i

ABSTRAK

AKTIVITAS ANTIBAKTERI EKSTRAK DAN FRAKSI AKTIF

DAUN BINAHONG [Anredera cordifolia (Ten.) v. Steenis]

SERTA PENGARUHNYA TERHADAP AKTIVITAS

BEBERAPA ANTIBIOTIK

Oleh

Ni Putu Eka Leliqia

NIM: 30715003

(Program Studi Doktor Farmasi)

Penggunaan antibiotik memegang peranan penting dalam penanganan penyakit

infeksi. Namun, penggunaan jangka panjang yang tidak terkontrol atau penggunaan

antibiotik yang tidak tepat memicu terjadinya resistensi bakteri. Pilihan terapi untuk

kasus resistensi sangat terbatas, sehingga diperlukan suatu pengembangan

antibakteri generasi baru. Skrining antibakteri dan kandungan kimia dari tanaman

merupakan salah satu alternatif dan titik awal penemuan antibakteri baru

Ekstrak etanol daun binahong [Anredera cordifolia (Ten.) v. Steenis] telah terbukti

aktif menghambat pertumbuhan beberapa bakteri Gram positif dan Gram negatif,

yaitu Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Methicillin-Resistant Coagulase-Negative Staphylococcus dan Methicillin-

Susceptible Staphylococcus aureus (MSSA). Kandungan kimia yang terdapat

dalam daun binahong seperti tanin, saponin, alkaloid, triterpenoid, dan flavonoid

telah terbukti memiliki aktivitas antibakteri. Studi keamanan ekstrak etanol daun

binahong melalui pengujian toksisitas akut dan subkronis menunjukkan bahwa

pemberian ekstrak tidak memberikan gejala toksik dan abnormalitas pada tikus.

Salah satu cara untuk menemukan senyawa aktif dari tanaman adalah dengan

menggunakan metode bioassay guided fractionation. Dengan mengetahui aktivitas

dari suatu kelompok senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi, dapat dilakukan

isolasi senyawa sehingga diperoleh senyawa tunggal aktif. Penelitian tentang fraksi

aktif dari daun binahong yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antibakteri

belum ditemukan sampai saat ini. Namun beberapa penelitian terhadap senyawa

yang terdapat dalam daun binahong seperti asam ursolat telah terbukti memiliki

aktivitas antibakteri.

Penggunaan kombinasi antibiotik yang diberikan secara bersamaan menjadi salah

satu strategi terapi untuk meningkatkan efikasi terapi antibakteri dan mengatasi

resistensi bakteri. Pemberian kombinasi antibakteri secara klinik sering dimulai

berdasarkan hasil uji in vitro yang memberikan efek sinergis dalam menghambat

pertumbuhan bakteri patogen. Amoksisilin, tetrasiklin HCl, dan siprofloksasin

merupakan antibiotik yang umum diberikan untuk terapi infeksi. Kombinasi

antibiotik tersebut dengan beberapa ekstrak tanaman maupun kandungan kimia

tanaman menunjukkan efek sinergis. Namun, selain potensi manfaat dari efek

ii

sinergis antara agen antibakteri, terdapat pula risiko terjadinya efek merugikan atau

efek samping terkait keamanan obat karena salah satu agen antibakteri dapat

mempengaruhi aktivitas agen lainnya.

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkaji aktivitas antibakteri ekstrak dan fraksi

daun binahong, mengkaji pengaruh ekstrak etanol dan fraksi aktif daun binahong

terhadap aktivitas amoksisilin, tetrasiklin HCl, dan siprofloksasin, menentukan

lokasi kerja ekstrak etanol dan fraksi aktif daun binahong pada sel bakteri serta

pengaruh ekstrak etanol terhadap aktivitas antibiotik berdasarkan hasil pengamatan

SEM dan TEM, serta mengkaji keamanan pemberian kombinasi ekstrak etanol

daun binahong dengan salah satu antibiotik yang memberikan efek sinergis dengan

uji toksisitas subkronis.

