ABI P SeqScape Software - Thermo Fisher Scientifictools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/SeqScape...まえがき viii ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル

Tutorial Chapter 10

ABI PRISM® SeqScape® Software Version 2.x

チュートリアル

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ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル iii

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まえがきこのチュートリアルについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

目的 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

範囲 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

対象となるユーザ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

前提条件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

表記法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii

ユーザへの注意事項 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii

関連資料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

連絡先 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

サービスとサポートの入手方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

第 1章チュートリアルに関する基本情報概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

ファイル命名規則 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

チュートリアルファイル . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-3

プロジェクトの構造 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

操作の手順 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5

第 2章 Project Template の作成Project Template . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Project Template の構成項目 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Project Template を作成するためのワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

ライブラリの作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-3

概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-3

ライブラリの作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-3

まとめ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6

リファレンスデータグループの作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7

RDG の構成項目 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7

RDG を作成するためのワークフロー . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-8

ライブラリと RDG の関連付け . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-10

RDG の保存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-10

Analysis Defaults の定義 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-11

ベースコーリングの設定の指定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-13

ミックスベースの設定の指定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-13

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iv ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル

Clear Range の設定の指定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-14

フィルタリングの設定の指定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-15

Analysis Protocol の保存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-15

Analysis Defaults の保存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-17

Display Settings の定義 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-17

まとめ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-17

Project Template の組立て . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-18

まとめ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-18

第 3章プロジェクトの作成プロジェクトの作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-2

未入力のプロジェクトの作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-2

スペシメンとサンプル . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-2

スペシメンの追加とサンプルのインポート . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3

プロジェクトデータの解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

まとめ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

第 4章データの確認、再解析、編集正常なサンプル解析の確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-2

データレイヤの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-2

Analysis QC レポートの表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-2

サンプルのフィルタリング設定の変更 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6

スペシメンアセンブリの表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-8

スペシメンコンセンサスセグメントアセンブリの表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9

Clear Range の変更 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11

データレイヤの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13

ライブラリ検索結果の確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

Library Search レポートの使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

「Library Identification」ペインの使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16

最終的なライブラリ検索結果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-18

ライブラリ検索結果のレポート . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-18

編集のプロジェクトへの保存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-18

結果のエクスポートと印刷 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-18

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ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル v

付録 A Software Warranty InformationComputer Configuration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

Limited Product Warranty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

Limited Warranty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

Warranty Period Effective Date . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

Warranty Claims . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

Warranty Exceptions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

Warranty Limitations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-3

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vi ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル

ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル vii

まえがき

このチュートリアルについて

目的 ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェア v2.x チュートリアルは、複数のエクソンが存在するプロジェクトでアライメント、編集された一連のコンセンサスシーケンスを作成するプロセスについて理解することのできるトレーニングツールです。

範囲このチュートリアルでは、ソフトウェア CD-ROM に収録されているデータを使用して HLA-C 実験を行う方法について説明します。プロジェクトの作成と解析の手順は次のとおりです。

対象となるユーザこのマニュアルは、このソフトウェアを使用してアプリケーションのリシーケンシングを行うSeqScape ソフトウェアの初心者および熟練ユーザを対象にしています。

前提条件このチュートリアルでは、SeqScape ソフトウェアが適切にインストールされ、読者が次の状態にあることを前提としています。

• 以前に SeqScape ソフトウェアにログインしたことがある（すでにアドミニストレータ（ Administrator）として設定されている）

• ソフトウェアのユーザガイドおよび Quick Reference Card にアクセスできる

また、このチュートリアルでは、読者が Microsoft Windows® オペレーティングシステムの実践的な知識を備えていることも前提としています。

まえがき

viii ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル

表記法このチュートリアルでは、次の表記法を使用しています。

• 太字は、ユーザの行う操作を示します。たとえば、次のとおりです。残りの各フィールドについて、0 を入力し、[Enter] キーを押します。

• ゴシック体は、初出または重要な語を示し、強調しています。たとえば、次のとおりです。解析の前に、必ず新しいマトリックスを調製してください。

• 右三角カッコ (>) は、ドロップダウンメニューまたはショートカットメニューで連続して選択するコマンドを区切って示しています。

たとえば、次のとおりです。

–「File」 > 「Open」 > 「Spot Set」を選択します。

– サンプル列を右クリックし、「View Filter」 > 「View All Runs」を選択します。

ユーザへの注意事項 Applied Biosystems ユーザマニュアルでは、2 種類の注意事項が記載されています。各注意事項は、次のような特定のレベルの注意と対応が必要なことを示しています。

注：製品を使用する上で役に立ちますが、必須ではない情報を記述しています。

重要！装置の適切な操作、ケミストリキットの正しい使用法、化学物質の安全な使用法に関する必要な情報を記述しています。

ユーザへの注意事項の例を次に示します。

注：カラムのサイズは、ランタイムに影響します。

注：換算機能は、Control Console でも使用できます。

重要！クライアントがデータベースに接続していることを確認するには、有効な Oracle ユーザ ID とパスワードが必要です。

重要！ 1 枚の 96 ウェルマイクロタイタープレートに対して、それぞれ 1 つの「Sample Entry」スプレッドシートを作成する必要があります。

サービスとサポートの入手方法

ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル ix

関連資料手順、定義、説明の詳細については、『ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェアユーザガイド』を参照してください。ワークフローの概要と一般的な手順については、Quick Reference Cardを参照してください。

このソフトウェアには、次の関連資料が同梱されています。

• 『ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェアユーザガイド』 - SeqScape ソフトウェアについて説明しています。このソフトウェアの詳しい使用手順とその他の役立つ情報が記載されています。

• 「ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェア Quick Reference Card」 - 一般的なタスクの詳しい実行手順が簡潔に記載されています。SeqScape ソフトウェアを使用しながら素早く参照することができます。

• 「ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェア Training Movie」 - SeqScape ソフトウェアについて説明しています。また、一般的なタスクの実行手順を実際にご覧いただけます。

注：前述の SeqScape 資料のポータブルドキュメントフォーマット（PDF）版は、SeqScapeソフトウェアのインストール CD に収録されています。

連絡先 Applied Biosystems では、弊社のユーザマニュアルをより使いやすいものにするため、お客様からのご意見、ご要望をお待ちしております。次の電子メールアドレス宛にお送りください。

[email protected]

サービスとサポートの入手方法すべての地域における最新サービスおよびサポート情報を入手するには、http://www.appliedbiosystems.co.jp にアクセスし、「カスタマーサポート」のリンクをクリックしてください。「カスタマーサポート」ページでは、次のことが可能です。

• よくある質問（FAQ）を検索する

• テクニカルサポートに質問を直接送信する

• Applied Biosystems ユーザマニュアル、MSDS、解析証明、およびその他の関連資料を注文する

• PDF 文書をダウンロードする

• 顧客トレーニングに関する情報を入手する

• ソフトウェアアップデートおよびパッチをダウンロードする

さらに、「カスタマーサポート」ページには、世界各地の Applied Biosystems テクニカルサービスおよびサポート機関の連絡先電話番号やファックス番号も掲載されています。

