ไรโซเบยม 1

ไรโซเบยมเปนจลนทรย อกกลมหนงทนยมใชในการผลตปยชวภาพ โดยใชกลไกของการตรง ธาต ไนโตร เจนท ม อย ในอากาศ มา เปล ยนให เปนแอมโม เน ย หรอสารประกอบไนโตร เจน ทพชสามารถนาไปใชได ความพเศษของเชอกลมไรโซเบยมกคอ ความสามารถในการเขาสรางปม ทรากหรอทลาตนของพชตระกลถว ดงแสดงในรปท 1 ทาใหพชเหลานนไดประโยชนจากการตรง ไนโตรเจนโดยตรงซงจาเปนจะตองอาศยการทางานรวมกนระหวางพชตระกลถว และไรโซเบยม ทสมพนธกน

รปท 1 ภาพแสดงปมของรากและลาตนทพบในพชตระกลถว ซงเกดจากการเขาอาศยของเชอไรโซเบยม

ทมา: http://www.doae.go.th/ni/nut/riso2.htm เชอจลนทรยกลมไรโซเบยมเปนแบคทเรยแกรมลบ จากการศกษาภายใตกลองจลทรรศน พบวา

จะมรปรางเปนแทงยาว (rod shape) เมอถกเลยงในสภาพปกต แตเมอเชอไรโซเบยมเขาสระบบรากของพช จะมการเปลยนแปลงรปรางไป โดยเชอไรโซเบยม ทพบในปมรากของพชตระกลถวจะมรปรางไมแนนอน เชน มรปรางเปนลกษณะ X-, Y- หรอ Star-shape ไรโซเบยมทเขาไปอาศยอยในปมแลวนจะเรยกวา แบคทรอยด (bacteroid) (Alexander, 1977) ดงแสดงในรปท 2

รปท 2 ลกษณะของเชอแบคทรอยดทพบในปมของรากพชตระกลถว

ทมา: www.agr.kuleuven.ac.be/ dtp/cmpg/research/symb...

1 เรยบเรยงโดย รองศาสตราจารย ดร.หนง เตยอารง อาจารยประจาสาขาวชาเทคโนโลยชวภาพ สานกวชาเทคโนโลยการเกษตร

1 มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร 111 ถนนมหาวทยาลย ตาบลสรนาร อาเภอเมอง จงหวดนครราชสมา 30000

เชอจลนทรยในกลมไรโซเบยมสามารถแบงออกไดเปนหลายกลม เมอจาแนกโดยใชวธการ ทางชวโมเลกล แตอยางไรกดในอดตนกวทยาศาสตรไดจดจาแนกเชอไรโซเบยมตามชนดของ พชตระกลถวท เชอไรโซเบยมนน ๆ สามารถเขาไปสรางปมได เชน เชอไรโซเบยมถวเหลอง เชอไรโซเบยมถวแดง เปนตน (Sahgal and Johri, 2003) จงแสดงใหเหนวา มความเฉพาะเจาะจง ระหวางเชอไรโซเบยมกบพชตระกลถวแตละชนด (host specificity) ดงนน การเลอกใชเชอ ไรโซเบยม เพอผลตเปนปยชวภาพ จงตองคานงถงพชตระกลถวทจะใชปลกดวย เชอไรโซเบยมนจะสามารถตรงไนโตรเจนใหกบพชตระกลถวไดกตอเมอเชอจะตองเขาอาศยอ ย ร ว ม ก น ใ นปม ร า ก ห ร อ ล า ต น ใ น ภ า ว ะ พ ง พ า ซ ง ก น แ ล ะ ก น ห ร อ เ ร ย ก ว า symbiosis กลไกของเชอไรโซเบยมทเขาสรากพชไดนน จะเรมจากการทรากพชจะปลอยสารจาพวก flavonoid หรอ isoflavonoid ออกมา จากนนสารนจะไปกระตนใหไรโซเบยมเคลอนตวสรากพช ดงแสดงในรปท 3 และกระตนกลมของยนสในเชอไรโซเบยม ทควบคมการสรางปม (nodulation genes หรอ nod) ใหมการแสดงออกเพอผลตเอนไซมทเกยวของ กบการสรางสารพวก lipopolysaccharide หรอเรยกวา nod factor เชอไรโซเบยมจะปลดปลอยสารน ออกสภายนอกเซลล จากนน nod factor ก จ ะ ท า ใ ห ร า ก ข อ งพ ช ต ร ะ ก ล ถ ว น น โ ค ง ง อ แ ล ะ เ ป ล ย น เ ป น โ ค ร งส ร า ง ข อ งปมต อ ไ ป ในชวงนเชอไรโซเบยมกจะเคลอนตว เขาสรากของพช ไปตามโครงสรางทเรยกวา infection thread ซ ง ย น ส ใ น เ ซ ล ล ข อ ง ร า ก พ ช เ ป น ต ว แ ส ด ง อ อ ก เ พ อ ใ ห เ ก ด โ ค ร ง ส ร า ง น และโครงสรางทจะขยายตวออกมาเปนปมตอไป (หนง และ นนทกร, 2539)

รปท 3 การเกาะตดของเชอไรโซเบยมบรเวณรากของพชตระกลถวกอนเขาสรางปม

ทมา: www.arc.agric.za/.../ rhizobium.htm เมอเชอไรโซเบยมสามารถเขาไปสรางปมไดแลว กจะเรมกระบวนการตรงไนโตรเจน จากอากาศใหกบพช โดยสรางเอนไซมไนโตรจเนส (nitrogenase) ซงเปนเอนไซมทสาคญทสด ในการควบคมกลไกทจะทาปฏก รยาเปลยนกาซไนโตรเจนใหเปนแอมโมเนย กลมของยนสใน ไรโซเบยมทเกยวของกบการตรงไนโตรเจนนเรยกวา nif ซงจะแสดงออกเพอทาหนาทในการผลต เอนไซมไนโตรจเนส (nitrogenase) นอกจากนยงพบยนสในกลม fix ซงทาหนาทเกยวของกบ การขนถายอเลคตรอน และพลงงานในกระบวนการตรงไนโตรเจนอกดวย (Moat and Foster, 1995) ใ น ข ณ ะ เ ด ย ว ก น ย ง ม โ ป ร ต น ท ช อ ว า เ ล ก ฮ โ ม โ ก ล บ น (leghemoglobin)

