Ergebnisse 51

4. Ergebnisse 4.1. Physikalische Kartierung eines STS-Markers aus dem KPNA2-Gen 4.1.1. Kartierung unter Verwendung somatischer Zellhybride Aufgrund der vollständigen Konkordanz der 18 somatischen Zellhybride erfolgte die

Zuordnung des verwendeten STS-Markers zum Chromosom 17 (Tab. 4.1., S. 52). Alle 15

Hybride, die das Chromosom 17 enthalten, erwiesen sich als positiv. Alle 3 Hybride, die

das Chromosom 17 nicht enthalten, waren negativ (Abb. 4.1.). Für alle anderen

Chromosomen ergab sich eine Diskonkordanz der Hybride.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Abb. 4.1: Kartierung eines STS-Markers aus dem 3‘-Ende des KPNA2-Gens unter Verwendung

einer Reihe von 18 somatischen Zellhybriden; Nachweis der PCR-Ampli fikate nach Agarosegel-

elektrophorese und Ethidiumbromidfärbung; Bahn 1: 1 Kb DNA Leiter (Gibco BRL), Bahn 2 - 19:

somatische Zellhybride (vgl. Kap. 3.1.1., S. 27), Bahn 20: Positivkontrolle (genomische DNA)

Außerdem wurden die Zellhybride mit einer intronüberspannenden Primerkombination

(6-25 und 189-169) untersucht, die sowohl ein Produkt in der Größenordnung der cDNA-

Sequenz (ca. 180 bp) zeigte als auch ein intronüberspannendes Produkt (ca. 1400 bp). Das

Hybridmuster der 180 bp großen Bande ergab eine vollständige Konkordanz mit dem

Muster für das Chromosom 4. Das Ergebnis für die 1400 bp große Bande stimmt mit dem

des 3‘-STS-Markers überein und unterstützt somit die Aussage, daß sich das KPNA2-Gen

auf dem Chromosom 17 befindet.

Ergebnisse 52

Tab. 4.1: Kartierung des Karyopherin-Alpha 2-Gens auf dem Chromosom 17 mit Hil fe einer Reihe von 18 somatischen Zellhybriden; +/+ bedeutet übereinstimmend positiv, -/- übereinstimmend negativ, +/- zusätzlich positiv, -/+ fehlende positive; Prinzip: ist / soll

Anzahl der Hybride

konkordant diskonkordant diskonkordant diskonkordant

Chromosom +/+ -/- +/- -/+ (gesamt) (in Prozent)

17 15 3 0 0 0 0

8 13 3 0 2 2 11

14 13 3 0 2 2 11

6 12 3 0 3 3 17

7 12 3 0 3 3 17

15 12 3 0 3 3 17

4 11 3 0 4 4 22

12 11 3 0 4 4 22

20 11 3 0 4 4 22

3 10 3 0 5 5 28

5 10 3 0 5 5 28

10 9 3 0 6 6 33

19 9 3 0 6 6 33

21 9 3 0 6 6 33

22 9 3 0 6 6 33

13 8 3 0 7 7 39

18 8 3 0 7 7 39

11 7 3 0 8 8 44

2 6 3 0 9 9 50

Y 5 3 0 10 10 56

1 4 3 0 11 11 61

X 3 2 1 12 13 72

16 2 2 1 13 14 78

9 0 2 1 15 16 89

Ergebnisse 53

4.1.2. Kartierung mit Hi lfe von YACs

Die Untersuchung der CEPH Human mega-YAC-Library ergab 5 positive Klone für den

verwendeten STS-Marker (Tab. 4.2.). Bei einer nachfolgenden Internetrecherche stellte

sich heraus, daß die Klone in dem YAC-Contig WC 17.9 des Center for Genome Research

des Whitehead Institute for Biomedical Research enthalten sind (Internetadresse:

http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/lookup-contig?contig=wc17.9&database=

release&type=singly-linked).

Tab. 4.2: Untersuchung der CEPH Human mega-YAC-Library mit Hil fe der PCR auf das

Vorhandensein des STS-Markers mit der Primerkombination: 1718-1738 und 1855-1834

Koordinaten der positiven Klonnebengruppen

positive Haupt-gruppen

Platte Reihe Spalte

komplette Klonadresse

30 845 3=C 6 845_C_6

33 871 3=C 4 871_C_4

37 902 3=C 10 902_C_10

40 931 2=B 10 931_B_10

43 955 8=H 4 955_H_4

Weitere PCR-Untersuchungen mit in dem Contig enthaltenen STS- und

Mikrosatelli tenmarkern (vgl. Tab. 3.4., S. 43 und Tab. 3.6., S. 45) ließ die Einordnung des

Gens zwischen dem STS-Marker D17S2020 und den Mikrosatelli tenmarkern D17S1813

und D17S1870 zu (vgl. Abb. 4.2., S. 54).