まえがき

x ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル

1

ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル 1-1

チュートリアルに関する基本情報

この章では、次の項目について説明します。

概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1-2

ファイル命名規則 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1-2

チュートリアルファイル . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1-3

プロジェクトの構造. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1-4

操作の手順 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1-5

第 1章チュートリアルに関する基本情報

1-2 ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル

概要重要！このチュートリアルのすべての手順では、操作を実行するユーザがアドミニストレータ（Administrator）ユーザとして設定されていることが必要です。アドミニストレータアクセスの設定に関する詳細については、『ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェアユーザーガイド』の第 2 章の「はじめに」を参照してください。

このチュートリアルでは、3 つのオーバーラップしない遺伝子領域（エクソン 2、3、および4）が単一のデータレイヤに存在する HLA-C プロジェクトの作成を通して、SeqScape® ソフトウェアの使用方法を習得します。このデータレイヤは、それぞれがリファレンスシーケンスにアライメントされたオーバーラップしない対象領域（ROI）を表します。

ファイル命名規則ユーザ名またはファイル名には、スペースと次の英数字を使用することはできません。

\ / : * ? “ < > |

ユーザ名またはファイル名にスペースやこれらのいずれかの文字を使用すると、エラーメッセージが表示されます。続行するには、使用できない文字を削除する必要があります。

チュートリアルファイル


チュートリアルファイルこのソフトウェアに付属の HLA-C プロジェクトデータは、インストールドライブの次の場所に存在します。

AppliedBiosystems\SeqScape\Tutorial Data\HLA-C

チュートリアルプロジェクト用に用意されているファイルを表 1-1 に示します。表 1-1 には、用意されている 3 つのファイルの種類とそのフォルダ名、および明確なファイル名と拡張子が明記されています。

表 1-1 チュートリアルで使用するファイルの種類、フォルダ、ファイル名

ファイルの種類フォルダ名ファイル名と拡張子

アレルライブラリ HLA-C_Exon2-4_FASTA Library HLA-C-ex2-4_v2_LibraryEntries.fsta

サンプルファイル HLA-C_3100POP6_Tutorial Data**

スペシメンフォルダ A1

** この場所には、3 つのデータフォルダ（A1、A2、および A3）が含まれています。各フォルダには、6 つのシーケンスファイルが存在します。

A1-2F_01.ab1*†

A1-2R_02.ab1A1-3F_01.ab1A1-3R_02.ab1A1-4F_01.ab1A1-4R_02.ab1

*† このファイル名規約の例として、A1-2F_01.ab1 があります（2F はエクソン 2 フォワードシーケンスプライマーを表します）。

HLA-C_3100POP6_Tutorial Dataスペシメンフォルダ A2

A2-2F_03.ab1A2-2R_04.ab1A2-3F_03.ab1A2-3R_04.ab1A2-4F_03.ab1A2-4R_04.ab1

HLA-C_3100POP6_Tutorial Dataスペシメンフォルダ A3

A3-2F_05.ab1A3-2R_06.ab1A3-3F_05.ab1A3-3R_06.ab1A3-4F_05.ab1A3-4R_06.ab1

リファレンスシーケンス HLA-C_Exon2-4_GenBank Refs HLA-C-ex-2-3_AF250557.gbHLA-C-ex-4_AJ277102.gb



プロジェクトの構造SeqScape Manager で作成するプロジェクトは、複数のファイルとユーザ設定から構成されます（図 1-1）。

図 1-1 プロジェクトのファイルと設定の構造

操作の手順


操作の手順このチュートリアルでは、HLA-C 実験を行う方法について説明します。この操作を実行するには、次の手順でプロジェクトを作成し、解析する必要があります。

• アレルライブラリを作成する

• Project Template の項目を設定し、Project Template を作成する

• プロジェクトを作成して解析する

• サンプルファイルを処理する

• コンセンサスシーケンスを確認して編集する

• サンプルファイルを確認して編集する

• 結果レポートを生成して確認する

• アレルライブラリでハプロタイプマッチを検索する

2


Project Template の作成


Project Template . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2-2

ライブラリの作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2-3

リファレンスデータグループの作成 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2-7

Analysis Defaults の定義 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2-11

Display Settings の定義 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2-17

Project Template の組立て. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2-18

第 2章 Project Template の作成


Project Template

概要この章では、Project Template の項目を設定し、このチュートリアルプロジェクト用の ProjectTemplate を作成して設定する方法について説明します。Project Template は、ABI PRISM®

SeqScape® ソフトウェアによるサンプルの解析方法と結果の表示方法を定義します。ProjectTemplate は各種の設定項目を組み込んでおり、インポート、エクスポート、編集が可能です。

Project Template の構成項目

Project Template には、プロジェクトでサンプルの解析と結果の表示を行うために必要となる情報が含まれます。このチュートリアルでは、次の情報が含まれる Project Template（図 2-1）を作成します。

• リンクされたアレルライブラリが含まれるリファレンスデータグループ（RDG）

• Analysis Protocol と解析のデフォルトの設定が含まれる Analysis Defaults• Display Settings

++

図 2-1 Project Template の構成項目

注： Project Template の 3 つの構成項目（RDG、Analysis Defaults、および Display Settings）は、任意の順序で作成できます。

Project Template を作成するためのワークフロー

このチュートリアルでは、Project Template を作成するために次の作業が必要です。

• 新規 RDG の作成 - ライブラリを作成してレイヤおよび ROI を定義し、保存します。• 新規の Analysis Defaults の作成 - Analysis Protocol を定義して保存し、Analysis Defaultsの設定を定義して保存します。次に、Analysis Protocol を選択し、保存します。

• Display Settings の作成 - Display Settings を定義して保存します。• 新規 Project Template の作成 - テンプレートに名前を付け、RDG、Analysis Defaults、および Display Settings を選択し、保存します。

ライブラリの作成



概要このセクションでは、プロジェクト用のシーケンスライブラリの作成過程について説明します。まず、SeqScape Manager で新規ライブラリエントリを作成して名前を付けます。次に、エクソン 2、3、および 4 に渡るアライメントされた 48 個の HLA-C アレルシーケンスで構成される、付属の FASTA 形式のファイルをライブラリファイルにインポートします。このライブラリは、後で Project Template に含めるリファレンスデータグループ（RDG）を作成するときに選択します。

SeqScape ソフトウェアのライブラリ検索機能を使用すると、アライメントされた関連するシーケンスのライブラリを構築できます。このライブラリは、プロジェクトの解析時にスペシメンコンセンサスレベルに対して検索され、ライブラリマッチが生成されます。ライブラリマッチは、1 つのアレル、または各コンセンサスシーケンスにほぼ一致するアレルの対です。