2

3

จากองคประกอบทกล าวมาข างตน เช อไรโซเบยมจงมคณสมบตในการนามาทา เปน ปยชวภาพเพอเปนแหลงผลตธาตไนโตรเจนใหกบพช ซงการนาเชอไรโซเบยมไปใชในสภาพไร นนจะกลาวถงในหวขอตอไป การบงชและการจาแนกเชอไรโซเบยม ในอดตเชอไรโซเบยมจะถกจดจาแนกตามพชตระกลถวทเชอนนๆ สามารถเขาสรางปมได ซงรวมเรยกเชอจลนทรยกลมนวา Rhizobium ซงถกจาแนกออกเปนกลม ดงน

1. Rhizobium japonicum ซงจะสรางปมกบถวในกลม Glycine max (ถวเหลอง) 2. Rhizobium lupine จะสรางปมกบถว Lupinus, Ornithopus 3. Rhizobium meliloti สรางปมกบถวในกลม Melilotus, Medicago (ถวอลฟลฟา), และ Trigonella 4. Rhizobium leguminosarum สรางปมกบถวในกลม Pisum (ถวลนเตา), Vicia (ถวปากอา), Lens และ

Lathyrus 5. Rhizobium phaseoli สรางปมกบถวในกลม Phaseolus (ถวแดงหลวง) 6. Rhizobium trifolii สรางปมกบถว Trifolium (ถวโคลเวอร)

นอกจากนการจาแนกกลมไรโซเบยมยงถกจดจาแนกตามอตราการเจรญอกดวย โดย แบงเปน 2 กลม

คอ ไรโซเบยมชนดโตเรว (Fast grower) ซงมอตราการแบงตวทกๆ 1 - 3 ชวโมง ซงจะพบโคโลนบน อาหารเลยงเชอไดหลงจากเลยงไปภายใน 2 - 4 วน สาหรบเชอไรโซเบยม อกกลม คอ ไรโซเบยม ชนดโตชา (Slow grower) ซงมอตราการแบงตวทกๆ 4 - 8 ชวโมง โดยจะพบโคโลนบนอาหารเลยงเชอได หลงจากเลยงไปภายใน 5 – 8 วน ซงทง 2 กลมนยงคงถกเรยกวา Rhizobium อยเชนเดม จนกระทงมการตงชอกลมไรโซเบยมอกกลมหนง ขนมาใหมเรยกวา Bradyrhizobium ซงใชเรยกเฉพาะ เชอไรโซเบยมทเจรญชา และแยกออกมาไดจากปมถวเหลอง (Glycine max) เทานน โดยเรยกวา Bradyrhizobium japonicum อยางไรกดตอมาไดมการคนพบเชอไรโซเบยมชนดเจรญเรวซงถกคดแยกออกมาจาก ถวเหลองไดเชนกน ปจจบนเชอไรโซเบยมกลมนไดชอวา

Sinorhizobium fredii ดงนนในปจจบน การจดจาแนกเชอไรโซเบยมตาม พชตระกลถวเพยงลกษณะเดยวจงไมสามารถใชได

จนกระทงเมอเทคโนโลยทางดานชวโมเลกลถกพฒนาขนมา จงไดมการนาเทคโนโลย ดานนมาประยกตใชในการจาแนกเชอไรโซเบยมรวมกบลกษณะทางสรรวทยา และทางชวเคม ซงสามารถจาแนกไรโซเบยม ออกไดเปน 7 กลม ดงแสดงในตารางท 1 แตอยางไรกด

4

ตารางท 1 การจดจาแนกเชอไรโซเบยม

จนส สปชส พชตระกลถวAllorhizobium A. undicola Neptunia natans Azorhizibium Az. caulinodans Sesbania rostrata Bradyrhizobium B. elkanii

B. japonicum B. liaoningense

Glycine max G. max G. max

Mesothizobium M. amorphae M.chacoense M. ciceri M. huakuii M. loti M. mediterraneum M. plurifarium M. tianshanense

Amorpha fruticosa Prosopis alba Cicer arietinum Astragalus Loti Cicer arietinum Acacia, Leucaena Glycyrrhiza, Sophora and Glycine

Methylobacterium M. nodulans Crotalaria pedocarpa

5

Rhizobium R. etli R. galegae R. gallicum R. giardinii R. hainanense R. huautlense R. leguminosarum R. mongolense R. phaseoli R. sullae R. tropici R. trifolii R. yanglingense

Phaseolus vulgaris Galege P. vulgaris P. vulgaris Centrosema, Desmodium Stylosanthes, Tephrosia Sesbania herbacea Trifolium, Vicia Medicago ruthenica P. vulgaris Hedysarum hedysari Leuceana, P. vulgaris Trifolium Amphicarpaea, Trisperma, Corollina varia and Gueldenstaedtia multiflora

Sinorhizobium S. arboris S. fredii S. kostiense S. medicae S. meliloti S. saheli S. terangae S. xinjiangense

Acacia senegal Prosposis chilensis G. max A. senegal, P. chilensis Medicago spp. M. sativa Sesbania Acacia, Sesbania G. max

ทมา: Sahgal and Johri, 2003

กลไกการใหธาตอาหาร 1. กระบวนการเขาสรากพชและลาตนพชโดยไรโซเบยม (Rhizobial Infection Process)