Ergebnisse 54

Abb. 4.2.: PCR-Untersuchung von Klonen aus dem YAC-Contig WC 17.9 des Center for Genome Research des Whitehead Institute for Biomedical Research [YAC-Adressen (Plattennummer_Reihe_Spalte) auf Y-Achse links] mit Markern aus der Region 17q23 (Locusbezeichnung auf X-Achse oben). Die schwarzen Balken kennzeichnen die Lage der einzelnen YACs und die senkrechten, unterbrochenen Linien markieren die Positionen der Marker.

D1

7S19

77

955_H_4

751_G_2

737_C_12

734_C_5

883_B_2

681_D_8

915_F_8

883_B_1

963_C_7

765_F_4

789_B_1

829_H_6

845_C_6

901_H_9

931_B_10

711_E_2

871_C_4

902_C_10

730_A_2

824_E_7

880_G_10

963_G_3

942_G_11

855_A_4

938_F_7

929_D_11

741_H_3

CA

CN

LG

D1

7S80

7

CH

LC

.1E

12

D1

71

816

D1

7S11

3

D1

7S17

92

D1

7S20

16

D1

7S19

90

D1

7S15

52

D1

7S15

57

D1

7S20

23

D1

7S20

20

KP

NA

2

D1

7S18

70

D1

7S18

13

D1

7S78

9

D1

7S79

5

Ergebnisse 55

4.1.3. Zellhybride mit chromosomalen Fragmenten aus der Region 17q

Die Untersuchung der 5 somatischen Zellhybride (vgl. Kap. 3.1.2., S. 28) mit Hilfe der

PCR auf das Vorhandensein der in Abbildung 4.3. enthaltenen Marker ergab eine

Lokalisation des KPNA2-Gens zwischen dem STS-Marker D17S2020 und dem

Mikrosatelli tenmaker D17S795.

Abb. 4.3: Physikalische Kartierung eines STS-Markers aus der 3‘ -Region des KPNA2-Gens und

einiger benachbarter STS-Marker mit Hil fe von 5 somatischen Zellhybriden mit Fragmenten aus

der distalen Region des langen Armes von Chromosom 17 - Die senkrechten, schräg schraff ierten

Balken stellen die Hybridfragmente dar und die waagerechten gestrichelten Linien beschreiben die

Positionen der untersuchten Marker.

Unter Berücksichtigung der Ergebnisse aus dem Kapitel 4.1.2. auf der Seite 53 ergab sich

im Hybrid UMGH 17/4b ein Loch zwischen D17S2020 und D17S795. In diesem, durch

diese beiden Marker definierten, Loch befinden sich sowohl das KPNA2-Gen als auch die

Mikrosatelli tenmarker D17S1813 und D17S1870.

UMHG 17/1

UMHG 17/2

UMHG 17/4b

UMHG 17/3

17q24

17q23

17q22

D17S2020

X10del-1396

D17S1977

D17S1870

D17S1813

D17S807

D17S1816

D17S113

RL- III

D17S789

D17S795

KPNA2

Ergebnisse 56

4.2. Konstruktion eines PAC-/BAC-Contigs 4.2.1. Screening einer PAC-/BAC-Bibliothek mit Markern aus der Region 17q23 Die Ergebnisse der Untersuchung der PAC-Bibliothek mit bereits bekannten Markern der

Region 17q23 sind in der Tabelle 4.3. zusammengefaßt.

Tab. 4.3: Untersuchung der RPCI 1 Human PAC-Bibliothek (vgl. Kap. 3.3.1., S. 31) mit bekannten Mikrosatelli tenmarkern und STS-Markern aus der Region 17q23 - Aufgelistet sind die Namen der Marker, die positiven Hauptgruppen (die fettgedruckten Hauptgruppen wurden für die weiteren Untersuchungen verwendet), die positiven Klongruppen und die Klonadressen.

Klongruppen Marker Hauptgruppen

Zeile Spalte Platte

Adresse

D17S1990 23 12 21 187 L21_187

D17S1552 2, 31 1 13 245 A13_245

D17S1557 4, 10,18 6 12 30 F12_30

D17S2020 1, 2, 4, 7, 9, 19 7 10 150 G10_150

D17S2016 11 4 4 83 D4_83

D17S2023 9, 11, 17, 30 4 4 83 D4_83

D17S1870 24, 26, 37 4 1 188 D1_188

D17S1813 4 , 14 11 16 28 K16_28

Nach der Sequenzanalyse der PAC-Enden und der Konstruktion eigener STS-Marker

wurden diese wiederum für ein erneutes Screening verwendet. Die Ergebnisse dieser

Untersuchung sind in der Tabelle 4.4. auf der Seite 57 zusammengefaßt.

Diejenigen Marker, die bei der Untersuchung der PAC-Bibliothek zu keinem positiven

Ergebnis führten, ergaben bei der Verwendung der CEPH Human BAC-Bibliothek die in

Tabelle 4.5. auf der Seite 57 aufgelisteten Klone.

4.2.2. Untersuchung der PAC-/BAC-K lone mittels PCR

Die Ergebnisse der PCR-Untersuchungen sind in der Abbildung 4.4. auf der Seite 58

graphisch dargestellt.