Simplisia daun binahong [Anredera cordifolia (Ten.) v. Steenis] yang digunakan

berasal dari daerah Manoko-Lembang, Kabupaten Bandung Barat, Jawa Barat.

Simplisia diekstraksi menggunakan 2 cara. Ekstraksi cara I yaitu simplisia

diekstraksi dengan metode refluks menggunakan pelarut etanol 96% dan diperoleh

ekstrak etanol 1 (EE1). EE1 ditambahkan dengan air panas kemudian disaring saat

masih panas. Filtrat difraksinasi menggunakan metode ekstraksi cair-cair dengan

pelarut yang berbeda kepolarannya yaitu dengan n-heksana dan etil asetat sehingga

diperoleh 3 fraksi yaitu fraksi n-heksana, fraksi etil asetat, dan fraksi air. Ekstraksi

cara II yaitu simplisia daun binahong diekstraksi secara bertingkat dengan metode

refluks menggunakan tiga pelarut yang berbeda kepolarannya yaitu n-heksana, etil

asetat, dan etanol 96% sehingga diperoleh ekstrak n-heksana, etil asetat, dan ekstrak

etanol 2 (EE2). Ekstrak yang paling baik aktivitas antibakterinya difraksinasi

dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif. Penapisan fitokimia

dilakukan terhadap EE1 dan fraksinya serta ekstrak hasil ekstraksi cara II yang

diikuti dengan pemeriksaan profil kromatografi menggunakan asam ursolat, asam

oleanolat, apigetrin, dan rutin sebagai senyawa penanda. Ekstrak dan fraksi daun

binahong diuji aktivitas antibakterinya dengan metode mikrodilusi terhadap

pertumbuhan bakteri Gram positif yaitu MSSA (ATCC 6538), MSSA 1, MRSA

(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) 23, B. cereus (ATCC 11778), B.

subtilis (ATCC 6633), dan bakteri Gram negatif yaitu P. aeruginosa (ATCC 9027),

E. coli (ATCC 8939), E. coli H7 (O156) dan isolat klinis Extended Spectrum Beta-

Lactamase-Producing E. coli. Aktivitas antibakteri ditentukan berdasarkan nilai

konsentrasi hambat minimum (KHM). Pengujian kombinasi etanol daun binahong

atau fraksi aktifnya dengan antibiotik (amoksisilin, tetrasiklin HCl, siprofloksasin)

dilakukan dengan menggunakan metode checkerboard. Efek kombinasi ditentukan

berdasarkan nilai indeks fraksi konsentrasi inhibisi. Lokasi kerja ekstrak etanol,

fraksi aktif dan kombinasi ekstrak etanol dengan antibiotik sebagai antibakteri

diamati dengan menggunakan scanning electron microscope (SEM) dan

transmission electron microscope (TEM).

Kombinasi EE1 dan amoksisilin diuji keamanannya dengan uji toksisitas subkronis

pada tikus Wistar. Terdapat 4 kelompok uji pada pengujian ini yaitu kelompok

kontrol (CMC Na 0,3%), kelompok kombinasi EE1 865 mg/kg bb dan amoksisilin

135 mg/kg bb (dosis total 1 g/kg bb), kelompok satelit kontrol, dan kelompok satelit

kombinasi. Pemberian sediaan uji pada tikus dilakukan selama 90 hari. Pada hari

ke 91 tikus kelompok kontrol dan kombinasi diamati karakteristik urin, hematologi,

indeks organ, biokimia darah, dan histopatologi. Sedangkan kelompok satelit

iii

diteruskan selama 30 hari dengan pemberian bahan pembawa, dan pada hari ke 120,

tikus kelompok satelit diamati karakteristik urin, hematologi, indeks organ,

biokimia darah, dan histopatologi. Data dianalisis menggunakan ANOVA one way-

LSD. Adanya perbedaan bermakna jika memiliki nilai signifikansi p <0,05.