ライブラリの作成チュートリアルプロジェクト用の新規ライブラリを作成するには

1. 「Tools」>「SeqScape Manager」を選択し、「Libraries」タブを選択します（図 2-2）。

図 2-2 SeqScape Manager の「Libraries」タブ

2. 「New」をクリックします（図 2-2）。

3. 「General」タブを次のとおりに完成させます（図 2-3）。

a. ライブラリに「TutorialLibrary（スペースなし）」という名前を付けます。

b.「Haploid」を選択し、このライブラリの参照先がハプロイドシーケンスであることを指定します。



c. コメントを入力してライブラリに関する情報を追加します。

図 2-3 完成された Library Editor の「General」タブ

4. 「Entries」タブを選択し、「Import」をクリックします（図 2-4）。

図 2-4 Library Editor の「Entries」タブ



5. 「Import Library Sequence Entries」ダイアログボックスで、次の手順でライブラリファイルを追加します

a. インストールしたドライブでAppliedBiosystems\SeqScape\Tutorial Data\HLA-C\HLA-C_Exon2-4_FASTA Library に移動し、HLA-C_ex2-4_v2_LibraryEntries.fsta を選択します（図 2-5）。

図 2-5 Import Library Sequence Entries ダイアログボックス

b.「Import」をクリックします。

6. 「OK」をクリックしてインポートを承認します（図 2-6）。

図 2-6 Library Entries Import Statistics ダイアログボックス

注：ファイルのインポート後、Library Editor の表（2-6ページの図 2-7）で任意のエントリ行をダブルクリックすると、そのエントリに関連付けられたシーケンス全体を表示することができます。シーケンスは読み取り専用ですが、コメントは編集可能です。



図 2-7 Library Editor のライブラリ

7. 「OK」をクリックして新規ライブラリを保存し、Library Editor を閉じます。

新規ライブラリが SeqScape Manager に表示されます（2-6ページの図 2-8）。

図 2-8 「Library」タブに表示された新規ライブラリ

まとめこれで、チュートリアルプロジェクト用のライブラリが作成されました。このライブラリは、次のセクションで RDG を作成するときに選択することができます。

リファレンスデータグループの作成


リファレンスデータグループの作成リファレンスデータグループ（RDG）は Project Template の構成項目の 1つで、リファレンスシーケンスの性質を定義します。このリファレンスシーケンスは、プロジェクトにインポートされたすべてのシーケンスを比較するときの基準となります。すべてのシーケンスを比較するときに基準にするリファレンスシーケンスの性質を定義します。

RDG の構成項目 RDG の構成項目を図 2-9 に示します。また、各構成項目について 2-7ページの表 2-1 に説明します。

図 2-9 RDG の構成項目

表 2-1 RDG の構成項目

構成項目定義

リファレンスシーケンス 1 つ以上のリファレンスセグメントから成る連続または不連続のシーケンス。

リファレンスセグメントは、解析されたサンプルファイルのテキストのみの FASTA 形式のシーケンスから取り込むことも、GenBank 形式のファイルから自動的に作成することもできます。

レイヤ関連するオーバーラップしない ROI で編成されたグループ。ROI をレイヤとして編成することで、結果の確認とライブラリの検索を短時間でより正確に行えるようになります。

対象領域（ROI）エクソン、イントロン、スプライスジャンクション、その他ユーザが定義可能なシーケンスの特徴を定義する、リファレンスセグメントの領域。

シーケンスライブラリ相互にアライメントされ、RDG のレイヤにリンクされた関連するシーケンスの集合で、プロジェクト内のスペシメンコンセンサスシーケンスに対する相同性検索に使用されます。

バリアントスタイルプロジェクトアライメントに含まれるヌクレオチドとアミノ酸バリアントの視覚的な表示に適用される、ユーザが定義可能な設定。



RDG を作成するためのワークフロー

このプロジェクト用の RDG を作成するには、次の作業が必要です。

• シーケンスライブラリの作成 - この章の最初のセクションで作成済みです。• 新規 RDG の作成 - 未設定の新規 RDG を作成して名前を付けます。• リファレンスセグメントの追加 - ソフトウェアに付属のリファレンスセグメント（2 つの

GenBank（.gb）ファイル）をインポートします。

• レイヤの定義 - RDG で対象領域（ROI）を作成し、これらの ROI をレイヤに編成します。• ライブラリとレイヤのリンク - この章の最初のセクションでインポートしたライブラリを

RDG のレイヤに関連付けます。

新規 RDG の作成

新規 RDG を作成するには

1. SeqScape ソフトウェアのメインウィンドウで、「Tools」>「SeqScape Manager」を選択し、「Reference Data Group」タブを選択します。

2. 「New」をクリックし、「RDG Properties」ダイアログボックスを開きます。

3. 「General」タブで、「Reference Data Group Name」フィールドに「TutorialRDG（スペースなし）」と入力します。

4. 「Codon Table」の種類は「Standard」のままにし、「HLA-C tutorial, exons 2 to 4」というコメントを入力します。

重要！「OK」をクリックしないでください。RDG を設定するには、さらに手順が必要です。

リファレンスシーケンスのインポート重要！このチュートリアルプロジェクトでは、用意されている 2 つの GenBank ファイルを使用してリファレンスシーケンスを作成します。ただし、通常の作業において SeqScape でGenBank シーケンスエントリを使用するには、まずインターネットから GenBank ファイルをダウンロードする必要があります。詳細については、『ABI PRISM® SeqScape ソフトウェア® ユーザーガイド』の第 4 章の「ファイルのダウンロード」を参照してください。

リファレンスシーケンスセグメントを追加するには

1. 「RDG Properties」ダイアログボックスで、「ROI」タブを選択します。

ヌクレオチドバリアントリファレンスシーケンス内で既知の塩基の変更、挿入、または欠失が存在する位置。

これらのバリアントは、マニュアルで入力することも、タブで区切られたテキストファイルからインポートすることもできます。

アミノ酸バリアント翻訳されたリファレンスシーケンス内で既知の残量の変更、挿入、欠失、またはサイレント変異が存在する位置。

これらのバリアントは、マニュアルで入力することも、タブで区切られたテキストファイルからインポートすることもできます。

表 2-1 RDG の構成項目（続き）

構成項目定義

リファレンスデータグループの作成


2. 「Add Ref. Segment」をクリックし、「Import Reference Sequence」ダイアログボックスを開きます。

3. HLA-C_Exon2-4_GenBank Refs データフォルダに移動し、最初の GenBank ファイル（HLA-C-ex-2-3_AF20557.gb ）を選択します（図 2-10）。

図 2-10 GenBank ファイルの選択

4. 「Import」をクリックします。「RDG Properties」ダイアログボックスで次の処理が行われます（2-9ページの図 2-11）。

• 最初のリファレンスセグメントが最初のレイヤに自動的に追加されます。

• GenBank ファイルのコーディング領域が次のレイヤ（HLA-C_CDS）に自動的に挿入されます。

• すべての GenBank 機能（コーディングおよび非コーディング）が「ROI」ペインのリストに表示されます。

「Layer」ペインのレイヤ 1 にリファレンスシーケンス、レイヤ 2 にエクソン 2 および 3の 2 つの ROI が含まれる HLA-C_CDS が表示されます（2-9ページの図 2-11）。

