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Anais do XX Encontro de Iniciação Científica – ISSN 1982-0178 Anais do V Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação – ISSN 2237-0420
22 e 23 de setembro de 2015
AÇÃO DO LICOPENO EM RATOS PARCIALMENTE
HEPATECTOMIZADOS ANÁLISE HISTOLÓGICA HEPÁTICA
Maria Clara V. D. Bastos Prof. Dr. Pedro Paulo Barros Faculdade de Ciências Farmacêuticas Faculdade de Ciências Biológicas
Centro de Ciências da Vida Centro de Ciências da Vida
Resumo: Este trabalho teve como objetivo avaliar
in vivo a atividade hiperplásica hepática,
abordando aspectos relacionados com a
morfologia hepática após realização de
hepatectomia parcial frente ao tratamento prévio
com Licopeno. Foram utilizados 30 ratos albinos
da linhagem Wistar divididos em 2 grupos. Os 15
animais do Grupo Tratado receberam por via oral
doses diárias padronizadas de soluções oleosas
de Licopeno e outros 15 animais que constituíram
o Grupo Controle receberam por via oral doses
diárias padronizadas de óleo de oliva. Ao final de
cada período de tratamento, e após a
hepatectomia parcial, os animais foram
eutanasiados e imediatamente após, foi retirado
fragmento de tecido hepático. Lâminas
histológicas dos espécimes do tecido hepático
foram tratadas com Hematoxilina-Eosina e
Feulgen, as imagens foram capturadas
digitalmente e analisadas quantitativamente para
a determinação da proliferação celular.
Palavras - chave: Hepatectomia parcial,
Licopeno, ratos.
1. INTRODUÇÃO
O licopeno atualmente é tido como um dos
mais potentes antioxidantes, sendo sua utilização
sugerida na prevenção do câncer e da
aterogênese. É um dos 600 pigmentos
carotenoides encontrados na natureza e um dos
25 encontrados no plasma e tecidos humanos.
O licopeno é considerado um potente protetor da camada celular devido à reação com os radicais peróxidos e com o oxigênio molecular (Rao e Shen, 2002; Shami e Moreira, 2004). Testes in vitro e in vivo sugerem que os carotenoides são excelentes antioxidantes, sequestrando e inativando os radicais livres (Erdman Jr, 1999). É tido como o carotenoide que possui a maior capacidade sequestrante de radicais livres de oxigênio possivelmente devido à presença das
duas ligações duplas não conjugadas, o que lhe oferece maior reatividade (Di Mascio et al, 1989; Krinsky, 2001). O estudo da hiperplasia hepática utilizando
o método da hepatectomia parcial constituiu-se
num vasto campo para a investigação
laboratorial. Diversos são os fatores que
influenciam a hiperplasia hepática como a
espécie animal e linhagem utilizada e a idade dos
animais. A retirada de mais de 2/3 do fígado
acarreta uma tendência de aumento
compensatório do órgão, verificado pelo acumulo
de diversas substâncias.
A lesão do parênquima hepático induzida por
estímulos desencadeia o processo de reparação,
que começou ser elucidado com o advento da
Biologia Molecular, cujas técnicas permitem
maiores esclarecimentos dos eventos que
promovem e controlam a divisão celular.
Desta forma, podem ser utilizados nos
tecidos em proliferação os marcadores que se
incorporam ao DNA, anticorpos como o PC-10
que marca o antígeno nuclear de proliferação
celular (PCNA), o índice mitótico que quantifica as
figuras de mitose entre outros. As células de
Kupffer e as células endoteliais são importantes
na proliferação do parênquima hepático por
liberarem substancias como fatores de
crescimento (HGF, TGF-a, TGF-b, VEGF, TNF-a,
INF-g) e citocinas (IL-2, IL-4, IL-6 e IL-10) com
efeitos endócrinos, paracrinos e autocrinos que
induzem os hepatócitos à proliferação celular.
As primeiras horas após hepatectomia
parcial são importantes na recuperação do tecido
hepático, pois o órgão é vulnerável a substâncias
químicas que podem alterar a resposta
proliferativa. No entanto, diferentes métodos têm
sido usados para detectar proliferação celular em
vários tecidos, fornecendo informações
importantes a respeito do crescimento,
transformação e reparação teciduais.
