ความหลากหลายของไรโซเบียมในจังหวัดพระนครศรีอยุธยา Diversity ... · อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีบรอมไทมอลบลูเป็นอินดิเคเตอร์บ่มที่30

656 KKU Res. J. 2014; 19(5)

ความหลากหลายของไรโซเบยมในจงหวดพระนครศรอยธยาDiversity of Rhizobia in Phranakhonsiayutthaya province

1สจตกลยา มฤครฐอนแปลง1Sujidkanlaya Maruekarajtinplaeng

1สาขาวชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏพระนครศรอยธยา*Correspondent author:[email protected]

บทคดยอ

งานวจยนมวตถประสงคเพอแยกและศกษาความหลากหลายของไรโซเบยมจากดนใน16อำาเภอของจงหวด

พระนครศรอยธยาสามารถแยกแบคทเรยได160ไอโซเลตสมคดเลอกแบคทเรย25ไอโซเลตมาศกษาคณสมบต

ทางสรรวทยาการเจรญบนอาหารวนสตรYeastExtractMannitolAgar(YMA)ทมคองโกเรด0.25ไมโครกรมตอ

มลลลตรพบวาสามารถแบงเปน2กลมคอพวกเจรญเรวและพวกเจรญชาเมอนำามาศกษาการสรางกรดและดางบน

อาหารเลยงเชอทมบรอมไทมอลบลเปนอนดเคเตอรบมท30องศาเซลเซยสพบวาม3รปแบบคอแบบท1สราง

สารทมฤทธเปนกรดตลอดระยะเวลาการบมเชอ10วนแบบท2สรางสารทมฤทธเปนดางหลงจากบมเชอนาน5วน

จากนนสรางกรดหลงจากบมเชอตอเนองนานอก5วนแบบท3สรางสารทมฤทธเปนดางตลอดระยะเวลาการบม

เชอ10วนผลการศกษาความสามารถในการเจรญในอาหารทมโซเดยมคลอไรดพบวาเชอสวนใหญสามารถเจรญ

ไดในอาหารทมปรมาณโซเดยมคลอไรด 0.1-0.5%จากการทดสอบการตอบสนองตอสารปฏชวนะพบวาเชอสวน

ใหญตานทานตอChloramphenicol(30µg)ผลการจำาแนกเชอโดยใช16SrDNAพบวาเชอตวแทนทง25ไอโซเลต

จำาแนกได4ชนดคอBradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium yuanmingense, Bradyrhizobiume lkanii และ

Shinorhizobium saheli

Abstract

Thepurposeofthisresearchwastoisolateandstudybiodiversityofrhizobiafromsixteendistrictsin

PhranakornsiAyutthayaprovince.Theresultofbacterialisolationshowed160isolates.The25from160isolates

wererandomlyselectedtostudyphysiologicalonYeastExtractMannitolAgar(YMA)supplementedwith0.25

µgml-1congored.Theywereidentifiedin2groups:fastgrowthandslowergrowth.Basedonacid-baseproduction

onYMAwithbromothymolblueasanindicatorandincubatedat30°C,theresultscouldbeclassifiedin3types.

TypeIsoilRhizobiaproducedonlyacidafter10-dayincubationwhiletypeIIsecretedalkalinemetabolize5-day

incubationandsubsequentlyproducedacidmetabolizeaftercontinuousincubationforanother5days.TypeIII

releasedonlyalkalinethroughout10-dayincubation.Furthermore,theeffectofsalinityonbacterialgrowthwas

studiedwiththevariationofNaClconcentration.MostsoilRhizobiacouldbepresentedonthemediumsup-

KKU Res. J. 2014; 19(5): 656-669http : //resjournal.kku.ac.th

657KKU Res. J. 2014; 19(5)

plementedwithlowconcentrationofNaCl.Inaddition,theresistantreactionofantibioticwasshowedthatmost

isolateswereabletoresistChloramphenicol(30µg).Comparativesequenceanalysisofthe25isolatesaccordingto

the16SrDNAsequencingrevealedthat25isolateswereclassifiedasBradyrhizobium japonicum,Bradyrhizobium

yuanmingense,Bradyrhizobium elkaniiandSinorhizobium saheli.

คำ�สำ�คญ: ความหลากหลายทางชวภาพ,ไรโซเบยม,การตรงไนโตรเจนทางชวภาพ

Keywords: biodiversity,rhizobia,biologicalnitrogenfixation

บทนำ�

ข า ว จ ด เ ป นพ ช เ ศ รษฐก จท สำ า ค ญของ

ประเทศไทย เพราะประชากรในประเทศสวนใหญเปน

เกษตรกรและนยมปลกขาวเปนพชหลก เชนเดยวกน

กบเกษตรกรในจงหวดพระนครศรอยธยาทมอาชพทำา

นาและนยมปลกขาวเปนพชหลกดวยเชนกนการทำาการ

เกษตรของเกษตรกรไทยในปจจบนนยมใชปยเคมเพอ

ชวยเพมผลผลตซงการใชปยเคมในการทำาการเกษตร

ในระยะยาวนนสงผลเสยหลายดาน เชนการทำาใหเกด

ปญหาดนเสอมสภาพ การทำาใหเกดปญหามลภาวะ

ประเภทยโทรฟเคชน (eutrofication) รวมทงยงสงผล

ใหตนทนในการผลตขาวสงขนเนองจากปยเคมมราคา

แพงและสงผลใหประเทศขาดดลการคาทงนเพราะปย

เคมสวนมากไดจากการนำาเขาแนวทางหนงทจะชวยลด

ปรมาณการใชปยเคมคอการรณรงคใหเกษตรกรใชปย

อนทรยหรอปยชวภาพทดแทนการใชปยเคมไรโซเบยม

เปนแบคทเรยทนยมนำามาผลตเปนปยชวภาพและใชกน

อยางแพรหลาย(1)ไรโซเบยมเปนแบคทเรยแกรมลบอย

ในวงศRhizobiaceaeในภาวะทเชอนอาศยอยรวมกบพช

ตระกลถวจะอยในลกษณะทไดประโยชนรวมกนทงสอง

ฝาย(symbiosis)โดยไรโซเบยมจะอาศยอยในโครงสราง

สวนทเปนปมของพชตระกลถวเซลลอสระของไรโซเบยม

จะมรปรางแบบแทง ขนาดของเซลลกวางประมาณ

0.5-0.9 ไมโครเมตร ยาวประมาณ1.2-3.0 ไมโครเมตร

(2) ไมสรางเอนโดสปอรและเคลอนทไดโดยใชแฟลก

เจลลา (3) เซลลของไรโซเบยมทอยในปมพชตระกลถว

รปรางเซลลจะแตกตางจากรปรางของเซลลอสระโดยท

รปรางของเซลลจะมหลายแบบ เชนรปรางคลายอกษร

เอกส(X-shape)รปรางคลายอกษรวาย(Y-shape)หรอ

รปรางคลายรปดาว (star shape) เรยกไรโซเบยมทอาศย

ในปมของพชตระกลถว วาแบคทรอยด (Bacteroid)