図 2-11 RDG にインポートされた最初の GenBank ファイル

レイヤ 1

レイヤ 2

リファレンスセグメント 1

エクソン 3 ROIエクソン 2 ROI

「Layer」ペイン

「ROI」ペイン



5. 手順 1 ～ 4 を繰り返し、2 番目のリファレンスセグメント（HLA-C-ex-4_AJ277102.gb）を追加します。

6. 次の手順で、セグメント 2 のエクソン 4 ROI をレイヤ 2 に手動で入力します。

a.「Layer」ペインで、レイヤ 2 をクリックします。

b. ROI 表で HLA-C_exon4 までスクロールし、「on Layer 2」チェックボックスを選択します（2-10ページの図 2-12）。

c. HLA-C_exon4 の「Translation」チェックボックスも選択されていることを確認します。

図 2-12 RDG にインポートされた 2 つの GenBank ファイル

ライブラリと RDG の関連付け

ライブラリは、RDG のレイヤに関連付けられます。この関連付けは、マスタ RDG またはプロジェクトに保存されている RDG に対して行うことができます。

ライブラリを RDG のレイヤにリンクするには

1. 「Layer」ペインで、「Layer 2」をクリックします。

2. 「Layer Settings」ペインで、「Library」ドロップダウンリストから第 2 章で作成したライブラリを選択します。

重要！ライブラリ検索アルゴリズムで正確にマッチさせるには、ライブラリシーケンスの内容が、選択したレイヤの ROI と相関している必要があります。このチュートリアルでは、レイヤ 2 に含まれるエクソン 2、3、および 4 ROI は、リンクされた HLA-C ライブラリのコーディング領域に対応しています。

RDG の保存「OK」をクリックし、RDG を SeqScape Manager の「Reference Data Group」タブに保存します。

レイヤ 2

「Layer」ペイン

「ROI」ペイン

リファレンスセグメント 2

エクソン 4 ROI

Analysis Defaults の定義


Analysis Defaults の定義Project Template を作成するための次の手順は、Analysis Defaults を定義することです。SeqScape ソフトウェアの Analysis Protocol は、サンプルに適用される解析条件を指定します。Analysis Protocol の設定は、1 つ以上のサンプルに対して指定することができます。Analysis Defaults を作成する前に、Analysis Protocol を作成する必要があります。

Analysis Defaults を定義するには、次の作業が必要です。

• Analysis Protocol を作成する

• Analysis Defaults の設定を選択する

Analysis Protocol の作成Analysis Defaults を定義するための最初の手順は、Analysis Protocol を作成することです。Analysis Protocol はマニュアルで入力された設定の集合で、SeqScape ソフトウェアの次の処理方法を指定します。

• 単一の塩基およびミックスベースの読取り

• Clear Range から除外するクオリティの低いデータの特定

• コンセンサスシーケンスの作成に使用するデータのフィルタリング

Analysis Protocol を作成するには、次の設定を指定する必要があります。

• Basecalling の設定

• Mixed Bases の設定

• Clear Range の設定

• Filter の設定



Analysis Protocol を作成するには

1. 「Tools」>「SeqScape Manager」を選択します。

2. 「Analysis Protocols」タブを選択します。

3. 「New」をクリックし、Analysis Protocol に NewAnalysisProtocol という名前を付けます（2-12ページの図 2-13）。

重要！ Analysis Protocol Editor のすべてのタブが完成するまで「OK」をクリックしないでください。

図 2-13 新規 Analysis Protocol



ベースコーリングの設定の指定

「Basecalling」タブに表示される設定では、ソフトウェアがサンプル取り込み時に適用されたラン条件に従ってシーケンスの塩基を検出する方法を指定します。チュートリアルデータは、POP-6™ ポリマーと 50cm キャピラリアレイをセットアップした ABI PRISM® 3100 ジェネティックアナライザで、スタンダードラン（SR）プロトコールを使用して泳動したものです。サンプルは、BigDye® Terminator v1.0 ケミストリでシーケンスされました。

Basecaller の設定を指定するには

1. Analysis Protocol Editor で、「Basecalling」タブを選択します。

2. 「Basecaller」ドロップダウンリストから「Basecaller-3100POP6SR.bcp」を選択します（2-13ページの図 2-14）。

3. 「DyeSet/Primer」ドロップダウンリストから「DT3100POP6(BD)v2.mob」を選択します（2-13ページの図 2-14）。

図 2-14 完成された「Basecalling」タブ

ミックスベースの設定の指定

ミックスベースの検出では、2 番目のピークの高さがメインピークの高さの特定の割合を超えている場合のみ、個々のシーケンスの位置が考慮されます。このレベルは、サンプルの種類、反応キットと精製方法、期待または容認される割合に従って設定します。

ミックスベースの設定を指定するには

1. Analysis Protocol Editor で、「Mixed Bases」タブを選択します。

2. 国際規格 IUB コードに従ってヘテロピークの塩基を読み出すため、「Use Mixed BasesIdentification」チェックボックスが選択されていることを確認します。このチュートリアルでは、2番目のピークのスレッシュホールドのデフォルト値である 25% を使用します。



Clear Range の設定の指定

Clear Range には、最も品質が高いシーケンス部分、すなわちエラーやあいまい性が最も少なく、ベースコールの信頼度が高く Spacing が適切な領域を指定することができます。ClearRange を指定するときに、リファレンスシーケンスに該当するデータのみを含めたり、5′ または 3′ 領域外にあるデータを除外することもできます。

Clear Range を指定するには

1. Analysis Protocol Editor で、「Clear Range」タブを選択します（図 2-15）。

2. 「Use quality values」を選択します。SeqScape ソフトウェアは塩基ごとの Quality Value（QV）を作成するため、ある一定のレベルを超える Quality Value を持つ塩基が指定された数だけ存在するシーケンスの領域を選択することができます。このプロジェクトでは、Clear Range の基準を、20 塩基のうち 20 未満の QV を持つ塩基が 4 つ未満であるとします（QV 20 = ベースコールのエラー確率が 1%）。

QV の詳細については、『ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェアユーザーガイド』の第 10 章を参照してください。

3. 「Use reference trimming」が選択されていることを確認します。

Clear Range を決定するために複数の手法を適用すると、手法が順に適用され、最も小さい Clear Range が生成されます。

図 2-15 完成された「Clear Range」タブ



フィルタリングの設定の指定

フィルタリングの設定では、スペシメンアセンブリからサンプルシーケンスを排除する基準を指定します。ここで設定する最小および最大の基準を満たさないシーケンスはアセンブルされませんが、こういうシーケンスを表示して Analysis Settings を修正し、プロジェクトから再解析することができます。

フィルタリングの設定を指定するには

1. Analysis Protocol Editor で、「Filter」タブを選択します（図 2-16）。

2. 「Maximum Mixed Bases (%)」のデフォルト値 20 を、チュートリアルデータセット用の新しい設定 35 に変更します。

図 2-16「Filter」タブ

3. 他のフィルタ設定が表 2-2 のとおりになっていることを確認します。

Analysis Protocol の保存

フィルタリングの設定の指定を完了したら、「OK」をクリックして Analysis Protocol をSeqScape Manager に保存します。

表 2-2 フィルタ設定

パラメータ値説明

Maximum Mixed Bases (%) = 35

サンプルファイルの Clear Range で許容されるミックスベースの合計最大割合。この数値を超えるサンプルは解析できません。

Maximum Ns (%) = 10 サンプルファイルの Clear Range で許容される N（曖昧塩基数）の合計最大割合。この数値を超えるサンプルは解析できません。

