Acu a Porinas

5/24/2018 Acu a Porinas

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AcuaporinasRelevancia fisiolgica y estructural comocanal doble de agua y iones

2013

CTEDRA DEL CURSO DE FISIOLOGA

HUMANA:

Jefe de Ctedra:

Mdico Neil Flores ValdezMdico Internista

Mdico Encargado del Seminario:

Mdico Mauricio Vsquez

Estudiante encargado:

Bruno lvaro Cruz Sosa


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ACUAPORINAS Relevancia Fisiolgica y Estructural

Bruno lvaro Cruz Sosa (2012-36788) 1

ContenidoEstructura, funcin y relevancia translacional de acuaporinas como canales dobles de agua y iones................ 2

1. Canales Inicos de acuaporinas .......... ........... .......... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ..... 3

1.1. Aquaporin-0, el canal MIP del cristalino ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ........... ..... 4

1.2. Nodulina 26 de la Soya .......... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... 7

1.3. Acuaporina 1 .................................................................................................................................. 8

1.4. Drosophila Big Brain .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ........... ... 9

1.5. Acuaporina 6 ................................................................................................................................ 10

2. Bases moleculares de los canales inicos Acuaporinas, compuertas y conductancia......................... 11

2.1. El Poro central inico ........... ........... .......... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... 11

2.2. Funcin del carboxilo terminal como dominio modulador: ........... .......... ........... .......... .......... ....... 13

2.3. El papel del bucle D como un dominio de compuerta ........... .......... ........... .......... .......... ........... ... 14

3. Papel fisiolgico de los canales inicos de acuaporinas...................................................................... 16

3.1. Papel inesperado de canales de acuaporinas .......... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ..... 16

3.2. Nuevas estrategias de investigacin ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ........... ........ 17

Aquaporin 2: Desde el descubrimiento de la estructura molecular ......... ........... .......... .......... ........... .......... ....... 20

y las implicaciones mdicas............................................................................................................................... 20

1. Introduccin: ......................................................................................................................................... 20

2. Descubrimiento de la AQP2, canal de agua regulado por vasopresina .......... ........... .......... .......... ....... 21

3. Acuaporina 2 humana:......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ........... ........ 23

4. Estructura y funcin de la AQP2 .......... ........... .......... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ... 24

5. Funcin fisiolgica de AQP2 en el cuerpo: .......... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ........... ........ 26

a) Localization of AQP2 in the body ......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ........... ........ 27

b) Un jugador clave en la concentracin de la orina .......... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ..... 28

c) Funcin de la AQP2 fuera del rin ........... .......... ........... .......... .......... ........... .......... .......... ........... ... 29

6. Regulacin de la AQP2 ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ..... 30

6.1. Sntesis de la Protena ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........ 31

6.2. Fosforilacin................................................................................................................................. 32

6.3. Complejo de la protena vinculante y el la translocacin ......... ........... .......... .......... ........... .......... 33

6.4. Endocitosis y degradacin .......... ........... .......... .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ... 35

6.5. La actividad del canal de cada molcula de AQP2 .......... .......... ........... .......... .......... ........... ........ 36

Las acuaporinas en el descubrimiento de frmacos y la farmacoterapia .......................................................... 37

1. Introduccin .......................................................................................................................................... 37

2. Acuaporinas como blanco de drogas en el Rin: .......... .......... ........... .......... ........... .......... .......... ....... 41

Conclusiones ..................................................................................................................................................... 43

Bibliografa ......................................................................................................................................................... 44


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Estructura, funcin y relevancia translacional de acuapor inas como canales

dob les de agua y iones

RESUMEN

Se ha asumido que las acuaporinas son selectivas solo para el agua, y

aquaglyceroporins son aceptadas como el transportador de agua y solutos pequeos

sin carga como el glicerol. Esta revisin presenta una vista ampliada de las

acuaporinas como canales con mecanismos ms complejos de regulacin y un

diverso repertorio de permeabilidad del sustrato que se aprecia inicialmente en el

pronto establecimiento del campo. Es probable que el papel de las acuaporinas como

canal dual de agua y canales inicos abiertos tenga relevancia fisiolgica ypotencialmente de traslacin, y se puede evaluar con herramientas moleculares y

farmacolgicas recin desarrollado.

Actividad de los canales inicos se ha demostrado para Acuaporinas -0, -1 y -6,

Drosphila Big Brain, y plant nodulina-26. Aunque el concepto de la funcin del canal

inico en las acuaporinas sigue siendo controversial, los avances de investigacin

estn comenzando a definir no slo la funcin de los canales inicos, sino tambin losmecanismos moleculares detallados que regulan y median las capacidades

multifuncionales. En cuanto a la importancia fisiolgica, la ventaja adaptativa de la

expresin de la actividad de los canales inicos en las acuaporinas, que implica la

conservacin de la secuencia de aminocidos de los dominios de compuerta del canal

inico, sugiere que proporcionan ms de agua o glicerol y transporte de solutos. Los

canales dobles de iones y agua son de inters para la comprensin de la modulacin

de los gradientes de fluidos transmembrana, la regulacin del volumen, y la posible

transduccin de seales en los tejidos que expresan clases de acuaporinas que

tienen la capacidad de doble funcin. Otras clases de acuaporinas se pueden

encontrar en el trabajo futuro para tener actividades de los canales inicos, en espera

de la identificacin de las posibles vas de sealizacin que podran regir la activacin.


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Opiniones sobre la investigacin de

acuaporinas tradicionalmente

comienzan con una simple clasificacin

binaria de las familias de los canales

en: acuaporinas y acuagliceroporinas.

Se supone que las acuaporinas son

selectivos para el agua sola, y

acuagliceroporinas se aceptan como

transportadores de una gama ms

amplia de otros solutos como glicerol.

Esta opinin ha sido til para la

elaboracin de las primeras etapas dela investigacin de acuaporinas, pero

una visin global de los progresos

recientes muestra que una amplia vista

de las acuaporinas es oportuna. La

perspectiva completa debe tener en

cuenta un mayor grado de complejidad

en los mecanismos de regulacin yms repertorio de permeabilidad del

sustrato en las clases de acuaporinas

que podra haber sido apreciados

durante el pronto establecimiento del

campo. En particular, el papel de las

acuaporinas como canales inicos

abiertos, adems de sus papeles como

canales de agua, es probable que

tenga relevancia fisiolgica y

potencialmente translacional. Aunque

el concepto de la funcin del canal de

iones en acuaporinas sigue siendo

controversial, los avances de

investigacin estn comenzando a

definir no slo la funcin de los canales

inicos, sino tambin los mecanismos

moleculares detallados que rigen y

median las capacidades

multifuncionales. Con respecto a la

relevancia fisiolgica, el beneficio de

adaptacin de la expresin de las

acuaporinas no es evidente en todos

los tipos de clulas, y sugiere que

proporcionan ms que el agua o eltransporte de glicerol solo. En los

tejidos que expresan clases de

acuaporinas que tienen canales dobles

de iones y de agua, modulacin de

gradientes transmembrana que podra

aumentar la funcin del canal de agua,

o como en el caso de la acuaporinarelacionada al canal de Drosophila Big

Brain podra ser la funcin principal, ya

que no hay actividad del canal de agua

osmtica es evidente en el canal de

tipo salvaje.

1. Canales Inicos de acuaporinas

Las acuaporinas (AQPs) forman

parte de una gran familia de

protenas principales intrnsecas,

MIP. Durante las ltimas dos

dcadas, la actividad del canal de


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iones se ha demostrado para varias

clases de MIP, aunque el papel

fisiolgico de los canales inicos de

acuaporina in vivo queda por

determinar. Los mecanismos de

activacin, los determinantes

moleculares de propiedades

funcionales y selectividad inica

difieren entre tipos de canales

inicos de acuaporinas,

argumentando en contra de

explicacin de los resultados comosimplemente un efecto genrico de

fugas debido a la presencia de la

protena exgena. Una combinacin

de electrofisiologa y mutagnesis ha

demostrado ser til en la definicin

de los dominios moleculares

implicados en la compuerta y lamodulacin de la actividad de canal

inico AQP, dentro del subconjunto

encontrado hasta ahora para tener la

capacidad de conductancia inica.

En AQP1, el poro central en el eje de

simetra se cuadriplica en el

tetrmero y se ha propuesto como la

va ms probable para la conduccin

de cationes. En contraste, los flujos

de agua son aceptados debido a que

estn mediados por poros separados

y distintos que se encuentran en

cada una de las subunidades del

tetrmero. En otras AQPs tales

como AQP6 y Drosophila Big Brain,

el posible papel de los poros dentro

de la subunidad como vas de

conductancia inica es consistente

con la idea de que un repertorio

diverso multifuncional se expresa a

travs de la familia de canales de

MIP (fig. 1).

1.1. Aquaporin-0, el canal MIP del

cristalino

AQP0 el principal componente

proteico de las uniones

aisladas del cristalino, cuando

se reconstituye en bicapas se

ha demostrado que tieneactividad de canal inico. Sin

embargo, otros grupos han

informado de la ausencia de un

cambio en la conductancia

inica con la expresin de MIP

lente en oocitos de Xenopus.

