7/10/2011

1

Compreendendo a patogênese microbiana como base para o desenvolvimento de uma vacina

André Alex Grassmanngrassmann.aa@gmail.com

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCentro de Desenvolvimento Tecnológico

Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Vacinologia e Engenharia de Vacinas

Como produzir uma vacina?

• O que é uma vacina?

• Quais vacinas estão disponíveis atualmente? Como elas são? Como atuam?

• Quem regulamenta a produção de uma vacina? Como é a legislação?

• Quero trabalhar na indústria de produção de vacinas!

• Quero pesquisar e produzir novas vacinas!

Quero pesquisar e produzir novas vacinas!

• Que conhecimento preciso ter para isso?

• Vacinologia experimental:

– Qual a resposta imune a ser induzida?

– Quais adjuvantes/moduladores usar?

– Qual a melhor estratégia para combater a infecção?

– Qual imunógeno?

Características de um imunógeno

• Imunógeno X antígeno X hapteno

• Requerimentos:

– Ser estranho;

– Alto peso molecular;

– Complexidade química;

– Degradabilidade;

Outras moléculasLipídeosCarboidratosProteínas

Quero pesquisar e produzir novas vacinas!

• Que conhecimento preciso ter para isso?

• Vacinologia experimental:

– Qual a resposta imune a ser induzida?

– Quais adjuvantes/moduladores usar?

– Qual a melhor estratégia para combater a infecção?

– Qual imunógeno?

Compreender a patogenicidade microbiana como base para o desenvolvimento de uma vacina

Patógenos bacterianos utilizam uma série de moléculas para causar infecção

Fatores de

virulência

potenciais alvos para vacina, mas compreender a base molecular da patogenicidade é

requerida para o desenvolvimento racional de vacinas.

7/10/2011

2

Patogenicidade X virulência

• Patogenicidade:

– Capacidade de causar doença;

• Virulência:

– Medida quantitativa da habilidade de causar doença;

• “patogênico” refere-se às características genotípicas expressas ou não;

• “virulento” refere-se às características fenotípicas que induzem alterações patológicas no hospedeiro;

Patogênese microbiana:

a presença de microrganismo nem

sempre leva à doença.

Infecção

Suscetibilidade do hospedeiro Mecanismos de patogenicidade

Imunocomprometido/imunocompetente

imunizações

idade

traumas

predisposição genética

terapia antimicrobiana

Secreção de fatores (toxinas)

Manipulação direta das células do

hospedeiro

Defesas do hospedeiroBarreiras naturais

Microbiota residente – afetada por dieta, antibióticos, exclusãocompetitiva

pH – inibe o crescimento

Mucina – glicoproteínas viscosas (barreira, armadilhas…)

Resposta imune inata

PRR - (pattern recognition receptor – receptor de reconhecimento de padrão)

Células: Macrófagos, PMNs, células dendríticas, cel. NK, mastócitos, basófilos,eosinófilos;

Resposta imune adquirida

B-cells – produção de anticorpos – patógenos extracelulares

T- cells – resposta citotóxica – patógenos intracelulares

Portas de entrada

• Membranas mucosas;

– Trato respiratório, gastro-intestinal, genito-urinário e conjutiva;

• Pele;

– Intacta = barreira; fissuras, arranhões...

• Parenteral;

– microrganismos são depositados em tecidos abaixo da pele e mucosas;

Porta de entrada preferencial

• A patogenicidade depende de uma porta de entrada preferencial:

• Streptococcus pneumoniae

– Se inalado pode causar pneumonia;

– Se entrar pelo trato G.I. não causará doença;

• Salmonella typhi

– Se entra pelo trato G.I. pode causar a febre tifóide;

– Na pele não causa doença alguma;

7/10/2011

3

Número de microrganismos infectantes

• Importante pois são necessários microrganismos que resistam ao sistema imune do hospedeiro para estabelecer a infecção;

• Depende essencialmente do hospedeiro, do patógeno e da via de infecção;

• Fundamental para o desenvolvimento de vacinas...

Medidas de doses infectantes

• DL50

– dose de microrganismos ou toxina que será letal para 50% dos animais experimentalmente inoculados;

• DI50

– dose infectante requerida para causar doença em 50% dos animais experimentalmente inoculados;

• DLmin

– a menor dose letal;

• DL100

– dose letal para todos os animais em experimentação;

2 vezes a DL50 é a DL100?