Minimum Clear Length (bp) = 50

サンプルファイルの Clear Range に必要な塩基の最小の長さ。この数値より小さいサンプルは解析できません。

Minimum Sample Score = 20

容認される最小 Quality Value スコア（Clear Range 内のすべてのサンプル QV の平均）。1 ～ 50 の値を指定できます。20 を指定すると、Clear Range に含まれるすべての塩基の平均 Quality Value が 20 以上の場合に、データが容認されます。これは、1 対 100、すなわち 1% のエラー率に相当します。



Analysis Defaults の設定の定義プロジェクトの Analysis Defaults を定義するための 2 番目の手順は、Analysis Defaults の設定を定義することです。Analysis Defaults の設定は、プロジェクト、スペシメン、およびサンプルの Analysis Settings を、プロジェクトにインポートされたすべてのサンプルおよびスペシメンに適用する方法を指定します。

Analysis Defaults の設定には、次の設定が含まれます。

• ユーザ定義のプロジェクトの設定

• ユーザ定義のスペシメンの設定

• 既に作成された Analysis Protocol のコピー

Analysis Defaults の設定を定義するには

1. SeqScape Manager で「Analysis Defaults」タブを選択し、「New」を選択して「New Analysis Settings」ダイアログボックスを開きます（図 2-17）。

2. 「General」タブで、NewAnalysisDefaults という名前を入力します。

3. 「Project」タブで、デフォルトのプロジェクトの設定を使用します。

4. 「Specimen」タブ（図 2-17）を選択し、次の操作を実行します。

a.「Gap Penalty」および「Extension Penalty」フィールドでは、デフォルト設定を使用します。

b.「# Library Matches」フィールドに 5 と入力し、各スペシメンコンセンサスシーケンスに対するライブラリ検索の結果、マッチとして返されるヒット数を指定します。

c.「Basecall Samples」が選択されていることを確認します。

図 2-17「Specimen」タブ

Display Settings の定義


5. 「Sample」タブ（図 2-18）を選択し、「Analysis Protocol」ドロップダウンリストから「TutorialAnalysisProtocol」（前のセクションで作成済みです）を選択します。

図 2-18「Sample」タブ

Analysis Defaults の保存

「Save」をクリックし、Analysis Defaults 設定を SeqScape Manager に保存します。

Display Settings の定義Project Template を作成するための次の手順は、Display Settings を定義することです。Display Settings は、解析の終了後に最初にプロジェクトを開いたときの、プロジェクトの視覚的な表示方法を制御します。このプロジェクトでは、SeqScape Manager でソフトウェアに付属の DefaultDisplaySettings_v2 を使用します。

Display Settings の詳細については、『ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェアユーザーガイド』の第 3 章を参照してください。

まとめこれで、プロジェクトデータの解析と表示を行うためのすべての構成項目が定義されました。次のセクションでこれらの項目を組み立て、Project Template を作成することができます。



Project Template の組立てProject Template を作成するための最後の手順は、Project Template の構成項目を組み立てることです。Project Template によって、作成した RDG、Analysis Defaults、および Display Settings を組み合わせ、繰り返し利用できるテンプレートにします。

このチュートリアルで作成した Project Template の構成項目は、3100 ジェネティックアナライザで POP-6 ポリマーを使用して取り込まれ、BigDye Terminator v1.0 ケミストリによってシーケンスされた、エクソン 2 ～ 4 に渡る HLA-C シーケンスを解析する目的で設定されています。単一の Project Template を、様々なプロジェクトの類似したサンプルデータに適用することができます。

Project Template を組み立てるには

1. SeqScape ソフトウェアのメインウィンドウで、「Tools」>「 SeqScape Manager」を選択します。

2. 「Project Templates」タブを選択し、「New」をクリックします。

図 2-19「Project Template Editor」ダイアログボックス

3. Project Template に MyHLA-CProjectTemplate という名前を付けます（図 2-19）。

4. 前に作成した RDG、Analysis Defaults、および Display Settings を次のとおりに選択します。

• 「Reference Data Group」ドロップダウンリストから「TutorialRDG」

• 「Analysis Defaults」ドロップダウンリストから「NewAnalysisDefaults」

• 「Display Settings」ドロップダウンリストから「DefaultDisplaySettings_v2」

5. 「OK」をクリックし、Project Template を SeqScape Manager に保存します。

まとめこの Project Template は、第 3 章でプロジェクトを作成するときに使用します。

3


プロジェクトの作成


プロジェクトの作成. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3-2

プロジェクトデータの解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3-5

第 3章プロジェクトの作成


プロジェクトの作成プロジェクトを作成するには、次の作業が必要です。

• 第 2 章で完成した Project Template を使用して未入力のプロジェクトを作成する

• ソフトウェアに付属の HLA-C サンプルデータをインポートし、このデータをプロジェクトのスペシメンに関連付ける

未入力のプロジェクトの作成

未入力のプロジェクトを作成するには

1. SeqScape ソフトウェアのメインウィンドウで、「File」>「New Project」を選択します。

2. 「New Project」ダイアログボックス（図 3-1）で、第 2 章で作成した Project Template（MyHLA-CProjectTemplate）を選択します。

図 3-1 新規プロジェクトの名前付け

3. 「Project Name」フィールドに HLA-C_Tutorial と入力します（図 3-1）。

4. 「New」をクリックしてプロジェクトを作成し、Project Template の RDG、Analysis Defaults、および Display Settings をプロジェクトにコピーします。新規プロジェクトが、スペシメンおよびサンプルがない状態で開きます。

スペシメンとサンプル新規作成した未入力のプロジェクトを使用して、スペシメンを追加し、サンプルをプロジェクトにインポートすることができます。スペシメンは、生物学的ソースまたは PCR 産物のすべてのサンプルデータが収容される容器と考えることができます。

このチュートリアル用のサンプルファイルは、3 つのフォルダ（A1、A2、A3）に保存されています。それぞれのフォルダは、DNA ソースまたはスペシメンを表します。各スペシメンには、フォワードシーケンスサンプルとリバースシーケンスサンプルがそれぞれ 3 つずつ含まれています。プロジェクトに追加されたサンプルファイルは .ab1 フォーマットで、まだアセンブルされていません。プロジェクトの解析後、ファイルはアセンブルされたコンティグとして表示されます。

プロジェクトの作成


スペシメンの追加とサンプルのインポートの自動実行

このチュートリアルプロジェクトでは、サンプル名にスペシメン名（A1、A2、A3）が組み込まれており、その後にデリミッタ、すなわちダッシュ（-）が続いています。「Import Samples」ダイアログボックス（3-3ページの図 3-2）で希望のデリミッタ文字を入力し、サンプルファイル名からスペシメン名が自動的に抽出されるようソフトウェアを設定することができます。