Los datos que apoyan la

actividad del canal de iones

han demostrado que la bovina

MIP26 tiene una conductancia

de 200 pS en vesculas

unilamelares con solucin


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salina 100 mM. El canal de

iones es sensible al voltaje y al

pH, abierto a pH cido y que

tiende a cerrar de forma

permanente a pH neutro a una

amplitud de corriente

comparable a la de bicapas de

control. MIP28 de los pollos

Figura 1. Diagrama que ilustra la organizacin estructural canal acuaporinas y las vas depenetracin. (A) topologa transmembrana de una subunidad acuaporina, con seis dominiostransmembrana (M1-6), los dominios amino y carboxilo terminales intracelulares, y dos buclesplegados (B y E) que cumplen dentro de la regin transmembrana del canal para crear el porodentro de la subunidad de cada unidad. (B) Dos modelos para la permeacin de iones. Los

iones pueden pasar a travs del poro central en el medio del tetrmero de subunidades (comose ha demostrado para Aquaporin-1, AQP1), o podran travs de las vas de poro dentro de lasubunidad individuales de canales de acuaporina (como ha sido propuesto para Drosophilagrande del cerebro, BIB y otros). El flujo de agua en AQP1 primaria est mediada por losporos dentro de la subunidad. BIB no tiene permeabilidad al agua osmtica apreciable.

MIP28 tiene un solo canal de

conductancia de aprox. 230 pS

en 150 mM de KCl. La

evidencia en contra de la

actividad del canal de iones +

vino a partir de estudios de

impedancia utilizados para

determinar las conductancias

de la membrana de la fibra del

cristalino, la comparacin de

clulas de tipo salvaje y una

cepa de ratn mutante

heterocigtico (CatFr) que ha

reducido la translocacin del

canal MIP a la membrana; la

conductancia acoplamiento fue

ligeramente menos en la lente

mutante heterocigtico (n = 2)


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en comparacin con el tipo

salvaje (n = 1), pero las

diferencias no fueron

estadsticamente significativas.

Este hallazgo podra desafiar a

los datos de los ensayos de

bicapa; alternativamente, la

falta de una diferencia podra

ser los bajos valores de n

utilizados, el hecho de que el

mutante heterocigoto todava

tena algo de expresin de MIPen la membrana, aunque a un

nivel reducido, o la posibilidad

de que los iones la actividad

del canal de AQP0 est

regulada y la supuesta

actividad de canal inico puede

ser ms evidente encondiciones distintas de las

utilizadas en la colagenasa

preparacin de clulas

disociadas de cristalino de

conejo. El mutante homocigoto

CatFr muestra la formacin de

cataratas de diagnstico,

mientras que el heterocigoto

utilizado para las medidas de

conductancia es normal en

apariencia. La observacin por

Varadaraj y colegas que en el

heterocigoto CatFr la

permeabilidad al agua de la

fibra del cristalino reduce

significativamente y no justifica

el supuesto de que la

conductancia inica debera ser

reducida, ya que las

mutaciones del canal de

acuaporina pueden afectar

diferencialmente flujos inicos

o agua (como se discute a

continuacin para AQP1). Elnico canal de la permeabilidad

al agua de AQP0 es de

aproximadamente l/40th que de

AQP1. Reglamento por el pH

que oscila 7.5 a 6.5 est

mediado por una histidina en el

bucle extracelular. Una funcinpropuesta para MIP en

cristalino est en la regulacin

del volumen, la prevencin de

la acumulacin de lquido

extracelular a travs de la

captacin de agua en el

cristalino rica en citoplasma

clula fibrosa, lo que minimiza

el espacio extracelular para

mejorar las propiedades de

transmisin de luz.


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1.2. Nodulina 26 de la Soya

El MIP de la soya, nodulina

(nod26), reconstituido en

bicapas es un canal sensible al

voltaje con una gran

conductancia de un solo canal

y selectividad dbil de aniones.

En el dominio carboxilo

terminal, servicio 262 de

nodulin 26 se fosforila por la

calmodulina con su dominiopreoteinquinasa, lo que

aumenta la compuerta

dependiente de voltaje y la

ocupacin preferencial de

estados subconductancia.

Nod26 es el principal

componente de protena de

membrana en ndulos de las

races que encierran

bacteroides fijadoras de

nitrgeno simbiticas. Cuando

se reconstituye en

proteoliposomas, nod26 facilita

el transporte de amonio

mercurio sensible, lo quesugiere un papel importante en

el transporte de nitrgeno fijo

del simbiosoma.


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Figura 2. Activaci Reversible de los canales de Drosophila Big Brain acuaporinas expresados enoocitos de Xenopus. (A) la activacin reversible de la (BIB) la conductancia inica medida por doselectrodos de tensin abrazadera de un oocito que expresa hemaglutinina (HA) eptopo de etiquetadocanales BIB. (B) de imgenes confocal con anti-HA anticuerpo etiquetado de la protena BIB, que

muestra la expresin en las membranas de plasma de ovocitos de Xenopus para los canales de tiposalvaje y para un no-inico mutante (glutamato a la asparagina 71) que ejerce un efecto negativodominante sobre la actividad de la conductancia inica .

1.3. Acuaporina 1

AQP1 del humano es un canal

de agua y funciona como un

canal monovalente no selectivo

de cationes cuando es activado

por GMPc intracelular, con unagran conductancia del canal

nico de aproximadamente 150

pS en condiciones salinas

fisiolgicas normales y los

estados subconductancia

aparentemente ms pequeas

cuando se reconstituye en

bicapas lipdicas. El tipo salvaje

AQP1 la conductancia de iones

lleva cationes monovalentes(K+ Cs+ > Na+>

tetraetilamonio+), pero no

aniones, protones, o los

cationes divalentes Ca2+o Mg2+


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como se determina a partir de

los potenciales de inversin

medidos en los experimentos

de sustitucin de iones (Yool et

al., 1996). El poro central AQP1

est revestida por los residuos

de barrera hidrfobiica (valina

50, y leucinas 54, 170, y 174;

humana AQP1) ubicados en los

dominios segundo y quinto

transmembrana, M2 y M5. La

sustitucin de todos los cuatroresiduos de barrera por alanina

aumenta la permeabilidad

relativa de tetraetilamonio, una

gran catin monovalente que

bloquea los poros de agua

monomricos pero lleva una

corriente inica a travs delgran poro del canal activado

por GMPc. La sustitucin de

cistena por lys 51 en el

dominio del poro central en una

cistena con menor fondo de

AQP1 crea un nuevo sitio para

la inhibicin de la conductancia

inica por el mercurio,

indicando que el poro central

es la va de conduccin de

iones. AQP1 mediada por

conductancia catinica ha sido

implicado en influir en las tasas

de transporte de fluido neto en

cultivos primarios de plexo

coroideo. El punto principal de

la incertidumbre en el campo

es la variabilidad en la amplitud

de la respuesta entre diferentes

modelos experimentales. A la

luz de los recientes hallazgos,

parece probable que las

diferencias entre los

preparados resultan de lasdiferencias en las vas de

regulacin intracelular de AQP1

que regulan la disponibilidad de

canales inicos. La fosforilacin

de la tirosina Y253 en el

dominio carboxilo terminal,

confirmado por Western Blot,podra ser uno de los

interruptores master en la

capacidad de respuesta de

AQP1 canales inicos con

cGMP. Treonina y la actividad

serina quinasa tambin regula

AQP1 actividad de canal inico

(Zhang et al., 2007).

1.4. Drosophila Big Brain

Drosophila grande del cerebro

(BIB) expresado en ovocitos es


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un canal de catin monovalente

reversible activada por la

sealizacin de la tirosina

quinasa (Fig. 2), sin ninguna

actividad de canal de agua

apreciable. Las mutaciones de

prdida de funcin de BIB

resulta un exceso de los

precursores neuronales en el

sistema nervioso embrionario y

una reduccin en el nmero de

clulas de la epidermis,clasificndolo como uno de los

genes neurognicos, adems

de Notch y Delta y otros. Sin

embargo, su mecanismo de

accin en la determinacin del

destino de la clula sigue

siendo desconocido. BIB sesugiri a ser una protena de

canal que participa en la seal

de inhibicin lateral controlar el

destino de las clulas

precursoras, y tambin ha sido

propuesto para desempear un

papel estructural en la

agregacin de clulas sobre la

base de ensayos de BIB

transfectadas clulas L.

Yanochko y sus colegas

mostraron que el canal BIB

expresa en ovocitos media una

monovalente conductancia de

canal catinico no selectivo que

es modulada por agentes

farmacolgicos que alteran

endgenos tirosina quinasa

vas de sealizacin en los

ovocitos, y la protena BIB

analizada por Western Blot

muestra la fosforilacin de

tirosina en el dominio carboxilo

terminal. Despolarizacin demembrana en teora, podra

estar implicado en la funcin

neurognica de BIB en el

desarrollo temprano.