(4) ซงมคณสมบตทพเศษอยางหนงคอ สามารถตรง

ไนโตรเจนจากบรรยากาศ ใหเปลยนเปนแอมโมเนยซง

เปนแหลงไนโตรเจนทพชสามารถนำาไปใชในการเจรญ

ได กรมวชาการเกษตรแนะนำาใหเกษตรกรปลกพช

ตระกลถว เปนพชหมนเวยนชวยปรบปรงโครงสราง

ดน เนองจากทปมรากม ไรโซเบยมทอยรวมกนแบบได

ประโยชนทงสองฝาย โดยไรโซเบยมจะไดรบสารอาหาร

ตางๆทพชปลอยออกมาทางรากสวนพชตระกลถวจะ

ไดรบธาตไนโตรเจนทถกตรงโดยไรโซเบยมใหมาอยใน

รปทพชสามารถนำามาใชในการเจรญเตบโตไดนอกจาก

นปรมาณธาตไนโตรเจนทเหลอในดนกจะชวยสงเสรม

การเจรญของพชทปลกหลงจากการปลกพชตระกลถว

ไมวาจะเปนขาวหรอพชชนดอนดงนนการสงเสรมให

เกษตรกรปลกพชตระกลถวเปนพชหมนเวยนสลบกบ

พชหลกกจะชวยลดปรมาณการใชปยเคมลงไดการใชปย

ชวภาพไรโซเบยมในการเพมผลผลตโดยเฉพาะอยางยง

ถวเหลองมอยางแพรหลายในประเทศทเปนผนำาดานการ

สงออกถวเหลอง (5)และมการศกษาเกยวกบความหลาก

หลายของไรโซเบยมถวเหลองกนมากโดยเฉพาะอยางยง

ประเทศทสงถวเหลองเปนสนคาออก (6,7,8)สำาหรบใน

ประเทศไทยมผศกษาดานความหลากหลายของไรโซเบยม

ไวบางเชนกน เชน ในป 1991 Thompson และคณะ

(9) ศกษาความหลากหลายของไรโซเบยมทแยกจากถว

เหลองและถวพม จากตวอยางดนในจงหวดเชยงใหม

ในป 1997Nuntagij และคณะ (10) ศกษาการจำาแนก

ไรโซเบยมในประเทศไทยแตไมไดระบไวชดเจนวาแยก

658 KKU Res. J. 2014; 19(5)

เชอจากพนใดพบเปนชนดBradyrhizobium japonicum

strainTHA2THA5,THA6,THA7และTHA211ในป

2010Sujidkanlaya (11)ศกษาความหลากหลายของไร

โซเบยมถวเหลองใน16ตำาบลของจงหวดพษณโลกผล

การจำาแนกเชอตวแทน20 ไอโซเลต โดยใช 16S rDNA

สามารถจำาแนกไรโซเบยมถวเหลองได3ชนด(species)

คอB. elkanii, B. japonicum และB. yuanmingense ยง

ไมพบขอมลทมการศกษาความหลากหลายของไรโซเบยม

ทแยกจากดนในจงหวดพระนครศรอยธยาดงนนในงาน

วจยนจงมวตถประสงคเพอศกษาความหลากหลายของ

ไรโซเบยมทแยกจากดน ในจงหวดพระนครศรอยธยา

ซงจะทำาใหไดคลงเชอไรโซเบยมและไดขอมลทางดาน

สรรวทยาและขอมลทางดานพนธกรรมของเชอทแยก

ได รวมทงมแหลงเชอไรโซเบยมทจะใชในการคดเลอก

หาชนดของไรโซเบยมทมความเหมาะสมกบพนธถว

และมประสทธภาพสงในการตรงไนโตรเจนทมศกยภาพ

เหมาะสมทจะนำาไปผลตเปนปยชวภาพซงนอกจากจะ

ชวยเพมผลผลตแลว ยงสงผลดทางออมคอสามารถลด

ปรมาณการใชปยเคมไนโตรเจนลงไดสงผลใหเกษตรกร

ประหยดคาใชจายในการซอปยเคม ทงยงเปนการชวย

ปรบปรงโครงสรางดนและชวยลดการขาดดลการคาของ

ประเทศในการนำาเขาปยเคมได

2.วธก�รวจย

2.1 ก�รแยกเชอไรโซเบยม

เกบตวอยางดน จาก 16 อำาเภอ ในจงหวด

พระนครศรอยธยานำามาแยกเชอไรโซเบยมตามวธของ

SomasegaranและHoben (3)ดงนใสดนลงในกระถาง

ทอบฆาเชอแลวกระถางละ5กโลกรมจากนนนำาเมลด

ถวเหลองพนธเชยงใหม 60 ทเพาะงอกรากแลวปลก

ลงในกระถางกระถางละ 5 เมลด รดดวยสารอาหาร

สำาหรบเลยงตนถวทไมมธาตไนโตรเจน (Nitrogen free

medium)พเอช 6.8นาน 4สปดาห แลวเกบสวนปม

มาแยกเชอ โดยการลางปมรากดวยนำาสะอาดหลายๆ

ครงจากนนแชดวย95%แอลกอฮอลนาน1นาทตาม

ดวยคลอรอกซ (chlorox) 3นาท แลวลางดวยนำากลน

ปลอดเชอ 7 ครงนำาปมมาผาดวยมดปลอดเชอแลวใช

ลปแตะบรเวณทมชมพมาขดลาก(streak)บนอาหารวน

สตรYM(Yeast extractmannitol agar)ทมคองโก เรด

(congored)เขมขน25ไมโครกรมตอไมโครลตรเปนอน

ดเคเตอร(3)บมจานอาหารทอณหภม30องศาเซลเซยส

เมอมแบคทเรยเจรญเลอกโคโลนเชอทคาดวาจะเปน

ไรโซเบยมคอโคโลนทกแบบทเจรญและมโคโลนสชมพ

เพราะเชอไรโซเบยมจะไมดดซบสคองโกเรดแลวนำามา

ขดลากบนอาหารวนสตรYM ใหมจนกระทงไดเชอท

บรสทธแลวจงเกบรกษาเชอบรสทธในหลอดอาหารวน

เอยงสตรYMเมอเชอเจรญเตมทแลวใหเกบไวทอณหภม

4องศาเซลเซยสเพอเกบเชอไวใชในการทดลองขนตอไป

2.2 ก�รศกษ�คว�มส�ม�รถในก�รเจรญ

กระตน(activate)แบคทเรยทจะศกษาโดยการ

ขดลากลงบนจานเพาะเชอทมอาหารวนสตรYMทม

คองโกเรดเขมขน25ไมโครกรมตอไมโครลตร(3)บมท

อณหภม30องศาเซลเซยสเปนเวลา10วนศกษาลกษณะ

โคโลนทเกดขน รวมทงสงเกตการปรากฏโคโลนของ

แบคทเรยทดสอบหากพบวาแบคทเรยททดสอบเจรญ

ใหเหนโคโลนภายใน24ชวโมงจะจดวาเปนพวกเจรญ

เพมจำานวนเรวแตหากแบคทเรยททดสอบใชเวลาในการ

เจรญใหเหนโคโลนนานกวา24ชวโมงจะจดวาเปนพวก

เจรญเพมจำานวนชา

2.3 ก�รทดสอบคว�มส�ม�รถในก�รผลตส�ร

ทตยภม(secondarymetabolites)

