Upload
vancong
View
230
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
J. Muchová, Z. Ďuračková
Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie, LF UK Bratislava
Klinická biochémia - nové trendy
(Oxidačný stres v patológii niektorých ochorení -
ako ho rozpoznať a ako sa proti nemu brániť)
Vývoj špecifických, spoľahlivých a
neinvazívnych metód vhodných na
meranie oxidačného stresu u ľudí
má zásadný význam pre vysvetlenie
úlohy voľných radikálov v patológii
ľudských ochorení.
Kritéria pre ideálny biomarker oxidačného poškodenia
A. Základné kritérium
Biomarker by mal vyjadrovať prognózu neskoršieho
vývoja ochorenia
B. Technické kritériá
• Mal by detegovať hlavnú časť celkového oxidačného
poškodenia in vivo
• Koeficient inter-variácie medzi meraniami tej istej vzorky by
mal byť menší ako intra-variabilné rozdiely medzi subjektmi
• Jeho hladina by nemala mať široký rozptyl v tých istých
subjektoch v rôznych časoch za rovnakých podmienok
• Jeho stanovenie by malo využívať priame chemické analytické
metódy
• Nemal by byť ovplyvnený diétou
• Mal by byť stabilný počas uskladnenia a netvoriť artefakty
Existuje nejaký všeobecný biomarker oxidačného poškodenia a oxidačného stresu?
NIE
V bunkách vystavených silnému oxidačnému stresu
biomarkery oxidačného poškodenia rôznych biomolekúl
rastú paralelne
V zdravých tkanivách takáto korelácia nie je
1. Detekciou voľných radikálov
2. Meraním produktov oxidačného stresu
3. Meraním antioxidantov
4. Meraním opravnej kapacity, resp. aktivity opravných (reparačných) enzýmov
A. Priame merania
Magnetická Rezonancia
Elektrónová spinová rezonancia (Berliner et al.2001, Han et al.2001
Jadrová magnetická rezonancia Utsumi & Yamada, 2003)
Stanovenie látok s nespárenými elektrónmi - metóda dokazuje ich prítomnosť a identitu
Pulzná rádiolýza
Chemiluminiscencia buniek a tkanív
Fluorescenčné sledovanie radikálov
Stanovenie: - superoxidu (UV oblasť)
- H2O2 (240 nm)
- NO (porfyrínová elektróda)
- peroxynitritu (302 nm)
B. Nepriame merania
RS majú len veľmi krátku životnosť (okrem H2O2, NO)
„Spin trapping“ ER – ak sa radikály zachytia do stabilnejšieho aduktu (DMPO – 5,5-
dimetyl-1-pyrolín-N-oxid)
Stanovenie superoxidu – nepriame metódy využívajú jeho schopnosť redukovať
detektorovú molekulu na farebný produkt (cyc c – 550 nm,
INT – 510 nm...)