Saponin ditemukan dalam fraksi air dan ekstrak etanol daun binahong dari kedua

cara ekstraksi. Flavonoid dan alkaloid ditemukan pada sebagian besar ekstrak dan

fraksi, kecuali fraksi n-heksana dan ekstrak n-heksana. Seluruh ekstrak dan fraksi

mengandung steroid/triterpenoid. Kromatogram lapis tipis ekstrak dan fraksi daun

binahong menunjukkan terdapatnya asam ursolat dan asam oleanolat pada EEI,

fraksi n-heksana dan ekstrak n-heksana. EE1, fraksi etil asetat, fraksi air, dan

ekstrak etil asetat mengandung apigetrin dan rutin, sedangkan EE2 hanya

mengandung apigetrin.

Pada EE1, fraksi n-heksana dan etil asetat yang diperoleh dari ekstraksi cara I

memiliki aktivitas antibakteri terhadap penghambatan pertumbuhan bakteri Gram

positif yaitu MSSA (ATCC 6538), MRSA, B. subtilis, dan B. cereus (KHM 256-

512 μg/mL). Namun, ekstrak n-heksana dan etil asetat hasil ekstraksi cara II

memiliki aktivitas antibakteri yang lebih baik, dimana kedua ekstrak tersebut

mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif yaitu

MSSA (ATCC 6538), MRSA, B. subtilis, P. aeruginosa, dan E. coli (KHM 256-

512 μg/mL). Ekstrak n-heksana hasil ekstraksi cara II memiliki aktivitas antibakteri

yang paling baik. Selanjutnya ekstrak n-heksana difraksinasi secara KLT preparatif

dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak toluena-etil asetat-asam format

(35:15:1) dan diperoleh 16 fraksi, kemudian diuji aktivitas antibakteri terhadap 6

bakteri uji yaitu MSSA (ATCC 6538), MSSA 1, MRSA, B. subitilis, P. aeruginosa

dan E. coli. Fraksi 1 (Rf 0,12), 5 (Rf 0,48), 6 (Rf 0,51), 8 (Rf 0,57), 10 (Rf 0,66),

14 (Rf 0,86), dan 16 (Rf 0,96) memperlihatkan aktivitas antibakteri terhadap MSSA

(ATCC 6538) (KHM 256-512 μg/mL). Fraksi 8, 10, 12 (Rf 0,77), 13 (Rf 0,82), dan

16 menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap MSSA 1 (KHM 512 μg/mL). Fraksi

1, 5, 8, dan 9 (Rf 0,61) menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap B. subtilis (KHM

512 μg/mL). Fraksi 8 menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap E. coli (KHM 512

μg/mL). Seluruh fraksi tidak memiliki potensi antibakteri terhadap bakteri P.

aeruginosa. Fraksi 8 memberikan aktivitas tertinggi dibandingkan dengan fraksi

lainnya dan dinyatakan sebagai fraksi aktif dari daun binahong. Pemeriksaan profil

kromatografi dari fraksi aktif dengan fase diam silika gel GF254, fase gerak toluena-

aseton-asam format (11:16:0,2), serta penampak bercak Liebermann-Burchard

menunjukkan fraksi ini mengandung senyawa golongan triterpenoid.

Ekstrak etanol hasil ekstraksi cara I (EE1) berpengaruh terhadap peningkatan

aktivitas antibiotik pada beberapa bakteri uji yang ditunjukkan dengan efek sinergis

dan aditif dari kombinasi ekstrak dengan antibiotik. Kombinasi EE1 dengan

amoksisilin dan siprofloksasin memberikan efek yang sinergis terhadap

penghambatan pertumbuhan bakteri MSSA (ATCC 6538) dan MSSA 1. Hanya

kombinasi ekstrak etanol dengan amoksisilin yang memberikan efek sinergis

terhadap penghambatan pertumbuhan B. subtilis. Kombinasi tidak berefek terhadap

pertumbuhan E. coli kecuali kombinasi ekstrak etanol dengan siprofloksasin.