กระตน แบคทเรยทจะศกษาโดยการขดลาก

ลงบนจานเพาะเชอทมอาหารวนสตรYMทมบรอม

ไทมลบล (bromthymolblue) เขมขน25ไมโครกรมตอ

ไมโครลตร(3)บมทอณหภม30องศาเซลเซยสเปนเวลา

10 วนศกษาความสามารถในการผลตสารทตยภมของ

แบคทเรยทดสอบโดยสงเกตการเปลยนสของอาหารเลยง

เชอหากมการเปลยนสจากสเขยวเปนสเหลองแสดงวา

แบคทเรยทดสอบนนสรางสารทมฤทธเปนกรดแตหาก

อาหารเลยงเชอเปลยนสจากสเขยวเปนสนำาเงนเขมแสดง

วาแบคทเรยทดสอบนนสรางสารทมฤทธเปนดาง

2.4 ก�รทดสอบคว�มส�ม�รถในก�รเจรญใน

อ�ห�รทมโซเดยมคลอไรด

659KKU Res. J. 2014; 19(5)

กระตนแบคทเรยทจะศกษาโดยการขดลากลงบน

จานเพาะเชอทมอาหารวนสตรYMทมคองโกเรดเขมขน

25ไมโครกรมตอไมโครลตร(3)บมทอณหภม30องศา

เซลเซยสเปนเวลา 10 วนจากนนถายเชอลงในอาหาร

เหลวสตรYMทมโซเดยคลอไรด(NaCl)เขมขนตางๆ

กนตงแต0.1%,0.5%,1.0%,2.0%และ3.0%ตามลำาดบ

นำาไปบมทอณหภม 30องศาเซลเซยส เปนเวลา 24-48

ชวโมงสงเกตการเจรญของแบคทเรยทดสอบในอาหาร

เหลวโดยตรวจสอบการเปลยนแปลงลกษณะของอาหาร

เลยงเชอหากพบวาอาหารเลยงเชอขนแสดงวาแบคทเรย

ทดสอบสามารถเจรญได แตหากอาหารเลยงเชอมสใส

แสดงวาแบคทเรยทดสอบไมสามารถเจรญได

2.5 ก�รทดสอบก�รตอบสนองตอส�ร

ปฏชวนะโดยวธAgardiscdiffusion(12)

กระตนแบคทเรยทจะศกษา โดยการขดลาก

ลงบนจานเพาะเชอทมอาหารวนสตรYMทมคองโกเรด

(congored)เขมขน25ไมโครกรมตอไมโครลตร(3)บมท

30องศาเซลเซยสเปนเวลา10วนและใสแบคทเรย1ลป

(loop)ลงในอาหารเหลวสตรYMปรมาตร50มลลลตร

เลยงบนเครองเขยาทความเรว200รอบ/นาททอณหภม

30องศาเซลเซยส เปนเวลา3วน (ความเขมขนของเซลล

106 เซลลตอมลลลตร)จากนนใชสารละลายของเชอ 1

มลลลตร เกลยใหทวผวหนาอาหารวนสตรYMนำาแผน

กระดาษทเคลอบดวยสารปฏชวนะชนดตางๆทตองการ

ทดสอบมาวางบนจานเพาะเชอบมท 30องศาเซลเซยส

นาน48ชวโมงแลวตรวจสอบผลโดยสงเกตการเจรญของ

เชอหากเกดบรเวณใสแสดงวาสารปฏชวนะทใชทดสอบ

สามารถยบยงการเจรญของเชอไดแตหากไมเกดบรเวณใส

แสดงวาสารปฏชวนะทใชทดสอบไมสามารถยบยงเชอได

ซงในงานวจยนใชสารปฏชวนะ10ชนด(ผลตโดยบรษท

Oxoid)ไดแกเจนตามยซน(Gentamycin,10µg),สเตรปโต

มยซน(Streptomycin,10µg),เตตราซยครน(Tetracycline,

30µg),โพลมยซนบ(PolymyxinB,300units),กานามย

ซน (Kanamycin, 30µg), ไรฟามพซน (Rifampicin, 5

µg), เบซทราซน(Bacitracin,10µg), คลอแรมเฟนคอล

(Chloramphenicol, 30µg),แอมพซลน (Ampicillin, 10

µg)และอรโทรมยซน(Erythromycin,15µg)

2.6 ก�รห�ลำ�ดบนวคลโอไทด

ใชวธพซอาร(Polymerase chain reaction;