DL50 numa população heterogênea

1

2

3

4

5

6

7

Dose

Animaisn = 10

DL50

2 X DL50

DL100

Exs.:Vibrio cholerea: 108 célulasLeptospira interrogans: 10 células

Medidas de virulência

Fatores de virulência bacterianos

• Aderência– Pili– Motilidade (flagelo), quimiotaxia– Proteínas de membrana externa

• Processo infeccioso– Exotoxinas, endotoxinas– Sist. secreção dos tipos III e IV– Crescimento intracelular

• Proteção contra as defesas do organismo– Capsula, parede celular, membrana externa– Inibição da ativação do complemento– Variação antigênica– Formação de biofilme

AdesãoCrucial para o patógeno resistir à tentativa de remoção

mecânica pelo hospedeiro;

Permite o estabelecimento da infecção;

• Fatores de adesão (adesinas):– Proteinas;

• Pili ou fímbrias;

• Não fimbriais;

– Carboidratos;

• Receptores;

Fatores de adesão fimbriais

• Arranjo polimérico helicoidal e protuberante com afinidade à algum receptor do hospedeiro;

• Muito comum em Gram-negativas:

– E. coli, V. cholerae, P. aeruginosa,

Neisseria sp.

Pili tipo IV↓

Motilidade twitching

7/10/2011

4

Fatores de adesão

• Adesinas protéicas não fimbriais:

– Não possuem a estrutura longa e polimérica da fímbria;

– Contato íntimo ao hospedeiro;

– Proteínas de membrana externa expostas na superfície;

– Gram negativas:

• Yersinia pseudotuberculosis, E coli enteropatogênica, Neisseria

spp, ...

– Gram positivas:

• Staphylococcus spp, Streptococcus spp;

– Micobacterias;

Adesão por polissacarídeos• Polissacarídeos que compõem a membrana externa,

parede celular ou cápsula;

– Ex.: Ácido teicóico serve de adesinas para Staphylococcus

spp. e Streptococcus spp;

Fatores de motilidade

• A motilidade é um fator essencial à virulência de diversos microrganismos;

• Permite a difusão pelos tecidos do hospedeiro em busca de locais preferenciais para o estabelecimento da infecção, bem como fuga do sistema imune;

• Proporcionado por flagelo ou pili;

Fatores de motilidade

• Tipos de motilidade:– Twitching;

– Swimming;

– Swarming;

– Pseudomonas aeruginosa apresenta estas três formas de movimento;

Fatores de motilidade

• Flagelos

Adesão e movimento

• Anticorpos contra adesinas ou flagelo normalmente bloqueiam a adesão do patógeno ao hospedeiro ou sua motilidade, permitindo a lise pelo sistema complemento;

Potenciais alvos para desenvolvimento de vacinas

de subunidade

7/10/2011

5

Proteínas de membrana externa

• Proteínas de membrana expostas na superfície bacteriana que proporcionam adesão ou invasão de células do hospedeiro;

– Sua função não é necessariamente apenas esta..

• Alvos potenciais para vacinas;

(Prasadarao et al, Infect. Immun. 1999)

E. coli invasion

E. coli - OmpA facilita adesão e

invasão

Anticorpos contra OmpA

bloqueiam a invasão

Invasão

• Uma vez aderidos, diversos patógenos penetram em determinados locais do hospedeiro;

• Invasão extracelular e invasão intracelular;

• A invasão extracelular permite o acesso dos patógenos a nichos em tecidos onde possam proliferar, disseminar a outros sítios, expressar toxinas...

Invasão extracelular

• Streptococcus β-hemolítico e Staphylococcus aureus

secretam enzimas que degradam moléculas do hospedeiro:

– Hialuronidase: clivam proteoglicanos intracelulares;

– Streptoquinase e stafiloquinase: desmancham coágulos;

– Lipases: degradam lipídeos acumulados;

– Hemolisinas: degradam hemácias e outras células;

Invasão extracelular

• Pseudomonas aeruginosa secreta elastase –

enzima que degrada moléculas extracelulares e permite invasão de tecido;

– associado com queratite, necrose tecidual e fibrose cística;

Invasão extracelular

• Leptospira possui quimiotaxia para hemácias;

– Expressa esfingomielinases hemolíticas;

– Transportadores de membrana (receptores TonB, transportadores ABC, ...);

– Heme oxigenase libera Fe2+

29

HEME BILIVERDINA

Heme b + 3O2 + 3½NADPH + 3½H+ + 7e- → biliverdina + Fe2+ + CO + 3½NADP+ + 3H2O ICTERÍCIA

7/10/2011

6

Invasão intracelular

• O patógeno entra nas células do hospedeiro e sobrevive neste ambiente;

• Alguns patógenos injetam proteínas (efetores) por meio de sistemas de secreção do tipo III (T3SS) dentro da célula do hospedeiro;

– Estas proteínas induzem modificações na célula, facilitando a invasão bacteriana;

– Salmonella spp.