E

rgeb

niss

e 57

Abb

. 4.4

.: G

raph

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K 6

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P 3

_1

10

J13_58-N2

J13_58-N1

H17_497-N1

B9_81-N2

H17_497-N2

KPNA2

B16_235-N1

B9_81-N1

G10_150-N1

B12_7-N2

B16_235-N2

G10_150-N2

B12_7-N1

D1_188-N2

D17S1870

D17S2020

D1_188-N1

K16_28-N1

K6_452-N2

D17S1813

P3_110-N1

K16_28-N2

K6_452-N1

P3_110-N2

Ergebnisse 58

Tab. 4.4: Untersuchung der RPCI 1 Human PAC-Bibliothek (vgl. Kap. 3.3.1., S. 31) mit selbst konstruierten STS-Markern aus der Region 17q23 - Aufgelistet sind die Namen der Marker, die positiven Hauptgruppen (die fettgedruckten Hauptgruppen wurden für die weiteren Untersuchungen verwendet), die positiven Klongruppen und die Klonadressen.

Klongruppen Marker Hauptgruppen

Zeile Spalte Platte

Adresse

1718-1855 2, 11, 23 2 9 81 B9_81

31 1 13 245 A13_245

K16_28-N1 4, 14 7 19 112 G3_112

G10_150-N1 2, 19, 31 8, 14 6, 15 12, 15 H6_12, N15_15

G10_150-N2 1, 2, 19 2 12 7 B12_7

H17_497-N1 5, 8, 15 10 13 58 J13_58

D4_83-N2 38, 39 9 18 313 I18_313

D1_188-N1 14, 24, 26 7 19 112 G3_112

D1_188-N2 24, 26, 38 15 9 306 O9_306

Tab. 4.5: Untersuchung der CEPH Human BAC-Bibliothek (vgl. Kap. 3.4.1., S. 36) mit selbst konstruierten STS-Markern (vgl. Tab. 3.7., S. 46) aus der Region 17q23 - Aufgelistet sind die Namen der Marker, die positiven Hauptgruppen (die fettgedruckten Hauptgruppen wurden für die weiteren Untersuchungen verwendet), die positiven Klongruppen und die Klonadressen.

Klongruppen Marker Hauptgruppen

Zeile Spalte Platte

Adresse

B9_81-N1 15 9 6 120 I6_120

30, 49 2 16 235 B16_235

B9_81-N2 63, 66 8 17 497 H17_497

K16_28-N2 7, 10, 14, 58, 16 3 110 P3_110

57, 61, 63, 64, 68 11 6 452 K6_452

Ergebnisse 59

4.3. Untersuchung von Heterozygotieverlusten in der Region 17q23 und allgemeiner

M ikrosatell itenstatus

4.3.1. M ikrodisseziierte Kolonkarzinome

Um die Aussagekraft der Untersuchung zu optimieren und somit die Reproduzierbarkeit

der Resultate zu erhöhen wurden folgende Differenzierungskriterien zugrunde gelegt, die

auf eigenen Überlegungen und einen großen Erfahrungswert basieren. Bei einer Reduktion

der Allelfläche (peak area) größer/gleich 50 % der untersuchten Tumor-DNA im Vergleich

zum Normalgewebe besitzt der Tumor an dieser, durch den Marker definierten Stelle,

einen sicheren Heterozygotieverlust (LOH). Bei einer Reduktion zwischen 30 % und 50 %

lautet das Ergebnis fraglicher LOH und unter 30 % wird von einer unveränderten

heterozygoten Situation (Retention) ausgegangen. Beim Auftreten mindestens eines

zusätzlichen Allels beim Tumorgewebe im Vergleich zum Normalgewebe wird die Probe

für den entsprechenden Marker als mikrosatelli teninstabil (MIN+) bezeichnet. Beispiele

für die einzelnen Kategorien (außer fraglicher LOH) sind in den Abbildungen 4.5.-4.9. auf

der Seite 61 dargestellt. Die Ergebnisse der LOH-Untersuchungen sind in den Abbildungen

4.10. (S. 62) und 4.11. (S. 63) dargestellt und in der Tabelle 4.6. auf der Seite 60

zusammengefaßt aufgelistet. Die Abbildungen 4.12. und 4.13. auf der Seite 64 beinhalten

eine graphische Darstellung der Untersuchungsergebnisse.

