ปจจยทสงผลตอการเจรญของเชอจลนทรย

โดย

ดร.นฤมล มาแทน

การเจรญเตบโตของเชอจลนทรย

มนษย

การวดการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย

1 วดน าหนกแหง

2 นบจ านวนเชอโดยใช direct microscopic count

3 นบจ านวนของเชอจลนทรยทมชวต (a total viable count)

4 วดสวนประกอบของเซลลทเกดขนเมอเชอมการเจรญเตบโต เชน ATP

Portable luminometer

การเจรญเตบโตของเชอแบบ binary fissionGenerati

on

Number of

cell

Number of cell

Exponential form

0 1 20

1 2 21

2 4 22

3 8 23

4 16 24

5 32 25

6 64 26

7 128 27

8 256 28

9 512 29

10 1024 210

การเจรญของเชอจลนทรยCell number plotted against time

0

200

400

600

800

1000

1200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Time

Ce

ll n

um

be

rs

Cell number plotted against time

1

10

100

1000

10000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Time

Lo

g c

ell

nu

mb

ers

3010.0

loglog NoNtn

NONt n2

2log

loglog NoNtn

Nt =จ านวนเชอทงหมด ณ เวลาตางๆNo=จ านวนเชอเรมตน ณ เวลาเรมตน

n=ประชากรของเชอ ณ เวลาตางๆ

ตวอยางการค านวณ• เชอ Escherichia coli ม generation time ท 20 นาท เมอเจรญในสภาวะท

เหมาะสม ซงเชอเรมตนม 103 เซลล ดงนนทเวลา 24 ชวโมงจะมจ านวนเชออยเทาใด?

n=(24x60)/20 = 72แทนคา

(72x0.3010)+3 = logNtlog Nt = antilog 24.672

Nt =4.7x1024

3010.0

loglog NoNtn

3010.0

10loglog72

3

Nt

กราฟการเจรญเตบโตของเชอ

ผลตสารทจ าเปนและซอมแซมสวนทสกหรอ

เจรญ

-อาหารหมด-pH เปลยน-เกดสารพษ

-ขาดออกซเจน

-ขาดพลงงาน-pH ท าลาย

-สารพษท าลาย

การเจรญของโคโลน

การเจรญของไมซเรยส (mycelial)

การ replication ของ viruses

Virus attaches to host cell wall

Injects DNA

Vial DNA replicates

Synthesized

Self-assembly

Lysozyme

Host cell lysis

การเจรญเตบโตของเชอในอาหาร

ชนดของปจจย1 ปจจยภายใน (intrinsic factors)

1.1 สารอาหาร

1.2 คา pH

1.3 คา Eh

1.4 สารยบยงเชอจลนทรย

1.5 คา aw

2 ปจจยภายนอก (Extrinsic factors)

2.1 คาความชนสมพทธ (%RH)

2.2 อณหภม (Temperature)

1.1 สารอาหารส าหรบการเจรญเตบโต

• สารอาหารเปนสงทจ าเปนตอการเจรญเตบโตของเชอจลนทรยเพราะอาหารเปนแหลงพลงงาน และเ ป น แ ห ล ง แ ร ธ า ต ใ หเ ช อ จ ล น ท ร ย น า ไ ป ใ ชประโยชนในการสรางหรอซอมแซมสวนทสกหรอ