– Shigella spp.

– Yersinia spp.

Invasão intracelular

• Salmonella spp. e Shigella spp.

Pedestal de actina

Estratégias intracelularesBactérias

intracelulares obrigatórias

Bactéria

intracelulares facultativas

Chlamydia spp.

Rickettsia spp

Coxiella burnetii

Mycobacterium spp

Salmonella spp.

Legionella pneumophila

Brucella spp.

Francisella tularensis

Shigella spp.

Listeria monocytogenes

Yersinia spp.

A invasão pode ocorrer em células fagocíticas ou não. Quando invadem células fagocíticas as bactérias sobrevivem

à ação enzimática do lisossomo.

Localização intracelular

• Vacúolo fagolisossomal competente, acídico e hidrolítico;

• Vacúolo não fusionado ao lisossomo;

• Citosol;

Coxiella burnetti – pH baixo é requerido para multiplicação. Intracelular obrigatório;

Mycobacterium spp, Salmonella spp, Legionella pneumophila e Chlamydia trachomatis

Shigella flexneri, Listeria monocytogenes e Rickettsia rickettsii – escapam do fagossomo e manipulam o citoesqueleto para dispersar para outras células;

Listeria monocytogenes

Movimento mediado por actina

Sobrevivência intracelular

• Patógenos invasores desenvolvem mecanismos parasobreviver intracelularmente

• Acidificação do vacúolo

• Fusão fagossomo-lisossomo

• Lise da membrana vacuolar e localização no citoplasma

• Maquinaria para recrutamento de actina;

Patógenos intracelulares requerem indução de resposta imune celular

7/10/2011

7

Estratégias para evasão do sistema imune

• Anti-fagocitose

• Exemplos:

- Yersinia (tirosina fosfatase,

serina-treonina quinase, inibidores de actina)

- E. coli EPEC (fosfatidil inositol-3 quinase)

Vacina pode ser desenhada para neutralizar estes

fatores, tornando os patógenos susceptíveis a

fagocitose e morte intracelular

Estratégias para evasão do sistema imune

• Variação antigênica;

Neisseria gonorrhoeae

Variação antigênica do pili

Estratégias para evasão do sistema imune

• Cápsula bacteriana: polissacarídeos expostos de alto peso molecular;

• Inibem fagocitose por dificultar ligação de anticorpos e/ou componentes do complemento;

• Aumentam virulência;– Bacillus anthracis

– Streptococcus pneumoniae

– Klebsiella pneumoniae

– Streptococcus mutans

Cápsula bacteriana

Animação mostrando o modo que a cápsula bacteriana age para evadir a ação do complemento do hospedeiro

mamífero:

O componente C3b do complemento tende a fixar-se sobre a superfície

bacteriana e o reconhecimento pelo seu receptor na célula fagocítica é

dificultado quando a bactéria possui cápsula.

Biofilmes

• Agregado microbiano em que as células se aderem umas às outras em uma superfície sólida.

– Substâncias poliméricas extracelulares;

7/10/2011

8

Biofilmes

• Funções:

– Resistência a fagócitos, dessecação, antibióticos, detergentes e estresses mecânicos;

– Ligação e seqüestro de nutrientes;

– Formação de comunidades microbianas interdependentes;

(www.math.utah.edu/.../ quorum_talk.html)

Bacterial biofilm - magnified 7,000x

S. Typhi – colonização crônica

Mary Mallon (September 23, 1869 – November 11, 1938)

S. Typhi – colonização crônica Evasão do sistema imune

46

47

Evasão do sistema imune Parede celular bacteriana

7/10/2011

9

LPS

• Principal responsável por choque séptico;

• Ativa sistema imune inato via TLR4;

• Endotoxina!

