Biol. 5, 187-193.

DRIKS, A. & DEROSIER, D.J. (1990). Additional structures associated with bacterial flagellar

basal body. J. Mol. Biol. 211, 669-672.

EFTINK, M.R. (1991). Fluorescence techniques for studying protein structure. Methods of

Biochem. Anal. 35, 127-205.

FAHRNER, K.A., BLOCK, S.M., KRISHNASWAMY, S., PARKINSON, J.S. & BERG, H.C. (1994).

A mutant hook-associated protein (HAP3) facilitates torsionally induced

transformations of the flagellar filament of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 238, 173-

186.

FEDOROV, O.V. & KOSTYUKOVA, A.S. (1984). Domain structure of flagellin. FEBS Lett.

171, 145-148.

FEDOROV, O.V., KOSTYUKOVA, A.S. & PYATIBRATOV, M.G. (1988). Architectonics of a

bacterial flagellin filament subunit. FEBS Lett. 241,145-158.

FERNANDEZ, S.M. & BERLIN, R.D. (1976). Cell surface distribution of lectin receptors

determined by resonance energy transfer. Nature 264, 411-415.

FERRIS H.U. & MINAMINO T. (2006). Flipping the switch: bringing order to flagellar

assembly. Trends. Microbiol. 14, 519-526.

FÖRSTER, V.TH. (1948). Zwischenmolekulare energiewanderung und fluorezenz. Ann. Phys.

(Leipzig) 2, 55-75.

Irodalomjegyzék

69

FRANCIS, N.R., IRIKURA, V.M., YAMAGUCHI, S., DEROSIER, D.J. & MACNAB, R.M. (1992).

Localization of the Salmonella typhimurium flagellar switch protein FliG to the

cytoplasmic M-ring face of the basal body. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6304-6308.

FRANCIS, N.R., SOSINSKY, G.E., THOMAS, D. & DEROSIER, D.J. (1994). Isolation,

characterization and structure of bacterial flagellar motors containing the switch

complex. J. Mol. Biol. 235, 1261-1270.

FUKUOKA H., SOWA Y., KOJIMA S., ISHIJIMA A. & HOMMA M. (2007). Visualization of

functional rotor proteins of the bacterial flagellar motor in the cell membrane. J. Mol.

Biol. 367, 692-701.

FURUKAWA Y., IMADA K., VONDERVISZT F., MATSUNAMI H., SANO K., KUTSUKAKE K. &

NAMBA K. (2002). Interactions between bacterial flagellar axial proteins in their

monomeric state in solution. J. Mol. Biol. 318, 889-900.

GARZA, A.G., BIRAN, R., WOHLSCHLEGEL, J.A. & MANSON, M.D. (1996) Mutations in

motB suppressible by changes in stator or rotor components of the bacterial flagellar

motor. J. Mol. Biol. 258, 270-285.

GENNIS, L.S., GENNIS, R.B. & CANTOR, C.R. (1972). Singlet energy-transfer studies on

associating protein systems. Distance measurements on trypsin, α-chymotrypsin, and

their protein inhibitors. Biochemistry 11, 2517-2524.

GENNIS, L.S. & CANTOR, C.R. (1976). Singlet-singlet energy transfer and other optical

studies on the structure of trypsin and chymotrypsin complexes. J. Biol. Chem. 251,

769-775.

HAUGLAND, R.P. (2002). Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. 9th

edition. Molecular Probes, Eugene, OR.

HIRANO, T., YAMAGUCHI, S., OOSAWA, K. & AIZAWA, S.-I. (1994). Roles of FliK and FlhB

in determination of flagellar hook length in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 176,

5439-5449.

HOMMA, M., KUTSUKAKE, K., IINO, T. & YAMAGUCHI, S. (1984a). Hook-associated

proteins essential for flagellar filament formation in Salmonella typhimurium. J.

Bacteriol. 157, 100-108.

HOMMA, M., FUJITA, H., YAMAGUCHI, S. & IINO, T. (1984b). Excretion of unassembled

flagellin by Salmonella typhimurium mutants deficient in hook-associated proteins. J.

Bacteriol. 159, 1056-1059.

HOMMA, M. & IINO, T. (1985). Excretion of unassembled hook-associated proteins by

Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 164, 1370-1372.

Irodalomjegyzék

70

HOMMA, M., KUTSUKAKE, K. & IINO, T. (1985). Structural genes for flagellar hook-

associated proteins in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 163, 464-471.