Kombinasi EE1 dengan seluruh antibiotik memberikan efek aditif terhadap

penghambatan pertumbuhan bakteri MRSA 23. Selain itu kombinasi EE1 dengan

tetrasiklin HCL memberikan efek aditif terhadap bakteri MSSA dan B. subtilis.

iv

Fraksi aktif daun binahong mampu meningkatkan aktivitas antibiotik terhadap

penghambatan beberapa bakteri uji yang ditunjukkan dengan efek sinergis atau

aditif. Efek kombinasi fraksi aktif dengan seluruh antibiotik memberikan efek yang

sinergis terhadap penghambatan pertumbuhan bakteri B. subtilis. Efek sinergis

terhadap penghambatan pertumbuhan MSSA (ATCC 6538) juga ditunjukkan ketika

fraksi aktif dikombinasikan dengan tetrasiklin HCl. Kombinasi tidak berefek

terhadap pertumbuhan E. coli kecuali kombinasi fraksi aktif dengan siprofloksasin.

Kombinasi fraksi aktif dengan amoksisilin memberikan efek aditif terhadap

penghambatan pertumbuhan MSSA.

Pengamatan SEM dilakukan terhadap sel bakteri MSSA (ATCC 6538) dan B.

subtilis yang terpapar EE1 (512 μg/mL), fraksi aktif (512 μg/mL), atau kombinasi

EE1 dengan antibiotik memberikan efek sinergis, dan hasilnya menunjukkan kedua

sel bakteri tersebut mengalami perubahan bentuk/morfologi pada dinding sel. Efek

sinergis ditunjukkan oleh kombinasi EE1 dengan antibiotik dimana sel bakteri yang

terpapar EE1 dengan konsentrasi ¼ KHM dan antibiotik dengan konsentrasi ≤ ¼

KHM juga mengalami perubahan bentuk/morfologi pada dinding sel. Berdasarkan

hasil pengamatan SEM diduga mekanisme kerja sampel uji terkait dengan

kemampuan menghambat biosintesis dinding sel bakteri. Hal ini didukung dengan

hasil pengamatan TEM yang menunjukkan bahwa dinding sel bakteri MSSA

(ATCC 6538) yang terpapar EE1 mengalami kebocoran sel (lisis). Lisis juga

tampak pada sel bakteri MSSA (ATCC 6538) yang terpapar EE1 dan amoksisilin.

Hasil uji toksisitas subkronis menunjukkan pemberian kombinasi EE1 865 mg/kg

bb dan amoksisilin 135 mg/kg bb pada tikus Wistar tidak menyebabkan kematian

serta perubahan perilaku dan aktivitas motorik. Terjadi peningkatan bobot badan

tikus selama pengujian, namun tidak terdapat perbedaan bermakna antara

peningkatan bobot badan tikus kelompok kombinasi dengan kelompok kontrol. Hal

ini menunjukkan bahwa pemberian kombinasi tidak menambah nafsu makan tikus.

Pemberian kombinasi tidak menyebabkan perubahan yang bermakna terhadap

karakteristik urin, hematologi, indeks organ, dan biokimia darah tikus, serta

mikroskopik pada organ jantung, hati, ginjal, kelenjar adrenal, limpa dan paru-paru

tikus.

Informasi yang dapat diberikan dari hasil penelitian ini adalah pemakaian antibiotik

jika digunakan bersamaan dengan seduhan daun binahong atau kapsulnya diduga

meningkatan efek dan tidak berbahaya berdasarkan hasil uji toksisitas.