(MACHADO; ROCHA, 2002)
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O modelo mais empregado até hoje no estudo
da regeneração hepática baseia-se em Higgins e
Anderson (1931), que após removerem 70% do
fígado de ratos Wistar, observaram que o órgão
voltava ao seu tamanho original no período de 14
a 21 dias. Após a hepatectomia parcial, os lobos
residuais cresciam rapidamente até que o volume
equivalesse ao de antes e, então, abruptamente,
o crescimento cessava.
Lima et al. (1993) fizeram uso de ratos que
foram submetidos a hepatectomia parcial
associada e não associada a vagotomia parcial.
Os níveis glicêmicos sistêmicos foram medidos
após 4, 24, 44 e 72 dias após cirurgia. Os autores
concluíram que a hepatectomia parcial, por si só,
reduz precocemente os níveis glicêmicos, a qual
permanece constante durante o jejum, não
dependendo, portanto da integridade do sistema
nervoso parassimpático [13].
Aznar e colaboradores (1991) estudaram a
influência do diabetes sobre a hiperplasia
hepática em ratos. Os autores observaram que
houve uma redução na população de hepatócitos
nos animais diabéticos quando comparados com
animais controle não diabéticos dezoito dias pós-
hepatectomia parcial. Os autores concluíram que
a diminuição da população de hepatócitos em
animais diabéticos se deve a redução de insulina
e glucagon, sugerindo que estes dois hormônios
estimulam a hepatogênese [14].
Silva, RL e colaboradores (2006) estudaram o
efeito do extrato aquoso da Sida cordifolia,
popularmente conhecida no Brasil como “malva-
branca” administrada oralmente nas doses diárias
de 0 (controle), 100, 200 e 400mg/kg de Sida em
animais parcialmente hepatectomizados. Vinte e
quatro horas após cirurgia os fígados foram
removidos e avaliados por imunohistoquimica
(PCNA) utilizando o anticorpo monoclonal PC-10.
Os autores concluíram que os animais tratados
com SIDA 100 e Sida 200 mostraram índices de
hiperplasia hepática superior ao grupo controle e
SIDA 400.
Oliveira, F. M. e colaboradores (2003)
propuseram um modelo de hepatectomia parcial
laparoscópica em ratos. Fazendo uso de material
cirúrgico semelhante ao usado em humanos, os
autores concluíram que o modelo é factível para o
treinamento e aprimoramento de novos
cirurgiões.
2. OBJETIVO
Analisar histológica e comparativamente as
amostras de tecidos hepáticos remanescentes
dos animais tratados com Licopeno e animais
controle, submetidos à hepatectomia parcial.
3. MÉTODO
3.1 Organização dos animais
Neste trabalho foram utilizados 30 ratos
albinos machos, da linhagem Wistar, não
isogênicos, fornecidos pós-desmame com 40 dias
de idade pelo Biotério do Campus II da PUC
Campinas.
Os animais foram alojados no Biotério
Experimental do Laboratório de Fisiologia e
Biofísica do Centro de Ciências da Vida, PUC-
Campinas, com capacidade máxima de
alojamento de 60 animais, com luz e ventilações
controladas, os quais receberam o fornecimento
de ração sólida Nuvilab e água sem restrição até
atingirem a idade de 50 dias.
Um grupo experimental denominado Grupo
Tratado (15 animais), foi dividido em 3 subgrupos
com 5 animais cada, e outro grupo experimental
denominado Grupo Controle (15 animais) foi
dividido em 3 subgrupos com 5 animais, assim
organizados em função do tempo de tratamento
pós-cirúrgico.
3.2 Tratamento pré – cirúrgico
Os animais dos grupos Controle e Tratado
foram alojados em gaiolas autoclaváveis com
forração de maravalha autoclavada e
fornecimento de ração sólida Nuvilab e água sem
restrição e permaneceram no Biotério
Experimental do Laboratório de Fisiologia e
Biofísica do Centro de Ciências da Vida, PUC-
Campinas, com luz e ventilações controladas.
