UNIVERSIDAD DE CRDOBAFACULTAD DE CIENCIAS BSICASPROGRAMA DE BIOLOGAPROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN DE MOSQUITOS CON UNMTODO SIN FENOLCRISTIAN MORENO C, ESTER GUERRA S, MARIA J PATERNINA, MARIA P VARGAS.

RESUMEN

El procedimiento de extraccin del ADN geonmico sigue ciertas pautas para su correcta purificacin que son muy diferentes a los empleados en la purificacin de protenas. Existen variastcnicasque se utilizan parala extraccin de ADN; en esta prctica se trabaj con el mtodo de extraccin de ADN sin fenol, en donde lo primero en hacerse fue quitar la cabeza a los mosquitos debido a que esta puede contaminar la muestra dado que posee parsitos.Luego de ya tener 3 mosquitos en el tubo de Eppendorf lo siguiente es el rompimiento de membranas con solucin de lisis y ayudar con el maceramiento, posteriormente precipitacin de protenas por medio de las altas concentraciones desales como acetato de potasio para la precipitacin de estas y posteriormente precipitar ADN con etanol absoluto frio ya que este ayuda a purificar la muestra de ADN eliminando las protenas presentes al solubilizarlas en la misma solucin de etanol, adems elimina impurezas orgnicas al solubilizarse en el mismo por ser un compuesto orgnico el etanol el etanol hace que el ADN se deshidrate, es decir, pierda contacto con las molculas de agua que lo rodean y por eso al final lo que hacemos es rehidratarlo con el buffer TE. Palabras claves: Extraccin de ADN, fenol, mosquito, DNA.

INTRODUCCINEl cido desoxirribonucleico o ADN (DNA) es la molcula que guarda el cdigo gentico de todas las clulas. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el DNA como vehculo de su cdigo gentico.La extraccin del ADN es el primer paso de muchas tcnicas moleculares. A pesar de su aparente sencillez, a menudo existen problemas con el rendimiento de los mtodos, la calidad del ADN obtenido encontrndose posibles contaminantes, degradaciones parciales. As como el tiempo de duracin de los protocolos. El empleo del nitrgeno liquido como variante en los protocolos de extraccin de ADN de diferentes especies ha permitido aumentar el rendimiento y la calidad del material gentico obtenido (Mann et al. 1989; Kang et al. 2004; Nichols et al. 2004). En varias familias de insectos esta variante ha sido empleada, demostrndose adems del aumento del rendimiento su posible empleo en tcnicas moleculares comprobndose la calidad del ADN resultantes.LaextraccindeADNdeuna muestra celular se basa en el hecho dequelos ionessalinosson atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Seempiezaporlisar(romper)las clulas mediante un detergente o un buffer de lisis,vacindosesu contenido molecularenuna disolucin tampn enlaquese disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos,protenasyotras sustancias en menor proporcin. Las protenas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrn fraccionado en cadenasmspequeasy separadasdelporaccindel bufferdelisis. Slo queda,portanto, extraer el ADN de esamezclatampn ydetergente, para lo cual se utiliza etanol frio, quien actua en la purificacin del ADN.

OBJETIVOS

Extraer DNA de mosquito sin el uso del fenol. Aprender las pautas para la extraccin de DNA en insectos.

MATERIALES Y REACTIVOS

2 Mosquitos Pinza Bistur EstereoscopiO Tubo eppendorf 1.5ml Buffer de lisis Incubadora Acetato de potasio Macerador pequeo Hielo Etanol absoluto Etanol frio al 70% Buffer TE Nevera

METODOLOGIA

1. Realizacin de la diseccin de las patas alas y la cabeza de un mosquito.2. Se colocar la zona abdominal, las patas y las alas del mosquito en un tubo eppendorf de 1.5 ml.3. Adicionamos 50 ul de buffer de lisis para homogenizar la muestra.4. Maceramos bien, hasta que la muestra homogenice.5. Incubamos a 65 por 30 minutos.

6. Agregar 15 ul de acetato de potasio y mezclar suavemente por inversin.7. Incubar durante 30 minutos en hielo.8. Centrifugar a 13000 r. p. m. por 15 minutos, a 4C.9. Pasar el SND a un tubo nuevo.