Kata kunci: Anredera cordifolia, Binahong, antibakteri, antibiotik, efek

kombinasi, toksisitas.

v

ABSTRACT

ANTIBACTERIAL ACTIVITIES OF EXTRACT AND

ACTIVE FRACTION OF MADEIRA VEIN [Anredera cordifolia

(Ten.) v. Steenis] LEAVES AND ITS INFLUENCE ON SEVERAL

ANTIBIOTICS

By

Ni Putu Eka Leliqia

NIM: 30715003

(Doctoral Program in Pharmacy)

The use of antibiotics played an important role in the infectious diseases therapy.

However, uncontrolled long-term use or improper use of antibiotic led to bacterial

resistance. Therapeutic options for this case were extremely limited, as well the

prospect for next generation antibacterial drug development. Chemical compounds

from plant that had antibacterial activity became an alternative and a starting point

of new antibacterial inventions.

Ethanol leaves extract of madeira vine [Anredera cordifolia (Ten.) v. Steenis] was

proven to inhibit the growth of some Gram-positive and Gram-negative bacteria

such as Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Methicillin-Resistant Coagulase-Negative Staphylococcus, and

Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus (MSSA). Chemical compounds such

as tannin, saponin, alkaloid, triterpenoid, and flavonoid found in madeira vine leaves

were proven to have antibacterial activity. Moreover, safety study of ethanolic

leaves extract of madeira vine by acute and subchronic study revealed that madeira

vine leaves extract showed no toxicity and abnormality in rats.

One way to find active compounds from plants is by using bioassay-guided

fractionation method. By knowing the activity of a chemical compound group which

was contained in the fraction, a compound isolation could be conducted to obtain

a single active compound. Research on the active fraction of madeira vine leaves

which was responsible for antibacterial activity were not reported. However,

several studies of alleged compounds found in madeira vine leaves such as ursolic

acid had antibacterial activity.

The use of antibiotics combination which was given simultaneously had become a

therapeutic strategy. Clinical administration of antibacterial combination based on

in vitro test result which gave a synergistic effect in preventing the growth of

pathogen bacteria. Amoxicillin, tetracycline HCl, and ciprofloxacin were

antibiotics commonly prescribed to treat the infection and its combination with

several plants extract or chemical compounds showed a synergistic effect.

However, besides the potential benefit of a synergistic effect between antibacterial

vi

agents, there was also a risk of antagonistic effects due to the antibacterial agent

which might affect the activity of other agents.

This study aimed to examine the antibacterial activities of extract and fraction of

madeira vine leaves; to determine the effect of ethanol extract and active fraction

of madeira vine leaves towards amoxicillin, tetracycline HCl, and ciprofloxacin

activities; to determine working site of ethanol extract and active fraction of

madeira vine leaves on bacterial cell, also the effect of ethanol extract on antibiotic

activity based on scanning electron microscope (SEM) and transmission electron

microscope (TEM) observations; and to test the safety of ethanol extract of madeira

vine leaves with one of the antibiotics that gave synergistic effect by using

subchronic toxicity test.

Crude drug of madeira vine [Anredera cordifolia (Ten.) v. Steenis] leaves was

collected from Manoko-Lembang, West Java, Indonesia. The crude drug was

extracted using two methods. The first extraction method was performed by reflux

using 96% ethanol and obtained a thick extract (EE1). EE1 was added with hot

water then filtered while still hot. Filtrate was fractionated by liquid-liquid

extraction method using n-hexane and ethyl acetate, therefore obtained n-hexane,

ethyl acetate, and aqueous fractions. The second extraction method was conducted

by reflux using increasing polarity solvents such as n-hexane, ethyl acetate, and

ethanol 96%, consecutively. The n-hexane, ethyl acetate, and ethanol extract (EE2)

were obtained by this method. Extract with the best antibacterial activity was

fractionated by the preparative thin layer chromatography (TLC) method.