การปลดปลอยสารประกอบอนทรยจากรากพช (Plant root exudation) ระหวางทพชกาลงเจรญเตบโตรากพชจะปลดปลอยสารประกอบอนทรย (root exudates) ชนดตาง ๆ ออกมาบรเวณรอบ ๆ ราก (rhizosphere) สารประกอบอนทรยเหลานนไดแก กรดอนทรยชนดต าง ๆ กรดอะมโน น าตาลชนดต าง ๆ โพลแซคคาไรด (polysaccharides) และเอนไซมชนดตาง ๆ ซงสารประกอบเหลานมคณสมบตเปนแหลงของพลงงาน และ growth factor

รปท 4 แสดงกระบวนการเขาสรากพชและสรางปมโดยแบคทเรยไรโซเบยม

ทมา: www.microbiologyonline.org.uk การสรางทอสาหรบเคลอนเขาสรากพช (Formation of infection thread) หลงจากนนเซลลรากพชกจะเกดเปลยนแปลงโครงสรางเปนทอเลกๆขนมาเรยกวา Infection thread ซงเกดจากการยดหดตวของผนงเซลล (infolded and extended plasma membrane)

6

2. วงจรไนโตรเจน (Nitrogen cycle) 2.1 Biological Nitrogen fixation

การตรงไนโตรเจนโดยแบคทเรยกลมไรโซเบยมนน แบคทเรยในรปของแบคทรอยด (Bacteroid) มความสามารถเปลยนกาซไนโตรเจนในบรรยากาศ (N2) ไปอยในรปของแอมโมเนยซงเปน สารประกอบอทรยไนโตรเจน (organic nitrogen) แบคทเรยสามารถตรงไนโตรเจนไดเนองมาจาก กจกรรมของเอนไซมไนโตรจเนส (Nitrogenase) กระบวนการตรงไนโตรเจนทกระตนโดย เอนไซมไนโตรจเนสแสดงดงน

Nitrogenase N + 8H+ + 8e + 16 ATP 2NH + H + 16ADP + 16 Pi2

-3 2

เอนไซมไนโตรจเนสประกอบไปดวยโปรตน 2 ชนดคอ โปรตนทมเหลกเปนองคประกอบ (iron

protein หรอ Fe-protein) และโปรตนทมโมลบดนมและเหลกเปนองคประกอบ (molybdenum-iron protein) ซงในขนแรก Fe-protein จะถกรดวสโดย ferredoxin ตอมา Fe-protein ทถกรดวสจะเขาจบกบ ATP และไปรดวส molybdenum-iron protein และใหอเลกตรอนกบ N2 และเกดเปน NH=NH และ ถกร ด วส ต อไป เร อ ยๆโดยรบอ เ ลกตอนจาก ferredoxin จนกลาย เปน 2NH3 โดยกลไกลปฏกรยาแสดงดงรปท 5

รปท5 แสดงปฏกรยารดกชนระหวางกระบวน การตรงไนโตรเจนโดยไนโตรจเนสเอนไซม

ทมา: http://helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/nitrogen.htm

7

2.2 Ammonification หรอ Mineralization Ammonification เปนกระบวนการท NH4

+ ถกปลดปลอยออกมาจากสารประกอบอนทรย ไนโตรเจนในดน ซงอาจมาจากซากพชซากสตว ยกตวอยางเชน จากโปรตน กรดนวคลอก (Nucleic acid) นาตาลททหมอะมโน (amino sugar) เปนตน โดยกจกรรมของจลนทรยดนสวนใหญ ตวอยางของปฏกรยามดงน

1) Direct Removal R-CH2 CH-NH2-COOH R-CH=CH-COOH + NH3

2) Deamination (oxidative - aerobic, reductive - anaerobic) Oxidative: R-CH2CH-NH2COOH + 1/2 O2 R-CH2-CO-COOH + NH3 Reductive: R-CH2CH-NH2COOH + 2H+ R-CH2CH-COOH + NH3

3) Decarboxylation Reductive: R-CH2CH-NH2COOH + H2 RCH3 + CO2 + NH3 Oxidative: R-CH2CH-NH2COOH + O2 R-COOH + CO2 + NH3

หลงจากนนแอมโมเนย (NH3) ในดนจะถกเปลยนไปเปน แอมโมเนยมอออน (NH4+) ซงเปนรปทมประจ

จงสามารถถกดดซบอยในดน และพชสามารถนาไปใชได หลงจากทไนโตรเจนจากบรรยากาศถกเปลยนไปเปนแอมโมเนยและแอมโมเนยมอออนแลว

ปฏกรยาตอมาทสามารถเกดขนไดแก Nitrification และ Assimilation (หรอ Immobilization) 2.3 Ammonium Assimilation

NH4+ Organic N

Ammonium assimilation เปนกระบวนการทแอมโมเนยถกเปลยนไปเปนโปรตนหรอสารประกอบ อนทรยไนโตรเจนอนๆ (organic nitrogen compounds) ซงเกดขนไดทงจากกจกรรมของพชเอง และกจกรรมของจลนทรย อาทเชน E. coli, Synechocystis sp., Aspergillus nidulans, Candida utilis เปนตน โดยโปรตนหลกท ถกสงเคราะหขนมาไดแก glutamate, alanine และ aspartate และเอนไซมทมบทบาทไดแก glutamate dehydrogenase (GDH), glutamine synthesis (GS) และ NADPH-dependent glutamine:2-oxoglutarate amidotransferase (GOGAT) หรอ glutamate synthetase

1) แสดงปฏกรยาทควบคมโดยเอนไซม glutamate dehydrogenase (GDH) GDH

NH4+ + 2-oxoglutarate + NADPH + H+ glutamate + NADP+

2) แสดงปฏกรยาทควบคมการทางานรวมกนของเอนไซม glutamine synthetase (GS) และเอนไซม glutamate synthetase (GOGAT)