PCR)โดยสงตวอยางไปวเคราะหทบรษท แมคโคร

เจน (Macrogen)ประเทศเกาหล ในการทำาพซอารใช

ไพรเมอร27f และ 1492r โปรแกรมปฏกรยาพซอาร

คอ 94 องศาเซลเซยส45นาท 55 องศาเซลเซยส 60

วนาท 72 องศาเซลเซยส 60 วนาท จำานวน 30 รอบ

แลวทำาใหผลตภณฑ PCR ใหบรสทธ การหาลำาดบ

นวคลโอไทด ใชไพรเมอร4 ชนดซงมลำาดบนวคลโอ

ไทดคอ

27F:AgAgTTTgATCMTGGCTCAg

1492R:TACggYTACCTTgTTACgACTT

518F:CCAgCAgCCgCggTAATACg

800R:TACCAgggTATCTAATCC

2.7 ก�รจำ�แนกเชอ

นำาขอมลลำาดบนวคลโอไทดทไดในขอ 2.6มา

เปรยบเทยบกบลำาดบนวคลโอไทดทมในฐานขอมลใน

GenBankโดยใชโปรแกรมTheBasicLocalAlignment

SearchTool (BLAST) เปรยบเทยบขอมลเพอจำาแนก

ชนดของเชอ

3.ผลก�รวจยและอภปร�ย

3.1 ผลก�รแยกไรโซเบยมโดยใชถวเหลองเปน

พชดกจบ

ผลจากการแยกเชอไรโซเบยมโดยการปลกถว

เหลองในตวอยางดนทเกบมาจาก 16อำาเภอในจงหวด

พระนครศรอยธยา แลวแยกเชอจากปมรากตามวธ

ของSomasegaranและHoben (3) ไดผลดงแสดงใน

ตารางท1

660 KKU Res. J. 2014; 19(5)

ต�ร�งท1. แบคทเรยทแยกจากปมรากถวเหลองโดยใชตวอยางจากดน16อำาเภอในจงหวดพระนครศรอยธยา

ลำ�ดบท อำ�เภอทเกบตวอย�งดน รหสเชอ จำ�นวนไอโซเลต

1 พระนครศรอยธยา SM001-SM010 10

2 บานแพรก SM011-SM020 10

3 มหาราช SM021-SM030 10

4 ทาเรอ SM031-SM040 10

5 บางปะหน SM041-SM050 10

6 นครหลวง SM051-SM060 10

7 ภาช SM061-SM070 10

8 อทย SM071-SM080 10

9 วงนอย SM081-SM090 10

10 บางปะอน SM091-SM100 10

11 บางบาล SM101-SM110 10

12 ผกไห SM111-SM120 10

13 เสนา SM121-SM130 10

14 บางซาย SM131-SM140 10

15 ลาดบวหลวง SM141-SM150 10

16 บางไทร SM151-SM160 10

จากตารางท 1 เมอใชตวอยางดนทเกบมาจาก

พนท 16 อำาเภอ ในจงหวดพระนครศรอยธยามาใชใน

การปลกถวเหลองแลวเกบปมรากมาแยกเชอพบวา ม

โคโลนของเชอแบคทเรยเจรญบนจานอาหารวนสตร

YMทมคองโกเรด 25 ไมโครกรมตอไมโครลตรเปน

อนดเคเตอรเปนจำานวนมาก เลอกเกบเฉพาะโคโลนทไม

ดดซบสคองโกเรดซงลกษณะดงกลาวเปนคณสมบต

เฉพาะของไรโซเบยมและเลอกเกบเชอทมลกษณะปลก

ยอยอนทแตกตาง เชนขนาดของโคโลน ความมนวาว

การสรางเมอก ทำาใหไดเชอแบคทเรย อำาเภอละ 10

ไอโซเลตรวมเชอแบคทเรยทแยกไดทงหมด160ไอโซเลต

3.2 ผลก�รศกษ�ลกษณะโคโลน

นำาเชอแบคทเรยทแยกไดจากผลในขอ 3.1มา

ศกษาลกษณะโคโลน โดยการเขยเชอลงบนจานอาหาร

วนสตรYMทมคองโกเรด25ไมโครกรมตอไมโครลตร

เปนอนดเคเตอรบมทอณหภม 30 องศาเซลเซยสเปน

เวลา10วนแลวศกษาลกษณะโคโลนทเกดขนพบลกษณะ

โคโลนของเชอทแตกตางกน5แบบดงรปท1

661KKU Res. J. 2014; 19(5)

รปท1. ลกษณะโคโลนของแบคทเรยตวแทนทแยกจากปมรากถวเหลองจากตวอยางดน 16อำาเภอในจงหวด

พระนครศรอยธยา

แบบท1:SM002โคโลนขนาดปานกลางขอบโคโลนเรยบ(entire)สรางเมอกมาก

แบบท2:SM011โคโลนขนาดเลกมากขอบโคโลนเรยบ(entire)สรางเมอกนอย

แบบท3:SM030โคโลนขนาดปานกลางขอบโคโลนไมเรยบ(undulate)และมการสรางเมอกนอย

แบบท4:SM028โคโลนขนาดใหญมนวาวคลายไขมกขอบโคโลนเรยบ(entire)และมการสรางเมอก

นอย

แบบท5:SM032โคโลนขนาดปานกลางขอบโคโลนไมเรยบ(undulate)และมการสรางเมอกมาก

รปท 1 แสดงโคโลนของตวแทนเชอทง 5

แบบทแตกตางกนทพบในงานวจยนกลาวคอแบบแรก

ตวแทนเชอคอ ไอโซเลต SM002 โคโลนมขนาดปาน

กลาง(เสนผาศนยกลางโคโลนยาวระหวาง0.1-0.3mm)

ลกษณะขอบโคโลนเรยบ (entire)สรางเมอกมากแบบ

ทสองตวแทนเชอคอ ไอโซเลตSM011 โคโลนมขนาด

เลกมาก (เสนผาศนยกลางโคโลนยาวนอยกวา 0.1mm)

ขอบโคโลนเรยบสรางเมอกนอย แบบท 3 ตวแทนเชอ

คอไอโซเลตSM030โคโลนมขนาดปานกลางขอบโคโลน

ไมเรยบ (undulate) และมการสรางเมอกปรมาณนอย

แบบท4ตวแทนเชอคอไอโซเลตSM028โคโลนมขนาด

ใหญ(เสนผาศนยกลางโคโลนยาวมากกวา0.3mm)มน

วาวคลายไขมก(pearly)ขอบโคโลนเรยบ(entire)และม

การสรางเมอกปรมาณนอยและแบบท5ตวแทนเชอคอ

ไอโซเลตSM032โคโลนมขนาดปานกลางขอบโคโลนไม

เรยบและมการสรางเมอกปรมาณมาก

3.3 ผลก�รศกษ�คณสมบตท�งสรรวทย�

ผลการศกษาการเจรญบนอาหารเลยงเชอแขง

และการผลตสารทตยภม (secondarymetabolites)ของ

เชอตามวธการทดลองในขอ2.2และ2.3ไดผลดงแสดง

ในตารางท2

662 KKU Res. J. 2014; 19(5)

ต�ร�งท2. การเจรญและความสามารถในการผลตสารทตยภมของไรโซเบยมทแยกจากปมรากถวเหลองจากตวอยาง