Ergebnisse 60

Tab. 4.6: Ergebnisse der LOH-Untersuchungen an 40 mikrodisseziierten kolorektalen Karzinomen

mit 12 Mikrosatelli tenmarkern

Anzahl der untersuchten Proben Heterozygotieverluste in %

Marker insge-

samt

homo-

zygot

hetero-

zygot

LOH/

fragl.LOH

MIN+

insge-

samt

sicher fraglich

D17S1792 39 22 14 3 / 2 3 35,7 21,4 14,3

D17S1809 34 14 18 2 / 1 2 16,6 11,1 5,5

D17S1813 40 7 29 8 / 6 4 48,3 27,6 20,7

D17S1870 39 18 18 7 / 1 3 44,4 38,9 5,5

D17S789 39 6 27 4 / 3 6 25,9 14,8 11,1

D17S795 39 20 16 4 / 2 3 37,5 25 12,5

D1S243 29 6 22 5 / 1 1 27,3 22,7 4,6

D5S82 38 11 24 9 / 0 3 37,5 37,5 0

D8S264 36 4 31 14 / 2 1 51,6 45,2 6,4

D15S127 37 5 30 12 / 2 2 46,6 40 6,6

D17S796 38 12 24 15 / 3 2 75 62,5 12,5

D18S70 31 3 26 19 / 0 2 73 73 0

Ergebnisse 61

124D1N

124D1T 80D1T

80D1N

124D1N

124D1T

124D1N

124D1T

175D1T

175D1N

Abb. 4.5: Beispiel für einen homozygoten Locus; 124D1N und T mit D15S127

Abb. 4.6: Beispiel für einen heterozygoten Locus; 80D1N und T mit D17S789

Homozygotie und Heterozygotie

Heterozygotieverlust; (loss of heterozygosity, LOH)

Abb. 4.7. und 4.8: Beispiele für Hetrozygotieverluste (Pfeile kennzeichnen verlorene Allele); Proben 124D1N und T mit den Markern D17S795 (links) und D17S1870 (rechts)

Mikrosatelli teninstabili tät

Abb. 4.9: Beispiel für Mikrosatelli teninstabili tät (Pfeile kennzeichnen zusätzliche Allele); Proben 175D1N und T mit dem Marker D17S795

118 bp

118 bp

118 bp

153 bp

235 bp

106 bp

118 bp

118 bp

118 bp

106 bp

106 bp

106 bp

231 bp

231 bp 235 bp

112 bp 100 bp

159 bp

153 bp 159 bp

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S18

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123D1T1

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125D1T1

126D1T1

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129D1T1

130D1T1

131D1T1

132D1T1

133D1T1

134D1T1

135D1T2

137D1T1

142D1T1

143D1T1

144D1T1

145D1T1

146D1T2

147D1T1

153D1T1

155D1T1

156D1T1

Abb

. 4.1

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S18

09

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171D1T1

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174D1T5

175D1T2

176D1T1

178D1T1

182D1T1

184D1T1

168D1T1

Abb

. 4.1

1: E

rgeb

niss

e de

r L

OH

-Unt

ersu

chun

gen

an m

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diss

eziie

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17q2

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Fel

der

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n ke

ine

Erg

ebni

sse

vor.

Ergebnisse 64

Abb. 4.12: Graphische Darstellung der Ergebnisse der LOH-Untersuchuchungen an kolorektalen

Karzinomen mit Mikrosatelli tenmarker aus der Region 17q23

Abb.4.13: Graphische Darstellung der Ergebnisse der LOH-Untersuchungen an kolorektalen

Karzinomen mit Mikrosatelli tenmarkern auf unterschiedlichen Chromosomen

05

101520253035404550

LOH in %

D17

S17

92

D17

S18

09

D17

S18

13

D17

S18

70

D17

S78

9

D17

S79

5

Mikrosatellitenmarker

LOH-Untersuchung in der Region 17q23

LOH insges.

LOH sicher

LOH fraglich

0

10

20

30

40

50

60

70

80

LOH in %

D1S

243

D5S

82

D8S

264

D15

S12

7

D17

S79

6

D18

S70

Mikrosatellit enmarker

Allgemeiner Mikrosatell itenstatus

LOH insges.

LOH sicher

LOH fraglich

Ergebnisse 65

4.3.2. M ikrodisseziierte Mammakarzinome

Die Einordnung der Proben in die Kategorien Homozygot, Heterozygot (Retention),

fraglicher LOH, sicherer LOH und Mikrosatelli teninstabil (MIN+) erfolgte nach den

selben Kriterien wie im Kapitel 4.3.1. auf der Seite 59. Die Abbildung 4.14. auf der Seite

66 beinhaltet eine graphische Darstellung der Ergebnisse der LOH-Untersuchungen. In der

Tabelle 4.7. sind die Ergebnisse und deren Auswertung tabellarisch erfaßt und in der

Abbildung 4.15. auf der Seite 67 ist die Auswertung wiederum graphisch dargestellt.