GS NH4

+ + glutamate + ATP glutamine + ADP + Pi GOGAT

8

glutamine + 2-oxoglutarate + NADPH + H+ 2 glutamate + NADP+

ซงกระบวนการนจะถกควบคมโดยปรมาณแอมโมเนยทมอย ถาในสภาวะทมแอมโมเนย

มากเกนพอ จะเปนสภาวะทไปกระตนการทางานของทงปฏกรยาท 1 และ 2 คอเรงการเปลยน แอมโมเนยไปเปนกรดอะมโน สวนในสภาวะทขาดแคลนแอมโมเนย (ความเขมขนของแอมโมเนยนอยกวา 1 mM) ปฏกรยาของ glutamine synthetase (GS) จะถกกระตน สวนปฏกรยาของ glutamate synthetase (GOGAT) จะถกยบยง ซงทงสองปฏกรยาจะผลต 1 โมลของ glutamate จาก 1 โมลของแอมโมเนย แตในระบบของ GS-GOGAT จะใชพลงงาน 1 ATP

นอกจากนนยงมปฏกรยาของเอนไซมอนท เกยวของ อาทเชน Alanine dehydrogenase ซงจะเปลยนแอมโมเนยไปเปน alanine NH4

+ + Pyruvate + NADH + H+ Alanine + NADH+

2.4 Nitrification ห ล ง จ า ก ท ไ น โ ต ร เ จ น จ า ก บ ร ร ย า ก า ศ ถ ก เ ป ล ย น ไ ป เ ป น แ อ ม โ ม เ น ย แ ล ว

พชหรอจลนทรยสามารถนาไปใชไดโดยตรงในกระบวนการ assimilation ทกลาวไปแลวขางตนนน แอมโมเนยยงสามารถเปลยนไปเปนไนไตรท (Nitrite; NO2

-) และเปลยนไปเปนไนเตรท (Nitrate;NO3-)

ซงอยในรปทพชสามารถนาไปใชประโยชนได โดยปฏกรยาออกซเดชน (Oxidation) โดยในปฏกรยานเกดขนไดเนองจากกจกรรมของแบคทเรยในกลมทเรยกวา Chemoautotrophic bacteria หรอเรยกวา

nitrifying bacteria ซงแบคทเรยกลมแรกทเกยวของกบการเปลยนแอมโมเนยมไปเปนไนไตรทคอ แบคทเรย กลม Nitrosomonas สวนแบคทเรยกลมทสองทเกยวของกบการเปลยนไนไตรทไปเปนไนเตรทสวนใหญคอ Nitrobactor ดงแสดงในรปท 6

รปท 6 แสดงปฏกรยาของ Ammonification และ Nitrification

http://www.esf.edu/efb/course/EFB530/lectures/nitrogen.htm ทมา:

9

2.5 Nitrate Assimilation เปนกระบวนการทพชและจลนทรยนาไนโตรเจนในรปของไนเตรทไปใชเปนแหลงไนโตรเจน

โดยขน แรกจะตองมการเปลยนไนเตรทไปเปนแอมโมเนยกอนโดยปฏก รยารดกชน (Reduction) และหลงจากนน จะผานกระบวนการรดกชนไปเรอยๆ โดยจาเปนตองใช NADH เปนโคแฟกเตอร (Coifactor) และจาเปนตองใชพลงงานในแตละกระบวนการ ดงแสดงตวอยางของปฏกรยาดงน

ปฏกรยา 1 : การรดวสไนเตรตไปเปนไนไตรท เอนไซมทเกยวของไดแก Assimilatory Nitrate Reductase

2 HNO3 2HNO2 2 NADH-H 2NAD

ปฏกรยา 2 : การรดวสไนไตรทไปเปนไฮดรอกซเอมน (hydroxylamine) เอนไซมทเกยวของไดแก Assimilatory Nitrite Reductase

2 HNO2 2NH2OH NADH-H NAD

ปฏกรยา 3 : การรดวสไฮดรอกซเอมนไปเปนแอมโมเนย เอนไซมทเกยวของไดแก Assimilatory Hydroxylamine Reductase

2 NH2OH 2NH3 NADH-H NAD

ปฏกรยา 4 : Protein synthesis 2NH3 + Organic Acids Amino Acids ---> Proteins

(ทมา : http://soils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Cycles/Denit.html) 2.6 Denitrification

Denitrification เปนปฏก ร ย าท ไนโตร เจนในรปออกซ ไดซ เ ชน ไนไตรท

และไนเตรทถกเปลยนไปเปนไนโตรเจน (N2) และกาซไนตรสออกไซด (nitrous oxide gas)

กลบสบรรยากาศโดยผานกระบวนการรดกชน (reduction) ซงจลนทรยทมบทบาทไดแก denitrifying

bacteria สวนใหญอยในกลมของ E. coli, Pseudomonas และ Bacillus ซงสามารถทาใหเกดกระบวนการ

Denitrification ดงน

ปฏกรยา 1 : การรดวสไนเตรตไปเปนไนไตรท เอนไซมทเกยวของไดแก Dissimilatory Nitrate Reductase 2HNO3 2HNO2 +4e 2NADH-H 2NAD

10

ปฏกรยา 2 : การรดวสไนไตรทไปเปนไนตรกออกไซด (Nitric oxide) เอนไซมทเกยวของไดแก Dissimilatory Nitrite Reductase

2HNO2 2NO +2e NADH-H NAD

ปฏกรยา 3 : การรดวสไนตรกออกไซดไปเปนไนไตรทออกไซด (Nitrous Oxide) เอนไซมทเกยวของไดแก Dissimilatory Nitric Oxide Reductase

2NO N2O +2e NADH-H NAD

ปฏกรยา 4 : การรดวสไนไตรทออกไซดไนโตรเจน เอนไซมทเกยวของไดแก Dissimilatory Nitrous Oxide Reductase

N2O N2 +2e NADH-H NAD

รวมปฏกรยาทงหมดNitrate Nitrite Nitric Oxide Nitrous Oxide Dinitrogen (NO3 ) (NO2 ) (NO) (N2O) (N2)