1.5. Acuaporina 6

AQP6 de mamfero expresadoen ovocitos muestra una

conductancia de un solo canal

intermedio (49 pS en 100 mM

de NaCl) inducida por el

tratamiento con 10 mM de

HgCl2. AQP6 en ratas se

encuentra en vesculas

intracelulares en epitelios

renales. Al tener pH cido

(


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incrementa. Mutacin dirigida al

sitio de lys 72 a Glu en el lado

interno del poro dentro de la

subunidad alter la selectividad

del catin a anin sin perjudicar

la activacin pH dependiente.

La alta permeabilidad al nitrato

se redujo por mutacin dirigida

al sitio de revestimiento del

revestimiento de Thr a Ile 63.

La permeabilidad del anin de

AQP6 fue eliminado por lamutacin de asn 60 a Gly (que

se encuentra en el punto de la

segunda y quinta dominios

transmembrana M2 y M5

cruzado), mientras que se

increment la pemeabilidad

basal al agua osmtica. Elgrupo de investigacin que

presenta AQP6 como un canal

de iones ha desestimado las

conductancias inicas de AQP1

como raro y aberrante. Sin

embargo, es interesante

observar que las similitudes en

los niveles relativos de agua y

actividades del canal de iones

entre AQP1-y AQP6 expresado

en ovocitos, as como

propiedades similares de

corrientes inicas medidas por

fijacin de voltaje, tales como la

amplitud de corriente, la

cintica y baja sensibilidad a la

tensin , y la importancia del

bucle B, M2 y M5 estructuras

para la funcin del canal de

iones, todos sugieren que un

tema comn se extiende a

travs de mltiples clases de

canales inicos AQP. Otros

acuaporinas adems losresumidos anteriormente

pueden ser encontrados en el

trabajo futuro para tener

actividades de los canales

inicos, en espera de la

identificacin de las posibles

vas de sealizacin quepodran regir la activacin.

2. Bases mo leculares de los

canales inicos Acuapor inas,

compu er tas y conductanc ia

2.1. El Poro central inico

El poro central podra no ser

la nica va permeable a iones

para las clases de

acuaporinas conductoras de

iones AQP (Fig. 1). Por


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ejemplo, en AQP6, residuos

de aminocidos que afectan a

las propiedades de los

canales inicos mutados se

encuentran en el bucle B, un

enlazador intracelular entre el

segundo y tercer dominio

transmembrana M2 y M3. El

bucle B forma parte de la

mitad intracelular del poro

dentro de la subunidad que se

asocia tpicamente con lafuncin de canal de agua en

otros AQPs. Por lo tanto, los

poros dentro de la subunidad

podran ser las vas de

conduccin inica en AQP6,

en contraste con el modelo de

poro central propuesto paraAQP1. Del mismo modo, la

gran conductancia inica

mediadas por BIB se ve

afectada por la mutacin de

un residuo conservado Glu 71

en el primer dominio

transmembrana M1, que es

un sitio que sobre la base de

estructuras cristalinas de otras

AQPs es ms probable que

afecte el poro dentro de la

subunidad que al poro central.

La mutacin de glu 71 al asn

(E71N) en BIB la funcin del

canal inico se suprime,

mientras que la mutacin

equivalente en AQP1 E17N

no impeda que la actividad

del canal inico, pero bloque

l funcin de AQP1 como canal

de agua. La magnitud del

efecto de cada del BIB

correlacionado con la relacin

de mutante de ARNc tiposalvaje se inyecta en los

ovocitos de Xenopus. La

coexpresin de AQP1 tipo

salvaje y E17N disminuy

significativamente la

permeabilidad al agua

osmtica, en comparacin conAQP1 tipo salvaje, sin crear

un efecto negativo dominante

en la funcin del canal de

agua de la AQP1. La

sensibilidad diferencial de BIB

y AQP1 a la mutacin de la

glutamato M1 sugiere que las

vas de permeacin de iones

podran implicar el poro

central o los poros dentro de

la subunidad, en funcin del

tipo de canal.


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2.2. Funcin del carboxilo

terminal como dominio

modulador:

El dominio carboxilo terminal

se ha sugerido para modular

la actividad del canal de iones

de acuaporina en AQP1 y

BIB. En AQP1, un patrn de

aminocidos en el dominio

carboxilo terminal parece

imitar algunos residuos claveque se han asociado con

selectividad de unin GMPc a

las cGMP fosfodiesterasas. La

Mutagnesis dirigida al sitio

de estos residuos en AQP1

disminuy la magnitud de la

conductancia inica activadapor GMPc. La fosforilacin de

una tirosina carboxilo terminal

(Tyr 253, humana AQP1)

mejora la disponibilidad de

AQP1 a ser cerrada como

canales inicos en respuesta

a cGMP. Los agentes

farmacolgicos que inducen la

desfosforilacin de tirosina

previenen la activacin de los

canales, mientras que los

agentes que aumentan el

estado fosforilado de tirosina

promueven a la activacin de

los canales. La mutacin del

sitio de fosforilacin de la

tirosina a cistena (Y253C)

impidi la activacin de

canales de iones, pero la

adicin covalente de un

agente alquilotiosulfonado

cargado negativamente (de

sodio (2-sulfonatoethyl)

methanotiosulfonado;(MTSES) para el lado

intracelular de AQP1 Y253C

rescat la respuesta de

conductancia de GMPc-

activado. El efecto MTSES se

invirti por el agente reductor

ditiotreitol. Estos resultadosapoyan la propuesta de que la

fosforilacin de la tirosina

Y253 en el dominio carboxilo

terminal, confirmado por

Western blot, acta como un

interruptor principal que regula

la capacidad de respuesta de

canales inicos de AQP1 de

cGMP. La fosforilacin de la

tirosina de BIB en el dominio

carboxilo terminal por el

contrario se ha demostrado


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que modulan negativamente

la actividad del canal de

iones, lo que resulta en una

disminucin de la amplitud de

la conductancia inica

activada en canales BIB

expresados en oocitos de

Xenopus.

2.3. El papel del bucle D como

un dominio de compuerta

El bucle D entre el cuarto y el

quinto dominio

transmembrana M4 y M5 se

ha relacionado con la

compuerta inica de

conductancia en AQP1. El

bucle equivalente en AQPs deplantas es esencial para la

actividad de canal de agua de

puerta en respuesta a factores

de estrs ambienta. El bucle

D, en la rata AQP4 se ha

propuesto como objetivo para

la regulacin de la actividad

del canal de agua por la

fosforilacin de la Ser 180. La

alineacin de la secuencia de

aminocidos de las regiones

del bucle D de los canales de

iones, conocidos acuaporina

AQPS 0, 1, 6, BIB y nodulina,

muestran el dominio est

altamente conservada para

una clase dada de canales

expresadas en diversas

especies, pero la patrones

dentro de cada una de las

diferentes clases de

acuaporina son nica y

distintiva de los de otras

clases de canales de AQP(Fig. 3). El alto grado de

conservacin de secuencias

de aminocidos en los

dominios de bucle D en una

clase de canales a partir de

una variedad de organismos

implica una ventaja adaptativaes conferida por la regin del

bucle D que implica papeles

funcionales especficos de la

clase. El Buce D ha sido

implicado en acuaporinas

vegetales y animales como

importante en la compuerta de

funciones de canal por varios

factores tales como la unin

de ligandos intracelulares,

fosforilacin, y el pH. En

AQP1, las mutaciones en


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3. Papel fisiolgico de los canales

inicos de acuapor inas

3.1. Papel inesperado de

canales de acuaporinas

AQP1 se expresa en el

epitelio de barrera en la que

es esencial el mantenimiento

del equilibrio homeosttico del

fluido, y su papel en facilitar el

flujo de agua en estos tejidos

es evidente. En el plexo

coroideo en los ventrculoscerebrales, AQP1 permite la

produccin de lquido

cefalorraqudeo. En el tbulo

proximal renal y la rama

descendente delgada del asa

de Henle, AQP1 permite la

reabsorcin de lquidos. En el

ojo, la expresin de AQP1 en

epitelio ciliar es importante

para la produccin de humor

acuoso, y su expresin en el


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diferencial de iones y las

actividades de los canales de

agua de AQPs estn

comenzando a emerger de los

proyectos en curso de

descubrimiento de frmacos y

de los anlisis moleculares de

compuert y dominios

reguladores. Por ejemplo, con

la informacin ahora

disponible, es posible en

cultivos de clulas paraevaluar el papel de la

actividad de canal inico

mediada por AQP1 sin la

actividad del canal de agua,

mediante la transfeccin de

clulas con un constructo

mutante de AQP1 en glu17,en la que se sustituye con asn

(E17N, humana AQP1 ). Con

esta construccin, la

respuesta de conductancia

inica GMPc inducida

permanece intacta, pero

AQP1 ya no muestra ninguna


osmtica apreciable. A la

inversa, para evaluar el papel

de AQP1 flujos de agua y sin

la capacidad para la

activacin de cGMP de la

conductancia catinica, una

estrategia sera para

transfectar clulas con el

constructo mutante AQP1

doble en la que arg 159 y arg

160 estn sustituidos con

alaninas (R159A, R160A;

AQP1 humana), una

construccin en el canal de

agua, pero la actividad de

canal inico no permaneceintacto. Para estos enfoques,

las clulas elegidas para la

transfeccin,

presumiblemente, deben estar

libres, ya que ninguno de los

mutantes deficientes

funcionalmente selectivosdescritos anteriormente ejerce

un efecto negativo dominante.