Tab. 4.7: Ergebnisse der LOH-Untersuchungen an 30 mikrodisseziierten Mammakarzinomen mit

7 Mikrosatelli tenmarkern

Anzahl der untersuchten Proben Heterozygotieverluste in %

Marker insge-

samt

homo-

zygot

hetero-

zygot

LOH/

fragl.LOH

MIN+ insge-

samt

sicher fraglich

D17S807 26 4 22 5 / 2 0 33,8 22,7 11,1

D17S1792 26 18 7 0 / 1 1 14,3 0 14,3

D17S1809 20 4 16 4 / 1 0 31,2 25 6,2

D17S1813 30 4 25 8 / 3 1 44 32 12

D17S1870 28 12 15 4 / 2 1 40 26,7 13,3

D17S789 29 5 23 5 / 6 1 47,8 21,7 26,1

D17S795 30 15 14 3 / 2 1 35,7 30 5,7

E

rgeb

niss

e 66

D17

S17

92

D17

S18

13

D17

S18

70

D17

S78

9

D17

S79

5

D17

S80

7

Ret

entio

n (H

eter

ozyg

ot)

unin

form

ativ

(H

omoz

ygot

)

Het

eroz

ygot

ieve

rlus

t (L

OH

)

frag

liche

r L

OH

Mik

rosa

telli

teni

nsta

bil

D17

S18

09

32D1T3

39D1T1

40D1T1

41D1T2

42D1T1

43D1T1

44D1T1

45D1T1

46D1T1

47D1T1

48D1T1

49D1T1

51D1T1

52D1T1

54D1T1

55D1T1

58D1T1

59D1T1

60D1T1

61D1T1

78D1T2

80D1T1

81D1T1

84D1T1

94D1T1

95D1T3

96D1T5

97D1T1

216D1T1

85D1T1

Abb

. 4.

14:

Erg

ebni

sse

der

LO

H-U

nter

such

unge

n an

m

ikro

diss

eziie

rten

M

amm

akar

zino

men

mit

Mik

rosa

telli

tenm

arke

rn a

us d

er R

egio

n 17

q23

(Für

die

frei

en F

elde

r lie

gen

kein

e E

rgeb

niss

e vo

r.)

Ergebnisse 67

Abb. 4.15: Graphische Darstellung der Ergebnisse der LOH-Untersuchungen an Mamma-

karzinomen mit Mikrosatelli tenmarkern aus der Region 17q22-23

05

101520253035404550

LOH in %D

17S

807

D17

S17

92

D17

S18

09

D17

S18

13

D17

S18

70

D17

S78

9

D17

S79

5

Mikrosatellitenmarker

LOH-Untersuchung in der Region 17q22-23

LOH insges.

LOH sicher

LOH fraglich

Ergebnisse 68

4.4. Sequenz und Genomische Struktur des Karyopherin Alpha 2–Gens

4.4.1. Sequenzierung genomischer DNA zur Identifizierung der Exon-Inton-

Übergänge

4.4.1.1. Verwendung genomischer DNA aus Leukozyten

Die Identifizierung der Exon-Intron Übergänge unter Verwendung genomischer DNA aus

Leukozyten erwies sich durch das Vorhandensein mehrerer Targets als sehr schwierig

(Abb. 4.16.). Nach der Isolierung des YAC-Klones 931_B_10 und des PAC-Klones B9_81,

die nach eigenen Untersuchungen das KPNA2-Gen enthalten, wurden die weiteren

Sequenzanalysen an der DNA dieser Klone durchgeführt.

1 2 3 4 5

Abb. 4.16: Untersuchung der Intron-

Exon-Übergänge unter Verwendung

intronüberspannender exonischer

Primer; Bahn 1: 1kb-Leiter; Bahn 2

und 4: YAC 931_B_10; Bahn 3 und

5: DNA aus Leukozyten; Bahn 2 und

3: PCR mit den Exonprimern 384-

403 und 885-866 (es werden die

Introns 4, 5 und 6 überspannt, vgl.

Tab. 3.5., S. 44); Bahn 4 und 5: PCR

mit den Exonprimern 772-791 und

1249-1230 (es werden die Introns 6

und 7 überspannt, vgl. Tab. 3.5.,

S. 44); PG: Pseudogen auf Chromo-

som 4 (vgl. Kap 4.1.1., S. 51);

KPNA2: Karyopherin Alpha 2-Gen

auf 17q23

PG PG

KPNA2

KPNA2

PG

KPNA2

Ergebnisse 69

4.4.1.2. Verwendung von DNA aus dem YAC 931_b_10 und dem PAC B9_81

Wegen der im Kapitel 4.4.1.1. geschilderten Probleme erfolgte die Untersuchung der

Exon-Intron-Übergänge ausschließlich unter Verwendung von DNA aus Hefezellen mit

dem YAC 931_b_10 und dem E. coli-Klon mit dem PAC B9_81 (Angabe in Klammern

jeweils am Ende der entsprechenden Exons). Die Sequenz des Exon 1 ist in der Abbildung

4.17. auf der Seite 74 graphisch dargestellt.