スペシメンの追加とサンプルのインポート

スペシメンを追加してサンプルをインポートするには

1. （「Import Samples to Project」）をクリックします。

2. HLA-C チュートリアルデータが含まれるフォルダに移動します（結果を 3-3ページの図3-2 に示します）。フォルダの場所とファイル名については、1-3 ページの「チュートリアルファイル」を参照してください。

図 3-2 HLA-C チュートリアルデータが含まれるフォルダ

3. 「Use sample file name」チェックボックスが選択されていない場合は選択します（図3-2）。

4. 「End」フィールドにダッシュ（-）が入力されていることを確認します（図 3-2）。

5. 「Files」タブで A1 フォルダを選択し、「Auto Add」をクリックします（図 3-2）。



6. A2 および A3 フォルダを選択し、それぞれ選択するごとに「Auto Add」をクリックします。

ソフトウェアによって自動的にスペシメン名（A1、A2、A3）が作成され、そのスペシメン名と関連するサンプル名が「Samples to Add」ペインに表示されます（3-4ページの図 3-3）。

図 3-3 ペインに追加されたスペシメンとサンプル

7. 「OK」をクリックして「Import Samples」ダイアログボックスを閉じます。

スペシメンとサンプルがプロジェクトに追加されます。

注：図 3-4 に示すように、Project Navigator では、アセンブルされていない、または未解析のサンプルとスペシメンのアイコンに赤の斜線が示されます。

図 3-4 プロジェクトに追加されたスペシメンとサンプル

プロジェクトデータの解析


プロジェクトデータの解析スペシメンとサンプルをプロジェクトに追加したら、（「Analyze samples」）をクリックしてプロジェクトデータを解析します。解析手順の詳細については、『ABI PRISM® SeqScape®

ソフトウェアユーザーガイド』の第 1 章を参照してください。

解析が完了すると、正常に解析されたサンプルは、Project Navigator で Unassembled ノードから Consensus Segment ノードに移動します。また、サンプルとスペシメンのアイコンに表示されていた赤の斜線が消えます（図 3-5）。

図 3-5 解析されたデータ

まとめこれで、新規プロジェクトを作成し、サンプルをインポートし、データを解析できました。第4 章の解析結果の確認手順に進んでください。

4


データの確認、再解析、編集


正常なサンプル解析の確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4-2

サンプルのフィルタリング設定の変更 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4-6

スペシメンアセンブリの表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4-8

スペシメンコンセンサスセグメントアセンブリの表示 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4-9

データレイヤの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4-13

ライブラリ検索結果の確認 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4-14

編集のプロジェクトへの保存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4-18

結果のエクスポートと印刷 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4-18

第 4章データの確認、再解析、編集


正常なサンプル解析の確認チュートリアルプロジェクトのサンプルを解析したら、解析結果からサンプルが適切に解析されたかどうかを確認し、必要に応じてデータを編集することができます。

データレイヤの選択最終的な解析と編集を行いながら、Project ビューまたは Specimen ビューで様々な対象レイヤのデータを表示することができます。

データレイヤを表示するには

SeqScape ソフトウェアのメインウィンドウで、「Active Layer」ドロップダウンリストから「HLA-C_CDS」を選択します（図 4-1）。

注： Project ビューには、選択したレイヤに関連するデータのみが表示されます。プロジェクトアセンブリの概要には、そのレイヤで表される ROI（エクソン 2、3、および 4）と、各 ROIに含まれる未知のバリアントのみが表示されます。

図 4-1 アクティブなデータレイヤの選択

Analysis QC レポートの表示

サンプルに対して解析プロセスの各手順が実行されたかどうかを確認するには、Analysis QCレポートの情報を確認する必要があります。

Analysis QC レポートを表示するには

1. Project Navigator で、TutorialProject ノードを選択します（図 4-2）。

図 4-2 TutorialProject を選択した状態

2. 「Tools」 > 「Report Manager」を選択するか、をクリックします。

3. Report Manager のナビゲーションペインで、「Analysis QC Report」を選択します（4-3ページの図 4-3）。

アクティブなレイヤを選択します。

プロジェクトを選択します。

正常なサンプル解析の確認


4. 「Report Settings」セクションで、「Wrap Text」をクリックします（図 4-3）。

5. レポートの「Specimen Analysis」および「Sample Analysis」セクションでデータを確認します（それぞれ図 4-3 および図 4-4 を参照してください）。

図 4-3 スペシメン A1、A2、A3 の Analysis QC レポート

「Specimen Analysis」セクション

レポートの「Specimen Analysis」セクションには、各スペシメンについて解析されたサンプル数と各解析ステップのクオリティが表示されます。表 4-1 に、色分けされた各グラフィックが示す解析のクオリティのステータスを示します。

また、各スペシメンのアライメントを数値で表したスコア（Specimen Score）と、各スペシメンのバリアント位置の数（Total # Variants）も表示されます。

表 4-1 記号、出力、説明、リンク

記号データ出力と説明記号のリンク先…

緑の四角形 - 完全なデータ出力 - 解析プロセスがすべて正常に完了しました。—

黄の三角形 - 部分的なデータ出力 - 解析プロセスで失敗したステップがあります。表の「Sample Analysis」セクション

赤の八角形 - データ出力なし - 解析プロセスがすべて失敗しました。

「Wrap Text」をクリックします。スペシメンの解析結果を確認します。



「Sample Analysis」セクション

「Partial Output」または「No output」のアイコン（図 4-4）が表示されたスペシメンがある場合、このアイコンをクリックすると、「Sample Analysis」表内の影響を受けたサンプルに移動します。ここには、解析の特定の失敗に関する詳細なメッセージが示されます。

たとえば、スペシメン A3 の黄の三角形（図 4-4）をクリックすると、サンプル A3-4F_05 について、フィルタリングのステップとアセンブルのステップの部分的な出力が作成されます。このサンプルのミックスベースの割合（45.9%）は、Analysis Protocol で指定された最大値（35%）を超えています。

図 4-4 スペシメン A3 のエラーの説明

リンクによるサンプルファイルの表示

サンプル A3-4F_05 のリンク（図 4-5）をクリックすると、選択したサンプルの Sample ビューワが開き、そのデータを表示することができます。

図 4-5 リンクを使用したサンプルファイルの表示

リンク

正常なサンプル解析の確認


「Electropherogram」タブ（図 4-6）には、サンプルのすべてのピークが灰色で表示されます。これは、そのデータがすべて Clear Range の範囲外にあることを示します。すなわち、ソフトウェアは、スペシメンコンセンサスシーケンスを作成するときにこのデータを含めません。また、このサンプルに関しては、かなりのレベルのベースラインノイズが認められます。

図 4-6 サンプル A3-4F_05 の Electropherogram ビュー

このサンプルデータをスペシメンアセンブリに含めるのであれば、次のセクションの手順に従って Analysis Protocol のフィルタ設定を緩めます。



サンプルのフィルタリング設定の変更Analysis Protocol のフィルタリング設定を変更することにより、フィルタリング設定によってコンセンサスシーケンスデータから除外されていたサンプルシーケンスを含めたり、または含まれていたシーケンスを除外することができます。