10. Adicionar 100Ul de etanol absoluto, mezclar suavemente por inversin ydejar a temperatura ambiente de 5 a 6 minutos, descartar el SND y lavar elbotn con 100ul de etanol frio al 70%.

11. Centrifugar a 13000 r. p. m. por 5 minutos, a 4C y descartar el SND.

12. Dejar secar el pellet 20 min y resuspenderlo en 150 ul de buffer TE por 10 minutos y almacenar a -20C.

ANALISIS DE RESULTADOS

En un procedimiento de laboratorio los materiales son muy importantes y cada uno cumple un papel especfico en nuestros procedimientos. En esta prctica se realizar un mtodo en el cual no usaremos fenol ya que si lo utilizramos necesitaramos compuestos orgnicos txicos para la salud de los seres humanos y para el ambiente.Para realizar la extraccin de ADN de moquito en este caso se utilizaron 3 de ellos , a los cuales se en primera instancia a cortarles la cabeza ya que esta posee parsitos los cuales pueden contaminar la muestra; se obtuvo ADNdemosquito medianteelmtodo dealtas concentraciones de sales. Se utiliz bufferdelisis,cuyafuncin es romper lamembranacelulary nuclear,permitiendoestola liberacindelADN.Posteriormente se le adiciono acetato de potasio (AcK) el cual precipita las protenas, y su eficiencia aumenta al incubarlo en hielo. El AcKes una sal neutra; se aadeunasalpara disminuirlasolubilidaddelas protenaspor incremento dela fuerza inica del solvente. Despusdelaadicin deciertacantidaddesal,se estableceunacompetencia entre los grupos cargados y polares de la protena y los iones de la sal (en mayor cantidad) por las molculas de aguaquedisminuyelacapade solvatacin alrededor de la molcula proteica,susgruposhidrofbicos superficialesse exponenyse favoreceelestablecimientode interaccionesintermoleculares,la agregacinyportanto,la precipitacin. Luego se centrifugo y se obtuvo un precipitado blanco. Posteriormente en otro tubo eppendorf que contena etanol absoluto se le adiciono el sobrenadante del tubo que se haba centrifugado; luego se centrifugo el tubo que contena el ADN con alcohol absoluto esto con el fin de precipitar el ADN. Posteriormente la muestra es lavada y precipitada con etanol frio al 70% del cual el 40% es etanol y el 30 % es agua. El etanol se encarga de precipitar el ADN, pueseste,es solubleen agua (y,portanto,invisibleanuestros ojos,puescada molculaest rodeada de agua y nuestra vista no percibemolculasindividuales de ADN) pero insoluble en etanol, lo cualoriginaqueenpresenciade ste se aglutine o "se precipite". Al aglutinarse, el ADN forma partculas macroscpicas y se hace visible. Finalmente el ADN es resuspendido en buffer TE, el cual es una solucin amortiguadora del pH, con el fin de proteger el DNA. Lacapacidad amortiguadoradel bufferdependedelTris,mientras que el EDTA es el responsable de proteger aloscidosnucleicos inactivandoalasDNAsas. El EDTAlograesta inactivacinactuandocomo quelantedecationesdivalentes como el Ca2+ y el Mg2+ los cuales sonindispensablesparael funcionamiento de estas enzimas. Por ltimo se almaceno a -200C para su conservacin. CONCLUSIONDurante este procedimiento se ha logrado familiarizarse un poco con los procesos de extraccin de ADN, y entendemos que como en todo proceso se siguen una serie de pasos o protocolos los cuales ayudan a un eficiente resultado. Este proceso tuvo unos puntos claves rompimiento de membranas, precipitacin y purificacin. La solucin de lisis rompe las membranas celulares,en la presipitacion actuando el acetato de potasio debido a que es una sal neutra y la purificacin por medio del etanol y rehidratacin por el buffer TE.

BIBLIOGRAFIA ALBERTS B., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K., WALTER P. Biologa molecular de la clula.Omega. 4Edicin (2004) Miller, S.A., Dykes, D.D. and Polesky, H.F. (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl. Acids Res. 16, 1215.

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