Element %Dry weight

Carbon 50

Oxygen 20

Nitrogen 14

Hydrogen 8

Phosphorus 3

Sulphur 1

Potassium 1

Sodium 1

Calcium 0.5

Magnesium 0.5

Chlorine 0.5

Iron 0.2

Boron

Cobalt 0.3

Manganese

หนาทของสารตางๆตอการเจรญของเชอจลนทรย

Element หนาท

Hydrogen เปนสวนประกอบของน าซงตองใชภายในสวนตางๆของเซลล

Oxygen เปนสวนประกอบของน า, ใชในการหายใจ, ใชในระดบโมเลกลของเซลล

Carbon เปนสวนประกอบของโมเลกลตางๆของเซลล

Nitrogen เปนสวนประกอบของกรดอะมโน, โปรตน สราง ATP และ เอนไซม

Sulphur พบในกรดอะมโนพวก cystine, methionine สราง co-enzyme

Phosphorus พบในนวคลอก DNA, RNA พบใน phospholipid, สราง co-enzyme

Potassium เปนสวนส าคญส าหรบใช osmotic pressurและสราง co-enzyme

Magnesium ใชส าหรบสรางเนอเยอเซลล ไรโบโซม DNA, RNA สราง enzyme

Calcium ใชสรางพนงเซลล เปนสวนประกอบหลกของ endospores

Iron ใชสราง cytochromes ส าหรบการหายใจแบบใชออกซเจนและสราง enzyme

Trace elements ใชสราง enzyme และ co-enzyme

ประเภทของเชอจลนทรยตามสารอาหาร

1 Photoautotophs เปนพวกทสามารถสงเคราะหแสงไดเองเชน photosynthetic bacteria

2Photoheterotrophs คลายกบ Photoautotophs แตเชอจลนทรยกลมนไมสามารถสงเคราะหโมเลกลไดจากคารบอนไดออกไซดแตตองการใชสารอนทรยคารบอน เชน Non-sulphur purple bacteria

3 Chemoheterotrophs เปนเชอกลมใหญ มการดดสารอาหารเขาไปแลวใช ATP เปนแหลงพลงงาน

แผนภาพแสดง ChemoheterotrophsOrganic carbon

compounds

Organic carboncompounds

ATP

Other functions

Energy Biosynthesis

Mineralnutrients

Organic carboncompounds

Organic carboncompounds

Mineralnutrients

Waste productsof metabolism

Absorbed by cell

Absorbed by cell

Growth factors*เชอจลนทรยสามารถใชกลโคสเปนแหลงพลงงาน แตสารอาหารอนๆในรป

อนนทรยกมความส าคญในการเจรญเตบโต สารทชวยใหเชอจลนทรยเจรญเตบโตไดดมดงน- water- glucose- ammonium chloride- potassium phosphate- magnesium sulphate- ferrous sulphate- calcium chloride- trace elecments

อาหารเลยงเชอ

อาหารแขง (agar)

อาหารเหลว (broth)

ชนดของอาหารเลยงเชอ1 General purpose media (non-selective) มสารอาหารทสามารถท าให

เชอจลนทรยหลายๆชนดสามารถเจรญได เชน Nutrient agar/broth (NA), plate count agar (PCA), malt extract agar (MEA)

2 Selective media สารอาหารทยบย งเชอชนดหนงแตเชอทตองการสามารถเจรญได เชน เตมกรดเฉพาะ, ม Aw เฉพาะ, %nitrogen, และมสาร antibiotic อยเปนตน เชน oxytetracycline glucose yeast extract agar (OGYE)

Aspergillus nigerCandida albicans

3 Enrichment media เปนอาหารเหลว (broth) ใชส าหรบเพมปรมาณเชอจลนทรยในกลมทตองการใหมากขน เชน Selenite broth เปนอาหาร enrichment ส าหรบเชอ Salmonella spp ซงมการเตม sodium biselenite ซงเปนพษกบเชอชนดอนๆแตเปนพษเลกนอยตอเชอ Salmonella spp จากนนจ านวนเชออนๆจะคอยๆตายไปและเหลอเชอ Salmonella spp เปนเชอหลกในตวอยางชนดนนในทสด

A B C

A=อาหาร Selenite brothB=อาหาร Selenite broth+ตวอยางอาหารC=อาหาร Selenite broth+ตวอยางอาหารทผานการบม 24 ชวโมง

4 Differential media เปนอาหารเลยงเชอทสามารถเปลยนแปลงไปเมอมเชอจลนทรยชนดใดชนดหนงเจรญขนมา เชนเกดการขนของอาหารแขง, เปลยนสอนเกดจากการเปลยนแปลง pH หรอการเปลยนแปลงสเรมตนของอาหารโดยการปฏกรยาทางเคม Differential agents ทนยมเตมคอ- สารทสามารถถกยอยไดโดย extracellular enzymes จากเชอ เชน lecithinase, proteinase, haemolysin-น าตาลและกรดอะมโน หากเชอมการใชน าตาลหรอกรดอะมโนอาจสรางสารชนดอนๆเชน กรด แลวท าใหอาหารเลยงเชอเปลยนส- สารประกอบเคม เชน potassium tellurite ท าใหเกดสด าของ tellurium- Iron salt เมอเชอใชจะสรางไฮโดรเจนออกมาแลวท าใหเกดสด าของ iron sulphide