Die Sequenzierung der oben aufgeführten Klone ergab folgende Sequenz

(-klein geschriebene Nukleotide werden weder transkribiert noch translatiert;

-groß geschriebene Nukleotide werden transkribiert, wobei nur die

Fettgedruckten letztendlich in ein Protein umgewandelt werden;

-die unterstrichenen Sequenzen sind eigene Vorschläge für intron-

basierende exonüberspannende Primer):

Exon 1

......cggccca gggaaccgcc ccttcgcgct gcttgacggg atctggagtc ctcccgctcc gcaccgccag

gcgctcaggg accgcccggc cgctccctca ccgcccggcc gctccctcat ctcgcgatgc catcctcttt tttttttttt

tctttccccc ctcccactcg cccccaagcc tgtgactccc tcccctccca acgtgttttt caaatccacc aatgggcaca

cagcttaggc tcgaaccagc caatcggaat gcggagtcac cgggaaattt aaatcgcgcc ggccggctgc acga

GCCACACGGT CTTTGAGCTG AGTCGAGGTG GACCCTTTGA ACGCAGTCGC

CCTACAGCCG CTGATTCCCC CCGCATCGCC TCCCGTGGAA GCCCAGGCCC

GCTTC GCAG gtacaaactc aggcggcggc ccggcccgag cgctaacggc ttgcccgtgg gcggcgttcg

ccttttgggt tgggggaggg aggccccggg tccacgccaa acctg-Exon1+106 gctct gcctcccgcg

ttaactaggc ctcgggggcg acattcattg accaNgcggc taatttcgc (B9_81).........

Ergebnisse 70

Exon 2 und 3; Codon 1-25 und 26-71

.......atatgg ctactaggaa gtttcaattt atatagctgg cattctattt ctgatggaga gccctctcca ggaagtctca

gccctttaga gggaaggggg acacttcccc tttgggtaaa gctatttcat agtgccgaaa acatgatgat cccccctcta

gtaatacaggt gtggattcag tagatgcttg ataattcagt tcttatttgg tactattatt gacaaaggaa aatgataaag

gagatatttt tctcttcccc catcttttag C TTTCTCCCTT TGTCTCATAA CC ATG TCC ACC

AAC GAG AAT GCT AAT ACA CCA GCT GCC CGT CTT CAC AGA TTC AAG

AAC AA G GGA AAA GAC AGT ACA gtgagtacctt ctgttgcttt cctgtggtgg t Exon3-118-

atttaaatg ggaagacatt tggaaagggg tgaaaactga ggtattta-Exon2+78 aa aaaaaaatgc ccccccttag

caacaaaaac tggttttata ggtgaaacgg catgttatct ttcctcaag GAA ATG AGG CGT CGC AGA

ATA GAG GTC AAT GTG GAG CTG AGG AAA GCT AAG AAG GAT GAC CAG

ATG CTG AAG AGG AGA AAT GTA AGC TCA TTT CCT GAT GAT GCT ACT

TCT CCG CTG CAG GAA AAC CGC AAC AAC CA G gtaaaaaatg tattttagtt tatgagttac

gtgaaatcca gaaaatcagt agggactttt cttagaaatt caagtaaact taacatttct agtcttaacg gttttaacta

tctgtgaaca t-Exon3+100 dtttttctc tgtttgcaat tagtaattgt cttctttcct gccttctgta atccactgaa

gctgatttag gatcttcctt tagctctgac cttccttcag acttccctgc atttctagct actagctggg taccttggcc

tgaccagtgt gtccagagcc agccagtttc tggtttatttc ttctttt. (B9_81).....

Exon 4; Codon 72-101.2

.....Exon4-79-ctgccttca caagtaagtgt ggattttatt gtttgtattt aatcttaatg ataatgtgca aactttcact

tttcttctag GGC ACT GTA AAT TGG TCT GTT GAT GAC ATT GTC AAA GGC

ATA AAT AGC AGC AAT GTG GAA AA T CAG CTC CAA GCT ACT CAA GCT

GCC AG gtaagtcttg tctgccatag catgggtagc ctaa-Exon4+34 gaaatt tgtgttttta gatttttttt

cgggggggtg gggcaggaag ggacagacag atagtacaa ggaaagatta ggccagccag ccataagcca aatagtattt

tttatttatt aatttggagg agaggggagg ccttgctatt ttgcccaggc aggccaggaa tgcctgggtt caagctatcc

tctgacctca acctcctgaa gtcctgggat cacaggtgtg tgccctccca ccagccccta aagtttttac c. (931_b_10)

Ergebnisse 71

Exon 5; Codon 101.3-191.1

.....accctgtc agaatgtgaa aagttttttt aaaaagtgac aagatctgga gtagatttct gcagggatgg aaaggagggt

aatctacatt aatttctgga aaaatggtag ttaattatac cgcatacata gcaccataca agtaatctgt tcagcttctc

cttaggttcc agcatgtctc agcatttagt gatttactta aaaggtt Exon5-113-gtc tgaagttcta aactcttgaa

ttgcatttta tattggtttt tacacaaact ccttttgtta atcactgtca acttttattt gtctttttgt tcccctttag G AAA CTA