Phytochemical screening was performed on EE1 and its fractions as well as the

extract from the second extraction, followed by chromatographic profile

examination using ursolic acid, oleanolic acid, apigetrin, and rutin as marker

compounds. The madeira vine leaves extracts and fractions were tested for their

antibacterial activities using microdilution method against the growth of Gram-

positive bacteria i.e. MSSA (ATCC 6538), MSSA 1, MRSA (Methicillin-Resistant

Staphylococcus aureus) 23, B. cereus (ATCC 11778), B. subtilis (ATCC 6633), and

Gram-negative bacteria such P. aeruginosa (ATCC 9027), E. coli (ATCC 8939), E.

coli H7 (O156), and clinical isolate of Extended-Spectrum Beta-Lactamase-

Producing E. coli. Antibacterial activity was determined based on the minimum

inhibitory concentration (MIC) value. Study of the combination of ethanol leaves

extract of madeira vine or its active fraction with antibiotics (amoxicillin,

tetracycline HCl, and ciprofloxacin) were tested by using checkerboard method.

Combination effect was determined based on the fractional inhibitory

concentration index. The antibacterial working site of ethanol extract, active

fraction, and the combination of ethanol extract and antibiotic were observed by

SEM and TEM.

Combination of EE1 and amoxicillin was tested for its safety with subchronic

toxicity test in Wistar rats. There were 4 test groups in this test: control group

(CMC Na 0.3%), EE1 (865 mg/kg bw) and amoxicillin (135 mg/kg bw) combination

group (total dose of 1 g/kg bw), control satellite group, and satellite group of

combined drugs. Administration of test preparation in rats was done for 90 days.

On the 91st day, the urine characteristics, hematology, organ index, blood

biochemistry, and histopathology from the control group and combination groups

were observed. While the satellite group was allowed to stand for 30 days after the

vii

administration of the test preparation, and on the 120th day, satellite groups were

observed for its urine characteristics, hematology, organ index, blood

biochemistry, and histopathology. Data were analyzed by using one-way ANOVA-

LSD. The significance value was set on p<0.05.

Saponins were found in aqueous fraction and ethanol extract from both extraction

methods. Flavonoid and alkaloid were seen in most extracts and fractions, except

in n-hexane fraction and n-hexane extract. All extracts and fractions contained

steroid/triterpenoid. Thin layer chromatogram of madeira vine leaves extract and

fraction indicated the presence of ursolic acid and oleanolic acid in EEI, n-hexane

fraction and n-hexane extract. EE1, ethyl acetate fraction, aqueous fraction, and

ethyl acetate extract contained apigetrin and rutin, whereas EE2 only contained

apigetrin.

Ethanol extract, n-hexane fraction, and ethyl acetate fraction from the first method

extraction had antibacterial activity against MSSA (ATCC 6538), MRSA, B.

subtilis, and B. cereus (MIC 256-512 μg/mL). However, n-hexane and ethyl acetate

extracts from the second method extraction had better activities than extract and

fraction from the first method, which could inhibit the growth of Gram-positive and

Gram-negative bacteria, such as MSSA (ATCC 6538), MRSA, B. subtilis, P.

aeruginosa, and E. coli (MIC 256-512 μg/mL). The n-hexane extract from the

second method extraction had the highest antibacterial activity. Furthermore, the

n-hexane extract was fractionated by preparative TLC with silica gel GF254 as

stationary phase, toluene-ethyl acetate-formic acid (35:15:1) as mobile phase and

16 fractions were obtained, then their antibacterial activity was tested against 6

test bacteria, i.e MSSA (ATCC 6538), MSSA 1, MRSA, B. subitilis, P. aeruginosa,

and E. coli. Fraction 1 (Rf 0.12), 5 (Rf 0.48), 6 (Rf 0.51), 8 (Rf 0.57), 10 (Rf 0.66),

14 (Rf 0.86), and 16 (Rf 0.96) showed antibacterial activities against MSSA (ATCC

6538) (MIC 256-512 μg/mL). Fraction 8, 10, 12 (Rf 0.77), 13 (Rf 0.82), and 16

expressed antibacterial activities against MSSA 1 (MIC 256-512 μg/mL). Fraction

1, 5, 8, and 9 (Rf 0.61) presented antibacterial activities against B. subtilis (MIC

512 μg/mL). Fraction 8 showed antibacterial activity against E. coli (MIC 512

μg/mL). None of the fractions showed antibacterial potential against P. aeruginosa.