Stanovenie H2O2 – merania O2 elektródou po pridaní katalázy, fluorimetrická
detekcia s použitím peroxidázovej reakcie
Aromatická hydroxylácia – odráža tvorbu •OH (salicylát s •OH tvorí 2,3 –
dihydrobenzoát (2,3-DHB), 2,5-DHB a katechol)
Stanovenie nitrátov a nitritov - konečné metabolity NO
Stanovenie peroxynitritu – imunochemická detekcia 3-nitrotyrozínu
POŠKODENIE LIPIDOV
POŠKODENIE PROTEÍNOV
POŠKODENIE DNA
2. Meranie produktov oxidačného
stresu
Poškodenie lipidov
*Peroxidácia lipidov – hlavná črta oxidačného stresu
*Kvantifikácia primárnych alebo sekundárnych produktov lipoperoxidácie
*Primárne produkty: konjugované diény
lipidové hydroperoxidy
*Sekundárne produkty: TBARP, MDA, alkány, (4-HNE),
izoprostány
Lipoperoxidácia R 1
R 2
Fosfolipid LH
Alkylový radikál
Konjugovaný dién alkylového radikálu
Peroxylový radikál
O O
malondialdehyd (MDA)
R 1
R 2
O
O
H
LOOH
Peroxylový radikál Alkoxylový radikál
Hydroperoxid
Alkanaly Alkenaly (4-HNE, MDA)
štiepenie
R 2 O
H
Alkenylový (alebo alkanylový) radikál Alkenal
modifikácia biomolekúl
O 2
Komplex Fe(II) Komplex Fe(III)
R
RH
L
L
LOO
R 1
R 2
R 1
R 2
R 1
R 2
O
O RH
R
R 2
O O
R 1
R 1
R 2
O
LO
R 1
R 2
O
O LOO
R 1
RH
R
Alkény
Alkány
pľúca
Produkty oxidačného poškodenia VNKK
ALDEHYD Malondialdehyd Propanal, Butanal Etanal, Pentanal Hexanal 2,4-Heptadienal 4-Hydroxy-2-hexenal 4-Hydroxy-2-oktenal 4-Hydroxy-2-nonenal 4-Hydroxy-nona-2,6-dienal 4,5-Dihydroxydecenal
VNKK 18:3, 20:4, 20:5, 20:6 18:2, 20:4 18:2, 20:4 18:2, 20:4 18:2, 20:4 22:6 18:2, 20:4 18:2, 20:4 20:5, 22:6 20:4
Produkty oxidačného poškodenia lipidov
• veľké množstvo rôznych produktov
• veľká variabilita vytvoreného množstva jednotlivých produktov
• konjugované diény (lag-time, 234 nm) – extrémne nestále – nie sú akceptované
• MDA – jednoduchý TBARP test – neakceptuje sa
• MDA-TBA chromogen – HPLC – akceptuje sa
EDTA-plazma (0,13-0,63, priemer 0,36 mol/l ),
citrátová plazma (0,61-2,57, priemer 1,43 mol/l ) (Suttnar et al, 2001)
Výhody a nevýhody stanovenia MDA ako TBARP
MDA nie je špecifický produkt Tvorba MDA z VNKK s tromi a viac dvojitými väzbami Tvoria sa aj ďalšie aldehydové produkty (propanal, hexanal, 4HNE, akroleín) MDA - substrát pre ďalšie reakcie - Schiffove zásady Aldehydy sa absorbujú aj z potravy (MDA-aminokyseliny) Tvorba MDA z nelipidových molekúl (aminokyseliny, sacharidy, bilirubín, DNA) TBARP
TBA
CH=O
CH2
CH=O
Izoprostány – markery oxidačného poškodenia lipidov
F2-izoprostány (8-iso-PGF2) (Fam&Marrow, 2003) z arachidónovej kys.
F4-izoprostány (Roberts & Morrow, 2002) z eikozapentaénovej
a dokozahexaénovej kyseliny
Zvýšená hladina izoprostánov: AD, cievne ochorenia, diabetes mellitus, ateroskleróza, endotelová dysfunkcia, chronická obštrukčná choroba pľúc a bronchiálna astma
Analýza (plazma, moč):
MS (Lawson et al., 1999), imunochemicky (komerčné sety)
• 30-40 pg/ml plazmy
Stanovenie F2-izoprostánov
Meranie je založené na kompetícii medzi 8-Izo
vo vzorke a 8-izo viazanými s AchE o protilátky
králičieho antiséra proti 8-Izo. Vzniknuté
konjugáty sú vychytávané IgG, ktoré sú
prichytené na dno mikrotitračnej platne.
Množstvo zachyteného konjugátu sa stanovuje
pomocou Ellmanovho činidla, ktoré obsahuje
substrát pre acetylcholínesterázu. Reakcia
acetylcholínesterázy so substrátom vyvolá
farebnú zmenu reakčnej sústavy. Zmena
zafarbenia je nepriamo úmerná množstvu
voľných 8-Izo vo vzorke.