HOMMA, M., IINO, T., KUTSUKAKE, K. & YAMAGUCHI, S. (1986). In vitro reconstitution of

flagellar filaments onto hooks of filamentless mutants of Salmonella typhimurium by

addition of hook-associated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6169-6173.

HOMMA, M., DEROSIER, D.J. & MACNAB, R.M. (1990a). Flagellar hook and hook-associated

proteins of Salmonella typhimurium and their relationship to other axial components

of the flagellum. J. Mol. Biol. 213, 819-832.

HOMMA, M., KUTSUKAKE, K., HASEBE, M., IINO, T. & MACNAB, R.M. (1990b). FlgB, FlgC,

FlgF and FlgG. A family of structurally related proteins in the flagellar basal body of

Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 211, 465-477.

HORTON, H.R. & KOSHLAND, D.E.JR. (1967). Environmentally sensitive groups attached to

proteins. I. Dansyl chloride (1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride).

Methods Enyzmol. 11, 857-866.

HOTANI, H. (1982). Micro-video study of moving bacterial flagellar filaments. III. Cyclic

transformation induced by mechanical force. J. Mol. Biol. 156, 791-806.

IINO, T. (1969). Polarity of flagellar growth in Salmonella. J. Gen. Microbiol. 56, 227-239.

IINO, T. (1974). Assembly of Salmonella flagellin in vitro and in vivo. J. Supramol. Str. 2,

372-384.

IKEDA, T., KAMIYA, R. & YAMAGUCHI, S. (1984). In vitro polymerization of flagellin

excreted by a short-flagellum Salmonella typhimurium mutant. J. Bacteriol. 159, 787-

789.

IKEDA, T., ASAKURA, S. & KAMIYA, R. (1985). „Cap” on the tip of Salmonella Flagella. J.

Mol. Biol. 184, 735-737.

IKEDA, T., HOMMA, M., IINO, T., ASAKURA, S. & KAMIYA, R. (1987). Localization and

stoichiometry of hook-associated proteins within Salmonella typhimurium flagella. J.

Bacteriol. 169, 1168-1173.

IKEDA, T., YAMAGUCHI, S. & HOTANI, H. (1993). Flagellar growth in a filament-less

Salmonella fliD mutant supplemented with purified hook-associated protein 2. J.

Biochem. 114, 39-44.

IKEDA, T., OOSAWA, K. & HOTANI, H. (1996). Self-assembly of the filament capping protein,

FliD, of bacterial flagella into an annular structure. J. Mol. Biol. 259, 679-686.

Irodalomjegyzék

71

IMADA, K., VONDERVISZT, F., FURUKAWA, Y., OOSAWA, K. & NAMBA, K. (1998).

Assembly characteristics of flagellar cap protein HAP2 of Salmonella: decamer and

pentamer in the pH-sensitive equilibrium. J. Mol. Biol. 277, 883-891.

JONES, C.J., MACNAB, R.M., OKINO, H. & AIZAWA, S.-I. (1990). Stoichiometric analysis of

the flagellar hook-(basal-body) complex of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 212,

377-387.

JOYS, T.M. (1985). The covalent structure of the phase-1 flagellar filament protein of

Salmonella typhimurium and its comparison with other flagellins. J. Biol. Chem. 260,

15758-15761.

KAMIYA, R. & ASAKURA, S. (1976). Helical transformations of Salmonella flagella in vitro.

J. Mol. Biol. 106, 167-186.

KAMIYA, R. & ASAKURA, S. (1977). Flagellar transformations at alkaline pH. J. Mol. Biol.

108, 513-518.

KAMIYA, R., ASAKURA, S., WAKABAYASHI, K. & NAMBA, K. (1979). Transition of bacterial

flagella from helical to straight forms with different subunit arrangements. J. Mol.

Biol. 131, 725-742.

KAMIYA, R., ASAKURA, S. & YAMAGUCHI, S. (1980). Formation of helical filaments by

copolymerization of two types of ‘ straight’ flagellins. Nature (London) 286, 628-630.

KANTO, S, OKINO, H., AIZAWA, S.-I. & YAMAGUCHI, S. (1991). Amino acids responsible for

flagellar shape are distributed in terminal regions of flagellin. J. Mol. Biol. 219, 471-

480

KATO, S., AIZAWA, S.-I. & ASAKURA, S. (1982). Reconstruction in vitro of the flagellar

polyhook from Salmonella. J. Mol. Biol. 161, 551-560.