ผลตอการเกษตรและสงแวดลอม (Agricultural and Environmental Impact) • ลดหรอหลกเลยงการใชปยเคม เนองจากไรโซเบยมสามารถตรงไนโตรเจนจากอากาศได ดงนนการใชไรโซเบยมเปนปยชวภาพ

จงมความสาคญ นอกจากนการใชไรโซเบยมรวมกบไมโคไรซา (Mycorrhiza) ยงสามารถ ใหแรธาตอกชนดหนงแกพช อนไดแก ฟอสฟอรส ซงส วนใหญมอย ในดน แตความเปนประโยชน ตอพชมจากด และเชอราดนไมโคไรซ าสามารถชวยใหฟอสฟอรส เป นประโยชนตอพชได มากขน การใชไรโซเบยมนอกจากจะทาใหสามารถลดการใชปยเคม ยงผลทาใหมตนทนการผลตลดลงอกดวย จงลดปญหาจากการใช ป ย เคมอนได แก การสะสมตกค างของสารเคม เ นองจากพชไมสามารถ นาไปใชไดทงหมดซงการใช ทาใหเกดการปนเปอน ไปยงแหลงนาได

• การอนรกษธาตอาหารในดน การใชไรโซเบยมรวมกบการใชปยพชสด สามารถชวย ในการอนรกษธาตอาหารในดน พชทปลกเปนพชปยสด (พชตระกลถว) จะดดกนหรอใชประโยชน จากปยซงตกคางจากการใสใหพชเศรษฐกจ อนเปนพชหลกเปนการปองกนการสญเสยธาตอาหาร ไมให ถกชะลางไป นอกจากนน ในพชตระกลถว ทมระบบรากลกกสามารถดดดงธาตอาหาร ทอยในดนชนลางขนมาในลาตน กงกาน และใบได เมอทาการไถกลบพชปยสด และสลายตวแลว ธาตอาหารเหลานนกจะตกอยในดนชนบน เปนประโยชนแกพชเศรษฐกจอนเปนพชหลกตอไป นอกจากนนยงเปนการการหมนเวยน ใชทรพยากรในไรนา ใหเกดประโยชนสงประหยดสด

11

• การศกษาไรโซเบยมทสามารถเจรญไดในสภาวะทไม เหมาะสม อนไดแก ดนท เปนกรด หรอดนทมความเคม จะทาใหสามารถนาไรโซเบยมไปประยกตใชในสภาพดนทไมเหมาะสมนนได ทาใหสามารถลดตนทนและกระบวนการในการปรบปรงดน

• การใชไรโซเบยมในเกษตรอนทรย เปนการใชหลกการพงพงความสมดลตามธรรมชาต เพอสรางสรรค ใหเกดระบบนเวศ การเกษตรทยงยน เปนการผสมผสานระบบการเกษตรทกระบบ ท ส ง เสรม และปรบปร งส ง แวดลอม เพ อการผลตอาหาร และป จจ ยพ นฐาน การด ารงชพ ทมความปลอดภยตอผบรโภค

• นอกจากลดการทาลายสงแวดลอมแลว ยงชวยใหเกษตรกรและผบรโภคลดการเสอมโทรมของสขภาพลงเนองจากการใชปยเคม

• ชวยลดปญหาสนคาเกษตรถกกดกนจากประเทศนาเขาเพราะมสารเคมตกคางในสนคา การเกษตร การประยกตใชในสภาพไรและประโยชนอน ๆ เชอไรโซเบยมสามารถนาไปใชในสภาพไรได โดยนาเชอไรโซเบยมนไปผสมกบ วสดพาหะ (carrier) เพ อให เช อไรโซเบ ยมเกาะอย และสะดวกในการน าไปใช ก บถ ว โดยว สด พาหะท น ยมใช ในปจจบนน คอ พท (peat) ซงชวยใหไรโซเบยมมชวตอยไดนาน และเพมปรมาณ.ในขณะ เกบรกษาได ดงนน เม อนาหว เช อไรโซเบยมน ไปใชกบ ถว กจะทาใหแนใจไดว ามปรมาณเชอไรโซเบยม เพ ยงพอท จะ เข าสร างปม และตร งไนโตร เจนจากอากาศใหแกพช อย างไรกด ในการ เลอก ซอหวเชอไรโซเบยม จะตองตรวจสอบใหแนใจวาเปนเชอไรโซเบยมทตรงกบถวทเกษตรกรตองการปลก เพราะเชอไรโซเบยมมความจา เพาะเจาะจงตอถวแตละชนดมาก นอกจากน ยงควรตรวจสอบ วนหมดอายของหวเชอไรโซเบยมทตดอยบนฉลากดวย เพอใหแนใจวา ยงมปรมาณไรโซเบยมทม ชวตมากเพยงพอ ทจะเกดปมกบพชตระกลถวได (ดงแสดงในรปท 7 และ 8 )

รปท 7 ภาพแสดงบรรจภณฑของหวเชอไรโซเบยมในรปทผสมกบวสดพาหะ (พท)