Oxidačné poškodenie proteínov
PRIMÁRNE
reakcie katalyzované iónmi prechodných prvkov
radiácia
ozón, oxidy dusíka, HOCl
SEKUNDÁRNE
Proteíny sú modifikované produktmi oxidácie iných molekúl (väzba 4HNE a MDA na -NH2 a -SH skupiny)
Oxidácia proteínov
NH
O
CO NH R NH2
CO
HOOC
NH RNH COOH
Prolín Pyroglutamát Glutamát
O
C
H
CH2 CH
2 CH
COR
NH R
O
C
OH
CH CH2 CH
2CH
2 NH
NHNH
2
NH2
Arginín Semialdehyd kyseliny glutámovej
NH
C
O
CH2
CH
NHR
COR
CHO NH
C
O
CH2
CH
NHR
COR
CHONH2
CH
NH
COOH
Tryptofán N - Formylkynurenín Kynurenín
HOS CH2
CH
NHR
COR HO2S CH
2CH
NHR
COR HO3S CH
2CH
NHR
CORSH CH
2CH
NH2
COOH
Cysteín Sulfenát Sulfinát Sulfonát
Stanovenie produktov oxidačného poškodenia proteínov
KARBONYLOVÉ PROTEÍNY Spektrofotometricky s DNPH (Abraham Z. a kol., 1994)
HPLC s DNPH (370 nm) [pmol] (Shacter E. a kol., 1996)
ELISA (Buss H. a kol., 1997)
3-NITROTYROZÍN HPLC s EC detektorom (Hensley K. a kol., 2000)
DITYROZÍN – v moči, mozgu – fluorescenčné sondy (Davies et al., 1999, Sakharov et al., 2003)
HO
COOH
H2NO2N
•Oxidačné poškodenie purínových a
pyrimidínových zásad
• Oxidačné poškodenie deoxyribózovej
jednotky (C4-D ribózy)
• Jednovláknové alebo dvojvláknové
zlomy DNA
OXIDAČNÉ POŠKODENIE DNA
STANOVENIE OXIDAČNÉHO POŠKODENIA DNA
*V izolovanej DNA stanovenie oxidačne poškodených
dusíkových zásad 8-oxo-dG/8-oxoG
* Zvýšený účinok oxidantov
* Znížený účinok reparačných systémov
* Stanovenie produktov v moči 8-oxo-dG /8-oxoG
* Jedno- a dvojvláknové zlomy DNA v lymfocytoch
Na stanovenie oxidačného poškodenia DNA sa môžu použiť viaceré metódy:
o HPLC/MS (hmotnostná spektrometria)
o ELISA (Kasai H.)
o HPLC/EC (elektrochemický detektor)
o Kométova metóda
Jednobunková gélová elektroforéza
Enzýmovo modifikovaná kométova metóda
- Fpg (oxidované puríny)
- endonukleáza III (oxidované pyrimidíny)
(Collins et al., 2004, ESCODD 2003, 2004)
a) Trieda 0 – nepoškodená DNA
b) Trieda 1 – veľmi málo poškodená DNA
c) Trieda 2 – poškodenia s viditeľným chvostom
d) Trieda 3 – väčšia časť DNA je v chvoste
e) Trieda 4 – takmer celá DNA je v chvoste
0 1 2
3 4
HPLC/EC METÓDA Meranie hladín 8-oxo-dG v sére v lymfocytoch Príprava vzorky:
Centrifugácia séra 1500 x g, 10 min
Ultracentrifiltrácia séra Filter Microcon YM-10
1500x g, 60 min
HPLC analýza
Izolácia DNA z
jadier lymfocytov
alebo z tkanív
(150-250 µg DNA)
Hydrolýza DNA
s fosfatázou
a nukleázou P
HPLC analýza
Kolóna: Nucleosil C18 5 mm, 250 x 4 mm
Mobilná fáza: 50 mM KH2PO4
(pH 5,5) s 5,5% metanolu
Prietok: 0,8 ml/min
Detekcia: ESA Coulochem II EC detector (20 mV, 500 mV)
Konvalina I. et al., 2004
8-oxo-dG
HPLC chromatograf vzorky séra a vzorky s interným štandardom
