Adenovirus

Adenovirus

• Virus che infettano svariate specie e tessuti

• Isolati per la prima volta nel 1953 da tessuto di adenoidi umane messe in coltura

Classificazione

Famiglia Adenoviridae, genus Mastadenovirus

51 sierotipi isolati dall’uomo

Adenoviruses sono ulteriormente classificati in 6 sottogruppi (A -F), in base alle proprietà emagglutinanti e alla omologia di DNA Patologie respiratorie: Sottogruppi B1,C,E

Patologie oculari: Sottogruppi B,D,E

Patologie intestinali (enteriti): Sottogruppo F (Sierotipi 40, 41)

Patologie renali e urinarie: Sottogruppo B2

ADENOVIRUSStruttura

Virus senza envelope Capside icosaedrico 70-90 nmGenoma: DNA lineare a doppia elica

Capside

252 capsomeri: 240 esoni, 12 pentoni La fibra (IV) media il contatto con il recettore cellulare, protrudendo dal pentone (III)Pentoni (III) ed esoni (II)Proteine minori del capside (VI, VIII, IX)

Core

V, VII, Mu, IVa2, TP (terminal protein) associate al DNA viraleProteasi importante per l’assemblaggio

capside costituito da 252 capsomeri di cui 240 esoni (trimero prot II + VI, VIII e IX) e 12 pentoni (pentamero prot III + 5 prot IIIa)core contiene almeno 4 proteine (TP, V, VII, Mu)

FIBRE (trimeri proteina IV): mediano il riconoscimento dei recettori sulla superficie delle cellule permissive (CAR, integrine); sono responsabili dell’emoagglutinazione

ESONI: Determinanti antigenici

PENTONI: Attività tossina-simile

STRUTTURA

Adenovirusrecettori principali

• Sottogruppo A (12,18,31)— proteina CAR (membro della superfamiglia delle Ig), funzione ignota, presente su molti tipi cellulari

• Sottogruppo B – B1 (3,7,16,21,50) –CD46 (proteina regolatoria nel

sistema del complemento), CD80, CD86– B2 (11,14,34,35)

• Sottogruppo C—CAR

• Sottogruppo D—acido sialico

Altre molecole importanti

1) Le fibre si legano ai due al recettore primario: ex a CAR (coxackie/adenoviral receptor)

2) I motivi RGD presenti nel pentone si legano alle integrine v3 e v5

Ciclo replicativo

FASI del CICLO VITALE DI ADENOVIRUS

- Avviene nel nucleo delle cellule permissive (cellule di origine epiteliale), il ciclo ha una durata di circa 32-36 ore (ciclo litico)- Un unico ciclo di replicazione è in grado di generare 10.000 virioni per cellula infettata;

1° fase2° fase

Fase di ingresso nella cellula

ADESIONE E ASSORBIMENTO

CAR è una proteina di adesione che è espressa ad alti livelli:- fegato, rene, cuore, cervello, pancreas, colon, prostata, endotelio

CAR non è espressa in:- linfociti periferici, milza, muscolo scheletrico e fibroblasti

• Adenovirus del gruppo B riconoscono un recettore diverso dal CAR (CD46)• Adenovirus di tipo 5 riconosce come recettore anche il dominio α2 del MHC di tipo I• Alcuni tumori in stadio avanzato perdono l’espressione del CAR (es. ovarico, colon...)• Un dominio RGD esposto in un loop dei pentoni promuove l’interazione con le integrine promuovendo l’endocitosi• Il colesterolo gioca un ruolo nell’uptake virale e fuoriuscita dall’endosoma

Penetrazione nella cellula

Ingresso mediato da endocitosi clatrina-dipendente/pH dipendente

Perdita delle fibreLisi della membrana degli endosomi mediato dalla proteina della base dei pentoni

A livello dei pori nucleari la struttura capsidica subisce un disassemblaggio parziale :

- perdita dei pentoni III e della proteina IIIa

- dissociazione della proteina VIII - degradazione proteolitica della

proteina VI da parte della proteasi presente nel virione

- perdita della proteina IX

pH

• Il genoma è costituito da una molecola di DNA lineare a doppia elica di 30-40 kb, a seconda del gruppo preso in analisi.

• Alle estremità sono presenti le sequenze ITRs, inverted terminal repeats, che fungono da origini di replicazione e da promotori per alcuni geni.

• Vicino alla ITRs in 5’ vi è la sequenza segnale (sequenza Ψ) per l’inserimento del genoma all’interno del virione.

• I geni vengono espressi con una precisa sequenza temporale (immediate-early, early, late genes).