ทมา: http://www.doae.go.th/ni/nut/riso2.htm

12

รปท 8 กาหนดวนหมดอายของหวเชอไรโซเบยม ควรแสดงให เหนอยางเดนชดบนบรรจภณฑ

ซงเกษตรกรควรสงเกตวนหมดอายนกอนนาไปใชกบถว

13

ทมา: http://www.doae.go.th/ni/nut/riso2.htm

วธการใชเชอไรโซเบยมในสภาพไรม 2 วธการใหญ ๆ คอ การคลกหวเชอไรโซเบยม กบเมลดถว แ ล ะ อ ก ว ธ ค อ ก า ร ใ ส ห ว เ ช อ ไ ร โ ซ เ บ ย ม ล ง ไ ป ใ น ด น ส า ห ร บ ว ธ ก า ร แ ร กน น ห ว เ ช อ ไรโซเบยมจะถกผสมกบเมลดโดยใชสารทชวยใหเชอตดเมลด เชน แปงเปยกชนดเหลว สารละลายนาตาล 30% หรอนามนพช (ดงแสดงในรปท 9 และ 10) โดยอตราการใชทพอเหมาะ เชน เมอใชกบถวเหลอง 10 กโลกรม หรอถวลสง 15 กโลกรม หรอถวเขยว 5 กโลกรม กบหวเชอไรโซเบยม 200 กรม จะใชปรมาณของสารทชวยใหตดเมลด 300 มลลลตร (นนทกร, 2529) สาหรบขนตอนการผสมนน จ ะ เ ร ม จ า ก ก า ร น า เ ม ล ด ถ ว ท ต อ ง ก า ร ป ล ก ใ ส ล ง ใ น ภ า ช น ะ เ ช น ถ ง น า จากนนใสสารทชวยใหหว เชอตดกบเมลดลงไปในอตราทพอเหมาะ แลวกวนเบา ๆ ให เมลด เปยกทวกนหมด แลวใสหวเชอไรโซเบยมลงไป คนใหเขากนเบา ๆ เพอไมใหเมลดไดรบ ความเสยหาย เ ม อ ค ล ก เ ช อ ก บ เ ม ล ด เ ส ร จ แ ล ว ค ว ร จ ะ น า ไ ป ป ล ก ท น ท ใ น ด น ท ม ค ว า ม ช น โดยใชดนกลบเพอใหดนรกษาความชนไว อยางไรกดในกรณทดนเปนกรดมากๆอาจใสหนปน หรอหนฟอสเฟตลงไปเคลอบเมลดถวทคลก เชอแลวอกชนหนงเพอลดความเปนกรดของดน บรเวณรอบ ๆ เมลด ซงจะทาใหไรโซเบยมมชวต อยรอดไดโดยไมถกทาลายไปในสภาวะทเปนกรด

รปท 9 ภาพแสดงการคลกผสมหวเชอไรโซเบยมกบเมลดถวเหลอง ทมา: http://www.doae.go.th/ni/nut/riso2.htm

รปท 10 แสดงภาพของเมลดถวททาการคลกดวยหวเชอไรโซเบยมแลว

ทมา: http://www.doae.go.th/ni/nut/riso2.htm การใชเชอไรโซเบยมในสภาพไรอกวธหนง คอ การใสหวเชอไรโซเบยมลงไปในดนกอน ทาการปลก เกษตรกรสามารถเลอกใชว ธนได เมอเมลดถวทตองการจะปลกคลกดวยสารเคม ก าจดศต รพ ชท เปน อนตรายตอ เช ไรโซ เบ ยม เชน สารฆ า เช อรา เปนตน หรอ เม อตองการ เชอไรโซเบยมปรมาณมากเพอเอาชนะเชอทมอยในดน ซงอาจเปนไรโซเบยมทไมมประสทธภาพ ในการตรงไนโตรเจน การใสเชอไรโซเบยมลงไปในดนโดยตรงนสามารถทาได 2 ลกษณะ คอ ใสในรปของแขง เชน ผสมหวเชอไรโซเบยมกบดน ทราย หรอขเถาแกลบ แลวหยอดลงไปใน หลมปลก ห ร อ ใ ส ใ น ร ป ข อ ง เ ห ล ว โ ด ย น า ห ว เ ช อ ท อ ย ใ น ร ป ผ ง ม า ล ะ ล า ย ก บ น า ผ สม ใ ห เ ข า ก น

14

15

แล ว จ งน า ไปฉ ดพ นลงบนด นท ต อ งก ารจะปล ก โดยต อ ง ระม ด ระว ง ว า เ ม อ ผสมน า แล ว อตราสวนของเชอทจะใชกบเมลดจะตองไมนอยกวาทกาหนดไว

นอกจากนการใชเชอไรโซเบยมในสภาพไรยงจะตองคานงถงปจจยแวดลอมอนๆทจะมผลทาใหประ ส ท ธ ภ า พ ก า ร เ ข า ส ร า ง ป ม แ ล ะ ก า ร ต ร ง ไ น โ ต ร เ จ นต า ล ง ด ว ย เ ช น ค า พ เ อ ช ห ร อ คาความเปนกรดดางของดน เนองจากในสภาพดนทเปนกรดหรอดางมากเกนไปนจะสงผลกระทบ ตอการเพมปรมาณและการเข าสรางปมของเชอไรโซเบยม นอกจากนธาตอาหารในดนยงม บทบาทสาคญท จะสงผลกระทบตอการสร างปม และการตรงไนโตรเจนอกดวย โดยเฉพาะ อยางยงธาตไนโตรเจน โดยดนทมปรมาณธาตไนโตรเจนตา ถวจะสรางปมกบเชอไรโซเบยมไดดมาก และ ส าม า ร ถต ร ง ธ า ต ไ น โ ต ร เ จ น จ า ก อ า ก า ศ ไ ด เ พ ย ง พอต อ ค ว า มต อ ง ก า ร ข อ งพ ช ใ นขณะ ทด นซงมปรมาณธาตไนโตรเจนสงจะทาใหถ วสรางปมกบไรโซเบยมไดชา หรอไมสรางปมเลย แต ถาสามารถสรางปมได ปมนนกอาจจะไมมประสทธภาพในการตรงไนโตรเจน ในทางตรงกนขาม ถาดนทจะทาการปลก ขาดธาตอาหารเหลาน คอ ฟอสฟอรส โพแทสเซยม โมลบดนม เหลก โบรอน กจะท าใหปม ถวมขนาด เลกลง และส งผลกระทบโดยตรงตอกระบวนการ ตรงไนโตร เจน ของไรโซเบยมอกดวย