Toxinas

• Protéicas ou não-protéicas (LPS);

• Endotoxinas (LPS) ou exotoxinas;

• Fatores de virulência melhor caracterizados;

• Fáceis de purificar (sobrenadante);

• Utilizados como toxóides em vacinas;

• Ótimos adjuvantes;

EXOTOXINAS x ENDOTOXINAS Exotoxinas protéicas

• Secretadas para o meio externo ou injetadas diretamente na célula do hospedeiro por T3SS;

• A maioria dos genes para exotoxinas está em plasmídeos ou fagos;

1. Toxinas A-B;

2. Toxinas proteolíticas;

3. Toxinas formadoras de poros;

Outras...

Toxinas A-B

Subunidade A:

Atividade enzimática, tóxica;

Subunidade B:

Ligação a receptor e internalizaçãoda toxina;

Toxinas A-B

• P. aeruginosa, E coli, Vibrio cholerae,

Corynebacterium diphtheriae e Bordetella pertussis;

• Atividades da subunidade A:

– Proteolítica: toxina tetânica e botulínica;

– Atua em adenilato ciclase (eleva cAMP): toxina colérica, diftérica, pertussis, exotoxina A de P. aeruginosa e toxina termolábil de E. coli;

• Subunidade B: excelente adjuvante;

7/10/2011

10

Toxinas A-B Toxinas proteolíticas

• Clivam proteínas específicas do hospedeiro levando à manifestações características da doença;

• Toxina botulínica e toxina tetânica – atuam em neurotransmissores;– Botulínica: ingerida – paralisia flácida;

– Tetânica: feridas – paralisia espasmica;

• P. aeruginosa: toxinas que degradam matriz extracelular– Elastase: degrada fibras de elastina.

Toxinas formadoras de poros

• Levam à lise celular;

• Toxinas da família RTX (motivos repetitivos arginina [R] treonina [T]) – Gram-negativas secretam por T1SS;

– Leucotoxinas e hemolisinas;

Toxinas formadoras de poros

• Muitas Gram-positivas secretam citolisinas ativadas por sulfidril;

– A melhor caracterizada é a listeriolisina O, utilizada por Listeria monocytogenes para escapar do fagolisossomo;

Outras toxinas

• IgA-proteases ;

– Neisseria spp. e Haemophilus influenzae;

• Toxinas termo-estáveis que ativam guanilato ciclase(eleva níveis de cGMP);

– Enterotoxina termo-estável de E. coli enterotoxigênica;

• Toxinas que modificam o citoesqueleto;

– Rho GTPases (Clostridium difficile, Salmonella, Shigella);

E os vírus?

• Vacinas baseadas em peptídeos de superfície;

• As disponíveis são vacinas atenuadas replicantes ou inativadas;

– Preocupam pois podem propagar-se no organismo;

• Recombinação e origem de novos vírus;

7/10/2011

11

Vacinas virais

• Resposta de anticorpos IgM e IgG aglutinantes e neutralisantes;

– Extracelular;

• Resposta Th1 – células citotóxicas; NK e macrófagos;

– Intracelular;

• DNA de fita simples – TLR8;

• DNA de fita dupla – TLR3;

Desafios na produção de vacinas virais

• Dificuldade de produção;

• Curta vida de prateleira dos produtos;

• Imunidade curta;

• Necessidade de dezenas de antígenos para abranger a

diversidade antigênica viral;

• Laboratório nível três;

• Alumínio como adjuvante;

• Inativação incompleta no uso de formaldeído;

E os parasitas?

• Taenia solium – mais de 3m – Th2 IgE

Vacinas contra parasitas

Leishmania spp.

protozoário invade macrófagos

Plasmodium spp.

protozoário invade hepatócitos e

eritrócitos

Evasão do sistema imune

• Tegumento: barreira física contra anticorpos e células de defesa;

• Proteínas antioxidantes: expressam superóxidos dismutasesque convertem superóxido em H2O e O2;

• Proteínas do tegumento bloqueiam a formação do complexo de ataque à membrana;

Eosinófilos atraídos por IgE ligado à larva de Schistosoma mansoni

E os fungos?

• Possuem fatores de virulência semelhante aos bacterianos;

– A maioria das infecções ocorre em depressão imunológica;

• Destacam-se a produção de micotoxinas, como a aflatoxina de Aspergillus spp.

– Interfere na síntese de proteínas e seus metabólitos podem se intercalar no DNA – cancerígenos;

7/10/2011

12

OBRIGADO PELA ATENÇÃO!

André Alex Grassmanngrassmann.aa@gmail.com

Compreendendo a patogênese microbiana como base para o desenvolvimento de uma vacina