ดน16อำาเภอในจงหวดพระนครศรอยธยา

ลำ�ดบท รหสเชอ คณสมบตเบองตน ลำ�ดบท รหสเชอ คณสมบตเบองตน

ก�รเจรญ

เพม

จำ�นวน

ก�รผลต

ส�รเมท�

บอไลต

ก�รเจรญ

เพม

จำ�นวน

ก�รผลต

ส�รเมท�

บอไลต

1 SM001 S K 14 SM090 S K/A

2 SM009 S K/A 15 SM098 S K

3 SM012 S K/A 16 SM101 S K

4 SM017 S K/A 17 SM104 S K/A

5 SM021 S K/A 18 SM110 S K

6 SM033 S K 19 SM111 S K

7 SM035 S K 20 SM125 S K

8 SM041 S K/A 21 SM132 F A

9 SM048 S K 22 SM140 S K/A

10 SM059 S K 23 SM145 S K/A

11 SM071 S K 24 SM149 S K/A

12 SM075 S K 25 SM151 S K/A

13 SM081 S K

หม�ยเหตSหมายถงการเจรญเพมจำานวนชา

Fหมายถงการเจรญเพมจำานวนเรว

Aหมายถงผลตสารทตยภมทมฤทธเปนกรด

Kหมายถงผลตสารทตยภมทมฤทธเปนดาง

K/Aหมายถงผลตสารทตยภมทมฤทธเปนดางจากนนผลตสารทตยภมทมฤทธเปนกรดตามมา

จากตารางท2สามารถจดกลมเชอได3กลมท

แตกตางกนคอกลมแรกมการเจรญเพมจำานวนเรวขบ

สารทตยภมทมฤทธเปนกรดไดแกไอโซเลตSM132กลม

ท2มการเจรญเพมจำานวนชาขบสารทตยภมทมฤทธเปน

ดางไดแกไอโซเลตSM001,SM033,SM035,SM048,

SM059,SM071,SM075,SM81,SM98,SM101,SM110,

SM111,และSM125กลมท3คณสมบตการเจรญเพม

จำานวนชาการขบสารทตยภมในระยะแรกของการเจรญ

จะขบสารทมฤทธเปนดางและจะเปลยนเปนกรดเมอเชอ

ทดสอบมอายเพมมากขน(K/A)ไดแกไอโซเลตSM009,

SM012, SM017, SM021, SM090, SM104, SM140,

SM145,SM149และSM151

3.4 ผลก�รเจรญของเชอในอ�ห�รทมโซเดยม

คลอไรด

ผลการทดสอบความสามารถในการเจรญ

ของเชอ ในอาหารเหลวสตร YM ทมปรมาณของ

โซเดยมคลอไรด(NaCl)แตกตางกนไดผลดงแสดงใน

ตารางท3

663KKU Res. J. 2014; 19(5)

ต�ร�งท3.การเจรญของไรโซเบยมทแยกจากปมรากถวเหลองจากตวอยางดน16อำาเภอในจงหวดพระนครศรอยธยา

ในอาหารเหลวสตรYMทมโซเดยมคลอไรด(NaCl)

ลำ�ดบท รหสเชอ ระดบคว�มเขมขนของNaCl(%)ในอ�ห�รเหลวสตรYM

0.1 0.5 1.0 2.0 3.0

1 SM001 + + - - -

2 SM009 + + - - -

3 SM012 + + - - -

4 SM017 + + - - -

5 SM021 + + - - -

6 SM033 + + - - -

7 SM035 + + - - -

8 SM041 + + - - -

9 SM048 + + - - -

10 SM059 + + - - -

11 SM071 + + - - -

12 SM075 + + - - -

13 SM081 + + - - -

14 SM090 + + - - -

15 SM098 + + - - -

16 SM101 + + - - -

17 SM104 + + - - -

18 SM110 + + - - -

19 SM111 + + - - -

20 SM125 + + - - -

21 SM132 + + + + +

22 SM140 + + - - -

23 SM145 - - - - -

24 SM149 - - - - -

25 SM151 - - - - -

หม�ยเหตเครองหมาย+หมายถงเชอทดสอบมการเจรญเครองหมาย–หมายถงเชอทดสอบไมมการเจรญ

จากตารางท 3 พบวา สวนใหญเชอทดสอบ

สามารถเจรญไดในอาหารทมระดบความเขมขนของ

โซเดยมคลอไรด0.1%และ0.5%ไดแกไอโซเลตSM001,

SM009, SM012, SM017, SM021, SM033 SM035,

SM041, SM048,SM059, SM071, SM075, SM081,

SM090,SM098,SM101, SM104, SM110, SM111,

SM125, และ SM140พบ 1 ไอโซเลตคอ SM132ท

สามารถเจรญไดในอาหารทมความเขมขนของโซเดยม

คลอไรดสงถง3%ไดสวนไอโซเลตทไมสามารถเจรญใน

อาหารทมโซเดยมคลอไรดไดม3ไอโซเลตคอไอโซเลต

SM145,SM149และSM151

664 KKU Res. J. 2014; 19(5)

3.5 ผลก�รทดสอบก�รตอบสนองตอส�ร

ปฏชวนะ

ผลการทดสอบการตอบสนองตอสารปฏชวนะ

ซงในงานวจยนใชยาปฏชวนะ10ชนดไดแกAmpicillin,

Bacitracin,Chloramphenicol,Erythromycin,Gentamy-

cin,Kanamycin,PolymixinB,Rifampicin,Streptomycin

และTetracyclineไดผลดงแสดงในตารางท4

ต�ร�งท4. การตอบสนองตอสารปฏชวนะของไรโซเบยมทแยกจากปมรากถวเหลองจากตวอยางดน16อำาเภอใน

จงหวดพระนครศรอยธยา

Isolates ชนดของส�รปฏชวนะ

Rifampicin

5µg

Erythromycin

15µg

PolymyxinB

300units

AmpiBacitraGentaStrepto ChloramKanaTetra

10µg 30µg

SM001 + - + + - - + - - -

SM009 + ++ - - - + ++ - - +

SM012 + - + + - - + - - -

SM017 + + + + - + + - - +

SM021 + ++ + + - + ++ - - +

SM033 ++ - - - - + - - ++ +

SM035 ++ - - + - - - - ++ -

SM041 - - - ++ - + + - + -

SM048 ++ - - - - + - - ++ -

SM059 ++ - + + - + - - ++ +

SM071 + - - - - - - - + -

SM075 - - - + - + + - + -

SM081 - + - - - + + + + +

SM090 + + + - - + + - - -

SM098 - - - - - + + - ++ -

SM101 + + + + - + ++ - - -

SM104 + - + + - + + - - +

SM110 + - - - - + + - ++ -

SM111 ++ - - - - + + - ++ +

SM125 - - - + - + + + ++ +

SM132 ++ - ++ + - ++ ++ - ++ ++

SM140 + ++ + + - + ++ - - +

SM145 ++ - + - - - - - - +

SM149 + ++ + + - + ++ - - +

SM151 - - - ++ - ++ ++ - ++ -

หม�ยเหต ชอยอสารปฏชวนะAmpiหมายถงAmpicillin,Bacitraหมายถง Bacitracin, GentaหมายถงGen-

tamycin,StreptoหมายถงStreptomycin,ChloramหมายถงChloramphenicol,KanaหมายถงKanamycin,Tetra

หมายถงTetracyclineเครองหมาย++เกดบรเวณใสกวางมากกวา1เซนตเมตร+หมายถงเกดบรเวณใส-หมายถง