En una condicin dominante

negativo, la expresin del

mutante no funcional tambin

podra disminuir la actividad

de la de tipo salvaje debido a

la co-ensamblaje de las

subunidades en el multmero

canal. Ser valioso en los

estudios en curso para

continuar a la pantalla nuevas


20/45



construcciones de mutantes

de una capacidad para reducir

o eliminar ya sea agua o

actividad de los canales de

iones a travs de una accin

negativa dominante, lo que

podra abrir posibilidades para

evaluar las contribuciones

diferenciales de agua y las

actividades de los canales

inicos en clulas que

expresan de AQP1 tiposalvaje. El mecanismo

dominante negativo es un

fenmeno que se ha utilizado

con ventaja por ejemplo en los

estudios de las funciones

fisiolgicas de los canales

dependientes de voltaje ypara la definicin de las

etiologas de enfermedades

heredadas ion canalopatas.

La identificacin de un grupo

diverso de bloqueadores

farmacolgicos selectivos de

canales de AQP podra

realizarse en la prxima

dcada. Mientras Cd2+ha sido

til como una herramienta

experimental para el bloqueo

de AQP1 canales inicos (sin

afectar a los canales de agua

paralelos), problemas con la

toxicidad, as como una falta

de especificidad para los

canales de AQP limitar su

valor como una sonda para

contribuciones fisiolgicas de

AQP1 canales inicos in vivo.

Los datos preliminares de una

biblioteca de derivados de

bumetanida sintticos que se

ha encontrado para mostraractividad farmacolgica AQP

ofrece promesa de que al

menos uno de los agentes es

un bloqueador eficaz de la

GMPc dependiente de

conductancia inica de AQP1

a concentracin micromolar ,y no tiene ningn efecto sobre

la actividad del canal de agua

AQP1 a dosis de hasta 100

micromolar (Yool y Campbell,

datos no publicados). Otros

agentes arilsulfonamida estn

desarrollando mantenga

independientemente promesa

para la creacin de una matriz

de compuestos de bloqueo

para AQPs. Un bloqueador

selectivo agudo de la


21/45



conductancia inica ser una

herramienta de gran alcance

para hacer frente a la

relevancia de traslacin del

doble de agua y la funcin del

canal de iones de AQP1. Una

vez que el papel funcional de

las vas duales se entiende,

es concebible que los AQP1

selectivos bloqueadores de

los canales de iones podran

tener aplicacionesteraputicas en medicina que

nunca han sido previstos

cuando se ve como AQP1''

nada ms que un canal de

agua''. Exploraciones

similares de las capacidades

multifuncionales de otros

acuaporinas multifuncionales

ofrecen emocionantes retos y

oportunidades para la

investigacin y los avances de

la traduccin.

Aquaporin 2: Desde el descubrimiento de la estructura molecular

y las implicaciones mdicas

1. Introduccin:

Acuaporinas 2 (AQP2) es un canal

de agua regulado por vasopresina

que determina la permeabilidad al

agua del conducto colector del

rin. En los animales terrestres,

incluidos los seres humanos, laprevencin de la prdida de agua

es obligatoria para la supervivencia

en condiciones secas del medio.

Para reducir al mnimo la prdida

de agua a travs de la orina, laorina debe ser altamente

concentrado; un ejemplo tpico es

que un roedor desierto concentra la

orina tan alto como 5.000 mOsm /

kg H2O. En consecuencia, los

mecanismos de concentracin de

la orina haban despertado el

inters de los investigadores y se

han realizado muchos estudios.

Smith y colaboradores propusieron

que la vasopresina reduce el flujo


22/45



de la orina mediante el aumento de

la permeabilidad de la nefrona

distal al agua, estimulando as la

reabsorcin de agua desde el

lumen hacia el intersticio, lo que

resulta en una mayor concentracin

de la orina. En la dcada de 1960,

sobre la base de estudios sobre la

piel de anfibios y vejiga urinaria

sapo (tejidos modelo de nefronas

renales distales), el concepto de

canales de agua de la regulacinpor vasopresina fue ampliamente

aceptada. Estudios posteriores de

congelacin utilizando microscopa

electrnica indicaron la presencia

de partculas intramembrana

(presumiblemente protenas de los

canales de agua) en la membranaapical de la vejiga urinaria de sapo

y demostraron que estas partculas

de agregado de respuesta a la

vasopresina.

2. Descubrimiento de la AQP2,

canal de agua regulado porvasopresina

Para identificar las molculas de

agua de los canales, estudios

bioqumicos tales como

marcadores de la porcin exterior

de protenas de la membrana con

reactivos especficos. Y una

estrategia de clonacin con

ovocitos de expresin heterloga

fueron empleados. Sin embargo, la

verdadera identificacin molecular

no se produjo hasta el

descubrimiento casual de una

molcula de canal de agua de los

glbulos rojas de la sangre.

Durante los estudios de protenas

de la membrana en las clulasrojas de la sangre, que reconocen

la presencia de gran cantidad de

una protena de 28 kDa de funcin

desconocida. Purificacin y

secuenciacin de aminocidos

parcial condujo al aislamiento de un

ADNc para una protena integral demembrana de 28 kDa, que. La

aparicin de la permeabilidad al

agua en oocitos inyectados con

ARNm in vitro con transcripcin de

CHIP28 era el momento en que se

produjo la identificacin molecular

de un canal de agua. Con base en

esta clonacin y el hecho de que

CHIP28 no est presente conducto

colector del rin, se inici una

bsqueda de homlogos de

CHIP28 utilizando una estrategia


23/45



de clonacin basada en PCR

aplicado a mdula renal ARNm. El

estudio dio como resultado con

xito en el aislamiento de un

ensayo funcional de ADNc y

posteriormente la versin completa

en los ovocitos dentro de 5 meses,

la confirmacin de su localizacin

inmunohistoqumica con

anticuerpos generados

recientemente en otros 4 meses, y

la publicacin final dentro de 1 aoen febrero de 1993 (fig. 4) Este

canal de agua recientemente

identificado es 42% idntica en la

secuencia de aminocidos a

CHIP28, localizada exclusivamente

en la regin apical y subapical de

los conductos colectores del rin,y fue nombrado WCH-CD (canal de

agua del conducto colector). Ms

tarde, un nuevo nombre

sistemtico, acuaporina 2 (AQP2)

fue asignado a este canal del rin

de reabsorcin de agua del

conducto y el nombre AQP1 fue

asignado a CHIP28 (Agre et al,

1993.). Curiosamente, al mismo

tiempo, otros dos clones fueron

aislados en nuestro laboratorio, uno

es un canal de agua expresado en

la membrana basolateral de

conducto colector y se llama AQP3.

Y el otro es un canal de cloruro

expresado en la rama ascendente

delgada del asa de Henle y se

nombra CLC-K1. Tanto ms tarde,

se mostr a ser crticamente

involucradas en la concentracin

de la orina. Por lo tanto, la mdula

renal era como una isla del tesoro

para la clonacin de molculas que

contribuyen a la concentracin dela orina. Fue fortuna que nos

aislamos AQP2 primera que AQP3.

En el momento que AQP2 se clon,

se demostr que la regulacin de

AQP2 por vasopresina era escasa.

Estudios posteriores de muchos

investigadores como nos lodemostraron. Tras la estimulacin

vasopresina, el trfico de AQP2 a

la membrana apical de las

vesculas intracelulares de

almacenamiento se demostr con

la microscopa inmunoelectrnica..

Ms importante an, la

acumulacin de AQP2 marcada en

partculas intramembranosas se

demostr en congelacin rplicas

de clulas LLC-PK1 AQP2-

experssing (Sun et al., 2002). Se


24/45



cree que tal estructura de las

partculas para representar

molculas canal de agua

vasopresina regulados en vejiga

urinaria de sapo, rin de roedores

y conducto colector. Por lo tanto,

AQP2 se ha demostrado que es un

canal de agua de la regulacin de

vasopresina.