ตวอยาง

Blood agar-ม defibrinated ของเลอดมา

ซงเชอจลนทรยบางชนดทมเอนไซมในการยอย haemolysin จะท าใหเกด clear zone รอบๆโคโลน

Beta hemolytic Streptococcus species seen with transmitted light

5 Selective/differential media ใชในการแยกเชอจลนทรยในกลมทใกลเคยงกนออกจากกน และแยกชนดของเชอในกลมของเชอเดยวกนออกจากกน เชน MacConkey agar ซงม peptone เปนองคประกอบ มการเตม bile salt ซงสามารถยบย งเชอแบคทเรยแกรมบวกและท าใหเชอแบคทเรยกลม Enterobacteriaceae (G-; E. coli, Enterobacter spp, Salmonella spp, Proteus spp) เจรญเตบโตไดและสารทเปนdifference agent คอ lactose และ สแดง (pH-indicator) ซงเชอ E.coilนจะใชน าตาล lactose และมโคโลนสแดง แตเชอ Salmonella spp. จะไมใช lactose และไมมสแดง

Ferment lactoseNon-ferment lactose

1.2 คา pH

กรดออนกบการยบย งการเจรญของเชอจลนทรย

Neutral pH

HA A-+H+

HA A-+H+

ATPADP

Low pH

PlasmaMembrane

pH กบการเจรญเตบโตของเชอจลนทรย

*แบคทเรยสามารถเจรญในคา pH ทต าสด 4-4.5 สงสดคอ 8.0-9.0และเจรญไดดใน pH ประมาณ 6.8-7.2 แตยงมแบคทเรยทนกรดบางชนดเชน Lactobacillus spp สามารถเจรญในสภาวะ 3.8-7.2

*เชอยสตและรามการเจรญในชวง pH ทกวางกวาเชอแบคทเรยเชนเชอรา Fusarium spp สามารถเจรญในชวง 1.8-11.1 ยสตเจรญไดดท pH 4.0-4.5 และเชอราท 3-3.5

*pHมผลตอ- อตราการเจรญเตบโตของเชอ (Growth rate)-จ านวนเชอสงสด- ระยะเวลาของ lag phase , stationary phase, death phase

อะไรจะเกดขนเมอเชอจลนทรยอาศยอยใน pH ทต ากวา minimum?

LogNumber

0fViable

cells

pH well below minimumNo”lag”-rapid cell death

“Lag” before death of cells occurs

Cell death

pH และสารกนบด

• Lactic acid และ Citric acid เปนกรดออนทสามารถเตมลงไปในอาหารแลวท าใหเชอจลนทรยทกอโรคไมสามารถเจรญเตบโตได

1.3 คา redox potential (Eh)

• คา Eh บอกถงการถายเทอเลกตรอนระหวางอะตอมและโมเลกลโดยสมการพนฐานคอ

(oxidant)+H++ne (Reductant)n=จ านวนอเลกตรอนทเกดการถายเท

* ในเซลลสงมชวตทงการถายทอดไฮโดรเจนอะตอมและอเลกตรอนจ าเปนอยางยงส าหรบการท า electron transport chain และการไดมาซงพลงงานส าหรบการท า oxidative phosphorylation

• ความแตกตางระหวางคา Eh ในตวเชอจลนทรยและสงแวดลอมยากทจะท าการวดคา แตถาหากเชอจลนทรยอาศยอยในสงแวดลอมทมคา Eh ต ากวา/สงกวา เซลลของมน จะเกดการแลกเปลยนกนขนและเชอชนดหนงอาจท าใหคา Eh ในสงแวดลอมเปลยนแปลงไปจนไมเหมาะสมตอการเจรญของเชออกชนดหนงได

• ปกตแลววตถดบอาหารทมการหายใจจะมคา Eh เปนบวกซงท าใหเกดการ reducing ในเซลลลงไปไดเชน ascosbic acid ในผกและผลไม