ประโยชนท ไดรบจากการใชเช อไรโซเบยมกบพชตระกลถ วนน สามารถจาแนกออกไดเปน 2 ลกษณะ คอ ประโยชนทไดรบจากกระบวนการตรงไนโตรเจน และพชตระกลถวโดยตรง และประโยชนทไดรบทางออม จากการท เชอไรโซเบยมเมอใชรวมกบพชตระกลถวแลวสามารถ ตรงไนโตรเจนจากอากาศมาใชเปนธาตอาหารใหกบพชได ทาใหเกษตรกรลดคาใชจายในการซอ ปยเคมโดยเฉพาะปยไนโตรเจน โดยไนโตรเจนทตรงไดจะเขาสกระบวนการสงเคราะหใหเปลยนไป เปนโปรตนชนดตาง ๆ ในสวนตาง ๆ ของพช เชน ยอด ใบ ลาตน หรอเมลด ทาใหสวนตาง ๆ เหลานของพชตระกลถวมปรมาณโปรตนสง ซงสามารถนาไปใชเปน อาหารของมนษยและสตวได เชน ถวเหลอง ซงนบวาเปนพชเศรษฐกจทสาคญ นอกจากนปรมาณไนโตรเจนทสะสมอยใน พชตระกลถว ยงมประโยชนในดานการนามาใชเปน ปยพชสดเพอนาไปใชกบพชชนดอนไดโดย การไถกลบลงในดน ทาใหธาตไนโตรเจนจากถว ถกปลดปลอยลงสดน เพอใหพชอนนาธาต ไนโตรเจนไปใชประโยชนได โดยพชตระกลถวทนยม ในการทาเปนปยพชสด เชน โสน ปอเทอง สาหรบประโยชนในทางออมนน พชตระกลถวยงใชไปในการอนรกษดน เชน ปองกนการกรอนของดน โดยการปลกพชคลมดน การปลกพชแซม หรอการปลกพชหมนเวยน เพอบารงดน (สมศกด, 2541) การผลตเปนหวเชอเชงการคา หวเชอไรโซเบยมในปจจบนไดจดทาขนในหลายรปแบบเพอเชงการคา เชน ในรปแบบ ของเชอไรโซเบยมทมอนทรยวตถเปนพาหะ เชน พท (peat), ถานหนลกไนท หรอ ปยหมก หรอใชในรปของเชอไรโซเบยมผงแหง เชอไรโซเบยมในรปของเหลว หรอเชอไรโซเบยม ผสมสาร สงเคราะห แตรปแบบของหวเชอไรโซเบยมทเปนทนยมมากทสดในปจจบนคอ ในรปแบบของเชอ ทผสมอยกบพท (Brick, 1999) อยางไรกดแมรปแบบของหวเชอไรโซเบยม จะมหลายชนด

เ ช อ ไ ร โซ เบ ยม เป นอ งค ป ระกอบหล กท ส า คญท ส ด ในก ารผล ตห ว เ ช อ เ ช ง ก า รค า เชอไรโซเบยมทจะนามาผลตนจะตองมการคดเลอก และทดสอบความสามารถ ในการสรางปมกบถว ประสทธภาพในการตรงไนโตรเจน รวมไปถงความสามารถในการแขงขน กบเชอทพบอยในดน ตามธรรมชาต หรอมคณสมบตในการทนตอสภาพแวดลอมทสงผลกระทบตอการเจรญ และการ มชวตอยรอดของเชอไรโซเบยม เชน ภาวะดนเปรยว ดนเคม หรอสภาวะแลง เปนตน

สาหรบองคประกอบทสองของหวเชอไรโซเบยม คอ อาหารเลยงเชอไรโซเบยม เนองจาก การผลตหวเชอในเชงการคานน จาเปนจะตองมการผลตเชอไรโซเบยมบรสทธในปรมาณมาก ดงนนอาหารเลยงเชอจงเปนอกปจจยหนงทจะตองคานงถง โดยเฉพาะอยางยงสารตาง ๆ ทใช ประกอบเปนสตรอาหารเลยงเชอ ซงจะตองเลอกใหเหมาะสมกบเชอไรโซเบยมทตองการผลตดวย เนองจากเชอไรโซเบยมตางสายพนธ กจะมความสามารถในการใชองคประกอบ หรอแหลง คารบอนของอาหารเลยงเชอแตกตางกนไปดวย ซงแหลงคารบอนท เปนองคประกอบ หลกของ อาหารเลยงเชอจะสงผลกระทบโดยตรงตอตนทนในการผลตหวเชอไรโซเบยมดวย ดงนนจงไดม การพยายามนาวสดราคาถกหรอวสดเหลอใช มาทดแทนแหลงอาหารเดมทใชอย เชน มนสาปะหลง น า ม า ผ า นก ร ะบวนก า รท า ง เ ทค โนโล ย ช ว ภ าพ เ พ อ เ ป ล ย น แป ง ท ม อ ย ใ นม น ส า ป ะหล ง ใหเปนนาตาลท เชอไรโซเบยมสามารถนาไปใชตอได สาหรบองคประกอบท สาคญของหวเชอ ไรโซเบยมอกสองอยางกคอ วสดพาหะและสารเตมแตงทเออประโยชนตอไรโซเบยมนน มความ สาคญในการชวยใหเชอไรโซเบยมยดเกาะกบเมลดถวไดด ปองกนเชอไรโซเบยม จากสภาวะ ในดนทไมเหมาะสม และชวยยดอายของเชอไรโซเบยมใหมชวตอยไดนานยงขน ดงนนการเลอก ใชวสดพาหะ หรอสารเตมแตงอนๆ ในการผลตหวเชอไรโซเบยม จะตองพจารณาใหมคณสมบต เหลาน คอ ไมเปนพษตอไรโซเบยม มการเกบกกความชนไดดและยดเกาะกบเมลดไดด เชน พท (Somasegaran and Hoben, 1994) หรอสารสงเคราะห Polyvinylpyrrolidone (PVP) ในหวเชอไรโซเบยมรปของเหลว (ดงแสดงในรปท 11) ซงชวยปองกนเชอไรโซเบยม จากสารพษ ซงหลงออกจากเมลดถวบางชนดขณะงอก (Singleton, 2001)