3. Acuaporina 2 humana:

Implicaciones clnicas futuras y las

aplicaciones requieren clonacin de

AQP2 humana. Poco despus de la

clonacin de AQP2 ADNc de rata

como se describe anteriormente,

comenzamos el aislamiento de un

homlogo humano de AQP2. El

ADNc aislado codifica una protenade 271 amino cidos con un 91%

de identidad a la rata AQP2 que se

localiza en clulas de los conductos

colectores humanos. El gen que

codifica AQP2 humana (NCBI

Gene ID: 359) tambin fue aislado,

y su organizacin estructural y la

localizacin cromosmica se

analizaron. El gen AQP2 es una

parte relativamente pequea de

genes que se distribuye ms de 5

kilobases (kbs) y compuesto por

cuatro exones. Su localizacin

cromosmica se mapea en el

cromosoma 12q13 donde otros

AQPs (AQP0, 5, 6) estn

estrechamente colocalizados. Si

AQP2 es el canal de agua de la

regulada por vasopresina de los

conductos colectores, se puede

esperar que las mutaciones en el

gen AQP2 causaran una

enfermedad hereditaria humana, ladiabetes inspida nefrognica

(NDI), en la que los pacientes no

pueden concentrar la orina,

encontraron un heterocigoto

compuesto de dos mutaciones en

el gen AQP2 de un paciente

masculino NDI, confirmando queAQP2 es el canal de agua regulada

por vasopresina. Ms importante

an, esto proporcion la primera

evidencia directa de que la protena

AQP hecho funciona como canal

de agua en los organismos vivos.

Desde este informe, ms de 43

mutaciones se han reportado para

ambas formas recesivas y

dominantes de NDI. El hecho de

que AQP2, AQP5 y AQP6 clster

en un rango muy estrecho (27 kb)


25/45



del cromosoma 12q13 (Ma et al.,

1997) es digno de mencin y una

gran delecin de un segmento de

este gen predice sntomas de la

enfermedad adicionales que no

sean simples NDI. Estos pacientes

no se han reportado, pero debemos

tener cuidado de no pasar por alto.

4. Estructura y funcin de la AQP2

La protena MIP de la membrana

del cristalino, que ahora se conocecomo AQP0, es el miembro de la

familia AQP canal prototpico, y su

topologa de la membrana abarca g

dominios transmembrana de alfa-

hlices conectados por cinco

bucles. La misma topologa se

confirm para AQP1 por estudios

bioqumicos, inmunomarcacin y

funcional, que conduce a la

estructura de modelo de reloj de

arena de las protenas AQP en el

que bucle citoplsmico B y bucle

Fig 4. El aumento dpermeabilidad al aosmtica de HBB(AQP2) ARN inyectovocitos de Xenop

Tiempo dependienteaumento de volumenlos ovocitos inyectacon ARN WCH-CDagua (control) monitorizada intervalos de 20 stambin se examinalos efectos de HgCl2Microfotografas rede ovocitos examinaen el orden de izquiea derecha y de arribabajo (b) adaptado


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extracelular E se proyecta de

nuevo en la bicapa de la membrana

y se conectan entre s para formar

una nica va acuosa estrecha a

travs de cada molcula de AQP.

Anlisis de la estructura de cristal

posterior mostr claramente que

AQP1 forma una estructura

tetramrica, y cada molcula tiene

un poro de transporte de agua

central en el que la secuencia Asn-

Pro-Ala (NPA) residen cerca de laparte ms estrecha del poro, una

observacin que confirma

bsicamente el modelo de reloj de

arena. AQP2 es la protena de 29-

kDa, con mayor masa molecular

adicional en 35-50 kDa que

corresponde a N-glicosilada en laasparagina 124. Nuestro estudio en

el sistema de expresin de oocitos

indic que la misma topologa de

membrana y regiones de mercurio

sensibles se conservan en AQP2

como en AQP1, pero mostr que el

relativamente hidrfilos (bucles C y

D) participan en la formacin del

poro acuoso, un hallazgo que es

diferente del modelo de reloj de

arena en el que los bucles B y E

son importantes. Se realiz el

aislamiento a gran escala de la

protena recombinante humana

AQP2, y la estructura de homo-

tetramrica de AQP2, al igual que

otros AQPs, se confirm. Un

estudio adicional utilizando la

misma estrategia de expresin dio

dos capas bidimensionales de

cristales de AQP2, y el anlisis de

estos cristales con microscopio

electrnico mostr la estructura

bsica de AQP2 a 4,5 . Lacaracterstica general del

monmero AQP2 se asemeja a la

de AQP1, lo que indica que la

estructura de AQP2 es consistente

con el modelo de reloj de arena.

Sin embargo, se observ una

nueva funcin, es decir, lapresencia de una capa de

densidades intercaladas entre

hojas de cristal de una sola capa, lo

que se interpret como la N-y C-

terminales de AQP2. No est claro

si esta capa se puede atribuir a la

estructura de doble capa de las

muestras o si es especfico para

AQP2 y juega un papel especfico

(Schenk et al., 2005). Claramente,

es necesario el anlisis de ms alta

resolucin de la estructura de


27/45



AQP2 y dicha informacin ser

proporcionar pistas importantes

para el desarrollo de inhibidores

especficos de esta clnicamente

importante canal de agua.

La familia AQP se dividi en

subgrupos ahora en gran medida

en tres grupos basados en

funciones de canal y las

secuencias primarias de

aminocidos. El subgrupo

acuaporina incluye AQPsselectivos de agua, tales como

AQP0, 1, 2, 4, 5, 6, y 8. El

subgrupo aquaglyceroporin

incluye molculas que son

permeables a solutos pequeos

neutros tales como el glicerol, la

urea, y el agua, tales como AQP3,7, 9, y 10. AQP11 y AQP12

constituyen otro subgrupo

superaquaporiny la homologa de

secuencia de estos AQPs a otros

AQPs es menos de 20% e incluyen

motivos NPA desviados. El primer

motivo NPA se sustituye por NPC

en AQP11 y por TNP en AQP12,

pero el segundo motivo NPA se

conserva. AQP2 pertenece al

subgrupo de acuaporina. Estudios

funcionales han demostrado que la

permeabilidad al agua de AQP2 es

muy alta, en el mismo rango que

AQP1. La conductancia de iones

de ovocitos que expresan AQP2-es

casi insignificante, lo que impide

una posible penetracin de

protones a travs de AQP2. Esta

caracterstica es importante en los

conductos colectores del rin,

porque los conductos colectores

debe mantener una gradiente de

protones empinada encircunstancias normales. Por

ejemplo, pH de la orina se

mantiene en 4,5 por la maana, lo

que significa un gradiente de

concentracin de protones 1.000

veces. Del mismo modo,

permeabilidades de AQP2 aglicerol y urea son insignificantes,

lo que sugiere que es un AQP2,

transportador especfico de agua

altamente selectivo.

5. Funcin fisiolgica de AQP2 en

el cuerpo:

AQP2 es un actor clave en la

concentracin de la orina. En

respuesta a la hiperosmolaridad de


28/45



suero, la vasopresina se libera de

la glndula pituitaria a la circulacin

sistmica. La vasopresina se une a

su receptor de tipo 2 (V2R) que se

encuentra en la membrana

basolateral de las clulas

principales del conducto colector, y

la unin desencadena el trfico de

AQP2 entre la membrana apical y

vesculas intracelulares provoca un

aumento de AQP2 en la membrana

apical que permite que se eleve lapermeabilidad de la membrana al

agua. Adems de este papel

fisiolgico bien establecido de

AQP2 en el rin, otras

posibilidades fuera el rin han

sido implicados.

a) Localization of AQP2 in the

bodyComo era de esperar como un

canal de agua de la

vasopresina-regulado, AQP2 se

demostr inicialmente que se

expresa exclusivamente en el

rin, pero ms tarde, estudiosdetallados mostraron que la

protena de AQP2 se expresa

en el odo interno y de los

rganos reproductivos

masculinos. Se describen ms

detalles de esta expresin extra-

renal de AQP2. En el rin,

AQP2 se localiza en la

membrana apical y subapical de

vesculas de clulas principales

del tubo colector interior y

medular. El trfico intracelular

de AQP2 entre estos dos

compartimentos determina la

permeabilidad al agua de la

membrana apical. AQP2tambin se observa en las

clulas de los tbulos de

conexin a lo largo del

segmento de soporte donde se

concentra el lquido luminal

tubular diluido a los niveles iso-

osmolar por reabsorcin deagua libre, lo que representa

una cantidad considerable de la

reabsorcin de agua. Otra pieza

importante de la maquinaria de

concentracin de la orina, V2R,

tambin est presente en este

segmento de la nefrona, lo que

sugiere que la reabsorcin de

agua aqu es tambin regulado

vasopresina. La tincin positiva

dbil para AQP2 se observa de

vez en cuando a lo largo de la


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membrana basolateral de

clulas de los conductos

colectores, lo que implica un

papel como un transportador de

agua a travs de esta

membrana, donde tambin se

observa una expresin

abundante de AQP3 y AQP4

(en la porcin terminal del

conducto colector). En

condiciones patolgicas

humanas, la expresin de AQP2se observ en las clulas

epiteliales renales con quistes

provenientes de enfermedades

renales poliqusticas autosmica

dominante y en el conducto de

Bellin coni tumores que se cree

que surgen de los conductoscolectores.

b) Un jugador clave en la

concentracin de la orina

Como se describi

anteriormente, la identificacin

de los pacientes conmutaciones en el gen del NDI

en AQP2 demuestra el papel

indispensable para AQP2 como

un elemento clave en el

mecanismo de concentracin de

la orina. Hasta la fecha, ninguna

mutacin gentica que no sean

los de los genes de AQP2 o

V2R se ha informado en

pacientes con NDI, lo que

confirma la importancia

fundamental de estas dos

protenas de membrana que se

encuentra opuesta a la

membrana apical y basolateral

de las clulas principales deltbulo colector. Por el contrario,

las molculas y las cascadas de

sealizacin que conectan estas

dos molculas clave (AQP2 y

V2R) no son de importancia

crtica en la formacin de orina

concentrada, o msprobablemente, la conexin

tiene muchos sistemas de copia

de seguridad para compensar la

ausencia de una molcula. Sin

embargo, las mutaciones en los

genes nuevos se deben buscar

en pacientes NDI en los que las

mutaciones de genes no se

encuentran ya sea en genes

AQP2 o V2R. Funciones

fisiolgicas esenciales para

AQP2 en el cuerpo se han


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examinado en ratones de genes

especficos. El total AQP2 de

ratones que murieron dentro de

2 semanas despus del

nacimiento debido a

discapacidad grave capacidad

de concentracin de orina y

muestra hidronefrosis causada

por la enorme cantidad de orina.