KATO, S., OKAMOTO, M. & ASAKURA, S. (1984). Polymorphic transition of the flagellar

polyhook from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 173, 463-

476.

KHAN, I.M., REESE, T.S. & KHAN, S. (1992). The cytoplasmic component of the bacterial

flagellar motor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 5956-5960.

KITAO A., YONEKURA K., MAKI-YONEKURA S., SAMATEY F.A., IMADA K., NAMBA K. &

GO N. (2006). Switch interactions control energy frustration and multiple flagellar

filament structures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 4894-4899.

KORNACKER M.G. & NEWTON A. (1994). Information essential for cell-cycle-dependent

secretion of the 591-residue Caulobacter hook protein is confined to a 21-amino-acid

sequence near the N-terminus. Mol. Microbiol. 14, 73-85.

Irodalomjegyzék

72

KOSTYUKOVA, A.S., PYATIBRATOV, M.G., FILIMONOV, V.V. & FEDOROV, O.V. (1988).

Flagellin parts acquiring a regular structure during polymerization are disposed on the

molecule ends. FEBS Lett. 241, 141-144.

KUDO, S., MAGARIYAMA, Y. & AIZAWA, S.-I. (1990). Abrupt changes in flagellar rotation

observed by laser dark-field microscopy. Nature (London) 346, 677-680.

KUTSUKAKE, K., OHYA, Y. & IINO, T. (1990). Transcriptional analysis of the flagellar

regulon of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 172, 741-747.

KUTSUKAKE, K., MINAMINO, T. & YOKOSEKI, T. (1994). Isolation and characterization of

FliK-independent flagellation mutants from Salmonella typhimurium. J. Bacteriol.

176, 7625-7629.

LAKOWICZ, J.R. (1983). Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum, New York.

LARSEN, S.H., READER, R.W., KORT, E.N., TSO, W.-W. & ADLER, J. (1974). Change in

direction of flagellar rotation is the basis of the chemotactic response in Escherichia

coli. Nature (London) 249, 74-77.

LIU, X. & MATSUMURA, P. (1994). The FlhD/FlhC complex, a transcriptional activator of the

Escherichia coli flagellar class II operons. J. Bacteriol. 176, 7345-7351.

LLOYD, S.A., TANG, H., WANG, X., BILLINGS, S. & BLAIR, D.F. (1996). Torque generation

in the flagellar motor of Eschericia coli: evidence of a direct role for FliG but not for

FliM or FliN. J. Bacteriol. 178, 223-231.

LOWE, G., MEISTER, M. & BERG, H.C. (1987). Rapid rotation of flagellar bundles in

swimming bacteria. Nature (London) 325, 637-640.

MACNAB, R.M. & KOSHLAND, D.E.JR. (1972). The gradient-sensing mechanism in bacterial

chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2509-2512.

MACNAB, R.M. & ORNSTON, M.K. (1977). Normal-to-curly flagellar transitions and their role

in bacterial tumbling. Stabilization of an alternative quaternary structure by

mechanical force. J. Mol. Biol. 112, 1-30.

MACNAB, R.M. (2003). How bacteria assemble flagella. Annu. Rev. Microbiol. 57, 77-100.

MACNAB, R.M. (2004). Type III flagellar protein export and flagellar assembly. Biochim.

Biophys. Acta 1694, 207-217.

MAGARIYAMA, Y., SUGIYAMA, S., MURAMOTO, K., MAEKAWA, Y., KAWAGISHI, I, IMAE,

Y. & KUDO, S. (1995). Very fast flagellar rotation. Nature (London) 371, 752-752.

MAKI, S., VONDERVISZT, F., FURUKAWA, Y., IMADA, K. & NAMBA, K. (1998). Plugging

interactions of HAP2 pentamer into the distal end of flagellar filament revealed by

electron microscopy. J. Mol. Biol. 277, 771-777.

Irodalomjegyzék

73

MAKI-YONEKURA, S., YONEKURA, K. & NAMBA, K. (2003). Domain movements of HAP2

in the cap-filament complex formation and growth process of the bacterial flagellum.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 15528-15533.

MANSON, M.D., TEDESCO, P., BERG, H.C., HAROLD, F.M. & VAN DER DRIFT, C. (1977). A

protonmotive force drives bacterial flagella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3060-

3064.

MANSON, M.D. (1992). Bacterial motility and chemotaxis. Adv. Microbial Physiol. 33, 277-

346.