Fraction 8 exhibited the highest activity compared to the other fractions and was

proposed as the active fraction of madeira vine leaves. A chromatographic profile

examination of active fraction with silica gel GF254 as the stationary phase and

toluene-acetone-formic acid (11:16:0.2) as mobile phase followed by spraying with

Liebermann-Burchard reagent, showed that this fraction contained triterpenoid

compounds.

Ethanol extract from the first method extraction (EE1) increased the antibacterial

activity of the antibiotics in some of the bacteria test indicated by the synergistic

and additive effects when extracts and antibiotics combined. The combination of

EE1 with amoxicillin and ciprofloxacin had a synergistic effect on inhibition of

MSSA (ATCC 6538) and MSSA 1 growth. Only the combination of EE1 with

amoxicillin gave synergistic effect on B. subtilis growth inhibition. The combination

had no effect on E. coli growth, except the combination of EE1 and ciprofloxacin.

The combination of EE1 with all antibiotics gave an additive effect on MRSA 23

growth inhibition. In addition, a combination of EE1 with tetracycline HCl also had

an additive effect on MSSA and B. subtilis.

viii

The active fraction of madeira leaves increased antibiotics inhibition of several test

bacteria growth, indicated by its synergistic or additive effects. The combination of

the active fraction with all antibiotics had a synergistic effect on B. subtilis bacteria

growth inhibition. The synergistic effect on MSSA (ATCC 6538) growth inhibition

was also shown when the active fraction was combined with tetracycline HCl. The

combination had no effect on E. coli growth, except the active fraction with

ciprofloxacin combination. The combination of the active fraction with amoxicillin

showed an additive effect on MSSA growth inhibition.

Scanning electron microscope observation was done for MSSA (ATCC 6538) and

B. subtilis cells which were exposed by EE1, active fraction, or combination of EE1

and antibiotics that gave synergistic effect. The results showed both bacterial cells

undergo changes in shape or morphology of cell wall. The synergistic effect was

shown by the combination of EE1 and antibiotics. Bacterial cells experienced

morphological changes when exposed to ¼ MIC of EE1 and antibiotics with a

concentration of ≤ ¼ MIC. Based on the SEM observation, the mechanism of action

exerted by the test sample was suspected to be related to their ability to inhibit the

biosynthesis of the bacterial cell wall. This result is confirmed by TEM's

observations that EE1 caused cell wall damage, eventually caused leakage of the

cellular contents. The cell wall damage was also seen in MSSA cells (ATCC 6538)

that exposed to EE1 and amoxicillin.

Subchronic toxicity test results showed that combination of EE1 (865 mg/kg bw)

and amoxicillin (135 mg/kg bw) in Wistar rats did not induce mortality, behavioral

changes, and motoric activities. Although an increased in body weight during test

were observed on the combination group and the control group, no statistical

difference appeared between them. This suggested that giving the combination did

not increase the appetite of rats. The combination administration did not cause

significant changes in the urine characteristics, hematology, organ index, blood

biochemistry, as well as microscopy of the rats’ heart, liver, kidney, spleen, and

lung in rats.

In conclusion, the information learned based on the results of this study is the use

of antibiotics in conjunction with steeping madeira leaves or capsules is thought to

increase its efficacy and declared safe based on the results of toxicity tests.

Keywords: Anredera cordifolia, madeira vine, antibacterial, antibiotic,

combination effect, toxicity.