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A velocidade das reações enzimáticas varia com diversos fatores:
• pH
• temperatura
• concentração de substrato
• concentração de enzima
• inibidores
CINÉTICA ENZIMÁTICA
• Efeito da concentração de substrato na velocidade da reação
• [S] varia no decorrer da reação
• [S] V aumenta quase linearmente com os aumentos da [S].
• Será alcançado um ponto acima do qual ocorrem apenas aumentos insignificantes em V. (Vmáx [S])Concentração de substrato
Vel
oci
dad
e (V
)
Estudo do efeito da concentração do substrato
medida da velocidade da reação.
1913 Leonor Michaelis e Maul Menten
consideram que uma reação enzimática ocorre em dois passos:
onde k1, k2, k3 e k4 são as constantes de velocidade de cada etapa.
RÁPIDA
LENTA
podemos simplificar a reação:
Portanto:
A velocidade de formação de produto é dependente de [ES].
(eq. 1)
Como [ES] não é facilmente medida, precisamos descobrir uma expressão alternativa para [ES].
Excesso de substrato ESTADO ESTACIONÁRIO
[ES] permanece praticamente constante durante todo o tempo.
V reflete o estado estacionário.
No estado estacionário:
Velocidade de formação de ES = Velocidade de decomposição de ES
Para simplificar a equação 4, foi definida uma constante, KM, conhecida como Constante de Michaelis:
Note que KM é a razão da soma das taxas de desaparecimento do complexo ES pela taxa de formação deste.
quando KM é pequeno, k1 é relativamente grande e a
barreira de energia livre para a formação do complexo é
pequena, portanto a ligação do substrato à enzima será
forte e a enzima irá catalisar a reação com baixas
concentrações.
KM, assim, reflete uma habilidade da enzima a se ligar
aos substratos e realizar a catálise.
desaparecimento
formação1
32 )(
k
kkKM
Substituindo a eq. 5 na eq. 4, teremos:
Na reação, pode-se assumir que o sítio da enzima pode estar ocupado ou livre. Assim a enzima existe em duas formas:
A forma livre E, e a forma ligada ES.
Substituindo a eq. 7 em 6, temos:
Que pode ser transformada em:
Podemos substituir esta eq. 9 na da velocidade inicial da reação
Em que situação teremos V= k3[E]TOTAL?
Quando a concentração de substrato for MUITO MAIOR que Km!
Como a velocidade máxima todas as enzimas estão na forma de complexo ES
[E]TOTAL= [ES]
a velocidade da reação não pode ser mais rápida do que quando todas as moléculas de enzimas estão na forma de complexo ES.
Portanto, enquanto houver E livre, pode-se aumentar a [S] até chegar em um ponto em que tudo estará como [ES], que é a velocidade máxima VMAX.
Vmáx = k3[E]TOTAL (eq. 11)
Então a equação 10, pode ser representada por:
Equaçao de Michaelis-Menten
Vmáx = k3[Et] (eq. 11)
Se a velocidade de reação for igual à metade da velocidade máxima, ou seja, V0=Vmáx/2, como fica a equação 12?
][
][2][
][
][
2
1
)(][
][
2 maxmaxmax
SK
SKS
KS
S
VKS
SVV
m
m
m
m
Temos: KM = [S]. Ou seja, KM corresponde à concentração de S necessária para se atingir a metade da velocidade máxima!
• Como será a velocidade da reação quando a concentração de substrato estiver muito baixa ([S]<<<Km)?
•Se [S]<<<Km, o termo [S] no denominador da eq. 12 torna-se insignificante e pode ser simplificada para:
V varia linearmente com [S]
•E quando a concentração de substrato estiver muito alta ([S]>> Km) ?
• Se [S] >>>> KM, o termo KM no denominador da eq. 12 torna-se insignificante, e pode ser simplificada para
Sendo consistente com o patamar observado em [S] grandes
maxVV
Portanto, esta equação nos diz que:
• [S] = KM quando a velocidade da reação é a metade da velocidade máxima.
• Quando KM é grande a [S] deve ser maior para atingir a máxima velocidade de catálise.
• KM pequeno exige menos S para atingir a VMAX e portanto é mais eficiente.
A equação de Michaelis-Menten pode ser representada na forma inversa (eq. 13) que representa uma equação do tipo y =ax+ b:
• Essa é uma equação de reta (y = ax + b) em que a inclinação (a) é igual a KM/Vmáx e o intercepto (b) é igual a 1/Vmáx,
• Essa é a forma mais comum de se determinar os parâmetros cinéticos (KM e Vmáx).
O gráfico dos duplos recíprocos determinação precisa de KM e Vmáx já que na extrapolação dos dados experimentais, chegamos a uma situação em que 1/V= 1/Vmáx quando 1/[S] = 0; ou seja, quando a concentração de substrato for muito alta!!!!
• Efeito da Concentração de Enzima na Velocidade da Reação
• concentração de substrato seja alta
aumento na concentração de enzima
um aumento na velocidade de reação
Quando fazemos o gráfico da velocidade da reação (V) em função da concentração de enzima, podemos observar uma relação linear:
Como vimos:
Ao se utilizar uma concentração maior de enzima, VMAX será maior utilizando-se a mesma concentração de substrato
Vmax é maior em [E] maior, utilizando a mesma [S]