I geni immediate-early sono E1A e E1B e servono ad innescare la replicazione nella cellula ospite. I geni early servono per la replicazione del genoma virale I geni late sono geni strutturali

Genoma degli adenovirus

Il GENOMA degli ADENOVIRUS

sequenza di impacchettamento

(ds DNA: 30-36 Kb)

ITR ITR

regioni di controllo trascrizionalesiti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer cellulari : NF-I e Oct-I

regione ORI (replicazione del genoma)

SEQUENZE ITR (100bp)

• le regioni da E1 a E4 codificano i geni precoci (early)• le regioni da L1 a L5 codificano i geni tardivi (late)

Trascrizione bidirezionale mediata da RNA pol-II, si ottengono diversi mRNA grazie all’uso di diversi siti poli-A o per splicing alternativo

Rappresentazione schematica del genoma di adenovirus: ds DNA lineare di 36 kb

Trascrizione bidirezionale mediata da RNA pol-II, si ottengono diversi mRNA grazie all’uso di diversi siti poli-A o per splicing

alternativo

Rappresentazione schematica deli trascritti virali

ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS

E- geni precociL- geni tardivi

geni precocigeni tardivi 50 proteine

Co-immunoprecipitazione di numerose proteine cellulari con la proteina E1A

L’espressione di E1A fa sfuggire al normale controllo da parte dell’interazione pRb-E2F

Regione E1:orientamento

- Indurre la cellula ospite ad entrare nella fase S del ciclo cellulare

- Sintetizzare i prodotti dei geni virali necessari per la replicazione del

DNA virale

- Down regola l’espressione dell’MHC I (effetto immuno regolatore)

Regione E2

orientamento

suddivisa in 2 regioni trascrizionali

separate: E2A ed E2B.

la regione E2A codifica una proteina che lega ssDNA (DBP),

altamente fosforilata nella regione N-terminale e richiesta per la

replicazione del DNA: probabilmente funziona come

fattore di regolazione della trascrizione.

la regione E2B codifica un precursore della proteina TP

(80kDa) che viene convertita in una proteina di 55 kDa durante

l’assemblaggio virale. Questa regione codifica anche una DNA

polimerasi di 240kDa.

Regione E3 (“cell death protein”) codifica prodotti genici antiapoptotici e inibisce l’espressione di MHC facilita il rilascio delle particelle virali dalle cellule infettate, riduce la produzione di linfociti T citotossici

Funzione sconosciuta Lega l’ MHC I

Inibisce la trascrizione

Funzione Sconosciuta

Promuove il rilascio del virus

Inibisce l’apoptosi

Inibisce l’apoptosi regolata da TNFAgisce su NF-KB

orientamento

E3

Regione E4 (modula il metabolismo dell’ospite!)

stimola lo sviluppo di una risposta umorale :

aumentando IL6 e IL8 per la maturazione delle cellule

B modula l’attività di trascrizione del virus inibisce la sintesi proteica dell’ospite.

orientamento

Modula l’attività di E2F

Interagisce con E1B 55K agevolando la produzione degli mRNA

Inibisce l’attivazione di E2F mediata da E1A

Interagisce con E1B 55K

Funzione sconosciuta

Facilita la trasformazion

e

Replicazione del genomaLa replicazione del DNA avviene grazie all’intervento di pTP, polimerasi virale, DBP che interagiscono con altre proteine cellulari

Entrambe le estremità del genoma fungono da origini

Protein priming and strand displacement model

ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI

ITR E1A/B

L5

E2A/B ITRE3

L1 L2 L3 L4

VA

E4

promotore MLPL1 L2 L3 L4 L5

E1AMLTF

IVa52 kd

unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con estremità 5’ identiche, divisi nei 5 gruppi L

proteine strutturaliproteine scaffoldproteasi

GENI TARDIVI Proteine tardive = componenti strutturali del virione

I geni tardivi sono trascritti a partire da un major late promoter (MLP)

A partire da un trascritto primario di 29.000 nucleotidi, circa 18 specie di mRNA sono prodotte in seguito a splicing alternativi, tali mRNA sono stati raggruppati in 5 famiglie classificate da L1 a L5 che hanno porzioni 5’ variabili Altri RNA (VA) vengono generati dalla polimerasi III e si possono attribuire diverse funzioni a questi RNA:

- regolazione degli splicing degli mRNA tardivi

- controllo degli stadi della migrazione dei peptidi tardivi

- inibizione degli effetti dell’INF mediante blocco del

legame dei dsRNA alle proteine chinasi cellulari

Rappresentazione di un modello delle strutture secondarie (dsRNA) che si generano a livello dell’Ad-tipo2

Assemblaggio degli adenovirus

proteine singole (no poliproteina)

ruolo critico della proteina L1(funzione scaffold ?)

citoplasma- formazione dei trimeri di proteina II (esoni). Funzione essenziale della proteina L4.