• ปจจยทท าใหเกดคา Eh ทแตกตางกนในอาหารคอ– ปรมาณความเขมขนของออกซเจนในสงแวดลอมและทสามารถซมเขาไป

ในอาหาร

– ความหนาแนนของโครงสรางของอาหารซงมผลตอการซมผานของออกซเจน

– ความเขมขนของสาร reducing ในอาหารซงจะตานทานการเปลยนแปลงคา Eh ใหเปนบวก หรอเรยกอกอยางวา poising capacity

– กระบวนการผลตอาหาร

– คา pH ในอาหารโดยทกการเปลยนแปลง pH 1 คาจะท าใหเกด Eh เพมขน +58 mv

คา Eh ในอาหาร

+200 mV -150 mV ปรมาณออกซเจนในถง

ชนดของเชอจลนทรยแบงตามการใชออกซเจน

1 Obligate anaerobes

Lid clamp

GasketGas-generating Envelope containSodium borohydride,Organic acid, sodiumBicabonate, Addition Water generates hydrogenAnd carbon dioxide

Redox indicator(methylene blue)

H2+O2

H2O

C2O

2 Microaerophiles

6 %oxygen

10%CO2

3 Obligate aerobes

4 Facultative anerobes

Redox indicators

• หากมคา Eh ต าจะเหมาะกบการเจรญของพวก anaerobic• สามารถใช dry reduction ในการทดสอบคณภาพของนมได

MeB+2H++2e- MeBH2

Oxidized (blue) Reduced (Colourless)

1.4 สารยบย งเชอจลนทรย• สารยบย งเชอจลนทรยสามารถพบไดในเซลลของพช เชน pigments,

alkaloides, resins • Benzoic และ sorbic acid พบในตน cranberries สามารถน ามาสกด

ใหอยในรปบรสทธและใชเปนสารกนบดได

Aspirin

• น ามนหอมระเหยยงเปนสารกนบดทางธรรมชาต เชน cinnamic aldehyde, thymol, eugenol เปนตน

1.5 คา Aw• เปนปรมาณน าทมอยในอาหาร ซงเชอจลนทรยสามารถใชน าเพอดดซมแรธาต• สตรการค านวณ

aw = n(N+n)

n= จ านวนโมลของสารละลาย,N=จ านวนโมลของตวท าละลาย

หรอเขยนสตรใหมคอaw = w/m

(w/m+w/m)

w =น าหนกm=มวลโมเลกล

ตวอยางการค านวณ

• สารละลายซโครสทมน าตาล 5 กรมละลายในน า 100 มลลลตรมคา aw=?

*aw = vapour pressure of a substance or solution (P)vapour pressure of water at the same temperature

• คา awในอาหารมความสมพนธกบสารทเตมลงไปในอาหารดวยเชน การเตมเกลอ น าตาล กรดอะมโนลงในอาหารท าใหคา awในอาหารลดลง

สารทท าหนาทในการลดปรมาณน าในอาหาร1 เกลอ เกลออมตว 27 %W/W ท าใหไดคา aw อยางนอย 0.742 น าตาลซโคส น าตาลซโคสอมตวท 67% W/W ท าใหไดคา aw อยาง

นอย 0.863 น าตาลกลโคส น าตาลกลโคสอมตวท 47% W/W ท าใหไดคา aw อยาง

นอย 0.92หากเตมเกลอลงในอาหารเพอจดประสงคในการท าเคมหรอเตมน าตาลปรมาณมากในอาหารเพอท าของหวาน จงเปนการลดปรมาณน าในอาหาร ซงการลดปรมาณน าในอาหารอาจใชวธการทางกายภาพ การอบแหง ฯลฯ อกดวย

เชอจลนทรยทอาจพบไดในอาหารทมน าตาลและเกลอเปนสวนผสม

-กลมเชอจลนทรยทพบไดในอาหารทมเกลอเปนสวนผสม*พวก Moderate halophiles เปนพวกทตองการเกลอประมาณ 1-10% เชน Vibrio parahaemolyticus* พวก Extreme halophiles เปนพวกททนเกลอไดสงเชน Halobacterium สามารถทนเกลอไดถง 12-36%* Halotolerant (haloduric) organisms เชน Staphylococcus aureus สามารถเจรญไดเกลอ 20% (aw~0.83) แตคา optimum ~ 0.5-4%