O Grupo Tratado Licopeno (15 animais),
assim denominado, recebeu diariamente, durante
30 dias, antecedendo a realização da
hepatectomia parcial, uma dose diária de 40
mg/kg peso, contida em volume de 1ml para um
animal de 250 (±) 10 gramas de peso da
suspensão de fitoterápico Licopeno na
concentração de 0,5g/100ml por via oral
administrada com auxílio de tubo de polietileno
introduzido até o estomago (gavagem). O Grupo Controle (15 animais) recebeu
diariamente, durante 30 dias antecedendo a
realização da hepatectomia parcial, uma dose
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diária de 1 ml de óleo de oliva, por via oral
administrada pelo método de gavagem.
3.3 Cirurgias: Hepatectomia Parcial
Os animais foram submetidos à anestesia
geral com solução de Cloridrato de Xylasina
(Virbaxyl 2%®) + Ketamina (Francotar ®),
administrado por via intraperitoneal na dose de
1,5 ml/kg de peso corporal e posteriormente
foram colocados em placa de contenção. Ambos
os grupos, Controle e Tratado, foram submetidos
à hepatectomia parcial, conforme procedimentos
descritos por Higgins e Anderson (1931) [15].
Inicialmente, procedeu-se a depilação da
região abdominal ao longo da linha mediana e a
assepsia da região. Em seguida, procedeu-se
uma incisão ventral mediana de 3 a 4 cm, a partir
do apêndice xifoide do osso externo.
Por compressão da região abdominal
efetuou-se a extrusão dos lóbulos hepático
mediano e lateral esquerdo, permanecendo na
cavidade abdominal o lóbulo lateral direito e
pequeno caudado, lobos remanescentes.
Imediatamente após, procedeu-se o
ligamento dos lóbulos mediano e lateral
esquerdo, com fios de algodão. Em seguida,
procedeu-se a secção dos ligamentos
suspensores e extirpação dos lobos. Finalizado
estes procedimentos, realizou-se a sutura com
fios de algodão, da musculatura abdominal com
pontos contínuos e a da pele com pontos
separados.
3.4 Obtenção do Tecido Hepático
Apos 24, 36, e 48 horas dos procedimentos
cirúrgicos, duas horas antes da remoção dos
lóbulos remanescentes e eutanásia, foi aplicado
uma injeção intraperitoneal de Tecnocris®
(Sulfato de Vincristina) na dose de 1mg/Kg de
peso animais, uma vez que a cinética da
hiperplasia hepática é caracterizada com a
síntese de DNA e tem seu início cerca de 12 a 16
horas após a hepatectomia, sendo que seus
valores máximos obtidos em 24 a 36 horas após
a cirurgia. É seguida por uma onda de mitoses
que se inicia 22 a 24 horas após a cirurgia, sendo
que seus valores máximos obtidos em 33 a 34
horas após cirurgia. Ciclos adicionais de síntese
de DNA acontecem aos 5 a 10 dias
subsequentes. O processo hiperplásico se
completa em 7 a 14 dias.
Em seguida os animais foram submetidos à
anestesia geral por solução de Cloridrato de
Xylasina (Virbaxyl 2%®) + Ketamina (Francotar
®), administrado por via intraperitoneal na dose
de 1,5 ml/kg de peso corporal.
Confirmada a anestesia, os animais foram
colocados em placa de contenção na posição
decúbito dorsal e a região do abdômen próxima
ao tórax foi tricotomizada.
Em seguida, com o animal ainda sob efeito
anestésico, procedeu-se a abertura do tórax com
exposição ao tecido hepático remanescente, ao
ser removido foi realizada a coleta do material,
em seguida foi feita a fixação do material com
formol para que os tecidos não sofressem efeitos
de deterioração [21].
Após esse processo os animais foram
eutanasiados por aprofundamento de anestesia
com solução de Cloridrato de Xylasina (Virbaxyl
2%®) + Ketamina (Francotar ®).