サンプル A3-4F_05 のフィルタ設定を変更して除外されたデータを含めるには

1. Project Navigator で、サンプル A3-4F_05 を選択します。

2. 「Analysis」 > 「Analysis Settings」を選択するか、をクリックして、サンプルの Analysis Protocol を開きます。

3. 「Filter」タブを選択します（図 4-7）。

4. 「Maximum Mixed Bases (%)」に 46.0 と入力します。

図 4-7 Analysis Protocol のフィルタ設定

重要！バックグラウンドシグナルを高くしてミックスベースの最大割合を緩めると、ミックスベースが正確に検出されなくなる可能性があります。その結果、サンプル A3-4F_05 をマニュアルで編集する必要性が増える場合があります。

注： SeqScape ソフトウェアには、サンプルのベースコーリングの矛盾（個々のサンプルシーケンスストランドからの塩基配列間）を確認するコンセンサスコーラアルゴリズムも備わっているため、予期されるマニュアルデータ確認のレベルが最小限に抑えられます。

コンセンサスコーラアルゴリズムの詳細については、『ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェアユーザガイド』の第 10 章を参照してください。

サンプルのフィルタリング設定の変更


5. 「OK」をクリックします。

Project Navigator で、サンプルとそれに関連するスペシメンのアイコンに赤の斜線（図4-8）が表示されます。これは、再解析が必要なことを示します。

図 4-8 サンプルとスペシメンの再解析前

6. （Analyze samples）をクリックし、データを再解析します。

解析が完了すると、サンプルがコンセンサスシーケンスにアセンブルされたことが示されます（図 4-9）。

図 4-9 サンプルとスペシメンの再解析後

7. 「Analysis QC Report」を選択し、ソフトウェアによってサンプルが正常に解析されたことを確認します。

サンプルとスペシメンの再解析が必要なことを示します。

サンプルが HSA277102 ノードに移動し、赤の斜線が消えます。



スペシメンアセンブリの表示完成されたスペシメンアセンブリを表示するには

1. SeqScape ソフトウェアのメインウィンドウで、HLA-C_CDS がアクティブなレイヤになっていることを確認します。

2. Project Navigator で、チュートリアルの最初のスペシメン（A1）を選択します（図 4-10）。

図 4-10 スペシメン A1 を選択した状態

3. リファレンスおよび ROI に対する各サンプルの位置を確認します（図 4-10）。グラフィックの表す意味については、「Legend」の表示を参考にしてください。

スペシメンコンセンサスセグメントアセンブリの表示


スペシメンコンセンサスセグメントアセンブリの表示「Specimen Consensus Segment Assembly」ペインには、次の 2 つのセグメントビューがあります。

• Layout ビュー - そのコンセンサスセグメントとリファレンスについて、サンプルの位置と方向が示された概略図が表示されます。

• Assembly ビュー - そのコンセンサスとサンプルのヌクレオチドシーケンス、サンプルのエレクトロフェログラムデータ、およびビューの位置が表示されます。

完成されたスペシメンコンセンサスセグメントアセンブリを表示するには

1. SeqScape ソフトウェアのメインウィンドウで、HLA-C_CDS がアクティブなレイヤになっていることを確認します。

2. Project Navigator で、チュートリアルのスペシメンコンセンサスセグメントノード（AF250557）を選択します。

3. 「Layout」タブ（図 4-11）を選択し、シーケンスがリファレンスシーケンス番号に対してどのようにアライメントされているか、また矢印で示されるサンプルの方向を確認します。

図 4-11「Layout」タブのコンセンサスセグメントデータ

シーケンスの方向



4. 「Assembly」タブ（図 4-12）を選択し、選択したセグメントのサンプルデータを表示します。青のボックスは、Assembly ビューに表示されている領域を示します。テキストシーケンスの上には、Active Layer ROI のバリアント位置とシーケンス範囲が関連付けられた、スペシメンコンセンサスシーケンスの図が表示されます。

図 4-12「Assembly」タブのコンセンサスセグメントデータ

5. Sample Assembly 表（図 4-12）で、アセンブルされた各サンプルに関連するデータの概要を参照します。

6. セグメントに含まれるすべてのサンプルのエレクトロフェログラムデータ（図 4-13）を表示するには、（Show/Hide All Electropherograms）をクリックします。

図 4-13 エレクトロフェログラムが表示された状態

青のボックス

サンプルシーケンス

コンセンサスシーケンス

Sample Assembly 表

スペシメンコンセンサスセグメントアセンブリの表示


Clear Range の変更 Clear Range は、5’ 末と 3’ 末の両側でクオリティの低いまたはエラーが発生しやすいシーケンスを除外した後に残るシーケンスの領域です。Clear Range 外にあるシーケンスは、灰色のテキストで示されます。

各サンプルで適切な Clear Range の開始塩基を判断するには、Sample Assembly 表（図 4-14）のエントリを使用します。サンプル A1-2F_01 および A1-2R_02 では、Clear Range の開始塩基（CR-Start）とリファレンスセグメントの最初の塩基（Ref. Start）が一致していません。

たとえば、サンプル A1-2F_01 の CR の開始塩基は 29 で、これはリファレンスの開始塩基 27に対応しています。すなわち、このシーケンスをリファレンスシーケンスの 5’ 末端まで拡張するため、サンプルの Clear Range が塩基位置 3 から開始されるように変更する必要があります。

図 4-14 Assembly 表のコンセンサスセグメントデータ

サンプルの Clear Range を変更するには

1. A1-2F_01 サンプルシーケンスの塩基位置 3 の左にポインタを移動し（図 4-15）、右クリックします。

図 4-15 CR の変更

2. 「Set CR start [ at selection」コマンドを選択します。

サンプルの CR の開始塩基が新しい位置に調整され、元の CR の範囲外にあり灰色で表示されていた塩基がスペシメンコンセンサスシーケンスに組み込まれます。

リファレンスの開始塩基

サンプルの CR 開始塩基

Sample Assembly 表



3. 手順 1 および 2 を使用してサンプル A1-2R_02 の CR を調整します。

Sample Assembly 表で、両方のサンプルのリファレンス開始塩基の設定が 1 になります（図 4-16）。

図 4-16 両方のサンプルについて調整された Start Point

リファレンスの開始塩基

Sample Assembly 表

データレイヤの選択


データレイヤの選択最終的な解析と編集を行いながら、Project ビューまたは Specimen ビューで様々な対象レイヤのデータを表示することができます。このチュートリアルプロジェクトでは、関連付けられたシーケンスライブラリに存在する ROI が含まれるデータレイヤのみを表示します。

データレイヤを表示するには

1. SeqScape ソフトウェアのメインウィンドウで、「Active Layer」ドロップダウンリストから「HLA-C_CDS」を選択します（図 4-17）。

図 4-17 アクティブなレイヤの選択

2. スペシメン A2 のコンセンサスシーケンスを選択して確認を開始します。

3. エレクトロフェログラムの抜粋を表示するには、スペシメン A2 の名前の左側にある黒の三角形をクリックします（図 4-18）。

図 4-18 A2 プロジェクトアセンブリの概要と抜粋が表示された状態

注：上部の青のボックスは、表示されている領域を示します。

アクティブなレイヤを選択します。

青のボックスは表示されている領域を示します。

エレクトロフェログラムデータの抜粋



ライブラリ検索結果の確認チュートリアルの RDG は、HLA-C アレルのリンクされたシーケンスライブラリを使用して作成されているため、プロジェクトの確認プロセスで次に実行する手順は、ソフトウェアによって自動的に作成されたライブラリマッチと各スペシメンコンセンサスシーケンスを比較確認することです。まず、Library Search レポートを確認します。