CTT TCC AGA GAA AAA CAG CCC CCC ATA GAC AAC A TA ATC CGG GCT

GGT TTG ATT CCG AAA TTT GTG TCC TTC TTG GGC AGA ACT GAT TGT

AGT CCC ATT CAG TTT GAA TCT GCT TGG GCA CTC ACT AAC ATT GCT

TCT GGG ACA TCA GAA CAA ACC AA G GCT GTG GTA GAT GGA GGT GCC

ATC CCA GCA TTC ATT TCT CTG TTG GCA TCT CCC CAT GCT CAC ATC

AGT GAA CAA GCT GTC TGG GCT CTA GGA AAC ATT GCA G gtacttggac

ttgaagttct tttgactgaa tgtatctaat cgtaattagt tggaagaaag gccttgttat aagtaataat gactttgtca

agttttgagc-Exon5+100 ttgctttcaa gcccttatta ggaatgaaag tgtcgccttt acaaaggcag (931_b_10)

Exon 6 und Exon 7; Codon 191.2-222 und Codon 223-310;

cagaggccat ctaagtaagt ttgggagttt t Exon6-363-tgctggtgc attcagtcac tgaaaattga tggtgttgga

caaggtaata aaattaatct tgcctc ALU-ggcc gggcatggtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga

ggcagaggcg ggtggatcat gaggtcagga gattgagacc atcctggcta acacagtgaa accccacctc tactaaaaat

acaaaaaatt agccgggcgt ggtggcgggc gcctgaagct gaagcaggag aatggcttga acccagagcg

gacttgcagt gagccgagat cgcgccactg cactccagcc tgggcgacag aNagaactcc gtctcaaaaa

aaaaaaaaaa aattaatctt gccttttttt tcag GT GAT GGC TCA GTG TTC CGA GAC TTG

GTT ATT AAG TAC GGT GCA GTT GAC CCA CTG TTG GCT CTC CTT GCA

GTT CCT GAT ATG TCA TCT TTA GCA gtaagttac Exon7-91-taacatgagta aagttactca

cttcttcatt ctaatttccc ccatcttctc aaaagacaga acctctcatt gcctat-Exon6+86 tttt tttcccccag

(B0981)TGT GGC TAC TTA CGT AAT CTT ACC TGG ACA CTT TCT AAT CTT

TGC CGC AAC AA G AAT CCT GCA CCC CCG ATA GAT GCT GTT GAG CAG

ATT CT T CCT ACC TTA GTT CGG CTC CTG CAT CAT GAT GAT CCA GAA

GTG TTA GCA GAT ACC TGC TGG GCT ATT TCC TAC CTT ACT GAT GGT

CCA AAT GAA CGA ATT GGC ATG GTG GTG AAA ACA GGA GTT GTG CCC

CAA CTT GTG AAG CTT CTA GGA GCT TCT GAA TTG CCA ATT GTG gtaa

Exon8-gttatt tacttgtaga ttaggacata agtataagaa gcatgatcag ggctgggc-Exon7+58 gt ggtagtggtg

gct ALU-cacacct gtgtaatccc agcactttgg gagaccaagg caggtggatc acctgaggtc aggagttcaa

gaccagcctg gccaacattg tgaaagccca tctctactaa aaatacaagg aaattatctg gacatggtgg cacgtgtctg

taatctcaac tactcgggag gctaaggcag gagaattgct tgatctggag cagagctgca gtgaccgaaa tcgtgccatta

tactccatct ctcaaaaaaaaa (B9_81)....

Ergebnisse 72

Exon 8 und Exon 9; Codon 311-388 und Codon 389-449

....ALU ca.120bp..ttttttttttttcag ACT CCT GCC CTA AGA GCC ATA GGG AAT ATT

GTC ACT GGT ACA GAT GAA CAG ACT CAG GTT GTG ATT GAT GCA GGA

GCA CTC GCC GTC TTT CCC AGC CTG CTC ACC AAC CCC AAA AC T AAC

ATT CAG AAG GAA GCT ACG TGG ACA ATG TCA AAC A TC ACA GCC GGC

CGC CAG GAC CAG ATA CAG CAA GTT GTG AAT CAT GGA TTA GTC CCA

TTC CTT GTC AGT GTT CTC TCT AAG gtaacaaagt cttaggattt aatcaagtca tttttagtat

ttatagaaag ctgtgcttga taagcttctt cacgtgcaag gaat-Exon8+84 cttggg ttctactagg agtcctttgc

tgaacaatac ccagtaaccc ctttt Exon9-115 actta aggttggata gaaccttggt actttcagtc attgtttttg

tgaaaaagta ctcttggaat cttatttgtg caactgttct gaaataaaac catttcctta tgtttaatag(B0981) GCA

GAT TTT AAG ACA CAA AAG GAA GCT GTG TGG GCC GTG ACC AAC TAT

ACC AGT GGT GGA ACA GTT GAA CAG ATT GTG TAC CTT GTT CAC TGT

GGC ATA ATA GAA CCG TTG ATG AAC CTC TTA ACT GCA AAA GAT ACC

AAG ATT ATT CTG GTT ATC CTG GAT GCC ATT TCA AAT ATC TTT CAG

gtaagtccta tcaaggtggc tttgtttgaa tttggacttg ataataatca gtttactatt tagactgg-Exon9+68 gg

ggagggcagc tgtaagttta ctcactagta agccacagaa tcagaaagc (B9_81) ....