MARTINEZ, R.J., ICHIKI, A.T., LUNDH, N.P. & TRONICK, S.R. (1968). Single amino acid

substitution responsible for altered flagellar morphology. J. Mol. Biol. 34, 559-564.

MATSUURA, S., SHIOI, J. & IMAE, Y. (1977). Motility in Bacillus subtilis driven by an

artificial protonmotive force. FEBS Lett. 82, 187-190.

MIMORI, Y., YAMASHITA, I., MURATA, K., FUJIYOSHI, Y., YONEKURA, K., TOYOSHIMA, C.

& NAMBA, K. (1995). The structure of the R-type straight flagellar filament of

Salmonella at 9 Ĺ resolution by electron cryomicroscopy. J. Mol. Biol. 249, 69-87.

MIMORI-KIYOSUE, Y., VONDERVISZT, F., YAMASHITA, I., FUJIYOSHI, Y. & NAMBA, K.

(1996). Direct interaction of flagellin termini essential for polymorphic ability of

flagellar filament. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 15108-15113.

MIMORI-KIYOSUE, Y., VONDERVISZT, F. & NAMBA, K. (1997). Locations of terminal

segments of flagellin in the filament structure and their roles in polymerization and

polymorphism. J. Mol. Biol. 270, 222-237.

MINAMINO, T. & NAMBA, K. (2008). Distinct roles of the FliI ATPase and proton motive

force in bacterial flagellar protein export. Nature 451, 485-488.

MORGAN, D.G., MACNAB, R.M., FRANCIS, N.R. & DEROSIER, D.J. (1993). Domain

organization of the subunit of the Salmonella typhimurium flagellar hook. J. Mol. Biol.

229, 79-84.

MORGAN, D.G., OWEN, C., MELANSON, L.A. & DEROSIER, D.J. (1995). Structure of

bacterial flagellar filaments at 11 Ĺ resolution: packing of the α-helices. J. Mol. Biol.

249, 88-110.

NAMBA, K., YAMASHITA, I. & VONDERVISZT, F. (1989b). Structure of the core and central

channel of bacterial flagella. Nature (London) 342, 648-654.

NAMBA, K. & VONDERVISZT, F. (1997). Molecular architecture of bacterial flagellum.

Quarterly Rev. of Biophysics 30, 1, 1-65.

Irodalomjegyzék

74

O'BRIEN, E.J. & BENNETT, P.M. (1972). Structure of straight flagella from a mutant

Salmonella. J. Mol. Biol. 70, 133-152.

OHNISHI, K., OHTA, Y., AIZAWA, S.-I., MACNAB, R.M. & IINO, T. (1994). FlgD is a

scaffolding protein needed for flagellar hook assembly in Salmonella typhimurium. J.

Bacteriol. 176, 2272-2281.

RUIZ, T., FRANCIS, N., MORGAN, D.G., & DEROSIER, D.J. (1993). Size of the export channel

in the flagellar filament of Salmonella typhimurium. Ultramicroscopy 48, 417-425.

SAIJO-HAMANO Y., UCHIDA N., NAMBA K. & OOSAWA K. (2004). In vitro characterization

of FlgB, FlgC, FlgF, FlgG and FliE, flagellar basal body proteins of Salmonella. J.

Mol. Biol. 339, 423-435.

SAMATEY, F.A., IMADA, K., NAGASHIMA, S., VONDERVISZT, F., KUMASAKA, T.,

YAMAMOTO, M. & NAMBA, K. (2001). Structure of the bacterial flagellar

protofilament and implications for a switch for supercoiling. Nature 410, 331-337.

SAMATEY F.A., MATSUNAMI H., IMADA K., NAGASHIMA S., SHAIKH T.R., THOMAS D.R.,

CHEN J.Z., DEROSIER D.J., KITAO A. & NAMBA K. (2004). Structure of the bacterial

flagellar hook and implication for the molecular universal joint mechanism. Nature

431, 1062-1068.

SANGER, F. & COULSON, A.R. (1975). A rapid method for determining sequences in DNA by

primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol. 94, 441-448.

SCHUSTER, S.C. & KHAN, S. (1994). The bacterial flagellar motor. Annu. Rev. Biophys.

Biomol. Struct. 23, 509-539.

SHARP, L.L., ZHOU, J. & BLAIR, D.F. (1995). Tryptophan-scanning mutagenesis of MotB, an

integral membrane protein essential for flagellar rotation in Eschericia coli.

Biochemistry 34, 9166-9171.