Library Searchレポートの使用

ライブラリ検索結果を表示するには

1. Project Navigator で、スペシメン A2 を選択します。

2. 「Tools」 > 「Report Manager」を選択するか、をクリックします。

3. Report Manager のナビゲーションペインで、「Library Search Report」を選択します。

4. 「Report Settings」セクションで、「Wrap Text」をクリックします。

5. 「Window」 > 「Tile」を選択します。

レポートの Hit List 表（図 4-19）には、選択したスペシメンについて検出されたライブラリマッチが表示されます。各スコアには、ライブラリ内の特定のハプロタイプに最も一致するマッチが示され、マッチ率が高い順に表示されます。

図 4-19 ライブラリ検索のヒットリスト

Constant Position Error 表（4-15ページの図 4-20）には、スペシメンコンセンサスシーケンスで、検索に関連付けられたライブラリのコンスタントポジションについて報告された矛盾が表示されます。

「Position」カラムの値は、Project ビューへのリンクになっています。

スペシメン A2 では、2 つのコンスタントポジションエラーを確認する必要があります。

ライブラリ検索結果の確認


6. スペシメン A2 の最初のリンクをクリックします（図 4-20）。

これにより、サンプル A2-4R_04 のエクソン 4 の位置 45 に移動します。この位置では、サンプルのベースコール K（G および T のミックス）とライブラリコンセンサスの塩基G が一致していません。エレクトロフェログラムでは、シーケンス領域にあるいくつかの「ノイズ」の T ピークのうち 1 つが、この位置にある最初の G ピークからわずかに右にずれていることがわかります。

図 4-20 サンプル A2-4R-04 の位置 45

7. QV バー（図 4-20）の上にポインタを移動し、QV の数値を表示します。

ベースコール K の QV は 16（2.5% のエラー率に相当）です。また、その他すべてのライブラリエントリでは、この位置に G が含まれているため、このサンプルの正しいベースコールは G であると判断できます。

8. 塩基を編集するには、サンプルの塩基をダブルクリックし、G と入力します。

ベースコールが小文字で表示され、QV バーが灰色になります。これは、ユーザによって編集されたことを示します（図 4-21）。

図 4-21 塩基の編集



9. スペシメン A2 の Library Search レポートに示された 2 番目のコンスタントポジションについて、同じ評価プロセスを繰り返します。

10. 操作を完了したら、Library Search レポートを閉じます。

「Library Identification」ペインの使用

「Library Identification」ペインを表示して、スペシメン A2 のライブラリ検索結果を引き続き確認します。

「Library Identification」ペインを表示するには

1. スペシメン A2 のコンセンサスシーケンスの塩基をクリックし、「Identification」ペインを開きます（図 4-22）。「Identification」ペインには、選択したスペシメンコンセンサスシーケンスに対して返された一連のライブラリマッチの中での決定的位置が示されます。

注：リストに表示されたマッチ階層を受け付ける前に、これらの位置のベースコールをマニュアルで確認してください。

2. ペインの高さを調整します（図 4-22）。

図 4-22 Project Assembly ビューで「Identification」ペインが表示された状態

3. （View Column Selector）をクリックします。

「Identification」ペイン

ここをクリックします。

分割バーをドラッグします。

ライブラリ検索結果の確認


4. 「Identification」ペインで最初の決定的位置のカラムを選択します（図 4-23）。

図 4-23 Project Assembly ビューと「Identification」ペイン間のリンク

決定的位置のカラムは、Project Assembly ビューでカラムセレクタによってハイライトされたスペシメンコンセンサスシーケンスの塩基位置へのリンクになっています。

この例では、エクソン 2 の決定的位置 197 および 268 と、エクソン 4 の位置 210 を確認し、スペシメン A2 について正確なライブラリマッチが返されるよう編集する必要があります。

5. 編集する際は、サンプルおよびコンセンサスのベースコール QV と、シーケンスコンテキストおよびサンプル範囲の追加情報を参考にしてください。

QV の詳細については、『ABI PRISM® SeqScape® ソフトウェアユーザガイド』の第 10章を参照してください。



最終的なライブラリ検索結果

最終的なライブラリ検索結果を図 4-24 に示します。

図 4-24 スペシメン A2 の最終的なライブラリマッチ

スペシメン A2 について返された最も一致するハプロタイプマッチは、次の 3 通りのアレルの組合わせのいずれかです。

Cw*07011、07012、または 0706 と Cw*02022

注：このプロジェクトを作成したときに、HLA-C 遺伝子座のエクソン 5 で Cw*07012、Cw*07011、および Cw*0706 のシーケンスが異なっていることがわかっていました。すなわち、エクソン 5 のデータは、このチュートリアルで使用する DNA スペシメン用に作成されていないため、これらのシーケンスはこの分類では解決されません。

ライブラリ検索結果のレポート

エントリを受け付けた後に、確認済みの最終的なマッチのリストが示された Library Search レポートを再作成、印刷、またはレコード保管や報告のためにエクスポートすることができます。

編集のプロジェクトへの保存プロジェクトの編集が完了したら、SeqScape Manager に保存します。

結果のエクスポートと印刷結果の編集後、適切なレポートの作成、データの印刷またはエクスポート、プロジェクト結果の印刷またはエクスポートを行うことができます。

データおよびレポートの印刷とエクスポートに関する詳細については、『ABI PRISM®

SeqScape® ソフトウェアユーザガイド』の第 9 章を参照してください。

A

ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル A-1

Software Warranty Information

この付録では、次の項目について説明します。

Computer Configuration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

Limited Product Warranty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

付録 A Software Warranty Information

A-2 ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル

Computer ConfigurationApplied Biosystems supplies or recommends certain configurations of computer hardware, software, and peripherals for use with its instrumentation. Applied Biosystems reserves the right to decline support for or impose extra charges for supporting nonstandard computer configurations or components that have not been supplied or recommended by Applied Biosystems. Applied Biosystems also reserves the right to require that computer hardware and software be restored to the standard configuration prior to providing service or technical support. For systems that have built-in computers or processing units, installing unauthorized hardware or software may void the Warranty or Service Plan.

Limited Product Warranty

Limited Warranty Applied Biosystems warrants that for a period of ninety (90) days from the date the warranty period begins, its ABI PRISM® SeqScape® Software Version 2.x will perform substantially in accordance with the functions and features described in its accompanying documentation when properly installed on the instrument system for which it is designated, and that for a period of ninety (90) days from the date the warranty period begins, the tapes, diskettes, or other media bearing the software product will be free of defects in materials and workmanship under normal use. If buyer beli

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ABI P SeqScape Software - Thermo Fisher Scientifictools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/SeqScape...まえがき viii ABI PRISM SeqScape ソフトウェア v2.x チュートリアル