ESCODD: Collins, A.R., ….. Ďuračková, Z., et al., 2002
Hydrofilné, plazma
Kyselina askorbová
Kyselina močová
Glutatión - plazma
Bilirubín
Albumín
Transferín
Ceruloplazmín
Polyfenoly
- SH skupiny
Lipofilné, plazma
-, -tokoferol
-karotén
Lykopén
Luteín
Ubichinón
Erytrocyty, plazma
Superoxiddizmutáza Glutatiónperoxidáza
Glutatiónreduktáza
Paraoxonáza
Glutatión
3. Parametre antioxidačného stavu
Stanovenie aktivity SOD
NEPRIAME METÓDY STANOVENIA AKTIVITY SOD
Pri skúmaní antioxidantov sa musí definovať
• cieľová molekula/substrát
• zdroj OS
• použitá metóda na stanovenie antioxidantov
Preanalytika:
Vit. E, -karotén, Ko-Q: citrát/EDTA plazma, -25°C, niekoľko týždňov
Vit. C: citrát/EDTA plazma rýchlo získaná v tme, -80°C, niekoľko týždňov
SOD: krv (heparín, citrát, EDTA) Ery - lyzát GPx - krv (heparín, EDTA),
PON: NIE EDTA plazma, -80°C
TAS: závisí od metódy
Metódy používané na stanovenie TAS Test
TRAP
ORAC
TAS
TEAC
FRAP
Plasma-Lag
Oxidant
ABAP
AAPH
Feryl-Mb/H2O2
K2S2O8
Fe3+-TPTZ
Cu2+
Princíp stanovenia
Poškodenie proteínu R-PE
Inhibícia oxidácie proteínu -PE
Inhibícia oxidácie ABTS na ABTS.+
Inhibícia oxidácie ABTS na ABTS.+ Redukcia na Fe2+-TPTZ
Kinetika absorbancie pri 245 nm
Literatúra
Ghiselli 1995
Cao 1993
Miller 1993
Re 1999
Benzie 1996
Schnitzer 1995
TRAP - Total Radical Trapping Antioxidant Parameter
ABAP - 2,2’-azobis-(2-amidino-propane) dihydrochloride
ORAC – Oxygen radical absorbance capacity
AAPH - 2,2’-azobis-(2-amidino-propane) hydrochloride
TEAC – Trolox equivalent antioxidant capacity
ABTS - 2,2’-azinobis-(3-etyl-benzotiazolin-6-sulfónová kys.)
FRAP – Ferric reducing antioxidant power
TPTZ - 2,4,6-tripyridyl-s-triazine, PE - phycoerythrin
Ďalšie markery oxidačného stresu
Hydroperoxidy lipidov a proteínov (El-Saadani et al., 1989)
AGE produkty (HPLC, imunochemická detekcia)
(Takahashi et al., 1993, Izuhara et al., 1999)
Lipofuscín (Tsuchida et al., 1987)
Alantoín (HPLC) (Žitňanová et al., 2004)
LMW-Cu a Fe (Ďuračková et al.: 2000)
OXIDAČNÝ STRES
MONITOROVAŤ
NIE JE ĽAHKÉ
OXIDAČNÝ STRES
MONITOROVAŤ
JE VŠAK MOŽNÉ
OXIDAČNÝ STRES
MONITOROVAŤ
JE POTREBNÉ
MONITOROVANIE OXIDAČNÉHO STRESU UMOŽNÍ
poznať príčinu poškodenia (druh oxidanta)
poznať dôsledok (poškodené molekuly)
cielene voliť farmakoterapiu
ZÁVER *Monitorovať oxidačný stres je potrebné.
*Poznanie skutočného stavu oxidačného stresu umožní
cielenú aplikáciu antioxidantov s vylúčením možnosti
sekundárneho poškodenia.
*Úspešnosť antioxidačnej terapie bude závisieť od
toho ako dobre budeme poznať exaktnú úlohu RM vo
fyziologických aj patologických procesoch a hlavne
prostredie, v ktorom pôsobia.
ĎAKUJEM ZA POZORNOSŤ