-กลมเชอจลนทรยทพบไดในอาหารทมน าตาลเปนสวนผสม

*Osmophilic yeasts สามารถเจรญในน าตาลสงๆแตจะไมเจรญหากมคา awต าๆ เชน Zygosaccharomyces rouxii ทเจรญในน าตาล 70% แตไมเจรญใน awต ากวา 0.62

*Osmotolerant organisms เปนพวกทเจรญไดดทคา aw สง และมน าตาลในปรมาณสง เชน Saccharomyces cerevisiae

ความสมพนธระหวางเชอจลนทรยกบคา awOrganism aw limit

G- bacteria

-Escherichia coli 0.95

-Klebsiella pneumoniae 0.95

-Pseudomonas aeruginosa 0.97

-Salmonella typhimurium 0.95

G+ bacteria

-Bacillus subtilis 0.90

-Staphylococcus aureus 0.85

Yeasts

-Saccharomyces cerevisiae 0.92

-Debaryomyces hansenii 0.65-0.75

Moulds

-Mucor hiemalis 0.90-0.75

-Penicillium chrysogenum 0.80

-Xeromyces bisporus 0.61-0.75

-Aspergillus chevalieri 0.61-0.75

*เชอจลนทรยทเจรญในชวง awทไมเหมาะสมจะท าใหเกดความผดปกตในการแบงตว, เยอหมเซลลถกท าลาย, เอนไซมใน membranes และ cytoplasm ถกท าลาย

ชนดของอาหารแบงตามคา aw

1 High moisture food (aw=0.99-0.90) อาหารสดทมสารทเตมลงไปต าเชน ไกสด, ผลไม, นม, น าผลไม สวนมากจะเสอมเสยไดจากแบคทเรยแกรมลบ, ราบางกลม

3 Intermediate moisture food (IMF) (aw=0.89-0.61) เปนอาหารทมการเตมเกลอหรอน าตาลลงไปเพอรกษาไมใหอาหารเสอมเสยไดเรว เชนทเรยนกวน, ปลาเคม, เคก การเสอมเสยสวนมากเกดจากเชอรา

4 Low moisture food ซงมคา aw ต ากวา 0.61 เชน บสกต, ซอกโกแลต

ชนดของปจจย1 ปจจยภายใน (intrinsic factors)

1.1 สารอาหาร

1.2 คา pH

1.3 คา Eh

1.4 สารยบยงเชอจลนทรย

1.5 คา aw

2 ปจจยภายนอก (Extrinsic factors)

2.1 คาความชนสมพทธ (%RH)

2.2 อณหภม (Temperature)

2.ปจจยภายนอก2.1 คาความชนสมพทธ (%RH) เมอวางอาหารไวในบรรยากาศจะเกด

การถายเทความชนระหวางอาหารและอากาศจนเกดความสมดล (Equilibrium)

อาหาร

2.2 อณหภม

10 40 50อณหภม

อตราการเจรญ

การแบงชนดของเชอตามอณหภม1 Mesophiles เปนกลมทสามารถอาศยในมนษย สตวเลอดอน โดย

อณหภมทเหมาะสมคอ 37 องศาเซลเซยส เชน Staphylococcusaureus

2 Obligate psychrophiles (cold loving) เปนพวกทอาศยในมหาสมทร arctic และ antarctic ซงสามารถทนความเยนระหวาง 0, 1-5 องศาเซลเซยส

3 Psychrotrophs เปนกลมของเชอทพบในน าและดน เปนพวกททนอากาศเลวรายได เชน Pseudomonas fragil ทนอณหภมได -10 องศาเซลเซยสและเปนกลมทท าใหเกดการเสอมเสยกบอาหารทแชเยน (-1 ถง 5 องศาเซลเซยส) เชน Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum type E

4 Thermophiles พบเชอไดในอณหภมสงประมาณ 70 องศาเซลเซยส หรอในน ารอน พวกททนความรอนไดสงและท าใหอาหารเนาเสยเชน Bacillus stearothermophilus, Clostridium thermosaccharolyticum