Curiosamente, AQP2 en ratones

condicionales en el que AQP2

se elimina selectivamente en elconducto colector, pero no en el

tbulo de conexin podran

sobrevivir a la edad adulta, pero

mostr una capacidad de

concentracin de la orina

notablemente reducida con

pequeas respuestas a 3 h-privacin de agua en relacin

con el volumen de orina y la

osmolalidad. Estos resultados

demuestran que AQP2 en el

conducto colector es esencial

para la regulacin del balance

de agua en el cuerpo y no se

pueden compensar por otros

mecanismos y que AQP2 en el

segmento de conexin

contribuye a la concentracin de

la orina en cierta medida.

c) Funcin de la AQP2 fuera del

rin

AQP2 se expresa en el odointerno y de los rganos

reproductivos masculinos, lo

que implica posibles funciones

en estos rganos. En el odo

interno, AQP2 se encuentra en

las estructuras de membrana

que bordean el saco

endoplsmico en ratas y seres

humanos, lo que sugiere que

AQP2 juega un papel activo en

la homeostasis de la endolinfa.

Por otra parte, tambin se

observ expresin de V2R en

los mismos tejidos. La

consecuencia inmediata de tal

localizacin puede ser que

AQP2 es involucrado en la

patognesis de la enfermedad

de Meniere, que se caracteriza

por episodios de vrtigo,

prdida auditiva fluctuante, y el

tinnitus. El estudio inicialbuscando mutaciones

genticas en el gen AQP2 en

pacientes de Meniere fall,

pero un estudio reciente


31/45



observ el aumento de la

expresin de AQP2 ARNm y

protenas en el saco

endoplsmico de las personas

con enfermedad de Meniere.

Niveles circulantes elevados de

vasopresina pueden estimular

el sistema V2R-AQP2,

causando internalizacin

endosomal apical AQP2

membrana y el desbordamiento

del lquido endoplsmico, quecrea hidropesa del odo

interno, un hallazgo patolgico

tpico de la enfermedad de

Meniere. Nuevos estudios

deben llevarse a cabo para

este nuevo y potencialmente

importante implicacin clnicade AQP2. En este sentido, no

hay anomalas en las funciones

del odo interno (audicin y la

sensacin equilibrio) han sido

reportados en pacientes con

deficiencia de NDI AQP2.

Estudios adicionales, ms

exigentes todava pueden

revelar anormalidades

menores. AQP2 inmunotincin

muestra la expresin en las

clulas principales de la

porcin distal del conducto

deferente de la rata. Los

conductos deferentes se

derivan del conducto de Wolff

durante la embriognesis y es

parte del sistema de conductos

excretores responsable del

transporte, el almacenamiento

y la maduracin de los

espermatozoides. Por lo tanto,

AQP2 puede estar implicado en

la fertilidad masculina normal.Distribucin ms amplia de

AQP2 en el tracto reproductivo

incluyendo la rete testis,

conductos eferentes y

epiddimo se observa en el

perro. Al igual que en el odo

interno, las anomalas clnicasde fertilidad masculina no han

sido notificados o examinados

con un inters especial en los

pacientes NDI AQP2 nulo, y los

futuros estudios minuciosos se

esperan.

6. Regulacin de la AQP2La regulacin de la permeabilidad

al agua de las clulas de los

conductos de colectores es

obligatoria para el mantenimiento


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adecuado de equilibrio de agua en

el cuerpo. La mayor parte de este

ajuste est mediada por el trfico

de AQP2 entre la membrana de la

superficie celular luminal y las

vesculas de almacenamiento

subapicales intracelulares. Este

campo de investigacin es el

objetivo de intensos estudios,

porque las regulaciones dinmicas

de AQP2 sirven como un buen

sistema modelo para otrasmolculas de la membrana

plasmtica de la superficie celular

cuya localizacin est regulada por

mecanismos de trfico.

6.1. Sntesis de la Protena

Privacin de agua durante uncierto tiempo (24 h o ms)

origina una mayor

permeabilidad al agua de los

tbulos colectores, lo que

maximiza la capacidad de

concentracin de la orina, una

respuesta conocida como'

regulacin a largo plazo''.

Esta respuesta se debe

principalmente a un aumento

de la abundancia de protena

AQP2 producida por la

transcripcin del gen

estimulado AQP2, que est

mediada por la cascada de

sealizacin de vasopresina-

V2R. Un elemento de

respuesta a AMPc est

presente en la regin 50 del

gen AQP2 y regula la

transcripcin del gen.

Conductos colectores

medulares estn rodeados porhipertonicidad intersticial, que

puede ser otro factor

determinante de la

transcripcin AQP2. La

hipertonicidad afecta a la

transcripcin de muchos

genes a travs de lainteraccin entre el

potenciador de la tonicidad

sensible (TONO) y su factor

de transcripcin TonEBP.

TONO est presente en el

gen AQP2, lo que sugiere que

la relacin TONO/TonEBP

contribuye a la transcripcin

de AQP2. En ratones que

muestran atrofia de la mdula

renal y la expresin de AQP2

es claramente regulado hacia


33/45



abajo, lo que confirma el

papel de Tono/ToneEBP en la

transcripcin de AQP2.

Adems, los elementos AP1 y

GATA se encuentran en la

regin promotora del gen de

AQP2 y pueden contribuir a la

transcripcin de genes.

Muchos otros reguladores

transcripcionales y

reguladores transcripcionales

elementos de enlace queparticipan en la transcripcin

del gen de AQP2 se buscaron

sistemticamente y localizarse

en un estudio reciente,

proporcionando una mayor

comprensin de la

transcripcin del gen deAQP2.

6.2. Fosforilacin

En la primaria secuencia de

aminocidos de AQP2, hay un

sitio de fosforilacin de la

protena quinasa A en la

serina 256, lo que implica su

papel en el trfico de AQP2.

Esta especulacin fue hecho

confirmado por las

observaciones en clulas

cultivadas. Al menos tres de

los cuatro monmeros en la

AQP2 debe ser fosforilada en

la serina 256 para realizar la

localizacin en la superficie

celular, lo que indica la

importancia de la fosforilacin

en este sitio. Adems, la

contribucin a la fosforilacin

de AQP2 quinasas distintas

de PKA, tales como la

protena quinasa C y laprotena quinasa G para el

trfico adecuado AQP2. Se

encontraron tres nuevos

lugares de fosforilacin de

serina, en la serina 261, 264 y

269 adems de la conocida

serina 256 en el extremo C-terminal de AQP2. Estudios

posteriores han demostrado

que la vasopresina aumenta

la fosforilacin en la serina

264, y la serina-264

fosforilada en AQP2 se

transloca a la membrana

plasmtica de manera similar

a serina AQP2 256-

fosforilada. Por otro lado, la

vasopresina disminuye los

niveles de fosforilacin en la


34/45



serina 261, y la localizacin

de la serina-261 fosforilada en

AQP2 es diferente de la de

serina-256 fosforilada, lo que

sugiere papeles distintos para

estos residuos en el trfico de

AQP2. Sin embargo, otro

informe mostr ningn efecto

de la fosforilacin de la serina

261 en el trfico de AQP2. La

cuantificacin de la

fosforilacin en cada sitio defosforilacin muestra que la

fosforilacin en la serina 269

es sensible a la vasopresina

con el aumento de expresin

de AQP2 fosforilada en la

membrana apical. El nivel

bsico de fosforilacin de laserina 256 es

constitutivamente alta y no es

sensible a la vasopresina, lo

que sugiere la importancia de

la fosforilacin de la serina

269 en el plasma de retencin

de membrana de AQP2. Sin

embargo, la fosforilacin de la

serina 264 y serina 269

depende de antes de la

fosforilacin de la serina 256,

y que la fosforilacin de la

serina 261 depende en parte

de la fosforilacin de la serina

264 y serina 269. Por el

contrario, la fosforilacin de la

serina 256 no es dependiente

del estado de cualquiera de

los otros sitios de

fosforilacin, lo que sugiere

que la serina 256 es el sitio de

fosforilacin ms importante

de AQP2. Como resultado, la

vasopresina de la seal alteralos estados de fosforilacin de

estos residuos, lo que

determina la

asociacin/disociacin de

AQP2 con sus protenas de

unin. Estos eventos

secuenciales pueden ser deimportancia crtica para AQP2

trata.