3.5 Análise das Laminas Histológicas
Tendo em vista as atividades realizadas,
descritas anteriormente, pode-se verificar que
estas resultaram na obtenção de lâminas
histológicas, que foram confeccionada e coradas
de duas maneiras: Hematoxilina-Eosina e
Feulgen, o que nos possibilitou avaliar a atividade
hiperplásica do fígado após hepatectomia parcial.
Tal avaliação ocorreu através da contagem das
figuras de mitose e apoptose através de
microscopia com o aumento de 400x em que
foram contados 20 campos de cada lâmina e
esses resultados foram posteriormente
comparados entre o grupo Tratado e o Controle.
4. RESULTADOS E DISCUSSAO
Com a finalidade de obtermos uma avaliação
da regeneração hepática dos animais, utilizamos
como parâmetro de analise para o estudo dois
enfoques, o numero de mitoses e número de
apoptoses.
Para análise desses parâmetros foram
confeccionadas e coradas laminas histológicas
com fragmentos remanescentes do fígado dos
animais. A partir das laminas foram analisados
através de microscopia de luz 20 campos,
buscando a quantificação dos parâmetros
utilizados no estudo.
Ao termino da leitura dos grupos de animais
envolvidos, foi realizado uma comparação entre
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os parâmetros observados através do software
ANOVA, que cruzou os dados obtidos de todos os
grupos tratados e controle com o tempo de
tratamento (24, 36 e 48 horas), Com a análise
dos resultados obtidos, pode-se observar que
ocorreu um aumento do índice mitótico no grupo
tratado de 24 para 36 horas, e uma redução
significante deste índice de 36 para 48 horas.
Além disso, observa-se que o grupo tratado de 24
e 48 horas foram significantemente diferentes
entre si. No grupo controle, pode-se observar que
o índice mitótico não foi significantemente
diferentes entre os grupos de 24, 36 e 48 horas.
Comparando-se o grupo controle com o grupo
tratado observou-se que houve diferença
significante entre os animais do grupo controle 48
horas e os animais do grupo tratado 48 horas.
Com a análise dos resultados obtidos pode-se
observar o aumento significante de apoptoses
entre controle e tratado de 24 para 48 horas,
porem, não há significância estatística entre
grupos controle e tratados no mesmo período de
hepatectomia, ou seja, o grupo controle 24 não
tem diferença significativa quando comparado ao
tratado 24, o controle 36 não tem diferença com o
tratado 36 e o controle 48 não apresenta
diferenças significativas quando comparado ao
tratado 48 horas.
A pesquisa de Wardi e colaboradores (2001),
utilizando modelo de cirrose hepática em ratos
induzida por tiocetamida, verificaram resultados
compatíveis com o encontrado neste estudo, o
betacaroteno apresentou ação hepatoproterora,
porém o licopeno e o retinol palmitato não
apresentaram eficiência significativa. Bahcecioglu
e colaboradores (2010) verificaram que o licopeno
apresentou efeito preventivo no desenvolvimento
de esteatohepatite não alcoólica induzida por
dieta altamente lipídica, sendo que este efeito
pode ser explicado primariamente por suas
características antioxidantes. Bestas e
colaboradores (2008), avaliando a atividade
preventiva do licopeno e da vitamina E na
hepatotoxicidade induzida pelo halotano,
verificaram que somente o licopeno apresentou
significativa atividade hepatoprotetora. Porém,
nenhuma atividade na regeneracao hepática.
5. CONCLUSÃO
Com os resultados obtidos, concluiu-se que, o
tratamento realizado com Licopeno nos ratos
numa dose diária de 40mg/Kg, durante o período
de 30 dias, apesar de apresentar dados
significativos, não se pode afirmar que o licopeno
interferiu na evolução dos índices de mitoses e
apoptoses no período da pesquisa.
Acredita-se que com a utilização de doses
maiores, por outra via de administração ou até
mesmo por um período maior de tratamento,
haveria uma possível evolução destes
parâmetros.
6. AGRADECIMENTOS
Ao Fundo de Apoio à Iniciação Científica – FAPIC/ Reitoria, PUC Campinas e ao Prof. Dr. Pedro Paulo Barros.
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