SILVERMAN, M. & SIMON, M. (1974). Flagellar rotation and the mechanism of bacterial

motility. Nature (London) 249, 73-74.

SOSINSKY, G.E., FRANCIS, N.R., DEROSIER, D.J., WALL, J.S., SIMON, M. & HEINFELD, J.

(1992). Mass determination and estimation of subunit stoichiometry of the bacterial

hook-basal body flagellar complex of Salmonella typhimurium by scanning

transmission electron microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4801-4805.

STRYER, L. (1995). Biochemistry. Freeman, New York.

TRACHTENBERG, S. & DEROSIER, D.J. (1988). Three-dimensional structure of the frozen

hydrated flagellar filament. The left-handed filament of Salmonella typhimurium. J.

Mol. Biol. 195, 581-601.

Irodalomjegyzék

75

TURNER, L., RYU, W.S. & BERG, H.C. (2000). Real-time imaging of fluorescent flagellar

filaments. J. Bacteriol. 182, 2793-2801.

UENO, T., OOSAWA, K. & AIZAWA, S.-I. (1992). M ring, S ring and proximal rod of the

flagellar basal body of Salmonella typhimurium are composed of subunits of a single

protein, FliF. J. Mol. Biol. 227, 672-677.

URATANI, Y., ASAKURA, S. & IMAHORI, K. (1972). A circular dichroism study of Salmonella

flagellin: evidence for conformational change on polymerization. J. Mol. Biol. 67, 85-

98.

VÉGH B.M., GÁL P., DOBÓ J., ZÁVODSZKY P., VONDERVISZT F. (2006). Localization of the

flagellum-specific secretion signal in Salmonella flagellin. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 345, 93-98.

VONDERVISZT, F., KANTO, S., AIZAWA, S.-I. & NAMBA, K. (1989). Terminal regions of

flagellin are disordered in solution. J. Mol. Biol. 209, 127-133.

VONDERVISZT, F., UEDAIRA, H., KIDOKORO, S. & NAMBA, K. (1990). Structural

organization of flagellin. J. Mol. Biol. 214, 97-104.

VONDERVISZT, F., AIZAWA, S.-I. & NAMBA, K. (1991). Role of the disordered terminal

regions of flagellin in filament formation and stability. J. Mol. Biol. 221, 1461-1474.

VONDERVISZT, F., ISHIMA, R., AKASAKA, K. & AIZAWA, S.-I. (1992a). Terminal disorder: a

common structural feature of the axial proteins of bacterial flagellum? J. Mol. Biol.

226, 575-579.

VONDERVISZT, F., SONOYAMA, M., TASUMI, M. & NAMBA, K. (1992b). Conformational

adaptability of the terminal regions of flagellin. Biophys. J. 63, 1672-1677.

VONDERVISZT, F., ZÁVODSZKY, P., ISHIMURA, M., UEDAIRA, H. & NAMBA, K. (1995).

Structural organization and assembly of flagellar hook protein from Salmonella

typhimurium. J. Mol. Biol. 251, 520-532.

VONDERVISZT, F., IMADA, K., FURUKAWA, Y., UEDAIRA, H., TANIGUCHI, S. & NAMBA, K.

(1998). Mechanism of self-association and filament capping by flagellar HAP2. J.

Mol. Biol. 284, 1399-1416.

WAGNER, R., PODESTÁ, F.E., GONZÁLEZ, D.H. & ANDREO, C.S. (1988). Proximity between

fluorescent probes attached to four essential lysyl residues in phophoenolpyruvate

carboxylase. Eur. J. Biochem. 173, 561-568.

WAKABAYASHI, K., HOTANI, H. & ASAKURA, S. (1969). Polymerization of Salmonella

flagellin in the presence of high concentrations of salts. Biochim. Biophys. Acta 175,

195-203.

Irodalomjegyzék

76

WEI, L.-N. & JOYS, T.M. (1985). Covalent structure of three phase-1 flagellar filament

proteins of Salmonella. J. Mol. Biol. 186, 791-803.

YAMASHITA, I., VONDERVISZT, F., MIMORI, Y., SUZUKI, H., OOSAWA, K. & NAMBA, K.

(1995). Radial mass analysis of the flagellar filament of Salmonella: implications for

subunit folding. J. Mol. Biol. 253, 547-558.

YAMASHITA, I., HASEGAWA, K., SUZUKI, H., VONDERVISZT, F., MIMORI-KIYOSUE, Y. &

NAMBA, K. (1998). Structure and switching of bacterial flagellar filaments studied by

X-ray fiber diffraction. Nat. Struct. Biol. 5, 125-132.