6.3. Complejo de la protena

vinculante y el la

translocacin

Varios casos de pacientes

NDI AQP2-desertado

muestran un patrn de

herencia dominante.

Curiosamente, las mutaciones

encontradas en estos casos


35/45



estn ubicados en la cola C-

terminal de AQP2, y estudios

de expresin heterlogos

muestran que las protenas de

AQP2 mutados estn

correctamente encaminadas a

la membrana basolateral en

lugar del destino correcto, la

membrana apical. Esta

observacin llev a la

especulacin de que hay

protenas de unin C-terminalque regulan el trfico y el

destino de AQP2. Aislado de

protena activadora de

GTPasa Spa-1 (SPA-1) como

una pareja de unin del

extremo C-terminal de AQP2,

que coincide con el motivoligando PDZ, y mostraron que

la unin de SPA-1 a AQP2 es

necesaria para el trfico de

AQP2. SPA-1 puede inhibir la

protena activadora de

GTPasa Rap1, lo que

desencadena la actina F

desmontaje, y puede

mantener la movilidad basal

de AQP2. Otro estudio con

cromatografa de

inmunoafinidad usando una

columna acoplado

covalentemente con el

anticuerpo anti-AQP2 se

realiz para aislar protenas

de unin a AQP2- Debido a

que la mayora de las

protenas identificadas tienen

capacidad de unin a actina,

se especula que estas

protenas pueden asociar

indirectamente con AQP2 a

travs de actina, y estasprotenas crear complejos de

protenas que interactan con

AQP2. Un patrn de

interacciones que compiten

entre AQP2 y G-actina o

tropomiosina se ha

demostrado para dirigir eltrfico de AQP2 a la

membrana apical por

despolimerizacin de la

barrera de la actina F por

debajo de la membrana

apical.

Se identificaron ms de 180

protenas, incluyendo GTPasa

Rab miembros de la familia,

las protenas SNARE,

marcadores de la red trans-

Golgi, las protenas motoras y


36/45



otros. La actina tambin se

incluye en esta lista, lo que

sugiere que en las muestras

recuperadas, se incluyeron las

protenas que se unen

directamente a AQP2. Por lo

tanto, esta lista identifica a un

grupo de protenas que

interactan con AQP2 a

travs de, la vinculacin

directa unin indirecta, o

colocalizacin en las mismasvesculas, y algunos de ellos

forman un complejo de

protenas para la regulacin

dinmica de AQP2.

6.4. Endocitosis y degradacin

La cantidad de AQP2 en la

membrana plasmtica es elresultado de un equilibrio

entre continuar endocitosis y

exocitosis (Brown et al.,

2008). Durante el proceso de

endocitosis AQP2 se acumula

en depresiones revestidas de

clatrina y se interioriza a

travs. La cantidad de AQP2

en la membrana apical se

puede aumentar mediante la

inhibicin de la endocitosis

mediada por clatrina, lo que

implica que la inhibicin de la

endocitosis es otra manera de

aumentar la permeabilidad al

agua de los conductos

colectores. La protena de

choque trmico, HSC70, es

importante para la prdida de

la envoltura vescular

revestidas de clatrina, se une

al extremo C-terminal de

AQP2 no fosforilada y esnecesaria para la endocitosis

AQP2 (Lu et al., 2007).

Despus de la endocitosis,

AQP2 se recupera a

endosomas temprano EEA1-

positivo a travs de un

mecanismo de IP3Kdependiente y luego se

transfiere a las vesculas de

almacenamiento Rab11-

positivos. Las vesculas de

almacenamiento Rab11-

positivos son especficos

AQP2 y pueden no incluir

otras protenas de transporte

de membrana. AQP2 en el

almacenamiento de vesculas

vuelve a aparecer en la

membrana apical a la


37/45



estimulacin vasopresina. La

ubiquitinacin funciona como

una seal para la endocitosis

y la degradacin posterior por

el cuerpo multivesicular (MVB)

o proteasoma. La

ubiquitinacin en la lisina 270

de AQP2 es importante para

la endocitosis y la

degradacin de AQP2.

Algunos AQP2 transferido a

MVB se excreta en la orina enforma de exosomas. La

cuantificacin de AQP2 en la

orina y rin que muestra ms

o menos 3% de AQP2 total en

el rin se excreta en la orina

todos los das, lo que indica

que esta ruta no es probableque la principal va para la

degradacin de AQP2.

6.5. La actividad del canal de

cada molcula de AQP2

Ha habido cierta controversia

sobre si la fosforilacin de

AQP2 regula la permeabilidad

al agua de la molcula AQP2

individual. Kuwahara et al.

(1995) demostraron en

oocitos de Xenopus que la

PKA fosforila AQP2 en la

serina 256 y aumenta la


osmtica (Pf) de ovocitos sin

un aumento significativo en la

cantidad de protena en la

superficie del voocito. Sin

embargo, este resultado no

fue apoyada por otro estudio

utilizando un mtodo similar

en el que los valores de Pf

corregidos de la membranaplasmtica frente a la

abundancia de protenas AQP

no fueron diferentes entre los

AQP2 de tipo salvaje, AQP2

no fosforilada y la fosforilacin

que imita AQP2. Sin embargo,

la participacin de otrasprotenas tales como

fosfatasas endgenas no se

puede excluir. Esta cuestin

fue estudiada recientemente

de nuevo con un sistema puro

que lleva a cabo la expresin

a gran escala de AQP2

humana recombinante,

reconstituido en

proteoliposomas, y se midi

su Pf. Los resultados

mostraron que la Pf de


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proteoliposomas se mejor

aproximadamente 2 veces por

fosforilacin en la serina 256.

Esta observacin indica que

actividad de canal de agua de

la AQP2 est directamente

regulada por su fosforilacin.

El mecanismo implicado no

est claro, pero una posible

explicacin es el canal gating.

Cada vez hay ms evidencia

de que las acuaporinas estancerrada. Anlisis de la

estructura cristalina de rayos

X de la acuaporina de

espinacas SoPIP2; 1 sugiere

que en la conformacin

cerrada, el bucle D tapa los

poros de este canal desde elcitoplasma, impidiendo el

paso del agua. En la

conformacin abierta, loop D

se desplaza, lo que permite el

paso de molculas de agua.

En este contexto, la presencia

de una capa de densidades

intercaladas entre hojas de

cristal de una sola capa de

AQP2 es digna de mencin.

Esta estructura fue

interpretada a ser N-y C-

terminales de AQP2, lo que

sugiere que la N-y / o C-

terminales de AQP2 funcionacomo la puerta del canal. Un

anlisis ms detallado de la

estructura de AQP2 protena

en una resolucin ms alta

est claramente necesaria

para comprender los detalles

moleculares de la funcin delos canales individuales de

agua.

Las acuaporinas en el descubrimiento de frmacos y la farmacoterapia

1. IntroduccinDurante el lapso de unos pocos

aos, el consenso en relacin con

el trfico fisiolgico agua ha pasado

de ser un transporte de masa no

facilitada a travs de la membrana

plasmtica a la circulacin del agua

a travs de canales especializados.

Este cambio de perspectiva

comenz en serio durante los


39/45



finales de los aos 1980 con el

trabajo pionero de la Georghe

Benga y grupos Peter Agre en la

protena integral ahora reconocido

como acuaporinas 1 (AQP1) y fue

aceptado en gran medida despus

de la identificacin formal de AQP1

en 1992. La explosin subsiguiente

de acuaporinas (AQP)

investigacin relacionada demostr

la existencia de estas protenas en

prcticamente todos losorganismos. Con su universalidad,

el transporte de agua fisiolgica y

otros solutos neutros realizados por

las protenas AQP ahora puede ser

pensado como un parmetro

modificable para el descubrimiento

de frmacos y farmacoterapia. Lafamilia de acuaporina es una gran

coleccin de protenas integrales

de membrana que permiten el

movimiento del agua y otros

solutos pequeos, neutros a travs

de membranas biolgicas. Las

acuaporinas pertenecen a la

superfamilia de protenas mayor

intrnseca (MIP), y se han

identificado en casi todos los

organismos, incluyendo

vertebrados, invertebrados, plantas

y organismos unicelulares, la

filogenia de los cuales ha sido

discutido ampliamente. Esta familia

de protenas se divide

generalmente en dos grupos,

canales de agua especficas

(acuaporinas ortodoxos), y el agua

y los facilitadores de soluto neutros

(GlpF, aquaglyceroporin), sin

embargo, estudios recientes han

sugerido que incluso los miembros

del primer grupo pueden serpermeables a una variedad de

sustratos, incluyendo gases y los

iones. AQPs de mamferos constan

de 13 miembros homlogos con

diversos grados de similitud.