รปท 11 แสดงภาพของหวเชอไรโซเบยมในรปของเหลว

16

ในการผลตหวเช อไรโซเบยมสามารถลดตนทนการผลตไดอ กว ธ หน งค อ การใชเทคนค การเจอจางปรมาณเชอไรโซเบยมบรสทธกอนทจะผสมกบวสดพาหะ (Dilution technique) เชน พท แลวบมไวท อณหภมหองประมาณสองอาทตยกอนการจาหนาย เพอใหเชอไรโซเบยมเจรญเพม จ า น ว น ข น ม า อ ย ใ น ร ะ ด บ ท ก า ห น ด ต า ม เ ก ณ ฑ เ ท ค น ค น ส า ม า ร ถ น า ม า ป ร ะ ย ก ต ใ ช ใ น ก า ร ผ ล ต ห ว เ ช อ ไ ร โ ซ เ บ ย ม ไ ด ก ต อ เ ม อ ว ส ด พ า ห ะ ท จ ะ น า ม า ผ ส ม ก บ เ ช อ ไ ร โ ซ เ บ ย ม บ ร ส ท ธ น น จ ะ ต อ ง ม ธ า ต อ า ห า ร หรออนทรยวต ถ เพยงพอท จะให เช อไรโซเบยมเจรญตอไปได อกระยะหน ง การเจอจางของเชอไรโซเบยมบรสทธน ในระดบอตสาหกรรมสามารถทาไดโดยใชอปกรณทเรยกวา Micro production unit (MPU) โดยมหลกการทางานคอ นาทใชในการเจอจางเชอไรโซเบยมบรสทธจะ ผานเครองกรองนา แ ล ว ผ า น แ ส ง อ ล ต ร า ไ ว โ อ เ ล ต เ พ อ ท า ล า ย เ ช อ จ ล น ท ร ย ท ป น เ ป อ น ม า ก บ น า แล วจ งผ านมาผสมก บห ว เช อบร ส ทธ ในอ ตราส วนท เหมาะสม ก อนการฉ ด เข าว สด พาหะ แลว ผสมใหเขากบวสดพาหะจากนนจงนาไปบมตอทอณหภมหองอกระยะหนงเพอใหเชอเจรญเพมขน

รปท 12 แสดงองคประกอบของอปกรณทใชในการเจอจางเชอไรโซเบยมบรสทธ กอนผสมกบวสดพาหะ

(Micro production unit)

นอกจากน สงสาคญในการผลตหวเชอไรโซเบยมคอ จะตองมการควบคมคณภาพของ หวเชอเพอใหไดประโยชนและประสทธภาพสงสดเมอเกษตรกรนาไปใช การควบคมคณภาพ จะตองคานงถงปรมาณของเชอไรโซเบยมทม ชวตอย และไมตากวามาตรฐานทกาหนดไว เชน จะตองมปรมาณเชอในพททเมอนาไปคลกกบเมลดถวแลวจะตองมปรมาณเชอไมตากวา 103 เซลล สาหรบถวขนาดเลก เชน ถวอาหารสตว หรอมไมตากวา 104 เซลล สาหรบถวขนาดกลาง เชน ถวเขยว และจะตองมปรมาณเชอไมตากวา 105 เซลล สาหรบถวขนาดใหญ เชน ถวเหลอง เปนตน (Deaker et al., 2004) น อ ก จ า ก น จ ะ ต อ ง ค ว บ ค ม ค ณ ภ า พ ไ ม ใ ห ม เ ช อ จ ล น ท ร ย อ น ท เ ป น อ น ต ร า ย ตอไรโซเบยมหรอเปนโรคพชปนเปอนอยในหวเชอ และทสาคญจะตองมการบอกถงวนหมดอาย บนถงทใชบรรจดวย

17

18

เอกสารอางอง

นนทกร บญเกด. 2529. คมอการใชเชอไรโซเบยม. กรมวชาการการเกษตร. กรงเทพมหานคร. สมศกด วงใน. 2541. การตรงไนโตรเจน: ไรโซเบยม – พชตระกลถว. สานกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร.

กรงเทพมหานคร.

หนง เตยอารง และ นนทกร บญเกด. 2539. ความสมพนธระหวางไรโซเบยมกบพชตระกลถว ในเชงพนธกรรมระดบโมเลกล. วารสารเทคโนโลยสรนาร. 3: 15-20.

Alexander, M. 1977. Introduction to soil microbiology. John Wiley and Son, Inc., NY. Brick, M.A. 1999. Legume seed inoculants. Colorado State Cooperative Extension. http://gopher.colostate.edu/Depts/CoopExt/PUBS/CROPS/00305.htmlChenn, P. 1999. Micro-organisms in Agriculture. Biological Sciences Review, (11): 2-4. Deaker, R., Roughley, R.J. and Kennedy, I.R. 2004. Legume seed inoculation Technology – a review.

Soil Biology & Biochemistry. 36: 1275-1288. Indge, B. 2000. The Nitrogen Cycle. Biological Sciences Review. 13: 25-27. Moat, A.G. and Foster, J.W. 1995. Microbial physiology. Wiley – Liss, Inc., NY. Moran, R. 1997. The Little Nitrogen Factories. Biological Sciences Review. 10: 2-6. Sahgal, M. and Johri, B.N. 2003. The changing face of rhizobial systematics. Current Science. 84(1): 43-48. Singleton, P., Keyser, H. and Sande, E. 2001. Development and evaluation of liquid inoculants. In

Inoculants and nitrogen fixation of legumes in Vietnam. Herridge, D. (ed.), Vietnam. Somasegaran, P. and Hoben, H.J. 1994. Handbook for Rhizobia Methods in Legume- Rhizobium Technology. Edwards Brothers, Inc., USA. www.fao.org/ag/AGP/AGPC/doc/publicat/gutt-shel/x5556e0g. www.microbiologyonline.org.uk www.microbiologyonline.org.uk