YONEKURA, K., MAKI, S., MORGAN, D.G., DEROSIER, D.J., VONDERVISZT, F., IMADA, K.

& NAMBA, K. (2000). The bacterial flagellar cap as the rotary promoter of flagellin

self-assembly. Science 290, 2148-2152.

YONEKURA, K., MAKI-YONEKURA, S. & NAMBA, K. (2001). Structure analysis of the

flagellar cap-filament complex by electron cryomicroscopy and single-particle image

analysis. J. Struct. Biol. 133, 246-253.

YONEKURA, K., MAKI-YONEKURA, S. & NAMBA, K. (2002). Growth mechanism of the

bacterial flagellar filament. Res. Microbiol. 153, 191-197.

YONEKURA, K., MAKI-YONEKURA, S. & NAMBA, K. (2003). Complete atomic model of the

bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy. Nature 424, 643-650.

ZHOU, J., FAZZIO, R.T. & BLAIR, D.F. (1995). Membrane topology of the MotA protein of

Eschericia coli. J. Mol. Biol. 251, 237-242.

Publikációk

77

Publikációs lista

A dolgozat alapjául szolgáló közlemények

Nemzetközi folyóiratokban megjelent közlemények:

Diószeghy Z., Závodszky P., Namba K., Vonderviszt F. (2004). Stabilization of flagellar

filaments by HAP2 capping. FEBS Lett. 568, 105-109.

Gugolya Z., Muskotál A., Sebestyén A., Diószeghy Z., Vonderviszt F. (2003). Interaction of

the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation. FEBS Lett. 535,

66-70.

Nemzetközi konferenciákon szereplı poszterek:

Vonderviszt F., Muskotál A., Sebestyén A., Gugolya Z., Diószeghy Z.: Interaction of the

disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. XIVth INTERNATIONAL

BIOPHYSICS CONGRESS. Buenos Aires, Argentína, 2002. április 27.- május 1.

Muskotál A., Sebestyén A., Gugolya Z., Diószeghy Z., Vonderviszt F.: Interaction of the

disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. KEIHANNA INTERNATIONAL

CONFERENCE ON MOLECULAR BIOPHYSICS. Kyoto, Japán, 2002. szeptember 19-21.

Hazai konferenciákon szereplı poszterek:

Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F.: A HAP2 sapka szerepe a flagelláris

filamentumok szerkezetének stabilizálásában. MAGYAR BIOKÉMIAI EGYESÜLET

MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI SZAKOSZTÁLYA 5. MUNKAÉRTEKEZLETE. Sopron, 2000. május 8-

11.

Muskotál A., Sebestyén A., Gugolya Z., Diószeghy Z., Vonderviszt F.: A flagellinmolekula

rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. MAGYAR

BIOKÉMIAI EGYESÜLET MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI SZAKOSZTÁLYA 7.

MUNKAÉRTEKEZLETE. Keszthely, 2002. május 14-17.

Publikációk

78

Egyéb közlemények

Nemzetközi folyóiratban megjelent absztrakt:

Sebestyén A., Gugolya Z., Jakab G., Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F. (2005): The

FliH component of the flagellarexport apparatus is a multi-zinc enzyme with phospholipase

activity. 30th FEBS CONGRESS AND 9th IUBMB CONFERENCE. Budapest, Magyarország,

2005. július 2-7. FEBS Journal 272, 347.

Hazai konferenciákon szereplı poszterek:

Vonderviszt F., Jakab G., Diószeghy Z., Gugolya Z., Závodszky P.: A FliH fehérje szerepe a

flagellum-specifikus exportapparátus mőködésében. MAGYAR BIOKÉMIAI EGYESÜLET

MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI SZAKOSZTÁLYA 8. MUNKAÉRTEKEZLETE. Tihany, 2003. május

12-15.

Sebestyén A., Gugolya Z., Jakab G., Muskotál A., Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt

F.: A flagellum-specifikus exportrendszer FliH komponense foszfolipáz aktivitással

rendelkezı multi-cink fehérje. MBFT XXII. KONGRESSZUSA. Debrecen, 2005. június 26-29.

Documents

A HAP2-sapka és a flagelláris filamentum közötti ...teo.elte.hu/minosites/ertekezes2009/dioszeghy_z.pdf · 7. Ábra: a hap2 sapka szerkezete. 24 8. Ábra: a hap2-sapka És a filamentum