Exon 10; Codon 450-499

..... ALU aaacttggattttttttttttttag GCT GCT GAG AAA CTA GGT GAA ACT GAG

AAA CTT AGT ATA ATG ATT GAA GAA TGT GGA GGC TTA GAC AAA A TT

GAA GCT CTA CAA AAC CAT GAA AA T GAG TCT GTG TAT AAG GCT TCG

TTA AGC TTA ATT GAG AAG TAT TTC TCT GTA GAG gtgagtaatg gatggtaata

ttaataacaa cttggaaaca tgtagtcaag gccataagcc tttttttccc ttttaaaaat aagtgtcata tctttgttaa

atatagtaaa atatcagtgt gcatgggaca taatgtactt atttgcccct ctagtttggc ttgatggtaa taaaatcttt

ttaaactgag attttaaaag tcaccagatt agtttcaaat gaacaacctt gagaatctta (B9_81)....

Ergebnisse 73

Exon 11; Codon 500-530

..... tcctattgaa aagtgacggt tggggaagaa aaaaatctcg gcctgtttgt gttactgtag tagctagcat ttatgaattg

gcaaagtttc agagaccctc cctcctctat gtcaaatact ataatatc atacaggatt aaaggtgta atatgcagat

caagaccta Exon11-81 g agattaaata cagacttcag gtaggctgct gcttggaata cttatatcat ttttatactt

attttttaat atatttccag GAA GAG GAA GAT CAA AAC GTT GTA CCA GAA ACT ACC

TCT GAA GGC TAC ACT TTC CAA GTT CAG GAT GGG GCT CCT GGG ACC

TTT AAC TTT T AG ATCATGTAGC TGAGACATAA ATTTGTTGTG

TACTACGTTT GGTATTTTGT CTTATTGTTT CTCTACTAAG AACTCTTTCT

TAAA TGTGGT TTGTTACTGT AGCACTTTTT ACACTGAAAC TATACTTGAA

CAGTTCCAAC TGTACATACA TACTGTATGA AGCTTGTCCT CTGACTAGGT

TTCTAATTTC TATGTGGAAT TTCCTATCTT GCAGCATCCT GTAAA TAAA C-

1952-33 ATTCAAGTCC ACCCTTttct tgacttcacc atgcctatgt gttgctttct aatttgggg cctttaatgt

tgctagt gaa aggtaacctg tccaaactga tgggattaac cagaggtagt cctggctgca gtttttgcag aagaatgaat

aacattttct ggaaaccctc agccagtgtc tccttaagtc tccttggcca gggagatggg ctaaataccg taaatttaat

cataaatctc tgctggagct acaaatggaa ttctttcctc ccaaacttca aggccgaatg gggttccaag gtaaatcacg

gctgcacatg ggcctNatct gggaaagtac ccagttctgt ttcgttgatg aggggcatga gggtccacca tg. (B9_81)

4.4.2. Analyse der genomischen Struktur des KPNA2-Gens

Aus den Ergebnissen der PCR-Untersuchungen zur Ermittlung der Introngrößen und der

Sequenzuntersuchungen läßt sich schließen, daß das KPNA2-Gen aus 11 Exons und 10

Introns besteht und ohne die Promotersequenz eine Größe von ca. 11000 bp besitzt. Die

Ergebnisse der genomischen Strukturanalyse des KPNA2-Gens sind in der Abbildung

4.18. auf der Seite 75 graphisch dargestellt.

E

rgeb

niss

e 74

Abb

. 4

.17:

Seq

uenz

des

Exo

n 1

des

KP

NA

2-G

ens

mit

Exo

n-In

tron

-Übe

rgän

gen

- D

ie S

eque

nzie

rung

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Cs

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81.

Für

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Seq

uenz

ierr

eakt

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. 68)

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vgl.

Seq

uenz

des

Exo

n 1

auf

Sei

te 6

8).

Tra

nskr

ipti

on

Tra

nskr

ipti

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E

rgeb

niss

e 75

Pro

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xon

1E

xon

2E

xon

3E

xon

4E

xon

5E

xon

6E

xon

7

Exo

n8

Exo

n9

Exo

n10

Exo

n11

010

911

020

720

834

534

643

443

570

370

479

879

910

62

5‘3‘

cDN

A b

p

1200

149

3000

1300

600

100

133

AT

G

1312

11.2

11.1

11.1

11.2

1221

.121

.221

.322

2324

25

qp

139

cM

KP

NA

2

Chr

omos

om 1

7

Intr

ongr

ößen

inbp

400

250

1500

700

3‘5‘

1063

1296

1297

1479

1480

1630

1631

1969

cDN

A b

p17

22

TA

G

Intr

onph

asen

00

21

00400

00

00

Intr

ongr

ößen

inbp

Intr

onph

asen

Maß

stab

Län

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t20

0bp

Abb

. 4.1

8:G

enom

isch

eS

truk

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des

KPN

A2-

Gen

s -

Die

Bal

kens

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ture

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