ไมเกดบรเวณใส

665KKU Res. J. 2014; 19(5)

จากตารางท 4พบรปแบบการตอบสนองตอ

สารปฏชวนะของเชอทดสอบทหลากหลายมากจากการ

ทดสอบเชอ25ไอโซเลตพบเชอไอโซเลตSM001และ

SM012sensitiveตอสารปฏชวนะ4ชนดคอRifampicin,

PolymyxinB,Ampicillinและ Streptomycin และม 3

ไอโซเลตคอSM021,SM140และSM149sensitiveตอ

สารปฏชวนะ 6ชนดคอRifampicin, Erythromycin,

PolymyxinB,Ampicillin,Gentamycin, Tetracycline

ในขณะทไอโซเลตทเหลอพบวามการตอบสนองตอสาร

ปฏชวนะทใชในการทดสอบแตกตางกน

3.6 ผลก�รจำ�แนกเชอโดยใช16SrDNA

ผลการจำาแนกเชอ 25 ไอโซเลต โดยใชวธการ

หาลำาดบนวคลโอไทดของ16SrDNAไดผลดงตารางท5

ต�ร�งท5. ผลการจำาแนกชนดของไรโซเบยมทแยกจากปมรากถวเหลองจากตวอยางดน 16 อำาเภอในจงหวด

พระนครศรอยธยาโดยใชลำาดบนวคลโอไทดของชนสวน16SrDNA

ลำ�ดบท รหสเชอ Length %Identities Blastreport

1 SM001 1433 99 Bradyrhizobiumy uanmingense strain LMRT-M62

2 SM009 1477 99 Bradyrhizobium yuanmingense

3 SM012 1433 99 Bradyrhizobium yuanmingense strain LMRT-M62



6 SM033 1452 100 Bradyrhizobium elkanii strain STB8


8 SM041 1450 100 Bradyrhizobium japonicum strain NA249


10 SM059 1450 99 Bradyrhizobium elkanii strain NA8






16 SM101 1393 99 Bradyrhizobium yuanmingense strain LMTR-M62





21 SM132 1410 99 Sinorhizobiumsaheli

22 SM140 1453 99 Bradyrhizobiumyuanmingense strain TTC4

23 SM145 1477 100 Bradyrhizobiumyuanmingense

24 SM149 1477 99 Bradyrhizobiumyuanmingense

25 SM151 1450 99 Bradyrhizobiumjaponicum strain NA249

666 KKU Res. J. 2014; 19(5)

จากตารางท 5พบวา ไรโซเบยม12 ไอโซเลต

(SM001, SM009, SM012, SM017, SM021 SM081,

SM090,SM101,SM104,SM140,SM145,SM149)ม

ความสมพนธทางววฒนาการใกลชดกบBradyrhizobium

yuanmingenseไรโซเบยม10ไอโซเลต(SM033,SM035,

SM048, SM059, SM071 SM075, SM098, SM110,

SM111, SM125) มความสมพนธทางววฒนาการใกล

ชดกบBradyrhizobium elkanii ไรโซเบยม2ไอโซเลต

(SM041, SM151)มความสมพนธทางววฒนาการใกล

ชดกบBradyrhizobium japonicum และ 1 ไอโซเลต

(SM132) มความสมพนธทางววฒนาการใกลชดกบ

Sinorhizobium saheli

3.7 ก�รอภปร�ยผล

งานวจยนเปนการศกษาความหลากหลายของ

เชอไรโซเบยมทแยกจากตวอยางดนในพนท16อำาเภอ

ของจงหวดพระนครศรอยธยา โดยการใชถวเหลองเปน

พชลอ(Hosttrappingmethod)(3)แลวศกษาคณสมบต

ทงดานสรรวทยาผนวกกบคณสมบตทางดานพนธกรรม

ของเชอและนำาขอมลทงสองดานมาใชในการจำาแนกเชอ

ทแยกได(Polyphasictaxonomy)ซงในปจจบนนยมใชใน

การจดอนกรมวธานแบคทเรย(13)ในงานวจยนสามารถ

แยกเชอจากปมรากถวเหลองไดทงสน160ไอโซเลตซงม

ลกษณะการเจรญ2แบบเมอเลยงบนอาหารวนสตรYM

ทมคองโกเรดคอเปนประเภทเจรญเรวและประเภทเจรญ

ชาซงสอดคลองกบงานวจยอน(14)ทพบวาไรโซเบยม

ถวเหลองหากแบงตามคณสมบตการเจรญจะม 2 แบบ

เชนกนผลจากการศกษารปรางและลกษณะของโคโลน

ของเชอพบวาสามารถใชเปนขอมลเบองตนในการ

ใชทำานายชนดของไรโซเบยม ได เชนB. japonicum

โคโลนรปรางกลม ลกษณะของโคโลนมความมนวาว

คลายไขมก ขอบโคโลนเรยบสรางเมอกนอย เปนตน

นอกจากนผลจากการศกษาขอมลดานการขบสารทตยภม

ของเชอตวแทน25 ไอโซเลตทพบรปแบบการขบสาร

3ประเภทนนกสามารถนำาขอมลมาผนวกกบลกษณะ

โคโลนและสณฐานวทยาของเชอในการทำานายชนดของ

ไรโซเบยมไดเชนกน(ตารางท2และตารางท5)ยกตวอยาง

เชนหากเชอทดสอบขบสารทมฤทธเปนกรดตลอดระยะ

เวลาการบมจะพบวาเปนพวกเจรญเรวซงในงานวจยน

พบเชอไรโซเบยมทเปนพวกเจรญเรวเพยง1ชนดเทานน

คอS. saheli (SM132) แตหากเชอทดสอบขบสารทม

ฤทธเปนดางตลอดระยะเวลาการบมจะพบวาเชอนนเปน

ไรโซเบยมชนดB. ekanii (SM033, SM035, SM048,

SM059,SM071SM075,SM098,SM110,SM111,SM125)

ในขณะทหากเชอทดสอบขบสารทมฤทธเปนดางใน

ชวงแรกของการเจรญจากนนเมอเลยงตอเนองนาน

เพมขนเชอจะขบสารทมฤทธเปนกรดชนดไรโซเบยม

นนจะเปนB. japonicum (SM041,SM151)