- formazione dei pentameri di proteina III (pentoni)- formazione dei trimeri diproteina IV (fibre)

formazione di capsidi vuoti

nucleo

disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi)

E3 - death protein (meccanismo sconosciuto)

RILASCIO DEL VIRUS

REPLICAZIONE E PATOGENESI

Infezione delle cellule mucoepiteliali a livello del sito di ingresso ovvero della congiuntiva, del tratto respiratorio, gastrointestinale e genitourinario.

Replicazione del DNA genomico intranucleare

Fasi di replicazione precoci e tardive a cui segue l’assemblaggio e il rilascio dei virioni

Danno diretto cellule mucoepiteliali ( tratto respiratorio, gastrointestinale, congiuntiva)

ADENOVIRUSINFEZIONE

Tre tipi di infezione:

• Litica – cellule mucoepiteliali, porta alla morte cellulare– Produzione di 10.000-1X106 virioni/cellula– 1-5% dei virioni sono infettivi

• Latente / persistente – il virus permane in tonsille, adenoidi, placche di Peyers– Scarsa produzione virale

ADENOVIRUSINFEZIONE

• Trasformazione oncogenica – crescita cellulare e replicazione senza morte cellulare.

Integrazione del DNA

Espressione costitutiva di geni E1A-E1B (importanti per

immortalizzazione cellulare; inattivazione p53, Rb)

Patogenesi

• Molto diffusi

• Virus citolitici per effetto di accumulo dei virioni nel nucleo e per l’effetto citotossico di E3 (death protein)

• Infezioni acute del tratto respiratorio e in misura minore gastro-intestinale, possono dare cistiti emorragiche, miocarditi e cheratocongiuntiviti

• Molte infezioni sono subcliniche

ONCOGENESI

Soltanto alcuni sottogruppi di adenovirus possono indurre

direttamente la formazione di masse tumorali nel topo:

Adenovirus del gruppo Agruppo A (Ad12, Ad18,..) sono altamente

oncogenici, e producono il tumore nella quasi totalità dei topi

nell’arco di 4 mesi;

Adenovirus del gruppo Bgruppo B (Ad3, Ad7,..) sono debolmente

oncogenici, inducono il tumore in 4-18 mesi.

Adenovirus del gruppo Cgruppo C e E E non sono stati mai visti implicati

nella induzione di tumori nell’animale.

CAR

E1A pRB

geni proliferativi

E1B55kd

p53geni pro-apoptotici

IB

NF-B

rispostainnata

E1A

E1B19kd

integrine

MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE

ADENOVIRUSTRASMISSIONE

• Aerosol

• Contatto diretto

• Oro-fecale

• Eliminazione intermittente

• Aree affollate

• Diffusione mondiale

• Diffusione interumana

ADENOVIRUSINFEZIONE

• Adenovirus replica nei tessuti linfoide-associati, la viremia puo’ causare infezione secondaria in organi viscerali.

• La replicazione del virus causa un eccesso di componenti antigeniche liberate nel sovranatante come antigeni solubili. Colorazione basofila intra-nucleare corpi inclusi nelle cellule.

Adenovirus Immunita’

• Infezioni controllate dalla risposta immunitaria

• Risposta anticorpale e T cellulare

Infezioni subcliniche nella maggior parte dei casi

Infezione primaria avviene nell’infanzia

Tipi 1,2,5,6 tipicamente isolati dal tessuto adenoide o tonsille dei bambiniIsolato dalle feci

5% malattie neonato, 3 % tra i 2-4 anni di vita

Frequente nelle caserme

Manifestazioni cliniche

Manifestazioni cliniche

•Patologie respiratorie:

Riniti, faringiti (con o senza febbre), tonsilliti, bronchiti, pertosse-simile, polmoniti

•Patologia oculare:

cherato-congiuntiviti

•Patologie renali e urinarie:

cistite emorragica, orchite, nefrite

Manifestazioni cliniche

•Patologia intestinale (gastroenteriti):diarrea per periodo più lungo che con altre infezioni virali, adeniti mesenteriche, epatiti, appendiciti (sierotipi 40,41,42)

•Patologie più rare nell’individuo immunocompetente: Meningiti, encefaliti, artriti, rash cutaneo, mioocarditi, pericarditi: Infezioni molto grave (o riattivazione infezione latente) in pazienti immunocompromessi

RIASSUMENDO……….

AdenovirusDiagnosi

Ricerca del virus:

• Metodi immunologici

• Metodi molecolari

• Isolamento colturale

In campioni di sangue, secrezioni, tamponi nasali, tamponi oculari, feci, urine, liquor….