Estudios de permeacin, lleva a

cabo principalmente utilizando elsistema de expresin de oocitos de

Xenopus, revelaron que AQP0, 1,

2, 4, 5 y 8 son AQPs ortodoxas,

mientras AQP 3, 7, 9 y 10 se

pueden clasificar como

acuagliceroporinas. La

especificidad de sustrato de las

AQPs identificados ms

recientemente, AQP11 y AQP12 no

han sido claramente identificados.

Los alineamientos de secuencias

para las 13 isoenzimas acuaporina


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humanos se muestran en la figura.

5. Estructura general AQP es muy

conservada entre las distintas

clases y las isoformas entre

especies, a pesar de las diferencias

significativas en las similitudes de

Fig. 5. Secuencia de protenas de las 13 acuaporinas humanas. Secuencias de protenas individuales

de larga duracin, humano AQP0-12 (gi: 6912506, 267412, 728874, 2497938, 2506859, 1703358,

212276421, 3121761, 47117819, 317373323, 47117905, 47115841, 47115836, respectivamente)

fueron descargados de la base de datos de protenas PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) y


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fueron alineados utilizando CLC principal Workbench (Ver. 6.5, CLC bio, Aarhus, Dinamarca).

Alineaciones con> 50% de conservacin se muestran con fondos cada vez ms oscuros. El logotipo

representa la secuencia de los aminocidos dentro de una alineacin de la columna determinada, con

la altura de letra proporcional a su nivel de conservacin.

Figura 2. (A) Esquema Generalizado de protenas de la familia AQP ampliado para mostrar la

conectividad. (B) Esquema generalizado de la estructura de la familia de protenas AQP contraer para

mostrar el plegamiento de protenas, gran flecha indica la trayectoria del substrato aproximada. (C)

Esquema de la unidad biolgica AQP, las flechas anchas indican trayectoria del substrato; estrecha la

flecha indica el camino propuesto de gases disueltos a travs del poro central.

secuencia. Todas las protenas de

la familia AQP deben tener seis

hlices que atraviesan la

membrana conectadas por cinco

bucles, y tienen un dominio

intracelular N-y C-terminales, la

figura. 6A. Los bucles B y E tienen

subunidades cortas helicoidales

que penetran en la membrana

plasmtica, y se relacionan entre s

a (NPA) la secuencia Asn-Pro-Ala

altamente conservadas. Los seis

dominios TM, y B y E hlices

forman un bucle de canal de

acuerdo, con las que interactan

NPA repite marcado su punto ms

estrecho, fig. 6B. La protena se

auto-ensambla en una unidad

biolgica tetramrica, donde

adems de los cuatro canales de

sustrato, se forma un poro

tetramrica adicional, la figura. 2C.

Este poro tetramrica se cree que

es responsable de la translocacin

de gases disueltos y especies

inicas. Nuestra comprensin de la

funcin AQP en biofisiologa

humana normal est en continua

expansin. Del mismo modo, los

estudios recientes han demostrado


42/45



alterar la distribucin AQP humana

y la expresin en situaciones

patolgicas. En consecuencia,

existe un creciente consenso de

que la modulacin de la funcin

AQP ser de utilidad teraputica.

Esta opinin destacar las

funciones AQPs normales y

patolgicas que son propensos a

responder a la intervencin

farmacolgica, as como

moduladores de AQP que puedenser tiles para los esfuerzos de

descubrimiento de frmacos.

2. Acuaporinas como blanco de

drogas en el Rin:

El rin es el principal rgano

encargado de regular el equilibriode agua fisiolgica, y es donde se

comprende mejor la funcin AQP.

Con un total de ocho AQPs que

tienen una distribucin especfica

en diferentes segmentos de la

nefrona, y tienen papeles distintos

en la reabsorcin de agua, y el

proceso de filtrado de sangre para

generar la orina. El ms

prometedor de los AQPs del rin

como un objetivo para el

descubrimiento de frmacos es

AQP2, que se expresa

principalmente en las clulas

principales de los tbulos

colectores a lo largo de las

membranas apicales, pero tambin

tiene una distribucin a lo largo de

las membranas basolateral de la

mdula renal. Como se ha

demostrado en ratones, AQP2 est

involucrado en el mecanismo de

concentracin urinaria. AQP2mediada por la reabsorcin de

agua se lleva a cabo en respuesta

a la hormona antidiurtica arginina-

vasopresina (AVP) que conduce a

la disminucin de la produccin de

orina y el aumento de la

osmolaridad de la orina. En laDiabetes inspida nefrognica (NDI)

a menudo se caracteriza por bajos

niveles expresivos de AQP2 y

correspondientemente alta

produccin de orina diluida.

Tpicamente, el NDI es causada

por perturbaciones en la expresin

o mutaciones en el receptor de la

vasopresina V2 AVP, sin embargo,

tambin se sugiri que las

mutaciones a AQP2 podran estar

implicados en la etiologa de


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algunas variantes NDI, a pesar de

la produccin de AVP por lo dems

normal y la funcin del receptor V2.

Mientras que la mayora (90%) de

los casos NDI congnitas parece

estar relacionada a AVP o de su

receptor, las mutaciones de AQP2

que causan NDI se caracterizan

tanto recesivas y dominantes. El

tratamiento de NDI por focalizacin

AQP2 indirectamente a travs de

AVP o el receptor V2probablemente ocasionar una

reduccin del beneficio teraputico,

sin embargo, en algunos casos,

puede ser til para apuntar

directamente AQP2. Adems de

NDI, AQP2 parece estar implicada

en condiciones clnicas asociadascon la retencin de agua, tales

como la insuficiencia cardaca

congestiva y la cirrosis heptica,

as como durante el embarazo. All,

se observaron aumentos

significativos en AQP2 y su

expresin en la membrana apical

de las clulas principales. AQP2

tambin puede estar implicada en

la patognesis de la hipertensin,

donde se observaron aumentos en

su expresin y orientacin apical en

ratas espontneamente

hipertensas (SHR). En estos casos,

los inhibidores directos AQP2

pueden mostrar beneficio clnico, y

ofrecer una alternativa a la

orientacin de la va del receptor

AVP/V2. Sin embargo, el cuadro

clnico se complica por la posible

participacin de otras isoenzimas

AQP en el rin. Por ejemplo, el

aumento de expresin de AQP1 y

AQP3 tambin se encontr SHR enlos riones, y tal interaccin entre

los diversos AQPs se debe

considerar en los trastornos

humanos tambin. AQP1 es

abundante en las membranas

apical y basolateral de las clulas

epiteliales en el tbulo proximal y yen la rama descendente delgada

del asa de Henle (DTLH), as como

en el endotelio microvascular de la

medula exterior descendente vasos

rectos (DVR). Los estudios en

ratones AQP1-nulos han

demostrado su probable

implicacin en los trastornos

renales humanos (Verkman, 2002).

AQP1 en ratones nulos tienen una

disminucin significativa de la

osmolaridad de orina como


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consecuencia de la alteracin de la

absorcin de lquido isotnico

proximal tbulo y un mecanismo de

concentracin contracorriente renal

defectuoso. Sin embargo, los seres

humanos con una mutacin para el

antgeno de grupo sanguneo

Colton (AQP1), lo que conduce a

mutaciones homocigticas en el

gen AQP1 y un nivel de

impedimento de AQP1 en las

clulas rojas de la sangre,muestran solamente los defectos

de concentracin renal leve incluso

bajo estrs privacin de agua. Por

otra parte, estas personas

generalmente no muestran

sntomas clnicos principales que

se pueden correlacionardirectamente a la disminucin de

AQP1 funcin. Aunque sigue

siendo posible que AQP1 pueda

ser un objetivo para los trastornos

renales, ausencia de indicacin

teraputica ha sido claramente

identificada. Otros AQPs se

expresan en el rin: AQP3 y

AQP4 en las membranas

basolateral; AQP6 en clulas

intercaladas; AQP7 y AQP8 en el

epitelio del tbulo proximal, y

AQP11 en vesculas intracelulares

del tbulo proximal. Sin embargo,

se ha informado poca evidencia

convincente que sugiere su uso

como dianas teraputicas en

trastornos renales. Curiosamente,

no se encontraron AQP11 ratones

KO para desarrollar riones

poliqusticos, y las similitudes entre

los modelos animales y modelos de

enfermedad poliqustica renal

pueden implicar un papelpatognico de AQP11. Esta

relacin puede a su vez sugerir

nuevas terapias para la

enfermedad renal poliqustica.

Conclusiones

Las acuaporinas se pueden

dividir en do subfamilias: el

primer grupo son selectivas

solo para el agua, y el segundo

grupo llamadas

acuagliceroporinas como

transportador de agua y solutos

pequeos sin carga como el

glicerol

AQP0 el principal componente

proteico de las uniones

aisladas del cristalino


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AQP2 es un actor clave en la

concentracin de la orina. En

respuesta a la

hiperosmolaridad de suero, la

vasopresina se libera de la

glndula pituitaria

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