ผลการศกษาการเจรญของเชอในอาหารทม

ปรมาณNaClทระดบความเขมขนตางๆกนพบวาม1

ไอโซเลตทสามารถเจรญไดในอาหารทมNaCl เขมขน

สงถง3%คอS. saheli SM132ซงเปนพวกเจรญเรวซง

สอดคลองกบงานวจยของGauriและคณะ(15)ทพบวา

เชอไรโซเบยมพวกเจรญเรวมกจะสามารถทนตอภาวะทม

ความเคมสงๆไดHashermและคณะ(16)ยงพบวาสภาวะ

ทมความเคมสงจะสงผลตอการเขาสรางปมของ

ไรโซเบยมรวมทงประสทธภาพในการตรงไนโตรเจนของ

เชอดวยดงนนควรศกษาเพมเตมทางดานความสามารถ

ในการเขาสรางปมประสทธภาพการตรงไนโตรเจนรวม

ทงแขงขนกบเชออนๆ ในสภาพแวดลอมจรงในแปลง

เพาะปลกของไรโซเบยมชนดS. saheli SM132 เพอ

การนำาไปประยกตใชในพนททางการเกษตรทสภาพ

แวดลอมของดนมความเคมสงตอไป

จากการทดสอบการตอบสนองตอสาร

ปฏชวนะของเชอ 25 ไอโซเลต พบรปแบบการตอบ

สนองมากถง22รปแบบและพบวาถงแมวาเชอทดสอบ

จะเปนชนดเดยวกน (จำาแนกโดย16S rDNA)กลบพบ

วามรปแบบของการสนองตอสารปฏชวนะมความแตก

ตางกนซงสอดคลองกบงานวจยกอนหนานหลายเรอง

ทพบวา ไรโซเบยมชนดเดยวกนแตแตกตาง ไอโซเลต

(Isolate) จะตอบสนองตอสารปฏชวนะทแตกตางกน

(17,18,19)ทงนสบเนองจากตามธรรมชาตเชอจลนทรย

มกระบวนการถายทอดสารพนธกรรม(horizontalgene

transfer)(20,21)ทสงผลตอววฒนาการของเชอจลนทรย

ยนทพบวาเกดการถายทอดไดมทงยนทเกยวของกบ

667KKU Res. J. 2014; 19(5)

ปฏกรยาการตอบสนองตอสารปฏชวนะยนทเกยวของ

กบความรนแรงของโรคตางๆของเชอกอโรค(virulence

gene)และยนทเกยวของกบการอยรวมกนของสงมชวต

(symbiosisgene)คณสมบตดงกลาวสามารถนำามาใชใน

การจำาแนกความแตกตางระดบสายพนธได

ผลการจำาแนกเชอในงานวจยนพบวามไรโซเบยม

ทหลากหลายชนด (species) โดยในงานวจยนพบชนด

ไรโซเบยม4ชนดคอB. yuanmingense B. japonicum

B. elkanii และS. saheli แตในงานวจยทศกษาดานความ

หลากหลายของไรโซเบยมทแยกเชอจากตวอยางดนใน

จงหวดพษณโลกพบไรโซเบยม3ชนด คอB. ekanii,

B. japonicum และB. yuanmingense (11)ในขณะทใน

งานวจยของChenและคณะ (22)ทศกษาความหลาก

หลายทางชวภาพและวงศวานววฒนาการของไรโซเบยม

ในประเทศจนทพบวามไรโซเบยมหลายชนดทพบและ

สวนมากจะจดอยในสกล(genus)Bradyrhizobium, Me-

sorhizobium และSinorhizobiumแตไมพบ B. ekanii ใน

ขณะทสายพนธไรโซเบยมทพบไดเสมอในประเทศจนคอ

B. japonicum ทงนการพบสายพนธไรโซเบยมทแตกตาง

กนในตางพนทสบเนองมาจากแตละพนทนนคณสมบต

ของดนมความแตกตางกนไมวาจะเปนคาความเปนกรด

ดางของดนอณหภมของดนรวมทงชนดของพชทปลก

ในดนซงลวนสงผลตอการคนพบชนดของจลนทรยดน

ดวยในงานวจยนนอกจากจะพบไรโซเบยมทหลากหลาย

สายพนธแลวยงพบS. saheli SM132ซงเปนไรโซเบยม

ประเภทเจรญเรว และโดยปกตเชอนเปนเชอทอยรวม

กนกบกบโสนการทในงานวจยนพบเชอนอาจสบเนอง

มาจากการเกดHorizontal transfer of symbiotic gene

จากเชอท เขาสรางปมในโสนมาทำาใหเชอนมความ

สามารถเขาสรางปมในถวเหลองได(23)ซงจะตองทำาการ

ศกษาตอไป

4.สรป

ไรโซเบยมเปนแบคทเรยแกรมลบ เมออยรวม

กบพชตระกลถวจะสามารถตรงไนโตรเจนจากอากาศ ให

อยในรปของธาตไนโตรเจนทพชสามารถนำาไปใชในการ

เจรญเตบโตไดงานวจยนมวตถประสงคเพอแยกไรโซเบยม

จากดน16อำาเภอในจงหวดพระนครศรอยธยาแลวศกษา

ความหลากหลาย ของไรโซเบยมทแยกได ผลการวจย

สามารถแยกแบคทเรยได160ไอโซเลตมลกษณะโคโลน

ทแตกตางกน 5แบบสมศกษาไรโซเบยม25 ไอโซเลต

ดานคณสมบตทางสรรวทยาเบองตนสามารถจดกลมไร

โซเบยมได 2กลมตามคณสมบตการเจรญบนอาหารวน

สตรYMทมคองโกเรด0.25ไมโครกรมตอมลลลตรคอ

เปนพวกเจรญชาทงหมดยกเวนไอโซเลตSM132ทเปน

พวกเจรญเรวผลการศกษาการผลตสารทตยภมบนอาหาร

วนสตรYMทมบรอมไทมลบลท30oCพบรปแบบการ

ขบสารทตยภม3แบบคอแบบท1ขบสารทมฤทธเปน

กรดตลอดระยะเวลาการบมเชอ10วนแบบท2ขบสาร

ทมฤทธเปนดางหลงจากบมเชอนาน5วนจากนนจะขบ

สารทมฤทธเปนกรดหลงจากบมเชอตอเนองนานอก 5

วนแบบท3ขบสารทมฤทธเปนดางตลอดระยะเวลาการ

บมเชอ10วนผลการศกษาความสามารถในการเจรญใน

อาหารทมโซเดยมคลอไรดพบวาม3ไอโซเลตทไมเจรญ

(SM145,SM149,SM151)แตเชอสวนใหญสามารถเจรญ

ไดในอาหารทมปรมาณโซเดยมคลอไรดตำาม1ไอโซเลตท

สามารถเจรญในอาหารทมโซเดยมคลอไรด3%(SM132)

ผลการศกษาการตอบสนองตอสารปฏชวนะ 10 ชนด

คอRifampicin,Erithromycin,PolymixinB,Ampicilin,

Acitracin,Gentamycin,Streptomycin,Chloramphenicol,

KanamycinและTetracyclineพบวามรปแบบการตอบ

สนองทหลากหลาย และเมอจำาแนกชนดโดยใชลำาดบ

นวคลโอไทดบรเวณ16S rDNAพบวามแบคทเรย 12

ไอโซเลต (SM001, SM009, SM012, SM017, SM021

SM081, SM090, SM101, SM104, SM140, SM145,

SM149) ทความสมพนธทางววฒนาการใกลชด

กบBradyrhizobium yuanmingense มแบคทเรย 10

ไอโซเลต (SM033, SM035, SM048, SM059, SM071

SM075,SM098,SM110,SM111,SM125)ทความสมพนธ

ทางววฒนาการใกลชดกบBradyrhizobium elkanii

มแบคทเรย2ไอโซเลต(SM041,SM151)ทความสมพนธ

ทางววฒนาการใกลชดกบBradyrhizobium japonicum

และม 1 ไอโซเลต (SM132) ทความสมพนธทาง

ววฒนาการใกลชดกบSinorhizobium saheli

668 KKU Res. J. 2014; 19(5)

5.กตตกรรมประก�ศ

ขอขอบคณ โครงการสงเสรมการวจยใน

อดมศกษาและพฒนามหาวทยาลยแหงชาต สำานกงาน

คณะกรรมการการอดมศกษาท ใหการสนบสนน

งบประมาณในการดำาเนนงานวจย และ ขอขอบคณ

มหาวทยาลยราชภฏพระนครศรอยธยาทอำานวยความ

สะดวกในดานสถานทและอปกรณการวจย รวมทง

บคลากรทเกยวของทกทาน

6.เอกส�รอ�งอง

(1) PamelaM,MariangelaH,FernandoGB,Eliane

VB,PabloNH,EsperanzaMR.Molecularphylog-

enybasedonthe16SrRNAgeneofeliterhizobial

strainsusedinBraziliancommercialinoculants.

2006;29:315-332.

(2) Jordan,D.C.Bergey’sManual of Systematic

Bacteriology.FamilyIIIRhizobiaceae.In:Krieg,

N.R.,andHolt,J.G.(eds).Baltimore:William&

Wilkins;1984.p.234-244.

(3) SomasegaranP,HobenHJ.HandbookforRhizo-

bia;MethodsinLegume-Rhizobium Technology.

NewYork:SpringerVerlag;1994.

(4) Alexander,M.Introductiontosoilmicrobiology.

2nd.ed.,NewYorkandLondon:JohnWileyand

sons;1977.

(5) AguilarDM,LopezMV,RiccilloPM.Thedi-

versityofrhizobianodulatingbeansinNorthwest

Argentinaasasourceofmoreefficientinoculant

strains.JBiotechnol.2001;91:181-188.

(6) Hume DJ, Blair DH. Effect of number of

Bradyrhizobium liaoningesp.Nov,isolatedfrom

rootofsoybean.IntJSystBacteriol.1992;45:706-

711.

(7) YoungCC,ChengKT.Geneticdiversityoffast-

andslow-growingsoybeanrhizobiadetermined

byrandomamplifiedpolymorphicDNAanalysis.

BiolFertilsoils.1998;26:254-256.

(8) SharmaRS,MohmmedA,MishraV.Diversity

inapromiscuousgroupofrhizobiafromthree

Sesbanias pp. colonizing ecologically distinct

habitats of the semi-aridDelhi region.Babu

CRResMicrobiol.2005;156:57-67.

(9) Thomson JA, Bhromsiri A, ShutsrirungA,

Lillakan S. Native root nodules bacteria of

traditional soybeangrowing areas of northern

Thailand.PlantandSoil.1991;135:53-65.

(10) Nuntagij A, AbeM, Uchiumi T, Seki Y,

BoonkerdN,Higashi S. Characterization of

Bradyrhizobium strains isolated from soybean

cultivationareasinThailand.JGenApplMicro-

biol.1997;43:183-187.

(11) SujidkanlayaM.DiversityofSoybeanrhizobiain

16subdistrictsofPhitsanulokProvince[PhDthe-

sis].Bangkok:ChulalongkornUniversity;2010.

(12) BauerAW,KirbyWMM,SherrisJC,TurckM.

Antibioticsusceptibilitytestingbyastandardized

singlediskmethod.AmJClinPathol.1966;45:

493-496.

(13) VandammeP,PotB,GillisM,DeVosP,Kersters

K,SwingsJ.Polyphasictaxonomy,aconsensus

approachtobacterialsystematics.MicrobiolRev.

1996;60(2):407-438.

(14) ElkanGH.TaxonomyoftheRhizobia.Canadian

JMicrobiol.1992;38:446-450.

(15) Gauri, Ashok KS, Rajendra PB, Shaija P,

ManjinderKB,AshokN.Characterization of

RhizobiumisolatedfromnodulesºofTrifoliumal-

exandrinum.JAgriTech.2011;7(6):1705-1723.

(16) HashermFM,SwelimDM,KuykendellLD.Iden-

tification andCharacterization of salt thermo-

tolerantLeucacnanodulatingRhizobiumstrains.

BiolFertilSoils.1998;27:335-341.

669KKU Res. J. 2014; 19(5)

(17) MilicicB,DelicD,KuzmanovicD,StajkovicO,

JosicD.Intrinsicantibioticresistanceofdiffer-

entBradyrhizobium japonicumandRhizobium

galegaestrains.RoumaniaBiotLett.2006;11(3):

2723-2731.

(18) AntounH.Strain identification inRhizobium

melilotiusing theantibioticdisksusceptibility

test.Plantandsoil1982;66:45-50.

(19) GwynAB,HandelmanJ.Arapidmethodforthe

isolationandidentificationofRhizobiumfrom

rootnodules.JMicrobiolMethod.1989;9:29-33.

(20) DobrindtU,HackerJ.Wholegenomeplasticityin

pathogenicbacteria.CurrentOpinionMicrobiol.

2001;4:550-557.

(21) FernandoGB,PamelaM,JesianeS,Mariangela

H.EvidenceofHorizontalTransferofSymbiotic

genefromaBradyrhizobium japonicumInocu-

lantStraintoIndigenousDiazotrophsSinorhizo-

bium (Ensifer) fredii andBradyrhizobium elkanii

inBrazillianSavannahSoil.ApplandEnviron

Micro.2007;73(8):2635-2643.

(22) ChenW,HuangQ,XiongX.Distributionand

biodiversityofsoybeanrhizobiainthesoilsof

Shennongjia forest reserve,China. BiolFertil

Soils.2004;40:306-312.

(23) MinamisawaK,ItakubaM,SuzukiM,IchigeK,

IsawaT,YuhashiK,MitsuiH.Horizontaltrans-

ferofnodulationgeneinsoilandmicrocosms

fromBradyrhizobium japonicum toB. elkanii.

MicrobandEnvi.2002;17(2):82-90.

Documents